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“模块化小组讨论”在动物胚胎工程教学中的应用 预览
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作者 潘阳阳 王萌 +4 位作者 刘犇 王立斌 余四九 徐庚全 《宜春学院学报》 2019年第3期108-111,共4页
动物胚胎工程是《兽医生物技术》课程的核心内容,是理论知识转化为实践知识连接的桥梁。目前该内容在本科教学中面临诸多困难,如理论知识抽象难懂,学生不能学以致用。如何通过改进动物胚胎工程的教学模式和方法,促进学生对该内容的理解... 动物胚胎工程是《兽医生物技术》课程的核心内容,是理论知识转化为实践知识连接的桥梁。目前该内容在本科教学中面临诸多困难,如理论知识抽象难懂,学生不能学以致用。如何通过改进动物胚胎工程的教学模式和方法,促进学生对该内容的理解、记忆和学以致用是该内容教学面临的主要问题。本文将模块化小组讨论的教学模式应用于动物胚胎工程的教学中,通过教师对学生讨论过程的评价、作业评阅成绩和学生对模块式小组讨论的满意度调查3个指标评价教学效果,以期能够克服学生学习该课程的困难,为改善教学质量、提高教学效果提供参考。 展开更多
关键词 动物胚胎工程 教学内容模块化 小组讨论
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牦牛源干燥棒状杆菌的分离与鉴定 预览
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作者 温峰琴 项海涛 +3 位作者 郝宝成 邢小勇 胡永浩 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第1期227-232,共6页
一只牦牛屠宰后肝有干酪样结节,为了探究其形成原因,本研究对该牦牛肝进行细菌的分离培养,对所分离可疑致病菌的16SrRNA以及rpoB基因序列进行扩增和序列分析,并用Vitek2全自动微生物鉴定仪进行生化表型的鉴定,用K-B法进行药敏试验。结... 一只牦牛屠宰后肝有干酪样结节,为了探究其形成原因,本研究对该牦牛肝进行细菌的分离培养,对所分离可疑致病菌的16SrRNA以及rpoB基因序列进行扩增和序列分析,并用Vitek2全自动微生物鉴定仪进行生化表型的鉴定,用K-B法进行药敏试验。结果显示,经细菌分离培养得到一株革兰阳性、棒状、可疑致病菌;其16SrRNA扩增片段大小1483bp,GenBank序列编号为MH000696,该菌的16SrRNA与干燥棒状杆菌GD34株(KF928790.1)等的相似性最高,序列一致性为99%,系统进化树显示,本菌与干燥棒状杆菌在同一进化分支上;rpoB基因扩增片段大小434bp,GenBank序列编号为MH006608;Vitek2全自动微生物鉴定仪鉴定为变异库克菌,可信度为93%。该菌对妥布霉素、氨曲南、头孢哌酮、米诺环素等多种药物高度敏感。综上所述,分离的细菌为干燥棒状杆菌,但基因序列,如rpoB等以及生化表型均存在一定程度的变异,本研究为兽医临床上该菌的分离和鉴定提供了依据,且为该菌的致病性研究奠定了基础。 展开更多
关键词 干燥棒状杆菌 16SrRNA RPOB 生化试验 药敏试验
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牛支原体临洮分离株NOX-1的克隆表达、酶学活性及其亚细胞定位研究 预览
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作者 李丹 张志雄 +1 位作者 邢小勇 《中国动物传染病学报》 CAS 北大核心 2019年第3期57-64,共8页
为研究牛支原体(M. bovis)临洮分离株(LT strain)NOX-1基因特征表达产物的酶活性,及其在细胞中的具体存在部位,参照GenBank中M. bovis NOX-1HuBei株NOX-1基因序列(GenBank登录号:NC015725.1)设计引物,应用PCR扩增M.bovis临洮株的NOX-1基... 为研究牛支原体(M. bovis)临洮分离株(LT strain)NOX-1基因特征表达产物的酶活性,及其在细胞中的具体存在部位,参照GenBank中M. bovis NOX-1HuBei株NOX-1基因序列(GenBank登录号:NC015725.1)设计引物,应用PCR扩增M.bovis临洮株的NOX-1基因,在完成测序后构建NOX-1基因原核表达载体pET-NOX-1,并转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后表达。表达产物纯化后进行酶活测定并免疫新西兰兔,制备多克隆抗体,继而应用Western blot及间接ELISA对NOX-1在M. bovis内的分布进行初步定位。结果显示,M. bovis临洮株NOX-1基因全长1365 bp,重组质粒经IPTG诱导在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达,重组蛋白His-NOX-1的分子量约为50 kDa;重组蛋白酶促反应最适酶促温度为30℃、pH为7.5,双倒数法求得重组蛋白Km和Vmax分别为256.41μmol/L、34.25μmol/(L·min);Western blot及间接ELISA结果表明His-NOX-1在M. bovis细胞膜上和细胞浆中均有分布且胞浆含量较高。本研究结果为进一步研究M. bovisNOX-1的生物学功能奠定了一定的基础。 展开更多
关键词 牛支原体 NOX-1基因 亚细胞定位 免疫原性
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PPRV武威分离株N基因的原核表达及免疫原性分析
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作者 王雯 +4 位作者 邢小勇 胡荣斌 丁小琴 伏小平 薛慧文 《农业生物技术学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第8期1478-1484,共7页
小反刍兽疫(Peste des petits ruminants, PPR)是由小反刍兽疫病毒(Peste des petits ruminants virus,PPRV)引起的一种急性传染病,严重危害世界养羊业的健康发展。2013年以来,国内多地出现小反刍兽疫疫情,给我国养羊业造成了重大经济... 小反刍兽疫(Peste des petits ruminants, PPR)是由小反刍兽疫病毒(Peste des petits ruminants virus,PPRV)引起的一种急性传染病,严重危害世界养羊业的健康发展。2013年以来,国内多地出现小反刍兽疫疫情,给我国养羊业造成了重大经济损失。本研究根据小反刍兽疫病毒Nigeria 75/1株N基因核苷酸序列(GenBank No. HQ197753)设计特异性引物,扩增获得PPRV武威分离株N基因全序列(GenBank No. KY429031),在序列分析的基础上,构建该基因的原核表达载体pET-PPRV-N,并将其转化大肠杆菌(Escherichia coli) Rosetta (DE3)后诱导表达。纯化表达产物,免疫Balb/C小鼠(Mus musculus)制备多克隆抗体,进而应用ELISA、Western blot和免疫荧光检测(immunological fluorescence assay, IFA)对PPRV N蛋白的免疫原性进行分析。结果表明,PPRV武威分离株属于Ⅳ系,且其N基因全序列与国内24株PPRV分离株及2016蒙古株的同源性高达99.0%;重组蛋白His-PPRV-N在大肠杆菌Rosetta (DE3)中成功获得表达,其相对分子质量约为57.8 kD,且主要以可溶性形式存在;ELISA、Western blot及IFA结果显示,重组蛋白小鼠多抗ELISA效价可达1∶64 000,可与PPRV疫苗株或武威分离株的N蛋白特异性结合,且制备的多抗显示出对PPRV明显的中和作用,表明了重组蛋白良好的免疫原性。本研究结果为PPRV检测方法的建立和N蛋白生物学功能的进一步研究提供了基础资料。 展开更多
关键词 小反刍兽疫病毒(PPRV) N基因 原核表达 免疫原性
肺炎克雷伯菌榆中分离株 OmpK17基因的克隆、生物信息学分析及免疫原性研究 预览
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作者 程家海 殷娟斌 +3 位作者 白珊泽 田泽暘 庞红红 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2019年第5期1456-1465,共10页
试验旨在研究肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae)外膜蛋白OmpK17基因序列特征及其免疫原性。参照GenBank中肺炎克雷伯菌外膜蛋白OmpK17基因序列(登录号:U52843.1)设计1对特异性引物,应用PCR技术扩增获得了肺炎克雷伯菌榆中分离株(YZ株)... 试验旨在研究肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae)外膜蛋白OmpK17基因序列特征及其免疫原性。参照GenBank中肺炎克雷伯菌外膜蛋白OmpK17基因序列(登录号:U52843.1)设计1对特异性引物,应用PCR技术扩增获得了肺炎克雷伯菌榆中分离株(YZ株)OmpK17基因CDS序列,应用相关软件及程序对OmpK17基因核苷酸序列及其推导的氨基酸序列进行生物信息学分析,构建其原核表达载体pET-OmpK17,并在大肠杆菌BL21(DE3)中进行了表达。表达产物纯化后免疫新西兰兔制备多抗血清,应用ELISA和Westernblotting分析了重组蛋白的免疫原性。结果显示,肺炎克雷伯菌YZ株外膜蛋白OmpK17基因高度保守,其CDS序列全长513bp,编码170个氨基酸,与GenBank中其他肺炎克雷伯菌OmpK17基因序列同源性均高于99.6%;OmpK17蛋白分子质量约为18.5ku,具有较强的亲水性,含有1个信号肽、1个跨膜区和6个抗原决定簇区域,是一种具有桶状三维结构的跨膜蛋白。SDS-PAGE结果显示,OmpK17基因在大肠杆菌中获得表达且表达产物主要以包涵体形式存在。ELISA及Westernblotting结果表明,肺炎克雷伯菌OmpK17蛋白具有良好的免疫原性。本研究克隆和表达了肺炎克雷伯菌OmpK17基因及其编码蛋白,并证实该蛋白具有良好的免疫原性,为OmpK17基因的生物学特性研究和肺炎克雷伯菌检测方法的建立奠定了基础,为肺炎克雷伯菌基因工程疫苗的研发提供了理论依据。 展开更多
关键词 肺炎克雷伯菌 OmpK17基因 克隆 生物信息学 原核表达 免疫原性
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临泽县牛羊布氏杆菌病的流行病学调查与血清学检测 预览
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作者 王耀东 《畜牧兽医杂志》 2019年第1期58-60,共3页
为预防临泽县牛羊布氏杆菌病的发生,采用问卷调查和血清学检测的方法对临泽县7个乡镇的奶牛和肉羊养殖情况以及布氏杆菌病的流行情况进行调查。结果发现,本县养殖方式主要是圈养或圈养及放养,养殖户对布病危害和相关法规政策认识不足,... 为预防临泽县牛羊布氏杆菌病的发生,采用问卷调查和血清学检测的方法对临泽县7个乡镇的奶牛和肉羊养殖情况以及布氏杆菌病的流行情况进行调查。结果发现,本县养殖方式主要是圈养或圈养及放养,养殖户对布病危害和相关法规政策认识不足,防护消毒措施不重视。在采集的1280份奶牛血样和23115份羊血样中,牛阳性率达0.23%,羊阳性率达0.52%。根据调查结果,提出布病防控的建议和措施。 展开更多
关键词 临泽县 牛羊 布氏杆菌病 流行病学 调查
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牛支原体武威分离株eno基因的克隆、表达及酶活测定
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作者 高翔 王昱茜 +2 位作者 邢小勇 魏彦明 《农业生物技术学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第5期936-942,共7页
牛支原体(Mycoplasma bovis, Mb)是引起肉牛(Bos taurus)和奶牛疾病的重要病原之一,给养牛业造成了重大的经济损失。烯醇化酶(enolase, eno)为糖酵解途径的关键限速酶,主要催化2-磷酸甘油酸转化为磷酸烯醇式丙酮酸。为研究Mb eno酶促活... 牛支原体(Mycoplasma bovis, Mb)是引起肉牛(Bos taurus)和奶牛疾病的重要病原之一,给养牛业造成了重大的经济损失。烯醇化酶(enolase, eno)为糖酵解途径的关键限速酶,主要催化2-磷酸甘油酸转化为磷酸烯醇式丙酮酸。为研究Mb eno酶促活性及其动力学参数,本研究参照GenBank中Mb PG45株eno基因(NC_014760.1)序列设计特异性引物,应用PCR扩增获得Mb武威分离株的eno基因。在序列分析及基因优化的基础上,构建其原核表达载体pET-eno并转化大肠杆菌(Escherichia coli)表达菌Transetta (DE3),经异丙基硫代半乳糖苷(isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside, IPTG)诱导表达,在十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl dulfate polyacrylamide gel electropheresis, SDS-PAGE)分析的基础上,纯化表达产物对其酶促活性进行分析。结果表明,优化后的Mb武威株eno基因在大肠杆菌中成功获得表达,重组蛋白His-eno大小约为53 kD,且主要以可溶性蛋白形式存在;酶活分析结果显示:纯化产物His-eno的催化活性略高于兔肌肉烯醇化酶,且其最适温度为42 ℃,最适pH为8.0。双倒数作图所得His-eno米氏常数(Km)和最大反应速率(Vmax)分别为4.1×10^-3 mol/L和3.4 μmol/(L·min)。本研究结果为进一步研究Mb eno的生物学功能提供基础资料。 展开更多
关键词 牛支原体 烯醇化酶 原核表达 酶活性
产苦马豆素疯草内生真菌U.oxytropis的发酵培养及苦马豆素检测方法的建立
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作者 宋向东 郝宝成 +7 位作者 梁剑平 续文君 王保海 刘建枝 夏晨阳 邢小勇 胡永浩 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第2期328-336,共9页
通过对生长初期疯草内生真菌U.oxytropis菌丝复苏后连续培养32d,每隔4d取样1次,并设3个平行培养组,测定其不同培养时期菌丝干重变化,利用超声减压旋蒸法提取菌丝和发酵液中苦马豆素(SW),并分别利用薄层层析法、气相色谱法和α-甘露糖苷... 通过对生长初期疯草内生真菌U.oxytropis菌丝复苏后连续培养32d,每隔4d取样1次,并设3个平行培养组,测定其不同培养时期菌丝干重变化,利用超声减压旋蒸法提取菌丝和发酵液中苦马豆素(SW),并分别利用薄层层析法、气相色谱法和α-甘露糖苷酶抑制法对菌丝、发酵液中SW含量进行测定。结果显示,经测定疯草内生真菌U.oxytropis菌丝干重质量,确定疯草内生真菌U.oxytropis生长周期为24d;薄层层析法、气相色谱法和α-甘露糖苷酶抑制法都可快速对菌丝和发酵液中提取的SW进行定性、定量检测,并比较3种检测方法,发现气相色谱法检测限低、灵敏度更高。本试验完成了疯草内生真菌U.oxytropis生长周期的测定,并建立了菌丝、发酵液中SW的有效、快速提取及检测方法,为下一步产苦马豆素疯草内生真菌U.oxytropis生物合成机理的研究奠定基础。 展开更多
关键词 疯草内生真菌U.oxytropis 苦马豆素 生长周期 α-甘露糖苷酶抑制法
牦牛漫游球菌的分离与生物学特性鉴定
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作者 温峰琴 项海涛 +3 位作者 郝宝成 邢小勇 胡永浩 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第3期421-425,共5页
为探究1只牦牛屠宰后肝脏有干酪样结节形成的原因,对肝脏进行细菌的分离培养,对分离到的1株细菌的16S rRNA和16S~23S rRNA基因序列用通用引物扩增和并用NCBI blast和MEGA 7进行序列分析,并用Vitek 2全自动微生物鉴定仪进行生化表型的鉴... 为探究1只牦牛屠宰后肝脏有干酪样结节形成的原因,对肝脏进行细菌的分离培养,对分离到的1株细菌的16S rRNA和16S~23S rRNA基因序列用通用引物扩增和并用NCBI blast和MEGA 7进行序列分析,并用Vitek 2全自动微生物鉴定仪进行生化表型的鉴定,用K-B法进行药敏试验,结果显示:该菌的16S rRNA为1 524 bp,NCBI GenBank登录号为MG753544.1,与水獭漫游球菌的同源性较高,16S~23S rRNA有大小不同的2个片段,分别为522,425 bp,NCBI GenBank登录号分别为MG758122.1和MG758123.1。Vitek 2全自动微生物鉴定仪鉴定为迟缓葡萄球菌。该菌对妥布霉素、头孢哌酮、米诺环素等多种药物高度敏感,对苯唑西林、头孢西丁有抗性。结果表明,分离出的细菌为漫游球菌,该菌是否具有致病性还有待进一步试验验证。 展开更多
关键词 漫游球菌 16SrRNA 16S~23S RRNA 生化试验 药敏试验
兔出血症病毒GS/YZ分离株VP60截段基因的原核表达及免疫效力评价
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作者 安凯 孔惠萍 +2 位作者 邢小勇 温峰琴 《农业生物技术学报》 CSCD 北大核心 2018年第5期861-870,共10页
兔(Lepus)出血症病毒(Rabbit hemorrhagic disease virus, RHDV)属杯状病毒科(Caliciviridae)兔病毒属(Lagovirus)。VP60为RHDV的衣壳蛋白与免疫原性蛋白,且其抗原表位区主要集中在N端。本研究应用反转录(reverse transcripti... 兔(Lepus)出血症病毒(Rabbit hemorrhagic disease virus, RHDV)属杯状病毒科(Caliciviridae)兔病毒属(Lagovirus)。VP60为RHDV的衣壳蛋白与免疫原性蛋白,且其抗原表位区主要集中在N端。本研究应用反转录(reverse transcription-PCR, RT-PCR)扩增获得VP60截段基因并将其亚克隆至pMD20-T,构建原核表达质粒pET-RHDV-VP60。转化大肠杆菌(Escherichia coli) Rosetta(DE3)后经异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside, IPTG)诱导表达,表达产物纯化后免疫Balb/C小鼠(Mus musculus)制备多抗,进而应用间接酶联免疫吸附试验(indirect enzyme linked immunosorbent assay, iELISA)和Western-blot对重组蛋白免疫原性进行分析。用混有弗氏佐剂的重组蛋白、商品苗、RHDV GS/YZ灭活苗、磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline, PBS)分别注射易感兔,14 d后重组蛋白组加强免疫1次,21 d后用HA(hemagglutination)效价为210的RHDV GS/YZ肝脏悬液全部攻毒,观察14 d,并记录结果。结果表明:RHDV GS/YZ株VP60截段基因与RHDV HB株(登录号:KU207100.1)和RHDV WX株(登录号:AF402614.1)同源性最高,达98.6%;RHDV GS/YZ株VP60截段氨基酸序列与与RHDV WX株(登录号:AF402614.1)和RHDV Mexico 89株(登录号:AF295785.1)同源性最高,达99.1%;RHDV GS/YZ株VP60截段片段在Rosetta(DE3)中成功获得表达,且以包涵体形式存在;iELISA测定制备的多克隆抗体效价为1∶32 000;Western-blot结果显示,重组蛋白具有良好的免疫原性;免疫保护实验表明,免疫组在攻毒后全部存活,保护率为100%,商品苗血凝抑制效价为25~28,自制灭活苗为25~26,重组蛋白加佐剂为24~25,而只注射了PBS的对照组在攻毒后的96 h全部死亡,表明大肠杆菌表达的VP60截段蛋白在混有弗氏佐剂后能够完全抵抗RHDV强毒的攻击。研究结果为RHD亚单位疫苗的研发及其快速诊断方 展开更多
关键词 兔出血症病毒(RHDV) VP60截段基因 原核表达 免疫原性 免疫效力
牛支原体生物被膜形成优势菌株的筛选及培养条件的优化
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作者 高翔 邢小勇 +4 位作者 伏小平 温峰琴 薛慧文 魏彦明 《农业生物技术学报》 CSCD 北大核心 2018年第8期1449-1456,共8页
牛支原体(Mycoplasma bovis, Mb)是牛(Bos taurus)的重要致病性支原体,其生物被膜的形成在宿主细胞中产生持续性感染,使养牛业造成重大的经济损失。因此,本研究旨在通过对Mb不同菌株生物被膜形成能力的鉴定,筛选出1株生物被膜... 牛支原体(Mycoplasma bovis, Mb)是牛(Bos taurus)的重要致病性支原体,其生物被膜的形成在宿主细胞中产生持续性感染,使养牛业造成重大的经济损失。因此,本研究旨在通过对Mb不同菌株生物被膜形成能力的鉴定,筛选出1株生物被膜形成优势菌株,并对其培养条件进行优化,以期为Mb生物被膜相关的研究提供生物材料。首先应用微孔板定量检测法鉴定Mb PG45株、湖北株(HB株)、武威株(WW株)、定西株(DX株)和临洮株(LT株)生物被膜的形成能力;进而以生物被膜形成能力强的菌株作为模式菌株,完成对Mb生物被膜形成培养条件的优化。结果显示,Mb不同菌株形成生物被膜的能力不同,其中临洮株生物被膜形成能力最强,湖北株生物被膜形成能力次之,PG45株、武威株和定西株生物被膜形成能力最弱。取浓度为1.7E+08 CFU/mL的Mb液体培养物,按1∶10转接种于含0.01 mg/mL DNA、20%马血清和1%葡萄糖的Eaton培养基(pH 8.5),于37 ℃、5% CO2条件下培养72 h,Mb生物被膜的形成最佳。本研究筛选获得1株生物被膜形成能力强的Mb,并通过培养条件的优化,使之形成稳定且明显的生物被膜,从而为Mb生物被膜相关研究提供了良好的生物材料。 展开更多
关键词 牛支原体(Mb) 生物被膜 优势菌株 影响因素 优化
猪支气管败血波氏杆菌生物被膜态和常规培养比较蛋白组学分析
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作者 宁建刚 高翔 +5 位作者 肖敏 冯娜 温峰琴 邢小勇 胡永浩 《农业生物技术学报》 CSCD 北大核心 2018年第1期159-166,共8页
猪支气管败血波氏杆菌(Bordetella bronchiseptica, Bb)是引起猪萎缩性鼻炎(Swine infectious atrophic rhinitis, AR)的病原之一;本研究首先对支气管败血波氏杆菌生物被膜的形成条件进行优化,结果表明,培养时间为24 h、NaCl 浓... 猪支气管败血波氏杆菌(Bordetella bronchiseptica, Bb)是引起猪萎缩性鼻炎(Swine infectious atrophic rhinitis, AR)的病原之一;本研究首先对支气管败血波氏杆菌生物被膜的形成条件进行优化,结果表明,培养时间为24 h、NaCl 浓度为0.4%、pH为7.5、乳糖浓度为0.5%是支气管败血波氏杆菌生物被膜形成的最适条件。进而利用比较蛋白质组学方法,研究了生物被膜态和常规培养下全菌蛋白的表达差异,明确差异蛋白的功能。通过双向电泳(two-dimensional gel electrophoresis, 2-DE)比较了两种状态下全菌蛋白的表达差异,结果发现在生物被膜态的全菌蛋白中,有15个蛋白点表达上调,9个蛋白点表达下调。经质谱鉴定,上调的蛋白点主要有延伸因子(elongation factor Tu, EF-Tu)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、分子伴侣(molecular chaperone)等,功能主要体现在应激、调控、代谢方面。该结果从蛋白质水平上深化了对Bb生物被膜形成机制的理解,并为AR的防控和深入研究提供参考。 展开更多
关键词 支气管败血波氏杆菌 比较蛋白组学 生物被膜态 常规培养
牛支原体pdhc基因的克隆、表达及其亚细胞定位 预览
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作者 张懿 邢小勇 +1 位作者 温峰琴 《中国畜牧兽医》 北大核心 2018年第9期2377-2385,共9页
试验旨在研究牛支原体(Mycoplasma bovis,M.bovis)武威株二氢硫辛酰胺转乙酰酶(PDHc-E2)基因序列特征及其在牛支原体细胞中的位置。参照GenBank中牛支原体HB0801株pdhc基因(登录号:CP002058.1)设计引物,应用PCR扩增获得牛支原体武威株p... 试验旨在研究牛支原体(Mycoplasma bovis,M.bovis)武威株二氢硫辛酰胺转乙酰酶(PDHc-E2)基因序列特征及其在牛支原体细胞中的位置。参照GenBank中牛支原体HB0801株pdhc基因(登录号:CP002058.1)设计引物,应用PCR扩增获得牛支原体武威株pdhc基因,在测序及序列分析的基础上,应用Overlap PCR完成点突变后将其克隆至pET-28a(+)中,构建原核表达载体pET-pdhc。pET-pdhc转化大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞后经IPTG诱导获得融合蛋白,将纯化蛋白免疫新西兰兔制备多抗血清,应用iELISA和Western blotting对牛支原体武威株PDHc-E2在细胞内的分布进行初步研究。结果显示,牛支原体武威株pdhc基因CDS全长735 bp,编码244个氨基酸,与国内牛支原体分离株HB0801、Hubei-1、CQ-W70、NM2012等基因序列完全一致,与国际标准株PG45同源性为99.2%,与无乳支原体(M.agalactiae)同源性为90.9%~91.2%,与加利福尼亚支原体(M.californicum)ST6株的同源性仅为78.4%,基因序列非常保守;通过Overlap PCR将该基因中4个编码色氨酸的TGA密码子突变为TGG,且完成点突变后的基因在大肠杆菌中成功表达,重组蛋白大小约为29 ku,主要以可溶性形式存在,iELISA结果显示,重组蛋白PDHc-E2具有较高的免疫原性,可刺激新西兰兔产生高水平的抗体,血清效价高达1∶100 000;亚细胞定位结果表明,制备的多抗血清与重组蛋白PDHc-E2、牛支原体全菌蛋白、牛支原体膜蛋白、牛支原体胞浆蛋白均能发生特异性结合,说明该蛋白在牛支原体细胞膜和细胞质中均有分布,为膜相关蛋白,但在细胞质中的分布多于细胞膜。本研究结果为进一步研究牛支原体的生物学功能提供了理论依据。 展开更多
关键词 牛支原体 二氢硫辛酰胺转乙酰酶 原核表达 亚细胞定位
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猪支气管败血波氏杆菌外膜蛋白OmpQ基因的克隆表达及多抗血清的制备
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作者 宁建刚 冯娜 +5 位作者 肖敏 高翔 温峰琴 邢小勇 胡永浩 《中国兽医学报》 CSCD 北大核心 2018年第6期1114-1118,共5页
为研究猪源性支气管败血波氏杆菌外膜蛋白OmpQ的功能及免疫原性,本研究参照GenBank中支气管败血波氏杆菌S798株的外膜蛋白OmF·Q基因序列设计引物,通过PCR扩增技术获得OmpQ基因,测序后进行同源性分析,并将其克隆至pET-28a(+... 为研究猪源性支气管败血波氏杆菌外膜蛋白OmpQ的功能及免疫原性,本研究参照GenBank中支气管败血波氏杆菌S798株的外膜蛋白OmF·Q基因序列设计引物,通过PCR扩增技术获得OmpQ基因,测序后进行同源性分析,并将其克隆至pET-28a(+)载体,构建重组质粒pET-OmpQ,转化大肠杆菌Transetta(DE3),经IPTG诱导表达纯化目的蛋白免疫昆明小鼠制备多克隆抗体,Western blot分析其免疫原性。结果显示,表达蛋白相对分子质量大小约为36000,且以包涵体的形式存在。间接ELISA和Western blot结果表明,表达产物具有较好的免疫原性。研究结果为支气管败血波氏杆菌外膜蛋白OmpQ的后续生物学功能研究奠定基础,并为支气管败血波氏杆菌的快速诊断提供数据支持。 展开更多
关键词 支气管败血波氏杆菌 外膜蛋白OmpQ 多克隆抗体
小反刍兽疫病毒甘肃株F基因的克隆、原核表达及多克隆抗体的制备 被引量:2
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作者 肖敏 +2 位作者 邢小勇 常惠芸 薛慧文 《农业生物技术学报》 CAS CSCD 北大核心 2017年第3期477-484,共8页
小反刍兽疫(peste des petits ruminants, PPR)是由副黏病毒科(Paramyxoviridae)麻疹病毒属(Morbillivirus)的小反刍兽疫病毒(Peste des petits ruminants virus, PPRV)引起绵羊(Ovis aries)和山羊(Capra hircus)等小反刍... 小反刍兽疫(peste des petits ruminants, PPR)是由副黏病毒科(Paramyxoviridae)麻疹病毒属(Morbillivirus)的小反刍兽疫病毒(Peste des petits ruminants virus, PPRV)引起绵羊(Ovis aries)和山羊(Capra hircus)等小反刍兽的一种急性和高度传染性病毒性疾病,由于其高死亡率常造成绵羊和山羊养殖业的重大经济损失。为研究小反刍兽疫病毒甘肃(GS)株融合蛋白(fusion protein)基因序列特征及其免疫原性,参照GenBank中PPRV Nigeria 75/1株F基因序列(GenBank登录号: HQ197753)设计引物,应用RT-PCR扩增PPRV GS株F基因,在测序及序列分析的基础上,设计引物扩增去信号肽和跨膜区的F基因片段Fa并将其亚克隆至原核表达载体pET-32a(+)。重组质粒pET-PPRV-Fa转化大肠杆菌表达菌(Escherichia coli)Transetta(DE3)后经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside, IPTG)诱导表达,表达产物纯化后免疫新西兰兔(Oryctolagus cuniculus)制备多克隆抗体,进而应用间接酶联免疫吸附实验(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)和Western blot对重组蛋白免疫原性进行分析。结果表明,PPRV GS株F基因(GenBank登录号: KX822738)完整CDS全长1 641 bp,编码546个氨基酸。去信号肽和跨膜区的F基因片段Fa在大肠杆菌中成功获得表达,重组蛋白大小约为59 kD,且主要以包涵体形式存在;间接ELISA和Western blot结果表明,纯化产物免疫原性良好。研究结果为F蛋白的相关功能研究及小反刍兽疫的快速诊断方法的建立提供了理论依据。 展开更多
关键词 小反刍兽疫病毒(PPRV) F基因 克隆 原核表达 免疫原性
牛支原体武威株fba基因的克隆、表达及亚细胞定位 被引量:1
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作者 高翔 邢小勇 +3 位作者 冯娜 薛慧文 温峰琴 《农业生物技术学报》 CAS CSCD 北大核心 2017年第2期274-281,共8页
牛支原体(Mycoplasma bovis,Mb)是牛(Bos taurus)的一种重要致病性支原体,其感染可引起牛的多种疾病。果糖二磷酸醛缩酶(fructose bisphosphate aldolase,FBA)是参与糖酵解过程中的关键酶,为3-磷酸甘油醛脱氢反应提供底物,... 牛支原体(Mycoplasma bovis,Mb)是牛(Bos taurus)的一种重要致病性支原体,其感染可引起牛的多种疾病。果糖二磷酸醛缩酶(fructose bisphosphate aldolase,FBA)是参与糖酵解过程中的关键酶,为3-磷酸甘油醛脱氢反应提供底物,并广泛存在于生物界中。为了研究FBA在Mb细胞内的分布,本研究参照GenBank中Mb PG45株加n基因序列设计特异性引物,应用PCR扩增获得Mb武威株加。基因并将其克隆至pMD19-T载体,在完成测序及基因优化的基础上,构建原核表达载体pET-fba并转化大肠杆菌(Escherichia coli)表达菌Transetta(DE3)后经异丙基硫代半乳糖苷(isopropyl β—D-1-thiogalactopyranoside,IPTG)诱导表达,表达产物纯化后免疫新西兰兔(Oryctolagus cuniculus)制备多克隆抗体,并采用间接酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbem assay,ELISA)测定抗体效价。进而应用Western blot对MbFBA在细胞内的分布进行了初步的定位。结果表明,Mb武威株fba基因编码框全长876bp(GenBank登录号:KX828563),编码292个氨基酸,优化后的基因在大肠杆菌中成功获得表达,重组蛋白rMbFBA大小约为34kD,主要以可溶性蛋白的形式存在;ELISA测定制备的多克隆抗体效价为1:25600,Western blot分析结果显示,该蛋白具有良好的免疫原性,且在Mb胞浆及膜表面均有分布。上述结果为进一步研究Mb FBA的生物学功能提供了理论依据。 展开更多
关键词 牛支原体 醛缩酶 原核表达 亚细胞定位
滑液支原体WVU1853株免疫相关膜蛋白的初步分析 预览 被引量:3
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作者 丁小琴 +3 位作者 邢小勇 伏小平 薛慧文 温峰琴 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2017年第2期316-323,共8页
膜蛋白是病原菌膜结构的主要组分,其不仅在病原菌的生命活动中具有重要的生理功能,且部分膜蛋白还与病原菌的感染及免疫应答密切相关。因此,本研究旨在应用免疫蛋白质组学方法分离、筛选并鉴定出滑液支原体免疫相关膜蛋白,以期为滑液支... 膜蛋白是病原菌膜结构的主要组分,其不仅在病原菌的生命活动中具有重要的生理功能,且部分膜蛋白还与病原菌的感染及免疫应答密切相关。因此,本研究旨在应用免疫蛋白质组学方法分离、筛选并鉴定出滑液支原体免疫相关膜蛋白,以期为滑液支原体感染和免疫机制的研究及相关疾病诊断和防治方法措施的建立奠定基础。笔者应用培养至对数生长中后期的滑液支原体(Mycoplasma synoviae,MS)WVU1853株全菌分别免疫鸡和新西兰兔,制备滑液支原体鸡多抗和兔多抗。提取滑液支原体WVU1853株的膜蛋白,应用二维电泳技术对其进行分离,继而应用所制多抗进行Western blot,筛选出免疫原性膜蛋白,并通过质谱分析进行鉴定。结果表明,在筛选的8个蛋白质点中,3个蛋白质点为延伸因子EF-Tu,其余蛋白质点分别是丙酮酸脱羧酶α亚基、β亚基、NADH氧化酶、组氨酰-tRNA合成酶和二氢硫辛酰胺脱氢酶。其中组氨酰-tRNA合成酶的质谱分析得分太低,尚需进一步验证,而丙酮酸脱羧酶α、β亚基与作为滑液支原体的免疫相关膜蛋白首次被证实。本研究筛选并初步鉴定出滑液支原体7种免疫相关膜蛋白,为深入研究目标蛋白质的生物学特性及新型亚单位疫苗和诊断试剂的研发奠定了基础。 展开更多
关键词 滑液支原体 免疫蛋白质组学 膜蛋白 鉴定
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牛源肺炎克雷伯氏菌的分离鉴定及遗传进化分析 被引量:9
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作者 冯娜 高翔 +3 位作者 肖敏 宁建刚 邢小勇 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2016年第11期1358-1364,共7页
为了对兰州市榆中县某奶牛场犊牛疑似肺炎克雷伯氏菌感染病例进行确诊,本研究采集病死犊牛的脏器组织并从中分离到1株革兰阴性短杆菌,进而对分离菌进行了生化鉴定、16S r RN A鉴定及khe基因鉴定,在此基础上,完成了分离菌的致病性试验、... 为了对兰州市榆中县某奶牛场犊牛疑似肺炎克雷伯氏菌感染病例进行确诊,本研究采集病死犊牛的脏器组织并从中分离到1株革兰阴性短杆菌,进而对分离菌进行了生化鉴定、16S r RN A鉴定及khe基因鉴定,在此基础上,完成了分离菌的致病性试验、耐药性分析及主要毒力基因的遗传进化分析。结果显示,除H2S试验外,分离菌生化特性均符合肺炎克雷伯氏菌的生化反应特性,其16S r RNA及khe基因序列与G enB ank中肺炎克雷伯氏菌株之间的同源性均高达99%,因此,可将分离菌确定为肺炎克雷伯氏菌,并将其命名为YZ2015。动物试验及耐药性试验结果表明,分离菌具有较强的致病性和多重耐药性。遗传进化分析表明,分离菌的fim H、mrk D及wab G基因与肺炎克雷伯氏菌其他菌株具有很高的同源性,其核酸序列相似性高达95%以上。 展开更多
关键词 肺炎克雷伯氏菌 分离 鉴定 药敏试验
牛支原体脂蛋白P48单克隆抗体的制备及鉴定
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作者 胡国明 +6 位作者 邢小勇 郝宝成 薛惠文 伏小平 温峰琴 胡永浩 项海涛 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2016年第11期1418-1423,共6页
为制备牛支原体表面脂蛋白P48的单克隆抗体,应用纯化的牛支原体武威株脂蛋白P48基因的原核表达产物免疫BALB/c小鼠,继而取免疫小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合,经克隆和筛选,获得2株能分泌抗牛支原体脂蛋白P48抗体的杂交瘤细胞... 为制备牛支原体表面脂蛋白P48的单克隆抗体,应用纯化的牛支原体武威株脂蛋白P48基因的原核表达产物免疫BALB/c小鼠,继而取免疫小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合,经克隆和筛选,获得2株能分泌抗牛支原体脂蛋白P48抗体的杂交瘤细胞融合株,并分别命名为C7及E5。ELISA和W estern-blot检测结果表明,2株单克隆抗体均可与牛支原体特异性地结合,而与牛的其他常见病原菌无任何反应。亚类鉴定结果表明,2株单克隆抗体重链均为Ig G 1,轻链均为λ型。稳定性试验结果表明,2株杂交瘤细胞均可稳定分泌单克隆抗体。本研究结果为建立牛支原体有效的检测方法和深入研究脂蛋白P48的生物学功能奠定了基础。 展开更多
关键词 牛支原体 单克隆抗体 杂交瘤 鉴定
牛支原体pdhα和pdhβ基因的克隆、原核表达及亚细胞的定位 被引量:4
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作者 苏炜德 李娜 +6 位作者 薛慧文 邢小勇 郝宝成 伏小平 温峰琴 项海涛 《农业生物技术学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第4期567-575,共9页
牛支原体(Mycoplasma bovis,M.b)是牛(Bos taurus)的一种重要致病性支原体,感染后可引起牛多种疾病。丙酮酸脱氢酶复合体E1(pyruvate dehydrogenase E1,PDHc E1)是参与生物体糖代谢过程的一个限速酶,广泛存在于微生物、哺乳动物... 牛支原体(Mycoplasma bovis,M.b)是牛(Bos taurus)的一种重要致病性支原体,感染后可引起牛多种疾病。丙酮酸脱氢酶复合体E1(pyruvate dehydrogenase E1,PDHc E1)是参与生物体糖代谢过程的一个限速酶,广泛存在于微生物、哺乳动物及高等植物中,其直接影响丙酮酸向乙酰辅酶A的转化。本研究参照Gen Bank中M.b PG45株的PDHc E1α亚基基因pdhα和PDHc E1β亚基基因pdhβ序列设计引物,通过PCR扩增获得M.b武威株的pdhα(Gen Bank登录号:KU355295)及pdhβ基因(Gen Bank登录号:KU355296),在序列测定的基础上应用重叠延伸PCR(Overlap PCR)技术完成基因优化并构建原核表达质粒p ET-pdhα和p ET-pdhβ。表达质粒分别转化大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)后经异丙基硫代半乳糖苷(isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside,IPTG)诱导表达重组PDHc E1α亚基融合蛋白PDHA及PDHc E1β亚基蛋白PDHB。纯化表达产物并分别免疫新西兰兔(Oryctolagus cuniculus)制备多克隆抗体,进而应用Western blot及酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)对M.b PDHc E1α亚基和PDHc E1β亚基在细胞内的分布进行了初步研究。结果表明,经IPTG的诱导,pdhα与pdhβ基因在大肠杆菌BL21(DE3)中均成功表达,重组蛋白r PDHA及r PDHB的分子量分别约为40和37 k D,且均有良好的免疫原性,而Western blot及ELISA结果证实E1α和E1β在牛支原体细胞膜上和胞浆中均有分布且分布量相当。本研究结果为进一步研究M.b生物学功能提供了基础资料。 展开更多
关键词 牛支原体(M.b) 丙酮酸脱氢酶 原核表达 膜定位
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