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3批乙型脑炎减毒活疫苗病毒全基因序列测定和分析
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作者 刘欣玉 黄艳秋 +3 位作者 徐宏山 贾丽丽 李玉华 俞永新 《中国病原生物学杂志》 CSCD 北大核心 2019年第3期330-333,337共5页
目的对3批乙型脑炎减毒活疫苗病毒进行全基因测序,并与疫苗原始种子序列进行比较。方法随机选取某厂家生产的3批乙脑减毒活疫苗,提取病毒全基因组RNA,逆转录为cDNA后分段PCR扩增并测序。序列拼接后利用MegAlign软件与GenBank中乙脑减毒... 目的对3批乙型脑炎减毒活疫苗病毒进行全基因测序,并与疫苗原始种子序列进行比较。方法随机选取某厂家生产的3批乙脑减毒活疫苗,提取病毒全基因组RNA,逆转录为cDNA后分段PCR扩增并测序。序列拼接后利用MegAlign软件与GenBank中乙脑减毒活疫苗原始种子全基因序列进行同源性比较。结果 3批乙型脑炎减毒活疫苗病毒基因组全长10 977个核苷酸,与乙脑减毒活疫苗原始种子序列同源性为100%。结论三批次乙型脑炎减毒活疫苗遗传特性高度稳定。 展开更多
关键词 乙型脑炎 减毒活疫苗 全基因序列
中国乙型脑炎病毒株的毒力变异和减毒活疫苗的研究 被引量:2
2
作者 俞永新 《中华实验和临床病毒学杂志》 CAS CSCD 2018年第5期449-457,共9页
1949年以来中国学者在自然界分离到数百株乙型脑炎(乙脑)病毒株,并对这些病毒株进行神经毒力的研究,发现毒株问存在明显的毒力差异,特别是神经外毒力,差异的原因与自然界环境如媒介、宿主和气候等有关。乙脑的显性和隐性感染则与... 1949年以来中国学者在自然界分离到数百株乙型脑炎(乙脑)病毒株,并对这些病毒株进行神经毒力的研究,发现毒株问存在明显的毒力差异,特别是神经外毒力,差异的原因与自然界环境如媒介、宿主和气候等有关。乙脑的显性和隐性感染则与病毒株的毒力强弱密切相关。对乙脑病毒的变异进行研究,发现病毒可以通过小鼠脑内或不同的细胞传代而毒力逐步减弱,特别是神经外毒力降低更快,并且可以通过空斑把强弱病毒分离从而挑选到低毒力的弱毒株。通过不同减毒试验,获得多株不同毒力的弱毒株用于人体、猪和马的免疫。特别是其中发现病毒通过实验动物体内的非神经组织传代,能够进一步降低病毒的残余毒力并提高其免疫性,应用该创新性技术成功筛选到1株高度减毒而稳定并保持高免疫性的SA14-14-2株,用该株病毒生产的活疫苗,自1989年取得生产许可证以来已在国内外广泛应用,证实其安全高效达到国际领先水平,并于2013年取得WHO的预认证。 展开更多
关键词 流行性乙型脑炎病毒 分离株 毒力 减毒活疫苗
乙型脑炎减毒活疫苗和灭活疫苗免疫效果评价
3
作者 刘欣玉 那瑞 +4 位作者 俞永新 赵丹华 赵欣 徐宏山 李玉华 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2018年第9期929-931,935共4页
目的对目前市场上的乙型脑炎(简称乙脑)减毒活疫苗和灭活疫苗的免疫效果进行评价。方法将乙脑减毒活疫苗和灭活疫苗以相同剂量免疫小鼠14 d后,采集一部分小鼠血液,分离血清,检测中和抗体水平;另一部分用乙脑病毒强毒P3株进行腹腔攻击... 目的对目前市场上的乙型脑炎(简称乙脑)减毒活疫苗和灭活疫苗的免疫效果进行评价。方法将乙脑减毒活疫苗和灭活疫苗以相同剂量免疫小鼠14 d后,采集一部分小鼠血液,分离血清,检测中和抗体水平;另一部分用乙脑病毒强毒P3株进行腹腔攻击,观察小鼠存活情况,计算疫苗的保护率。结果乙脑减毒活疫苗和灭活疫苗原倍免疫小鼠后,抗体阳转率均为100%,乙脑病毒强毒攻击后保护率均为100%;乙脑减毒活疫苗1∶20稀释免疫小鼠后,抗体阳转率为90%,攻击保护率为100%。乙脑灭活疫苗1∶20稀释免疫小鼠后抗体阳转率为80%,乙脑病毒强毒攻击后保护率为70%。结论目前市场上应用的乙脑减毒活疫苗和乙脑灭活疫苗均是有效的,乙脑减毒活疫苗的保护效果更好。但通过接种不同的抗原量和采用不同的免疫程序,均可消除免疫保护效果的差异。 展开更多
关键词 乙脑减毒活疫苗 乙脑灭活疫苗 免疫效果 攻击保护率
狂犬病暴露后动物免疫模型的应用进展
4
作者 石磊泰 俞永新 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2018年第8期910-917,共8页
目前,狂犬病疫苗采用先免疫后攻毒的暴露前免疫方法来判定狂犬病疫苗的有效性,这与该疫苗在人体的实际应用是先感染后免疫的暴露后免疫不符,因此无法真实体现疫苗对暴露后免疫的有效性。本文对狂犬病疫苗中的灭活疫苗、减毒活疫苗、DNA... 目前,狂犬病疫苗采用先免疫后攻毒的暴露前免疫方法来判定狂犬病疫苗的有效性,这与该疫苗在人体的实际应用是先感染后免疫的暴露后免疫不符,因此无法真实体现疫苗对暴露后免疫的有效性。本文对狂犬病疫苗中的灭活疫苗、减毒活疫苗、DNA疫苗及佐剂灭活疫苗的暴露后免疫效果作一综述。采用暴露后免疫评价狂犬病疫苗的有效性,符合该疫苗在人体暴露后免疫的实际应用,更客观真实,也将促进狂犬病疫苗质量的提高,加速狂犬病新型疫苗的研发。 展开更多
关键词 狂犬病 暴露后 动物模型
狂犬病两株不同毒力克隆株病毒的神经毒力和全长基因序列比较 预览
5
作者 石磊泰 李玉华 俞永新 《中国人兽共患病学报》 CSCD 北大核心 2018年第11期986-990,共5页
目的对2株毒力不同的狂犬病病毒克隆株(CTN181-3和CTN181-12)进行神经毒力和全长基因序列的比较。方法分别对2株病毒用10、14和21日龄小鼠脑内接种,测定小鼠的致死力(LD50);同时用空斑法测定2株病毒的病毒滴度(PFU),以lgPFU/lgLD50比较... 目的对2株毒力不同的狂犬病病毒克隆株(CTN181-3和CTN181-12)进行神经毒力和全长基因序列的比较。方法分别对2株病毒用10、14和21日龄小鼠脑内接种,测定小鼠的致死力(LD50);同时用空斑法测定2株病毒的病毒滴度(PFU),以lgPFU/lgLD50比较2株病毒的毒力差异;分别对2株病毒进行全基因序列测定并分析,找出毒力差异关键基因位点。结果2株病毒对10、14和21日龄小鼠的lgPFU/lgLD50,CTN181-3株为0.07、3.40和6.60,CTN181-12株为<-0.9、<-0.6和1.04。全基因序列分析表明,二者共有8个核苷酸和6个位点的氨基酸存在差异。结论CTN181-3株的神经毒力明显低于CTN181-12株,两者间6个氨基酸的差异是其毒力差异的分子基础。 展开更多
关键词 狂犬病减毒株 克隆株 毒力 全基因序列分析
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国产CTN-1V株人用狂犬病疫苗(Vero细胞)在健康人群中的安全性及免疫原性 被引量:1
6
作者 黄腾 李艳萍 +9 位作者 莫顺平 李加 南日范 周蕾 王明惠 聂飞 陈建民 杨天兵 李玉华 俞永新 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2018年第6期624-628,637共6页
目的评价国产CTN-1V株人用狂犬病疫苗(Vero细胞)在10~60岁健康人群中的安全性和免疫原性。方法采用随机、盲法、同类制品平行对照的设计,将900名受试者按2∶1随机配对分别接种试验疫苗及对照疫苗,观察安全性;所有受试者于首剂免前和... 目的评价国产CTN-1V株人用狂犬病疫苗(Vero细胞)在10~60岁健康人群中的安全性和免疫原性。方法采用随机、盲法、同类制品平行对照的设计,将900名受试者按2∶1随机配对分别接种试验疫苗及对照疫苗,观察安全性;所有受试者于首剂免前和免后14及45 d采集静脉血,通过快速免疫荧光灶抑制试验(RFFIT)测定血清中狂犬病病毒中和抗体滴度,计算几何平均浓度水平(GMC)。结果试验组与对照组不良反应发生率分别为32.33%和38.67%,试验组明显低于对照组(P〈0.05)。局部反应主要为接种部位疼痛、发红、肿胀、瘙痒,全身反应主要为发热、头痛、乏力等,大部分为轻度(1级)。免后14、45 d试验组的狂犬病病毒中和抗体阳转率均为100.00%,抗体GMC分别为9.96和28.83 IU/m L,且与对照组比较,差异均无统计学意义(P〉0.05)。结论国产CTN-1V株人用狂犬病疫苗(Vero细胞)具有良好的安全性和免疫原性。 展开更多
关键词 狂犬病疫苗 CTN-1V株 安全性 免疫原性
狂犬病病毒CTN株核蛋白可溶性高效表达及纯化
7
作者 李加 刘雅菲 +2 位作者 王云鹏 俞永新 李玉华 《中国病毒病杂志》 CAS 2017年第1期32-37,共6页
目的通过原核表达系统对狂犬病病毒CTN株核蛋白(NP)进行高效的可溶性表达及纯化。方法构建含有融合标签的狂犬病病毒CTN株核蛋白表达质粒,筛选可溶性表达条件,采用亲和层析和凝胶过滤层析对目的蛋白进行纯化,切除目的蛋白的融合标签,... 目的通过原核表达系统对狂犬病病毒CTN株核蛋白(NP)进行高效的可溶性表达及纯化。方法构建含有融合标签的狂犬病病毒CTN株核蛋白表达质粒,筛选可溶性表达条件,采用亲和层析和凝胶过滤层析对目的蛋白进行纯化,切除目的蛋白的融合标签,最终获得高效表达的可溶性目的蛋白。结果成功建立应用PBCX原核表达系统高效表达重组可溶性狂犬病病毒CTN株核蛋白rb-NP的表达及纯化工艺,获得高纯度目的蛋白。结论本研究建立的可溶性表达狂犬病病毒核蛋白的方法,操作简便,表达量高,适合目的蛋白的规模制备,为深入研究狂犬病病毒核蛋白生物学功能、开展狂犬病诊断试剂研究及新型疫苗的研发提供了新的技术手段。 展开更多
关键词 狂犬病病毒 核蛋白 可溶性表达
狂犬病病毒CTN株糖蛋白膜外区可溶性高效表达及纯化
8
作者 李加 刘雅菲 +4 位作者 王云鹏 曹守春 石磊泰 俞永新 李玉华 《中华微生物学和免疫学杂志》 CSCD 北大核心 2017年第6期438-442,共5页
目的 探索原核可溶性目的蛋白表达系统对狂犬病病毒糖蛋白膜外区(Ex-GP)进行高效制备及纯化的方法.方法 构建含有融合标签的狂犬病病毒糖蛋白膜外区表达质粒,筛选可溶性表达条件,采用亲和层析和凝胶过滤层析对目的蛋白进行纯化,以获... 目的 探索原核可溶性目的蛋白表达系统对狂犬病病毒糖蛋白膜外区(Ex-GP)进行高效制备及纯化的方法.方法 构建含有融合标签的狂犬病病毒糖蛋白膜外区表达质粒,筛选可溶性表达条件,采用亲和层析和凝胶过滤层析对目的蛋白进行纯化,以获得高效表达的可溶性目的蛋白.结果 成功建立应用原核表达系统高效制备重组可溶性狂犬病病毒糖蛋白膜外区蛋白的方法,获得的目的蛋白具有ELISA抗原活性,推测其构象与天然狂犬病病毒糖蛋白膜外区具有相似性.结论 本研究建立的目的蛋白高效制备方法,操作简便,表达量高,目的蛋白具有抗原性活性,适合目的蛋白规模制备,为深入研究狂犬病病毒糖蛋白生物学功能,解析糖蛋白结构,揭示狂犬病病毒致病机制及开展狂犬病诊断试剂的研发提供了思路. 展开更多
关键词 狂犬病病毒 糖蛋白膜外区 可溶性表达
狂犬病病毒弱毒克隆株的毒力和免疫原性研究
9
作者 邹剑 石磊泰 +1 位作者 俞永新 李玉华 《中国病毒病杂志》 CAS 2016年第2期134-139,共6页
目的对狂犬病病毒CTN-181弱毒株经豚鼠颌下腺传代和空斑纯化而获得的3株弱毒株病毒(CTN-1-3,CTN-1-16和CTN-1-19)进行全面的致病性、免疫性研究和遗传稳定性研究。方法分别对3株病毒用10、14和21日龄小鼠脑内接种,观察小鼠的发病死亡... 目的对狂犬病病毒CTN-181弱毒株经豚鼠颌下腺传代和空斑纯化而获得的3株弱毒株病毒(CTN-1-3,CTN-1-16和CTN-1-19)进行全面的致病性、免疫性研究和遗传稳定性研究。方法分别对3株病毒用10、14和21日龄小鼠脑内接种,观察小鼠的发病死亡情况进行致病性研究;分别对3株病毒用3周龄小鼠进行肌内免疫和口腔免疫,测定小鼠中和抗体阳转率和中和抗体水平;将3株病毒在乳鼠脑内连续传代或豚鼠颌下腺传代,传代后病毒以小鼠脑内接种观察有无致病性进行遗传稳定性研究。结果在致病性方面:3株病毒均对3周龄小白鼠脑内接种无致病性,其中CTN-1-3和CTN-1-19对14日龄乳鼠约半数存活,而CTN-1-16株则大部分死亡。对10日龄乳鼠只有CTN-1-3株不完全致死。在免疫性方面:3株病毒以≥5.5lg PFU病毒肌内免疫或≥6.5lg PFU口腔免疫的3周龄小鼠,30d后的中和抗体阳转率均为100%,GMT分别为7.0~16.1IU/ml和7.9~39.5IU/ml。在遗传稳定性方面,3株病毒经1~3日龄乳鼠脑内连续传5代或豚鼠颌下腺传1代,传代增殖后的病毒滴度虽高达6.5或8.0lg PFU/ml,对小鼠脑内接种仍保留无致病力的弱毒特性。结论结果表明3株病毒的毒力已高度减弱,免疫效力良好,诱生的抗体水平很高,遗传稳定性十分稳定,是研发兽用狂犬病口服活疫苗和狂犬病暴露后人体免疫用减毒活疫苗的良好候选株。 展开更多
关键词 狂犬病减毒克隆株 致病力 免疫原性 遗传稳定性
金黄地鼠作为狂犬病暴露后疫苗免疫动物模型的应用 被引量:1
10
作者 汤重发 石磊泰 +5 位作者 俞永新 李玉华 曹守春 李加 吴小红 王云鹏 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2016年第3期225-230,共6页
目的以金黄地鼠作为动物模型,评价不同种类狂犬病疫苗在暴露后免疫中的保护效果。方法将不同类型狂犬病疫苗分别免疫两组金黄地鼠,一组为未感染过病毒的健康动物(Pr EP),另一组为感染过CVS株的动物(PEP),免疫后不同时间点通过心脏... 目的以金黄地鼠作为动物模型,评价不同种类狂犬病疫苗在暴露后免疫中的保护效果。方法将不同类型狂犬病疫苗分别免疫两组金黄地鼠,一组为未感染过病毒的健康动物(Pr EP),另一组为感染过CVS株的动物(PEP),免疫后不同时间点通过心脏穿刺采血,RFFIT法测定血清抗体效价。对PEP组动物同时观察其死亡情况,分析各动物抗体水平与保护效果的相关性。另以4.0 lg MICLD_(50)/ml的CVS狂犬病固定毒株感染金黄地鼠左腿腓肠肌,每只0.2 ml,6 h后开始以不同类型狂犬病疫苗按0、3、7、14 d程序免疫,观察疫苗对动物的保护效果。结果暴露后免疫组(PEP)的血清抗体可在第4天出现阳性,第5天达100%,以后持续维持较高水平。未感染的暴露前免疫(Pr EP)动物的抗体水平从第4天开始一直较PEP组低。但PEP组中不同疫苗免疫的各动物中均观察到免疫后第4天及以后的抗体水平与最终该动物的发病死亡无相关性。高效价人用狂犬病疫苗的免疫保护率为80%,但疫苗原液分别稀释2倍和5倍后,保护率分别降至30%和20%。疫苗加PIKA佐剂作相同倍数稀释后,保护率可达80%,疫苗联合使用免疫球蛋白,暴露后保护率可达100%,未免疫的感染对照组动物的死亡率在90%左右。结论以金黄地鼠作为狂犬病暴露后免疫的动物模型可对不同质量疫苗作出有效评价。疫苗的效价与暴露后免疫中的保护作用有相关性,疫苗联合使用免疫球蛋白注射是最佳的暴露后免疫方案;PIKA佐剂在降低疫苗抗原量的同时提高了疫苗的保护作用;暴露后抗体水平未显示与保护效果具有相关性。 展开更多
关键词 狂犬病病毒 金黄地鼠 动物模型 暴露后免疫 佐剂 体液免疫
登革热疫苗研究最新进展和展望
11
作者 陈柠 石磊泰 俞永新 《中国病毒病杂志》 CAS 2016年第6期471-480,共10页
登革热是一种由登革病毒(dengue virus,DENV)引起的急性传染病,登革出血热(dengue hemorrhagic fever,DHF)和登革热休克综合征(dengue shock syndrome,DSS)为登革病毒感染的严重临床类型,主要由埃及伊蚊和白纹伊蚊传播。登革热在... 登革热是一种由登革病毒(dengue virus,DENV)引起的急性传染病,登革出血热(dengue hemorrhagic fever,DHF)和登革热休克综合征(dengue shock syndrome,DSS)为登革病毒感染的严重临床类型,主要由埃及伊蚊和白纹伊蚊传播。登革热在热带和亚热带地区频繁暴发,严重威胁着人类的健康。 展开更多
关键词 登革热 登革热疫苗 减毒活疫苗 嵌合疫苗
狂犬病病毒CTN-181减毒株在豚鼠颌下腺的繁殖动态及其低毒力克隆株的筛选研究 被引量:4
12
作者 石磊泰 邹剑 +4 位作者 俞永新 王玲 曹守春 董关木 李玉华 《中国病毒病杂志》 2015年第3期217-222,共6页
目的了解狂犬病病毒减毒株CTN-181在豚鼠颌下腺的繁殖动态并获得毒力更低的病毒纯化克隆株。方法将CTN-181经刚离乳豚鼠颈部皮下注射,分别于1、2、3和4d取颌下腺分离狂犬病病毒,测定各天次颌下腺内的病毒滴度。用滴度高的病毒液进行下... 目的了解狂犬病病毒减毒株CTN-181在豚鼠颌下腺的繁殖动态并获得毒力更低的病毒纯化克隆株。方法将CTN-181经刚离乳豚鼠颈部皮下注射,分别于1、2、3和4d取颌下腺分离狂犬病病毒,测定各天次颌下腺内的病毒滴度。用滴度高的病毒液进行下一次豚鼠颌下腺传代,连续传3代。将第3代颌下腺传代的病毒液在BHK21细胞上进行空斑试验,挑选单个病毒克隆,以3周龄小鼠脑内接种测病毒毒力。筛选对小鼠不致病的克隆株进一步测定其对乳鼠的脑内毒力,并以乳鼠脑内传代和豚鼠颌下腺传代检测其遗传稳定性。结果 CTN-181在豚鼠颌下腺能短暂轻度繁殖,通过颌下腺传代后病毒毒力明显有回升。获得19个病毒克隆,不同克隆病毒的毒力不同,为0~3.16lg LD50;3株脑内无致病力的克隆株对乳鼠的毒力亦有减弱;乳鼠脑内和颌下腺回传后毒力无回升返祖,即传代后的病毒对小鼠均无致病力。结论CTN-181母株对3周龄小鼠仍存在低水平毒力,经豚鼠颌下腺传代后毒力十分不稳定。筛选到的3株克隆病毒较其母株的毒力更低,遗传稳定性更高,更适合作为狂犬病兽用口服疫苗候选株。 展开更多
关键词 狂犬病病毒减毒株 颌下腺传代 空斑纯化
叙利亚地鼠作为狂犬病暴露后免疫动物模型的研究 被引量:2
13
作者 汤重发 俞永新 +5 位作者 李玉华 曹守春 石磊泰 李加 吴小红 王云鹏 《国际生物制品学杂志》 CAS 2015年第6期267-272,共6页
目的对叙利亚地鼠(地鼠)作为狂犬病暴露后疫苗免疫效果动物模型的可行性进行研究。方法将狂犬病病毒CVS株和CTN-1V株分别肌内感染不同周龄的地鼠和小鼠,观察动物对不同毒株的敏感性。用直接免疫荧光法检测CVS株进入地鼠脑组织的情况... 目的对叙利亚地鼠(地鼠)作为狂犬病暴露后疫苗免疫效果动物模型的可行性进行研究。方法将狂犬病病毒CVS株和CTN-1V株分别肌内感染不同周龄的地鼠和小鼠,观察动物对不同毒株的敏感性。用直接免疫荧光法检测CVS株进入地鼠脑组织的情况;用快速荧光灶抑制试验检测血清中和抗体。以不同病毒量CVS株感染8周龄雌性地鼠,确定暴露时病毒的最佳感染剂量。对暴露后地鼠用疫苗进行免疫,观察疫苗的保护效果。结果地鼠感染后7d左右出现狂犬病临床症状,同一病毒株对地鼠的致病力比小鼠强[6.4~8.0 lg半数致死量(LD50)/ml对3.4~6.5 lgLD50/ml];3周龄和8周龄地鼠对病毒的敏感性无差异。感染后5~6d病毒进入地鼠脑组织。以3.8~4.0 lg小鼠脑内半数致死量(MICLD50)/ml的CVS株感染后6~7d,地鼠血清中检出中和抗体。暴露后疫苗免疫结果显示,不同疫苗具有不同程度的保护效果。结论地鼠对狂犬病病毒神经外途径感染敏感,临床症状典型,潜伏期恒定,感染后免疫血清抗体应答出现早,具备作为暴露后疫苗免疫动物模型的条件。 展开更多
关键词 模型 动物 金仓鼠 狂犬病病毒 暴露后预防
一株特殊抗原性乙脑毒株的分子生物学特征研究 被引量:1
14
作者 刘欣玉 俞永新 +2 位作者 贾丽丽 董关木 李玉华 《中国病原生物学杂志》 CSCD 北大核心 2014年第5期385-388,416共5页
目的对一株抗原性特殊的乙脑毒株进行生物学和分子生物学特征研究,以找出特殊抗原性的分子生物学基础。方法通过空斑减少交叉中和试验对乙脑病毒KT株的抗原性进行比较。提取KT株RNA,逆转录后扩增其E基因片段并测序,通过Blast与GenBan... 目的对一株抗原性特殊的乙脑毒株进行生物学和分子生物学特征研究,以找出特殊抗原性的分子生物学基础。方法通过空斑减少交叉中和试验对乙脑病毒KT株的抗原性进行比较。提取KT株RNA,逆转录后扩增其E基因片段并测序,通过Blast与GenBank中所有乙脑病毒基因进行核苷酸和氨基酸序列比对,利用Pdb Viewer对KT株关键位点突变后的空间构象进行预测比对。结果交叉中和试验显示,KT株免疫血清对其他株乙脑病毒的中和作用较低,而其他乙脑病毒免疫血清对KT株的中和作用也较低。对E基因序列进行比对,KT株属于基因Ⅲ型,氨基酸序列上只在E62位存在一个独特的位点突变:组氨酸(H)-精氨酸(R)。空间构象显示,该位点位于结构域Ⅰ与结构域Ⅱ的连接交界处,当发生由组氨酸(H)到精氨酸(R)突变时,其与周围氨基酸形成的氢键数量和长度发生改变,空间构象也随之发生改变。结论乙脑病毒KT株的抗原性与其他乙脑病毒株存在较大差异,E62位组氨酸(H)-精氨酸(R)的突变是导致其抗原性差异的主要原因。 展开更多
关键词 乙脑病毒 抗原性 氨基酸突变 空间构象
狂犬病病毒不同毒株的生物学特性研究 被引量:6
15
作者 汤重发 俞永新 +7 位作者 刘景华 曹守春 石磊泰 李加 吴小红 王云鹏 董关木 李玉华 《中国病毒病杂志》 2014年第3期179-186,共8页
目的研究狂犬病不同固定毒株对动物的致病性和对细胞的感染性。方法以小鼠脑内和肌内途径接种比较不同毒株的致病性,研究并建立HEPES(4-羟乙基哌嗪乙磺酸)诱导的空斑形成技术测定病毒空斑形成单位(plaque-forming unit,PFU)和细胞... 目的研究狂犬病不同固定毒株对动物的致病性和对细胞的感染性。方法以小鼠脑内和肌内途径接种比较不同毒株的致病性,研究并建立HEPES(4-羟乙基哌嗪乙磺酸)诱导的空斑形成技术测定病毒空斑形成单位(plaque-forming unit,PFU)和细胞病变感染技术测定病毒感染滴度(CCID50),并用以比较不同毒株的病毒滴度,实验同时以常规的直接免疫荧光法(direct immunofluorescent assay,dFA)做对照。结果不同固定毒株对10~12g小鼠的脑内致病力普遍很高,但肌内毒力普遍较低,脑腔感染致病力比肌内感染致病力高3.0~5.0lg LD50,CVS株相差最大为5.0lg LD50。用两种新的方法 (PFU和CCID50)测定不同毒株的病毒滴度与dFA法测定的结果比较,除个别株外无明显差异,如CVS-11、4aG、PV株用三种方法测定的滴度均在7.1~7.9lg。结论用dFA法测定病毒滴度的结果与小鼠脑内测定的结果有可比性,用以替代小鼠脑内法测定病毒滴度是可行的。两种细胞感染法测定的病毒滴度操作简便,无需贵重仪器和昂贵试剂,可以更广泛地应用于狂犬病病毒和疫苗发展的研究。 展开更多
关键词 狂犬病病毒 细胞病变 蚀斑形成 4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)
乙脑病毒包膜蛋白可溶性表达及纯化 被引量:1
16
作者 刘欣玉 俞永新 +2 位作者 鲁旭 余凝盼 李玉华 《中华微生物学和免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2014年第7期546-550,共5页
目的:通过原核表达载体对乙脑病毒包膜蛋白进行可溶性表达和纯化。方法筛选不同的表达载体、宿主菌株、表达条件,以获得可溶性的目的蛋白表达。采用镍柱和凝胶过滤层析对表达蛋白进行纯化。结果对不同的载体、菌株、表达条件筛选后,... 目的:通过原核表达载体对乙脑病毒包膜蛋白进行可溶性表达和纯化。方法筛选不同的表达载体、宿主菌株、表达条件,以获得可溶性的目的蛋白表达。采用镍柱和凝胶过滤层析对表达蛋白进行纯化。结果对不同的载体、菌株、表达条件筛选后,最终发现PBCX载体与乙脑病毒包膜蛋白E406基因连接后的质粒,在低温诱导后获得可溶性E蛋白表达,且表达量较高。表达量占可溶性蛋白总量的23%。通过镍柱和凝胶过滤层析纯化后,目的蛋白纯度较高,达85%,满足试验需求。结论本研究获得了可溶性表达的乙脑病毒E蛋白,方法简单高效,为深入研究该蛋白生物学特性和功能,解析乙脑病毒的致病机制、乙脑减毒活疫苗毒株的减毒机制及其质量控制,乙脑诊断试剂开发,奠定了技术基础。 展开更多
关键词 乙脑病毒 包膜蛋白 可溶性表达 纯化
乙型脑炎灭活疫苗生产用毒种P3-Smb53株全基因序列分析 被引量:1
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作者 刘欣玉 俞永新 +5 位作者 徐宏山 岳广智 杨立宏 董关木 李玉华 贾丽丽 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2014年第8期985-989,共5页
目的 对我国乙型脑炎灭活疫苗生产用毒种P3株鼠脑53代(P3-Smb53)进行全基因序列测定及分析。方法提取P3-Smb53株病毒全基因组RNA,逆转录合成为cDNA,以其为模板分段进行PCR扩增,并测序;序列拼接后,利用NCBI的Blast程序和DNASTAR软件包... 目的 对我国乙型脑炎灭活疫苗生产用毒种P3株鼠脑53代(P3-Smb53)进行全基因序列测定及分析。方法提取P3-Smb53株病毒全基因组RNA,逆转录合成为cDNA,以其为模板分段进行PCR扩增,并测序;序列拼接后,利用NCBI的Blast程序和DNASTAR软件包中的MegAlign软件与GenBank中登录的5个基因型别的177株乙脑病毒全基因序列、551株乙脑病毒E蛋白序列进行比对。结果P3-Smb53株病毒基因组全长10 976个核苷酸,与177株乙脑病毒株的全基因序列核苷酸同源性为79.6%-99.7%,氨基酸同源性为91.3%-99.7%;与GenBank中登录的551株乙脑病毒E蛋白氨基酸同源性为91.0%-99.8%,在E蛋白12个关键抗原性位点中,所有毒株均非常保守;与GenBank中登录的P3株全基因序列核苷酸同源性为99.4%,氨基酸同源性为99.5%。结论 乙型脑炎灭活疫苗生产用毒种P3-Smb53株虽然与不同基因型毒株间的氨基酸差异较大,但在关键抗原位点上高度一致,理论上能够抵抗目前国内外所有乙脑分离株的感染。 展开更多
关键词 流行性乙型脑炎 灭活疫苗 毒种 序列分析
我国云南登革4型病毒减毒株生物学特性及全基因组序列分析
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作者 陈柠 俞永新 +7 位作者 徐宏山 刘欣玉 王志伟 杨立宏 岳广智 贾丽丽 董关木 李玉华 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2014年第8期997-1001,1009共6页
目的 对我国云南登革4型病毒分离株(Ban18)及其减毒株(Ban18 HK20和Ban18 HK30)的生物学特性进行分析,测定原株和减毒株的全基因组序列并进行比对,分析与毒力相关的位点。方法 将各毒株在Vero细胞传代后进行空斑形态观察、小鼠脑内... 目的 对我国云南登革4型病毒分离株(Ban18)及其减毒株(Ban18 HK20和Ban18 HK30)的生物学特性进行分析,测定原株和减毒株的全基因组序列并进行比对,分析与毒力相关的位点。方法 将各毒株在Vero细胞传代后进行空斑形态观察、小鼠脑内致病力和免疫原性检测;减毒株经空斑纯化后,挑选单克隆,检测其小鼠脑内致病力;提取减毒株基因组RNA,RT-PCR法分段扩增其全基因组序列并测序,应用DNAStar软件包进行序列比对分析。结果Ban18 HK20和Ban18 HK30毒株在Vero细胞上形成的空斑较其原株稍大,但边界较模糊;两个代次的减毒株对KM小鼠不致病,对2~4日龄乳鼠的脑内致病力也明显低于其原株;Ban18原株和Ban18 HK20毒株免疫的小鼠经3个剂量的国际标准株H241株脑内攻击后,均无死亡,但Ban18 HK30毒株与对照组相比,未显示出保护作用;Ban18 HK20毒株的9个克隆株中,3株对乳鼠的脑内致病力低于其他6株克隆株,Ban18 HK30毒株的5个克隆株对乳鼠的脑内致病力无明显差异;减毒株的两个代次病毒与其原株存在3个氨基酸[A→V(C-111)、I→T(E-155)、I→L(E-369)]和一个核苷酸[G→A(3’UTR-219)]的共同差异。结论 通过原代地鼠肾细胞传代的两个代次(HK20和HK30)病毒对小鼠的脑内致病力明显减弱,其中Ban18 HK20免疫原性较好,并从空斑克隆中筛选出3株毒力较Ban18 HK20更低的克隆株;C-111、E-155、E-369和3’UTR-219突变与毒力减弱密切相关。 展开更多
关键词 登革4型病毒 Ban18株 减毒株 毒力 免疫原性 序列分析
中国广西登革3型病毒分离株基因组序列特征分析 被引量:2
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作者 陈柠 俞永新 +4 位作者 徐宏山 刘欣玉 贾丽丽 董关木 李玉华 《中国病原生物学杂志》 CSCD 北大核心 2014年第5期394-399,共6页
目的对我国广西登革3型病毒分离株桂登-1株(GD-1株)和桂登-11株(GD11株)进行全基因组序列测定和分析,为了解其地理来源提供依据。方法根据GenBank提交的登革3型病毒基因序列设计9对引物,RT—PCR方法分段扩增GD-1和GD-11株基因序... 目的对我国广西登革3型病毒分离株桂登-1株(GD-1株)和桂登-11株(GD11株)进行全基因组序列测定和分析,为了解其地理来源提供依据。方法根据GenBank提交的登革3型病毒基因序列设计9对引物,RT—PCR方法分段扩增GD-1和GD-11株基因序列,测序后进行拼接,得到其全基因组序列。结果两株病毒全长均为10707nt,与国际参考株H87株核苷酸同源性为96.0%,氨基酸同源性为98.8%。GD-1株和GD-11株间仅有4个氨基酸差异,二者与H87株分别存在39和41个氨基酸差异。对3’UTR二级结构进行预测,二者与H87株存在较大差异。根据E蛋白基因序列对两株病毒进行进化分析,GD-1和GD-11均属于亚型Ⅱ,与分离自泰国的两毒株进化关系较近。结论GD-1和GD-11均属于登革3型病毒亚型Ⅱ,二者可能是源自泰国的病原。 展开更多
关键词 登革3型病毒 亚型 二级结构 进化树
低神经外毒力乙脑病毒M47株的分子生物学特征
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作者 刘欣玉 俞永新 +1 位作者 贾丽丽 李玉华 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2014年第9期1127-1131,共5页
目的探究低神经毒力乙脑病毒M47株的分子生物学特征,以期找出其低毒力的分子基础。方法采用RTPCR法扩增M47株病毒全长基因片段,测定其序列,并与GenBank中19株代表性乙脑病毒株全基因序列进行核苷酸和氨基酸比对分析。结果 M47株属于基... 目的探究低神经毒力乙脑病毒M47株的分子生物学特征,以期找出其低毒力的分子基础。方法采用RTPCR法扩增M47株病毒全长基因片段,测定其序列,并与GenBank中19株代表性乙脑病毒株全基因序列进行核苷酸和氨基酸比对分析。结果 M47株属于基因Ⅲ型,与GenBank中19株代表性乙脑病毒株核苷酸序列同源性为79.4%-99.6%,氨基酸序列同源性为91.3%-99.6%;氨基酸序列比对发现,该毒株存在一个独特的氨基酸位点改变E-29(S-R)。结论 M47株独特的氨基酸位点改变E-29(S-R)可能是导致其低神经外毒力的原因。 展开更多
关键词 乙脑病毒 M47株 神经外毒力 全基因序列 氨基酸位点
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