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脑心肌炎病毒VP1基因重组腺病毒的构建及对小鼠免疫效果的研究
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作者 张海霞 令瑛 +8 位作者 杨术伟 静静 李琼毅 李向茸 马玉梅 包晓婧 魏嘉 马忠仁 冯若飞 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2017年第3期315-321,共7页
为构建脑心肌炎病毒(EMCV)VP1基因的重组腺病毒,以期为EMCV疫苗研制提供试验依据。扩增EMCV VP1基因并与载体pYr-adshuttle-4连接构建pYr-ads-4-VP1穿梭载体;穿梭质粒通过体外重组与腺病毒载体进行重组,获得pAd-VP1-EGFP重组腺病毒载... 为构建脑心肌炎病毒(EMCV)VP1基因的重组腺病毒,以期为EMCV疫苗研制提供试验依据。扩增EMCV VP1基因并与载体pYr-adshuttle-4连接构建pYr-ads-4-VP1穿梭载体;穿梭质粒通过体外重组与腺病毒载体进行重组,获得pAd-VP1-EGFP重组腺病毒载体,将此载体于HEK293细胞中包装最终成功获得rAd-VP1-EGFP重组腺病毒,并测定其TCID50;构建的重组腺病毒感染细胞后在基因水平、蛋白水平对VP1进行检测;最后通过对小鼠免疫重组腺病毒后进行EMCV攻毒试验,验证其免疫效果。结果显示,成功构建了EMCV VP1基因重组腺病毒rAd-VP1-EGFP,测得其TCID50为10-8.5/mL;感染细胞后基因水平及蛋白水平均可检测到VP1基因的表达;重组腺病毒免疫小鼠后的存活情况表明,重组腺病毒对小鼠有较好的免疫效果,且二次免疫后保护率显著高于单次免疫。结果表明,本试验成功制备了EMCV基因重组腺病毒,且对小鼠具有较好的免疫效果,可为进一步开发EMCV基因工程疫苗奠定基础。 展开更多
关键词 脑心肌炎病毒 结构蛋白VP1 腺病毒 免疫效果
脑心肌炎病毒环介导等温扩增快速检测方法的建立及初步应用 被引量:2
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作者 王丹 冯若飞 +4 位作者 张海霞 静静 谢晶莹 马忠仁 冯玉萍 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2013年第10期1067-1072,共6页
为建立快速检测脑心肌炎病毒(EMCV)的环介导等温扩增方法(LAMP),参照GenBank中EMCV基因组序列(X74312.1),针对EMCV的3D基因保守区域设计并合成了4条引物,对建立的反应体系进行条件优化,并进行特异性、敏感性试验及临床样本的检测... 为建立快速检测脑心肌炎病毒(EMCV)的环介导等温扩增方法(LAMP),参照GenBank中EMCV基因组序列(X74312.1),针对EMCV的3D基因保守区域设计并合成了4条引物,对建立的反应体系进行条件优化,并进行特异性、敏感性试验及临床样本的检测。结果显示,成功建立了EMCV LAMP检测方法,且当内、外引物浓度比例为5∶1(即内、外引物浓度分别为50μmol/L、10μmol/L),反应温度为64℃,反应时间为60min时反应体系可达最佳。特异性和敏感性试验表明,该方法能够特异性地检测EMCV,且敏感性比常规RT-PCR法高10倍。分别用建立的LAMP法与ELISA法对临床样本进行检测,结果二者的符合率为97%。表明建立的LAMP方法特异性强、敏感性高,可适用于EMCV临床样本的快速检测。 展开更多
关键词 脑心肌炎病毒 环介导等温扩增技术 检测
脑心肌炎病毒VP1基因真核表达载体的构建及表达 被引量:1
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作者 静静 冯若飞 +5 位作者 杨妍梅 张海霞 李向茸 王丹 谢晶莹 马忠仁 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2013年第3期304-309,共6页
为构建脑心肌炎病毒(EMCV)VP1基因的真核表达载体,并在CHO细胞中进行表达,通过RT-PCR扩增目的基因,酶切连接后将VP1基因克隆入真核表达载体pEGFP-C1中,通过脂质体法转染重组质粒pEGFP-C1-VP1,提取CHO细胞的总RNA,用RT-PCR检测目的基... 为构建脑心肌炎病毒(EMCV)VP1基因的真核表达载体,并在CHO细胞中进行表达,通过RT-PCR扩增目的基因,酶切连接后将VP1基因克隆入真核表达载体pEGFP-C1中,通过脂质体法转染重组质粒pEGFP-C1-VP1,提取CHO细胞的总RNA,用RT-PCR检测目的基因的转录情况,并利用免疫组织化学和Western-blot分析检测目的基因表达情况、VP1蛋白在细胞中的定位及其抗原性。PCR、酶切验证及测序结果证实,重组质粒构建成功,绿色荧光蛋白正常表达。提取试验组细胞的总RNA,进行RT-PCR,在900bp处扩增出了目的条带。免疫组织化学结果显示,VP1主要分布在CHO细胞的细胞膜中,少量存在于胞浆中。Western-blot分析结果证实,VP1能与兔抗EMCV抗体特异性结合。表明VP1蛋白在CHO细胞中表达良好,表达的蛋白具有反应原性。 展开更多
关键词 脑心肌炎病毒 VP1基因 真核表达 免疫组织化学
脑心肌炎病毒 TaqMan real-time PCR检测方法的建立及应用 被引量:5
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作者 张海霞 冯若飞 +4 位作者 王丹 静静 谢晶莹 马忠仁 冯玉萍 《中华微生物学和免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2013年第9期706-710,共5页
目的建立脑心肌炎病毒( EMCV) TaqMan real-time PCR检测方法。方法根据GenBank中公布的EMCV 3D基因保守区段设计并合成1对引物和1条TaqMan 探针,建立EMCV TaqMan real-time PCR检测方法,且对体系进行优化;对该法进行灵敏性、特异... 目的建立脑心肌炎病毒( EMCV) TaqMan real-time PCR检测方法。方法根据GenBank中公布的EMCV 3D基因保守区段设计并合成1对引物和1条TaqMan 探针,建立EMCV TaqMan real-time PCR检测方法,且对体系进行优化;对该法进行灵敏性、特异性验证;采用建立的方法对98份猪血清样本进行检测,并与ELISA结果进行比较。结果建立的EMCV TaqMan real-time PCR检测方法线性关系较好,以质粒标准品构建的标准曲线相关系数R2为0.995;灵敏性比普通PCR高100倍,且仅能特异性检出 EMCV;对猪血清样本的检测与 ELISA 法检测结果符合率为98.0%。结论已建立了EMCV TaqMan real-time PCR检测方法,该法灵敏性高、特异性好,可用于EMCV的检测及定量分析。 展开更多
关键词 脑心肌炎病毒 实时荧光定量PCR
感染脑心肌炎病毒小鼠的脑组织病理损伤及体内病毒分布
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作者 张海霞 冯若飞 +5 位作者 王丹 静静 李向茸 杨妍梅 马忠仁 冯玉萍 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2013年第9期982-985,共4页
为探讨脑心肌炎病毒对小鼠的致病性及体内病毒分布、复制情况,选用脑心肌炎病毒VR129B株进行小鼠接种,观察其临床症状,并将死亡小鼠脑组织进行病理切片,同时利用PCR及real-time PCR方法对各组织中病毒含量进行测定。结果显示,感染小鼠... 为探讨脑心肌炎病毒对小鼠的致病性及体内病毒分布、复制情况,选用脑心肌炎病毒VR129B株进行小鼠接种,观察其临床症状,并将死亡小鼠脑组织进行病理切片,同时利用PCR及real-time PCR方法对各组织中病毒含量进行测定。结果显示,感染小鼠出现典型的神经性临床症状,感染后第4天开始死亡,第5~9天死亡达到高峰;脑组织切片可见血管镶边现象、卫星化、噬神经细胞现象及胶质细胞结节等典型的组织病理学现象,脑、心、脾、肝及胸腺均存在病毒复制子,其中脑组织病毒含量最高。表明,小鼠对脑心肌炎病毒较为敏感,感染后出现脑炎症状和病理变化,且病毒集中在小鼠脑组织中。 展开更多
关键词 脑心肌炎病毒 组织切片 实时荧光定量PCR 病理学变化
脑心肌炎病毒的体外细胞增殖培养及其冻干保存试验 被引量:3
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作者 张海霞 冯若飞 +5 位作者 王丹 静静 李向茸 杨妍梅 马忠仁 冯玉萍 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2012年第11期1128-1132,共5页
为了解脑心肌炎病毒在Vero细胞不同培养方式下的增殖效果和用不同冻干保护剂的冻干效果,分别采用方瓶、转瓶来培养Vero细胞并接种脑心肌炎病毒,测定收获病毒毒液的效价,比较病毒的增殖效果;配制了10组冻干保护剂,分别与病毒混合后真空冻... 为了解脑心肌炎病毒在Vero细胞不同培养方式下的增殖效果和用不同冻干保护剂的冻干效果,分别采用方瓶、转瓶来培养Vero细胞并接种脑心肌炎病毒,测定收获病毒毒液的效价,比较病毒的增殖效果;配制了10组冻干保护剂,分别与病毒混合后真空冻干,通过测定冻干前后的病毒效价,以期筛选最佳的保护剂配方。结果显示,脑心肌炎病毒在Vero细胞转瓶培养中增殖效果较好,第Ⅷ组保护剂对脑心肌炎病毒的冻干保护效果最好,冻干后效价下降低于1.5(lg)TCID50/mL。表明Vero细胞转瓶培养方式可用于脑心肌炎病毒的体外大规模培养;含有50g/L蔗糖、2.2g/L牛血清白蛋白、5.0g/L明胶和6.0g/L谷氨酰胺的保护剂对脑心肌炎病毒冻干具有较好的保护作用。 展开更多
关键词 脑心肌炎病毒 增殖培养 效价 冻干保护剂
盖他病毒重组E2蛋白间接ELISA检测方法的建立 被引量:1
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作者 李向茸 冯若飞 +5 位作者 刘俊林 王丹 杨妍梅 静静 张海霞 马忠仁 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2012年第10期1037-1042,共6页
参照GenBank中盖他病毒株E2蛋白氨基酸序列并进行密码子优化后,人工合成该基因,并将其定向克隆到表达载体pGEX-4T-1中,经酶切及测序鉴定均正确后,转化宿主菌BL21(DE3)进行IPTG诱导表达。以该表达蛋白作为诊断抗原,建立了检测猪盖他病... 参照GenBank中盖他病毒株E2蛋白氨基酸序列并进行密码子优化后,人工合成该基因,并将其定向克隆到表达载体pGEX-4T-1中,经酶切及测序鉴定均正确后,转化宿主菌BL21(DE3)进行IPTG诱导表达。以该表达蛋白作为诊断抗原,建立了检测猪盖他病毒抗体的E2-ELISA方法,并对临床血清样品进行检测。结果显示,重组表达的E2蛋白具有良好的抗原性和特异性。用建立的间接ELISA检测471份临床血清样品,检出抗体阳性119份,阳性率为25.27%。结果表明,本研究制备的重组E2蛋白具有良好的免疫原性,可应用于ELISA等相关检测方法的建立。 展开更多
关键词 盖他病毒 E2蛋白 原核表达 间接ELISA
脑心肌炎病毒及其蛋白结构和功能研究进展 预览 被引量:6
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作者 静静 冯若飞 马忠仁 《动物医学进展》 CSCD 北大核心 2012年第2期 67-70,共4页
脑心肌炎病毒(EMCV)是一种重要的人畜共患病病原,高危感染动物是猪,自然宿主是啮齿动物,人也可以感染这种病毒。也有研究报道,病毒可分解为前体蛋白P1、P2、P 3和L蛋白,最终切割成11个蛋白终产物,其中VP1蛋白存在主要抗原表位,具有良... 脑心肌炎病毒(EMCV)是一种重要的人畜共患病病原,高危感染动物是猪,自然宿主是啮齿动物,人也可以感染这种病毒。也有研究报道,病毒可分解为前体蛋白P1、P2、P 3和L蛋白,最终切割成11个蛋白终产物,其中VP1蛋白存在主要抗原表位,具有良好的中和作用。目前尚不能阐明病毒感染后的发病机制,宿主感染病毒的影响因素等。因此,对病毒特性进行的研究有助于对该病的预防及控制,对病毒基因组及它所编码蛋白的结构与功能的研究对新型疫苗及动物机体的抗感染免疫机制的研究有重要的生物学作用。论文综述了脑心肌炎病毒基因组结构及其编码蛋白的结构和功能。 展开更多
关键词 脑心肌炎病毒 蛋白 结构 功能
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脑心肌炎疫苗研究进展 预览 被引量:1
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作者 静静 于国伟 《动物医学进展》 CSCD 北大核心 2012年第8期74-76,共3页
脑心肌炎主要是由脑心肌炎病毒引起的一种急性传染病,危及多种动物和人,对人类生命健康和经济发展造成了较大的危害。国外对于该病已经有了有效的疫苗,对于该病毒的研究也主要集中在病毒的致病机制方面。国内还没有研制出安全有效的... 脑心肌炎主要是由脑心肌炎病毒引起的一种急性传染病,危及多种动物和人,对人类生命健康和经济发展造成了较大的危害。国外对于该病已经有了有效的疫苗,对于该病毒的研究也主要集中在病毒的致病机制方面。国内还没有研制出安全有效的疫苗,而须采用进口疫苗,致使免疫猪的代价太大,因而难以推广。随着以疫苗免疫为主的防控措施逐渐受到关注,基因工程疫苗成为脑心肌炎疫苗研究的热点。论文就脑心肌炎疫苗的应用现状和新型疫苗的研发情况进行综述。 展开更多
关键词 脑心肌炎病毒 分子结构 疫苗
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脑心肌炎病毒抗体双抗原夹心ELISA检测方法的建立及初步应用 被引量:3
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作者 樊得英 冯若飞 +4 位作者 李向茸 张海霞 静静 沈心亮 马忠仁 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2012年第1期 104-107,共4页
目的建立脑心肌炎病毒(Encephalomyocarditisvirus,EMCV)抗体双抗原夹心ELISA检测方法,用于EMCV血清学调查及临床检测。方法采用EMCV基因重组蛋白VPl、VP2和2c作为包被抗原,HRP标记EMCV作为酶标抗原,建立EMCV抗体双抗原夹心ELISA... 目的建立脑心肌炎病毒(Encephalomyocarditisvirus,EMCV)抗体双抗原夹心ELISA检测方法,用于EMCV血清学调查及临床检测。方法采用EMCV基因重组蛋白VPl、VP2和2c作为包被抗原,HRP标记EMCV作为酶标抗原,建立EMCV抗体双抗原夹心ELISA检测方法;用内部参考血清对建立的方法进行评价,并与间接ELISA法进行比较;采用所建立的方法对1475份人血清和1309份猪血清进行检测。结果建立的双抗原夹心ELISA法的最佳抗原包被浓度为7.5斗g/ml,封闭液为10%马血清或2%鱼蛋白胨,酶标抗原稀释度为1:400。该方法的批内和批间变异系数均小于10%;热稳定性较好;与间接ELISA法检测结果的符合率为93.5%。应用建立的方法检测人血清和猪血清中的EMCV抗体阳性率分别为16.8%和63.4%。结论已建立了EMCV抗体双抗原夹心ELISA检测方法,该方法可靠、稳定、特异、敏感、操作简便,为EMCV抗体的临床检测提供了有效的技术手段。 展开更多
关键词 脑心肌炎病毒 抗体 酶联免疫吸附测定
乙型脑炎病毒E蛋白基因真核表达载体pEGFP-C1-JEV的构建及在BHK-21细胞中表达
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作者 冯若飞 张晓媛 +6 位作者 林贵鸿 乔自林 静静 李向茸 张海霞 樊得英 马忠仁 《中华微生物学和免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2012年第7期600-605,共6页
目的构建乙脑病毒E蛋白基因片段的真核表达载体pEGFP-C1-JEV,旨在研究E蛋白基因在BHK-21细胞中的瞬时表达情况,为进一步深入研究提供基础资料。方法通过liT—PCR扩增目的基因,酶切并重组后成功构建绿色荧光蛋白标记的pEGrP—C1-JEV... 目的构建乙脑病毒E蛋白基因片段的真核表达载体pEGFP-C1-JEV,旨在研究E蛋白基因在BHK-21细胞中的瞬时表达情况,为进一步深入研究提供基础资料。方法通过liT—PCR扩增目的基因,酶切并重组后成功构建绿色荧光蛋白标记的pEGrP—C1-JEV重组表达载体,利用脂质体介导将重组质粒转染BHK-21细胞,观察绿色荧光标记蛋白表达情况,同时提取细胞RNA,检查目的基因转录表达情况,并利用免疫组化和Westernblot法检测目的基因表达情况、表达蛋白在细胞中的定位以及表达蛋白抗原性。结果重组质粒pEGrP—C1-JEV构建成功,转染至BHK-21细胞中,绿色荧光标记蛋白正常表达,表达率较高,RT-PCR表明目的基因在BHK-21正常转录并表达,表达蛋白主要分布在BHK-21细胞的胞质和包膜中,且能与豚鼠抗JEV抗体特异性结合。结论pEGFP-C1-JEV质粒在BHK-21细胞中正常表达,且对细胞生长和形态不产生影响,真核表达抗原具有良好的抗原性,本研究可为进一步探讨乙型脑炎E蛋白基因体外真核表达及其功能和应用的研究提供基础资料。 展开更多
关键词 乙型脑炎病毒 E蛋白基因 绿色荧光蛋白 真核表达
脑心肌炎病毒VP1结构蛋白的可溶性表达及鉴定 被引量:4
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作者 李向茸 冯若飞 +4 位作者 静静 张海霞 韦鹏建 樊得英 马忠仁 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2011年第6期557-561,共5页
为获得可溶性表达的脑心肌炎病毒(EMCV)结构蛋白VP1片段,将EMCV VP1基因克隆到原核表达载体pGEX-4T-1中,并转化大肠杆菌BL21(DE3)表达菌中。采用不同温度、不同IPTG浓度及不同诱导时间诱导目的蛋白表达,以筛选VP1融合蛋白可溶性表... 为获得可溶性表达的脑心肌炎病毒(EMCV)结构蛋白VP1片段,将EMCV VP1基因克隆到原核表达载体pGEX-4T-1中,并转化大肠杆菌BL21(DE3)表达菌中。采用不同温度、不同IPTG浓度及不同诱导时间诱导目的蛋白表达,以筛选VP1融合蛋白可溶性表达的最佳条件,并通过Western-blotting检测最佳条件下表达蛋白的免疫活性。PCR、酶切鉴定及测序结果表明,VP1基因已克隆入pGEX-4T-1质粒。经优化,确定VP1融合蛋白可溶性表达的最佳条件为:当D600nm值为0.4~0.6时,以0.25mmol/L IPTG于25℃条件下诱导表达12h。Western-blotting结果显示,诱导表达的蛋白具有免疫活性。 展开更多
关键词 脑心肌炎病毒 VP1基因 可溶性表达 原核表达
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