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产气荚膜梭菌α毒素突变体的表达及免疫保护力评价
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作者 杜吉革 薛麒 +5 位作者 朱真 李启红 春生 姚文生 康凯 陈小云 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第2期265-270,280共7页
对已知的产气荚膜梭菌CPA编码基因进行优化设计,同时引入包括第56和130位的天冬氨酸(D)突变为甘氨酸(G),及第275位的酪氨酸(Y)和第336位的天冬氨酸(D)突变为天冬酰胺(N)的4个氨基酸突变,经人工合成获得基因片段Gcpam4。将Gcpam4克隆至... 对已知的产气荚膜梭菌CPA编码基因进行优化设计,同时引入包括第56和130位的天冬氨酸(D)突变为甘氨酸(G),及第275位的酪氨酸(Y)和第336位的天冬氨酸(D)突变为天冬酰胺(N)的4个氨基酸突变,经人工合成获得基因片段Gcpam4。将Gcpam4克隆至原核表达载体pET-30a(+)中进行表达与纯化,获得重组蛋白rCPAm4。利用Western blot方法检测rCPAm4与产气荚膜梭菌A型毒素抗血清的反应性,并采用小鼠检测纯化蛋白的毒力。随后,将rCPAm4与Montanide ISA 201佐剂以1∶1的比例混合乳化制备疫苗,免疫家兔,按照《中华人民共和国兽药典》(2015年版)规定的方法检测兔血清的中和抗体效价。二免后21d,对家兔通过耳缘静脉注射1个家兔MLD剂量的A型产气荚膜梭菌毒素,以检测rCPAm4对家兔的免疫保护效果。结果表明,rCPAm4主要以包涵体的形式表达,且能与产气荚膜梭菌A型毒素抗血清反应;小鼠安全性试验显示,5.5mg/kg剂量的rCPAm4对小鼠仍无致死性;免疫rCPAm4后,每毫升的一免抗血清可中和10~20个小鼠MLD、二免抗血清可中和30~50个小鼠MLD的A型产气荚膜梭菌毒素;1个家兔MLD的A型产气荚膜梭菌毒素攻毒后,对照组家兔100%死亡,免疫组家兔得到了100%的保护。以上结果表明,rCPAm4具有良好的安全性和免疫原性,从而为A型产气荚膜梭菌基因工程亚单位疫苗的研制提供了重要的试验数据。 展开更多
关键词 A型产气荚膜梭α毒素 突变 重组表达 毒力 抗原性
蓝舌病毒14型的分离与鉴定
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作者 曹雨 张莹辉 +7 位作者 赵炜 陈新 薄宗义 姚文生 JUNG Yong-Sam 戴建君 钱莺娟 春生 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2019年第7期855-860,共6页
为了解我国新疆地区羊蓝舌病的流行情况,对某羊场疑似发生蓝舌病的羊病料进行了采集,并进行病毒分离和鉴定。应用间接ELISA试剂盒检测血清抗体,抗凝血样品接种敏感的BHK21细胞进行连续盲传,对细胞病变呈阳性的样品进行间接免疫荧光鉴定... 为了解我国新疆地区羊蓝舌病的流行情况,对某羊场疑似发生蓝舌病的羊病料进行了采集,并进行病毒分离和鉴定。应用间接ELISA试剂盒检测血清抗体,抗凝血样品接种敏感的BHK21细胞进行连续盲传,对细胞病变呈阳性的样品进行间接免疫荧光鉴定,同时针对VP7片段和VP2片段设计引物进行RT-PCR检测鉴定,并对其L2基因进行系统发育树分析。结果显示,血清中BTV抗体检测均为阳性,接种BHK21细胞后均产生了特异性细胞病变,并与FITC标记的抗BTV单抗特异性结合,针对VP7扩增出1156bp片段,针对VP2分别扩增出850bp和1581bp片段,经测序和序列分析确定为BTV-14型。结果表明,我国新疆地区存在蓝舌病毒14型,这也是我国境内首次分离到蓝舌病毒14型,为进一步防控我国蓝舌病疫情提供了科学依据。 展开更多
关键词 蓝舌病毒 14型 分离 鉴定
犬腺病毒(Ⅱ型)阳性血清的研制及应用 预览
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作者 赵炜 孙淼 +3 位作者 薛青红 陈延飞 韩爽 春生 《中国兽药杂志》 2019年第3期54-60,共7页
为研制犬腺病毒相关制品的检验用阳性血清,以健康易感山羊为免疫靶动物,深入优化免疫原和免疫程序,无菌采血后分离血清,并分装冻干。通过常规检验方法进行纯净性检测、特异性检测、抗体效价测定和中和指数测定,并将其应用于代表性的含... 为研制犬腺病毒相关制品的检验用阳性血清,以健康易感山羊为免疫靶动物,深入优化免疫原和免疫程序,无菌采血后分离血清,并分装冻干。通过常规检验方法进行纯净性检测、特异性检测、抗体效价测定和中和指数测定,并将其应用于代表性的含犬腺病毒组分的活疫苗制品的外源病毒检验和鉴别检验等。结果显示,该批血清的纯净性检验和特异性满足要求,中和抗体效价为1∶9364,中和指数>106.0。结果表明,该血清对犬腺病毒具有良好的中和作用,能够应用于犬腺病毒相关制品的外源病毒检验和特异性检验等,是兽用生物制品国家标准物质的重要候选标准品。 展开更多
关键词 犬腺病毒 阳性血清 标准物质
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产气荚膜梭菌α毒素C末端的二拷贝串联表达与免疫原性分析 预览
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作者 杜吉革 王磊 +6 位作者 薛麒 朱真 李启红 春生 姚文生 康凯 陈小云 《中国兽医杂志》 CAS 北大核心 2019年第1期7-10,共4页
本研究旨在获得产气荚膜梭菌α毒素(CPA)C末端(第247-370位氨基酸,CPAC)二拷贝串联融合蛋白,并评价其免疫原性。对已知的A型产气荚膜梭菌CPAC编码基因进行优化设计,将其以同向串连的方式串联成二拷贝基因(GCPAC2),经人工合成获得基因片... 本研究旨在获得产气荚膜梭菌α毒素(CPA)C末端(第247-370位氨基酸,CPAC)二拷贝串联融合蛋白,并评价其免疫原性。对已知的A型产气荚膜梭菌CPAC编码基因进行优化设计,将其以同向串连的方式串联成二拷贝基因(GCPAC2),经人工合成获得基因片段GCPAC2。将GCPAC2克隆至原核表达载体pET-30a(+)中进行表达与纯化,获得重组蛋白rCPAC2。利用Western Blot方法检测rCPAC2与A型产气荚膜梭菌毒素抗血清的反应性。随后,用rCPAC2免疫家兔,并检测一免及二免后兔血清的中和抗体效价。在二免21 d后,经耳缘静脉注射1个家兔MLD的A型产气荚膜梭菌毒素,检测rCPAC2对家兔的免疫保护效果。结果表明,rCPAC2主要以包涵体的形式表达且能与A型产气荚膜梭菌毒素抗血清反应。每毫升的一免和二免抗血清分别可中和30个和80个小鼠MLD的A型产气荚膜梭菌毒素。1个兔MLD的A型产气荚膜梭菌毒素攻毒后,对照组4/4死亡,免疫组得到了100%(4/4)的保护。以上结果说明,rCPAC2具有良好的免疫原性,从而为A型产气荚膜梭菌病基因工程疫苗的研制提供了重要的实验数据。 展开更多
关键词 产气荚膜梭菌α毒素 C末端 串联表达 抗原性
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山羊痘病毒检测方法研究进展 预览 被引量:1
5
作者 张莹辉 姚文生 +5 位作者 康凯 王团结 薛麒 吴思捷 赵俊杰 春生 《中国兽药杂志》 2018年第3期72-77,共6页
就山羊痘病毒分离鉴定、电镜观察、ELISA试验、琼脂扩散试验、免疫荧光抗体试验、PCR试验等检测方法进行了综述,以期为山羊痘病毒的实验室诊断提供参考。
关键词 山羊痘病毒 检测方法 研究进展
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重组腐败梭菌α毒素对兔的免疫效力分析 预览
6
作者 陈小云 刘莹 +6 位作者 薛麒 朱真 李启红 春生 姚文生 康凯 杜吉革 《畜牧兽医学报》 CSCD 北大核心 2018年第8期1727-1734,共8页
本研究旨在获得重组腐败梭菌α毒素,并评价其毒力及免疫原性。对已知的腐败梭菌α毒素编码基因进行优化设计,通过人工合成获得基因片段Gcsa。将Gcsa克隆至原核表达载体pET-30a(+)中进行表达与纯化,从而获得重组蛋白rCSA。利用Western... 本研究旨在获得重组腐败梭菌α毒素,并评价其毒力及免疫原性。对已知的腐败梭菌α毒素编码基因进行优化设计,通过人工合成获得基因片段Gcsa。将Gcsa克隆至原核表达载体pET-30a(+)中进行表达与纯化,从而获得重组蛋白rCSA。利用Western blot方法检测纯化的rCSA与腐败梭菌α毒素抗血清的反应性,并采用犬肾细胞系(MDCK)和小鼠来检测rCSA的毒力。以甲醛脱毒后的rCSA与Montanide ISA 201佐剂以1∶1的比例制备疫苗,免疫家兔,按照《中华人民共和国兽药典》(2015年版)规定的方法检测兔血清的中和抗体效价。结果表明,rCSA为可溶性表达,比例可达50%,且能与腐败梭菌抗血清反应。MDCK细胞毒性试验显示,0.15ng·mL^-1的rCSA即可引起明显的细胞病变;小鼠安全性试验显示,rCSA对ICR小鼠的最小致死量是1.5×10^6 ng·kg^-1;每毫升的一免抗血清可中和100~130个小鼠MLD的腐败梭菌毒素;每毫升的二免抗血清可中和360~480个小鼠MLD的腐败梭菌毒素;1个家兔MLD的腐败梭菌毒素攻毒后,对照组家兔4/4死亡,免疫组家兔得到了4/4的保护。以上结果表明,rCSA具有良好的免疫原性,可作为腐败梭菌病基因工程亚单位疫苗的候选抗原。 展开更多
关键词 腐败梭菌α毒素 重组表达 毒力 抗原性
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腐败梭菌α毒素重组突变体的免疫保护力评价 被引量:1
7
作者 杜吉革 薛麒 +6 位作者 朱真 李启红 春生 彭小兵 姚文生 康凯 陈小云 《中国兽医科学》 CSCD 北大核心 2018年第9期1124-1130,共7页
本研究旨在获得腐败梭菌OL毒素(CSa)的重组突变体,并评价该重组毒素的毒力及免疫原性。对已知的腐败梭菌OL毒素编码基因进行优化设计,同时引入包括第86位半胱氨酸突变为亮氨酸及第296位的天冬氨酸、第301位的组氨酸和第342位的色氨... 本研究旨在获得腐败梭菌OL毒素(CSa)的重组突变体,并评价该重组毒素的毒力及免疫原性。对已知的腐败梭菌OL毒素编码基因进行优化设计,同时引入包括第86位半胱氨酸突变为亮氨酸及第296位的天冬氨酸、第301位的组氨酸和第342位的色氨酸突变为丙氨酸的4个氨基酸突变,经人工合成获得基因片段Gcsam4。将Gcsam4克隆至原核表达载体pET-30(+)中进行表达与纯化,获得重组蛋白rcsam4。利用Western—blot检测rcsam4与腐败梭菌α毒素抗血清的反应性,并采用Vero细胞和小鼠检测其毒性。随后,将rcsam4与Montanide ISA206佐剂以1:1(v/V)的比例混合乳化制备疫苗并免疫家兔,按照《中华人民共和国兽药典》(2015年版)规定的方法检测兔血清的中和抗体效价。二免后第21天对家兔通过耳缘静脉注射1个MLD剂量的腐败梭菌毒素,来检测rCSam4对家兔的免疫保护效果。结果表明。rcsam4主要以包涵体的形式存在,且能够与腐败梭菌抗血清反应。Vero细胞毒性试验显示,9.85μg/mL的蛋白仍无细胞毒性:小鼠安全性试验显示,5.5×10^3μg/kg的剂量对小鼠无致死性;免疫rcsam4后,每毫升的一免兔血清可中和50~70个小鼠MLD的腐败梭菌毒素;每毫升的二免兔血清可中和110~130个小鼠MLD的腐败梭菌毒素;1个家免MLD的腐败梭菌毒素攻毒后,对照组家兔全部死亡,免疫组家免得到了100%(4/4)的保护。以上结果表明,rcsam4在丧失毒性的同时还保留了良好的免疫原性,从而为腐败梭菌病基因工程疫苗的研制提供了重要的试验数据。 展开更多
关键词 腐败梭菌α毒素 突变 重组表达 毒性 抗原性
产气荚膜梭菌重组ε毒素突变体的免疫保护力评价 预览 被引量:1
8
作者 杜吉革 朱真 +6 位作者 薛麒 李启红 春生 彭小兵 姚文生 康凯 陈小云 《畜牧兽医学报》 CSCD 北大核心 2018年第4期777-785,共9页
旨在获得产气荚膜梭菌ε毒素的重组突变体,并评价其毒力及免疫原性。对已知的D型产气荚膜梭菌ε毒素编码基因进行了优化设计和人工合成,同时引入3个氨基酸点突变:第30和196位酪氨酸突变为丙氨酸,第106位组氨酸突变为脯氨酸。将该基因... 旨在获得产气荚膜梭菌ε毒素的重组突变体,并评价其毒力及免疫原性。对已知的D型产气荚膜梭菌ε毒素编码基因进行了优化设计和人工合成,同时引入3个氨基酸点突变:第30和196位酪氨酸突变为丙氨酸,第106位组氨酸突变为脯氨酸。将该基因片段克隆至原核表达载体pET30a-(+)中进行表达,并纯化。利用Western blot方法检测纯化蛋白质与D型产气荚膜梭菌ε毒素抗血清的反应性,并检测其对小鼠的毒力。随后,以纯化的重组蛋白质免疫兔,根据《中华人民共和国兽药典》(2015年版)规定的方法检测兔血清的中和抗体效价。结果表明,ε毒素的重组突变体为可溶性表达,通过灰度扫描,其表达量比例可达40%;该蛋白质能与D型产气荚膜梭菌ε毒素抗血清反应,小鼠安全试验显示,6.25×106 ng·kg-1的蛋白质仍无毒力;免疫兔血清对D型产气荚膜梭菌ε毒素的中和效价在一免后可达50~60最小致死量(MLD),二免后可达400~450 MLD;用1个MLD的D型产气荚膜梭菌毒素攻毒后,对照组4/4死亡,免疫组得到保护。由此表明,产气荚膜梭菌重组ε毒素突变体无毒力且保留了良好的免疫原性,为D型产气荚膜梭菌病新型疫苗的研制提供了重要的实验数据。 展开更多
关键词 产气荚膜梭菌ε毒素 突变 重组表达 毒力 抗原性
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无毒性产气荚膜梭菌ε毒素突变体的表达及免疫保护力评价 预览
9
作者 杜吉革 薛麒 +5 位作者 朱真 李启红 春生 姚文生 康凯 陈小云 《中国农业科学》 CSCD 北大核心 2018年第11期2206-2215,共10页
【目的】获得产气荚膜梭菌ε毒素(ETX)的无毒重组突变体,并评价其毒力及免疫原性。【方法】对已知的D型产气荚膜梭菌ETX编码基因按照大肠杆菌偏爱密码子进行优化设计。同时,将第106位的组氨酸和第199位的苯丙氨酸分别突变为脯氨酸和... 【目的】获得产气荚膜梭菌ε毒素(ETX)的无毒重组突变体,并评价其毒力及免疫原性。【方法】对已知的D型产气荚膜梭菌ETX编码基因按照大肠杆菌偏爱密码子进行优化设计。同时,将第106位的组氨酸和第199位的苯丙氨酸分别突变为脯氨酸和谷氨酸,经人工合成,获得基因片段GETXm2。将GETXm2克隆至原核表达载体p ET30a-(+)后,将p ET30a-GETXm2转化至BL21(DE3)感受态细胞中,在15℃和37℃两种条件下分别用IPTG诱导16 h和4 h,超声破碎后收集上清和沉淀,采用SDS-PAGE和Western blot方法检测重组蛋白的表达情况及其可溶性。利用Ni-IDA亲和层析方法对可溶性表达的重组蛋白进行纯化,从而获得重组蛋白r ETXm2。利用Western blot方法,检测r ETXm2与D型产气荚膜梭菌ETX抗血清的反应性。将r ETXm2用细胞维持液稀释至100及10μg·m L-1,检测其对犬肾细胞系(MDCK细胞)的毒力。分别用胰酶活化前和活化后的r ETXm2,以0.0625、0.625和6.25 mg·kg-1 3个剂量尾静脉注射,检测r ETXm2对小鼠的毒力。随后,将r ETXm2与Montanide ISA 201佐剂混合乳化制备疫苗,取4只健康家兔,皮下免疫2次(间隔两周),100μg/只。同时,Montanide ISA 201佐剂与PBS混合液免疫组作为对照组。分别在一免后14 d以及二免后21 d,采血,分离血清,按照《中华人民共和国兽药典》(2015年版)规定的方法检测血清对D型产气荚膜梭菌毒素的中和抗体效价。同时,在二免后21 d,对家兔经耳缘静脉注射1个家兔MLD的D型产气荚膜梭菌毒素,检测r ETXm2对家兔的免疫保护效果。【结果】在15℃和37℃条件,r ETXm2在BL21(DE3)菌体中均以可溶性和包涵体两种形式表达,综合考虑重组蛋白的表达量、可溶性及诱导时间,选择纯化在37℃条件下诱导获得的可溶性r ETXm2。灰度扫描结果显示,在37℃诱导条件下,r ETXm2可溶表达比例达30%;Western blot检测结果表明,D型产气荚膜梭菌� 展开更多
关键词 产气荚膜梭菌ε毒素 突变 重组表达 毒力 抗原性
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产气荚膜梭菌α毒素C末端的三拷贝串联表达与免疫原性分析 预览
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作者 杜吉革 刘莹 +7 位作者 朱真 薛麒 张秀坤 李启红 春生 康凯 姚文生 陈小云 《中国畜牧兽医》 北大核心 2018年第11期3237-3245,共9页
本研究旨在获得产气荚膜梭菌α毒素(CPA)C末端(第247-370位氨基酸,CPA C)三拷贝串联融合蛋白,并评价其免疫原性。对已知的A型产气荚膜梭菌CPA C编码基因(GenBank登录号:AY823400.1)进行优化设计,以同向串连的方式串联成三拷贝基因(GCPA ... 本研究旨在获得产气荚膜梭菌α毒素(CPA)C末端(第247-370位氨基酸,CPA C)三拷贝串联融合蛋白,并评价其免疫原性。对已知的A型产气荚膜梭菌CPA C编码基因(GenBank登录号:AY823400.1)进行优化设计,以同向串连的方式串联成三拷贝基因(GCPA C3),片段之间用柔性氨基酸linker(GGGS)连接,经人工合成后克隆至原核表达载体pET-30a(+)中进行表达与纯化,获得CPA C的三拷贝重组蛋白(rCPA C3)。利用Western blotting方法检测rCPA C3与A型产气荚膜梭菌毒素抗血清的反应性。将rCPA C3与Montanide ISA 201佐剂混合乳化制备疫苗,免疫4只健康家兔,检测一免及二免后兔血清的中和抗体效价。在二免21 d后,对家兔经耳缘静脉注射1个家兔最低致死剂量(MLD)的A型产气荚膜梭菌毒素,检测rCPA C3对家兔的免疫保护效果。结果显示,rCPA C3主要以包涵体的形式表达,且能与A型产气荚膜梭菌毒素抗血清反应;每毫升的一免抗血清可中和30~50个、二免抗血清可中和70~100个小鼠MLD的A型产气荚膜梭菌毒素。采用1个家兔MLD的A型产气荚膜梭菌毒素攻毒后,对照组家兔100%(4/4)死亡,免疫组得到了100%(4/4)的保护。以上结果说明,rCPA C3具有良好的免疫原性,为A型产气荚膜梭菌病基因工程疫苗的研制提供了重要的试验数据。 展开更多
关键词 产气荚膜梭菌α毒素 C末端 串联表达 抗原性
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重组产气荚膜梭菌α毒素突变体的表达与免疫保护力评价 预览 被引量:1
11
作者 杜吉革 朱真 +8 位作者 薛麒 赵俊杰 彭小兵 张秀坤 李启红 春生 姚文生 康凯 陈小云 《中国兽药杂志》 2018年第9期1-8,共8页
为获得产气荚膜梭菌α毒素(CPA)的重组突变体,并评价其毒力和免疫原性,对已知的产气荚膜梭菌CPA编码基因进行优化设计,同时引入包括第56位和第130位的天冬氨酸(D)突变为甘氨酸(G),及第275位的酪氨酸(Y)和第336位的天冬氨酸(D)突变为天... 为获得产气荚膜梭菌α毒素(CPA)的重组突变体,并评价其毒力和免疫原性,对已知的产气荚膜梭菌CPA编码基因进行优化设计,同时引入包括第56位和第130位的天冬氨酸(D)突变为甘氨酸(G),及第275位的酪氨酸(Y)和第336位的天冬氨酸(D)突变为天冬酰胺(N)的4个氨基酸突变。此外,在该基因5'端添加Th细胞表位(T)和鞭毛蛋白(flagellin)N末端编码序列,经人工合成获得基因片段GTF NCPA m4。将GTF NCPA m4克隆至原核表达载体pET-30a(+)中进行表达与纯化,获得重组蛋白rTF NCPA m4。利用Western blot方法检测rTF NCPA m4与产气荚膜梭菌A型毒素抗血清的反应性,并检测该蛋白的卵磷脂酶和溶血活性以及对小鼠的毒力。随后,将重组蛋白与Montanide ISA 201佐剂以1∶1(V/V)的比例混合乳化,免疫家兔,检测兔血清的中和抗体效价。二免后21 d,对家兔通过耳缘静脉注射1个MLD剂量的A型产气荚膜梭菌毒素,以检测rTF NCPA m4对家兔的免疫保护效果。结果表明,rTF NCPA m4主要以包涵体的形式表达,且能与A型产气荚膜梭菌毒素产生血清反应;体外实验显示,rTF NCPA m4无卵磷脂酶和溶血活性;小鼠安全性实验显示,5.5 mg/kg剂量的rTF NCPA m4对小鼠无致死性;免疫重组蛋白后,每毫升的一免抗血清可中和10个MLD、二免抗血清可中和40个MLD的A型产气荚膜梭菌毒素;1个MLD的A型产气荚膜梭菌毒素攻毒后,对照组家兔4/4死亡,免疫组家兔得到了100%(4/4)的保护。以上数据说明,表达的CPA重组突变体蛋白具有良好的安全性和免疫原性,为A型产气荚膜梭菌基因工程亚单位疫苗的研制提供了重要的实验数据。 展开更多
关键词 A型产气荚膜梭菌CPA 突变 Th细胞表位 鞭毛蛋白 重组表达 毒力 抗原性
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产气荚膜梭菌α毒素C末端与中和抗原表位的串联表达及免疫保护性分析 预览
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作者 杜吉革 薛麒 +7 位作者 朱真 彭小兵 张秀坤 李启红 春生 姚文生 康凯 陈小云 《中国兽药杂志》 2018年第8期1-6,共6页
为获得产气荚膜梭菌α毒素(CPA)的C末端(CPAC)与中和抗原表位NE(ARGFAK)的串联融合蛋白并评价其免疫原性,对已知的A型产气荚膜梭菌CPAC及NE的编码基因进行优化设计,并将两个基因的三拷贝序列串联,经人工合成获得基因片段GCPAC3NE... 为获得产气荚膜梭菌α毒素(CPA)的C末端(CPAC)与中和抗原表位NE(ARGFAK)的串联融合蛋白并评价其免疫原性,对已知的A型产气荚膜梭菌CPAC及NE的编码基因进行优化设计,并将两个基因的三拷贝序列串联,经人工合成获得基因片段GCPAC3NE3。将该片段克隆至原核表达载体p ET30a(+)中进行表达与纯化,获得重组蛋白。利用Western blot方法检测重组蛋白与A型产气荚膜梭菌毒素抗血清的反应性。随后,以纯化的重组蛋白免疫家兔,根据《中华人民共和国兽药典》(2015年版)规定的方法检测家兔血清的中和抗体效价。在二免后21 d,以1个MLD的A型产气荚膜梭菌毒素对家兔进行攻毒。结果表明重组蛋白主要以包涵体的形式存在表达且能与A型产气荚膜梭菌毒素抗血清反应。每毫升的一免抗血清可中和40个最小致死量(MLD)、二免抗血清可中和80个MLD的A型产气荚膜梭菌毒素;1个MLD的A型产气荚膜梭菌毒素攻毒后,对照组4/4死亡,免疫组得到了100%(4/4)的保护。以上结果说明,重组蛋白具有良好的免疫原性,从而为A型产气荚膜梭菌病基因工程疫苗的研制提供了重要的实验数据。 展开更多
关键词 产气荚膜梭菌α毒素 C末端 中和抗原表位 串联表达 抗原性
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重组产气荚膜梭菌ε毒素三点突变体的融合表达及其免疫活性分析 预览 被引量:3
13
作者 杜吉革 张秀坤 +8 位作者 朱真 薛麒 李启红 春生 彭小兵 王磊 姚文生 康凯 陈小云 《中国兽药杂志》 2018年第7期28-34,共7页
为获得并评价重组产气荚膜梭菌ε毒素(ETX)三点突变体蛋白的毒力及免疫活性,对已知的D型产气荚膜梭菌ETX编码基因进行优化设计,同时引入包括第30和196位酪氨酸突变为丙氨酸,及第106位组氨酸突变为脯氨酸共3个氨基酸突变,并在该基因5... 为获得并评价重组产气荚膜梭菌ε毒素(ETX)三点突变体蛋白的毒力及免疫活性,对已知的D型产气荚膜梭菌ETX编码基因进行优化设计,同时引入包括第30和196位酪氨酸突变为丙氨酸,及第106位组氨酸突变为脯氨酸共3个氨基酸突变,并在该基因5'端添加Th细胞表位(T)和鞭毛蛋白(flagellin)N末端编码序列,经人工合成获得基因片段GTFNETXm3。随后,将该基因片段克隆至原核表达载体p ET30a-(+),转染BL21(DE3)菌诱导表达、纯化,从而获得重组蛋白,进而利用Western blot方法检测重组蛋白与D型产气荚膜梭菌抗血清的反应性,并检测其对犬肾细胞系(MDCK细胞)及小鼠的毒力。最后,将重组蛋白与Montanide ISA 201佐剂混合乳化制备疫苗,免疫4只健康家兔,根据《中华人民共和国兽药典》(2015年版)规定的方法检测一免及二免后兔血清的中和抗体效价。结果显示,重组蛋白主要以包涵体的形式存在,且能与D型产气荚膜梭菌毒素抗血清反应;100μg/m L的重组蛋白未显示细胞毒性;6.25 mg/kg剂量的重组蛋白对小鼠无致死性;每毫升的一免抗血清可中和80-120个最小致死量(MLD)、二免抗血清可中和750-1100个MLD的D型产气荚膜梭菌毒素;用1个MLD的D型产气荚膜梭菌毒素攻毒后,对照组家兔4/4死亡,免疫组家兔4/4保护。试验表明,产气荚膜梭菌ETX三点突变体的毒力基本消失,且保留了良好的免疫原性,是D型产气荚膜梭菌病基因工程亚单位疫苗的理想候选抗原蛋白。 展开更多
关键词 产气荚膜梭菌ε毒素 突变体 Th细胞表位 鞭毛蛋白 抗原性
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产气荚膜梭菌ε毒素突变体的表达及免疫保护力评价 预览 被引量:1
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作者 杜吉革 彭小兵 +9 位作者 张秀坤 朱真 薛麒 王磊 李启红 春生 姚文生 康凯 蒋玉文 陈小云 《中国兽药杂志》 2018年第6期13-20,共8页
为获得产气荚膜梭菌ε毒素(ETX)的重组突变体,并评价其毒力及免疫原性。对已知的D型产气荚膜梭菌ETX编码基因进行优化设计,并将第106位组氨酸突变为脯氨酸,经人工合成获得基因片段GETX H106P 。将GETX H106P 克隆至原核表达载体pET... 为获得产气荚膜梭菌ε毒素(ETX)的重组突变体,并评价其毒力及免疫原性。对已知的D型产气荚膜梭菌ETX编码基因进行优化设计,并将第106位组氨酸突变为脯氨酸,经人工合成获得基因片段GETX H106P 。将GETX H106P 克隆至原核表达载体pET30a(+),转染BL21(DE3)菌中进行表达与纯化,从而获得重组蛋白rETX H106P 。利用Western blot方法检测rETX H106P 与D型产气荚膜梭菌抗血清的反应性,并检测其对犬肾细胞系(MDCK细胞)以及小鼠的毒力。随后,将rETX H106P 与Montanide ISA 201佐剂混合乳化制备疫苗,免疫4只健康家兔,按照《中华人民共和国兽药典》(2015年版)规定的方法检测一免及二免后兔血清的中和抗体效价。结果表明,rETX H106P 为可溶性表达,通过灰度扫描,其可溶性表达量比例可达30%;该重组蛋白能与D型产气荚膜梭菌毒素抗血清反应;细胞毒性试验结果显示,100 μg/mL的重组蛋白仍无细胞毒性;小鼠安全性实验结果显示,6.25×10 6 ng/kg剂量的重组蛋白对小鼠仍无致死性;每毫升的一免抗血清可中和450~700个最小致死量(MLD)、二免抗血清可中和3000~4000个MLD的D型产气荚膜梭菌毒素;用1 MLD的D型产气荚膜梭菌毒素攻毒后,对照组家兔4/4死亡,免疫组家兔4/4保护。以上结果表明,产气荚膜梭菌rETX H106P 重组蛋白毒力基本消失,且保留了良好的免疫原性,是D型产气荚膜梭菌病基因工程亚单位疫苗的理想候选抗原蛋白. 展开更多
关键词 产气荚膜梭菌ε毒素 突变 重组表达 毒力 抗原性
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磺胺氯哒嗪对大肠杆菌的生长、突变及接合转移效应的影响
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作者 史珺怡 马清萍 +4 位作者 于洋 宋春磊 潘永正 林志芬 春生 《环境化学》 CSCD 北大核心 2018年第6期1209-1216,共8页
抗生素的大量使用导致细菌的耐药性,直接威胁了人类的生命健康,加剧了抗生素的环境生态风险.为了研究抗生素抗性基因(antibiotic resistance genes,ARGs)的扩散与抗生素浓度之间的关系,本文以磺胺氯哒嗪(sulfachloropyridazine,SCP... 抗生素的大量使用导致细菌的耐药性,直接威胁了人类的生命健康,加剧了抗生素的环境生态风险.为了研究抗生素抗性基因(antibiotic resistance genes,ARGs)的扩散与抗生素浓度之间的关系,本文以磺胺氯哒嗪(sulfachloropyridazine,SCP)为研究对象,测定了SCP对只有磺胺敏感大肠杆菌的单一菌液的生长和突变效应的影响,SCP对含有耐磺胺大肠杆菌和磺胺敏感大肠杆菌的混合菌液的生长、突变及RP4质粒和R388质粒的接合转移效应的影响.研究结果显示,单一菌液的突变促进效应浓度区间(RCS)和突变促进无效应浓度RC0-1皆小于混合菌液;4.0×10^-5—8.7×10^-5mol·L^-1浓度范围内SCP作用下,单一菌液的突变效应受抑制而混合菌液的突变效应相较于空白组显著促进(P〈0.05);1.9×10^-5—6.3×10^-5mol·L^-1浓度范围的SCP能够促进混合菌液的突变,对ARGs的筛选风险较大,且SCP在6.3×10^-5—1.5×10^-4mol·L^-1范围对RP4和R388质粒的接合转移效应有明显的抑制作用,说明在本实验浓度范围内SCP对接合子的促进风险较小.综上,单一菌液的效应不足以说明环境中磺胺类抗生素的突变风险,研究磺胺类抗生素对耐药基因传播的影响时应混合耐磺胺大肠杆菌和磺胺敏感大肠杆菌作为受试菌,实验证明环境中低浓度的SCP对抗性基因的产生的促进风险较大. 展开更多
关键词 耐磺胺大肠杆菌 磺胺敏感大肠杆菌 磺胺氯哒嗪(SCP) 突变 接合转移
Miseq测序分析围垦后海三棱藨草湿地土壤微生物群落多样性的季节变化 被引量:1
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作者 赵萌 春生 +3 位作者 厉成伟 钟胜财 于克锋 方淑波 《上海海洋大学学报》 CSCD 北大核心 2018年第5期718-727,共10页
为探讨上海南汇东滩湿地围垦后海三棱藨草土壤微生物群落多样性的季节变化,应用Miseq高通量测序技术,分析藨草密集区与光滩区4个季度土壤微生物群落多样性以及相关的土壤环境因子。结果表明,藨草密集区与光滩区土壤微生物群落多样性及... 为探讨上海南汇东滩湿地围垦后海三棱藨草土壤微生物群落多样性的季节变化,应用Miseq高通量测序技术,分析藨草密集区与光滩区4个季度土壤微生物群落多样性以及相关的土壤环境因子。结果表明,藨草密集区与光滩区土壤微生物群落多样性及丰富度差异显著(P 〈0. 001),藨草密集区高于光滩区,同一区域样本微生物多样性及丰富度季节变化显著(P 〈0. 001),春夏2季低于秋冬2季。Proteobacteria(变形菌门)、Bacteroidetes(拟杆菌门)、Acidobacteria(酸杆菌门)、Chloroflexi(绿弯菌门)、Planctomycetes(浮霉菌门)、Actinobacteria(放线菌门)、Cyanobacteria(蓝藻菌门)是各样本中相对丰度较高的菌门,且样品优势菌季节性差异较大。RDA冗余分析表明,土壤盐分、干湿比、硝态氮是影响土壤微生物群落结构的主要因素。研究对弄清海三棱藨草湿地的空间扩张微观机制及促进海三棱藨草湿地快速修复具有理论意义。 展开更多
关键词 高通量测序 微生物多样性 海三棱藨草 沉积环境 湿地修复
磺胺类化合物对大肠杆菌突变QSAR预测模型初探
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作者 巫晓丹 马清萍 +2 位作者 宋春磊 林志芬 春生 《生态毒理学报》 CSCD 北大核心 2018年第5期118-127,共10页
抗生素被广泛应用于医疗、农业和畜牧业等领域,但是长期滥用会促进细菌的突变作用。本文以大肠杆菌(E.coli)为受试生物,测定了10种磺胺类抗生素(SAs)单一暴露时对E.coli的突变效应,采用物化参数Ebinding(抗生素与其靶蛋白的相互作... 抗生素被广泛应用于医疗、农业和畜牧业等领域,但是长期滥用会促进细菌的突变作用。本文以大肠杆菌(E.coli)为受试生物,测定了10种磺胺类抗生素(SAs)单一暴露时对E.coli的突变效应,采用物化参数Ebinding(抗生素与其靶蛋白的相互作用能力)与突变效应参数lgRC0-2(最高可观测突变促进效应浓度)或lgRCmax(突变促进率最大值对应的浓度),建立了突变效应的QSAR模型,并采用雷达图进行验证。结果表明,lgRC0-2与Ebinding模型和lgRCmax与Ebinding、DMG(偶极矩)模型的拟合系数R2分别是0.888、0.873,即lgRC0-2或lgRCmax与Ebinding相关性均较好,可能由于磺胺类化合物(SAs)会作用于叶酸合成通路,影响嘌呤、嘧啶碱基的合成,从而对E.coli的突变具有促进效应,且雷达图验证表明,上述2个模型均具有良好的内部预测能力。本研究有望为抗生素使用带来的生态风险评价以及药物设计提供相关指导。 展开更多
关键词 磺胺类抗生素 大肠杆菌 突变效应 QSAR模型
全文增补中
高剂量高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒TJM-F92疫苗株对低剂量伪狂犬病毒Bartha-K61疫苗株的免疫干扰研究 预览 被引量:2
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作者 夏铭崎 春生 +8 位作者 王鑫 王炜 王宇菲 孟庆森 陈超阳 武莹 封腾 武华 薛青红 《中国预防兽医学报》 CSCD 北大核心 2017年第5期412-415,共4页
为研究高剂量高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)TJM-F92疫苗株对低剂量伪狂犬病毒(PRV)Bartha-K61疫苗株是否存在免疫干扰作用,本研究对其从体液免疫水平、免疫攻毒保护水平及病理学变化等方面进行评价。结果表明,二联免疫组... 为研究高剂量高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)TJM-F92疫苗株对低剂量伪狂犬病毒(PRV)Bartha-K61疫苗株是否存在免疫干扰作用,本研究对其从体液免疫水平、免疫攻毒保护水平及病理学变化等方面进行评价。结果表明,二联免疫组抗体消长规律与低剂量PRV Bartha-K61株免疫对照组抗体消长规律相一致,二联免疫组中高剂量PRRSV TJM-F92株未抑制低剂量PRV Bartha-K61株抗体生成;二联免疫组与低剂量PRV Bartha-K61免疫对照组对PRV JL1株强毒攻击保护率均为5/5;免疫病理学研究结果表明,两组免疫组攻击PRV JL1株强毒后各组织器官病理变化轻微;二联免疫组与低剂量PRV Bartha-K61免疫对照组均可对PRV强毒攻击产生良好的保护效果。综上,高剂量PRRSV TJM-F92株对低剂量PRV Bartha-K61株无免疫干扰作用。 展开更多
关键词 PRRSV TJM-F92株 PRV Bartha-K61株 免疫干扰
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漂浮和沉水植物降解过程中氮磷的释放规律 预览 被引量:1
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作者 殷春雨 关保华 +2 位作者 陈梦琪 方淑波 春生 《江苏农业科学》 北大核心 2017年第21期275-277,共3页
将浮萍(Lemna minor)、马来眼子菜(Potamogeton malaianus)烘干植物体悬挂在水柱中,定期检测残存干物质和总氮(TN)、总磷(TP)含量,研究漂浮植物和沉水植物降解速率的差异。试验条件分别是原位池塘、有沉积物温室和无沉积物温室... 将浮萍(Lemna minor)、马来眼子菜(Potamogeton malaianus)烘干植物体悬挂在水柱中,定期检测残存干物质和总氮(TN)、总磷(TP)含量,研究漂浮植物和沉水植物降解速率的差异。试验条件分别是原位池塘、有沉积物温室和无沉积物温室等3种降解条件。结果表明:马来眼子菜干物质降解速率略高于浮萍,2种植物的分解都是在原位池塘的条件下快于温室条件下。马来眼子菜TN的降解速率在有沉积物温室和原位池塘的条件下高于浮萍,但TP的降解速率却在所有处理条件下低于浮萍。2种植物分解1周后,氮磷比(N/P)均上升,说明TP的降解速率高于TN,1周后则波动不大。由此可见,无论是漂浮植物还是沉水植物,磷的分解速率在1周之内最快,漂浮植物浮萍TP的降解速率高于沉水植物马来眼子菜。由结果可知,与沉水植物马来眼子菜相比,漂浮植物浮萍释放到水体的TP更多。 展开更多
关键词 漂浮植物 沉水植物 浮萍 马来眼子菜 降解
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牛病毒性腹泻病毒检测研究进展 预览 被引量:3
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作者 薛麒 吴思捷 +4 位作者 张莹辉 康凯 春生 姚文生 陈小云 《中国畜牧兽医文摘》 2017年第7期73-74,184共3页
牛病毒性腹泻病给养牛业造成了很大的经济损失,检测牛病毒性腹泻病毒对于养牛业的发展非常重要。本文综述了近年来检测牛病毒性病毒的检测方法,并归纳这些方法的优缺点。建议检测人员结合该病诊断检测的实际需要,合理使用牛病毒性腹泻... 牛病毒性腹泻病给养牛业造成了很大的经济损失,检测牛病毒性腹泻病毒对于养牛业的发展非常重要。本文综述了近年来检测牛病毒性病毒的检测方法,并归纳这些方法的优缺点。建议检测人员结合该病诊断检测的实际需要,合理使用牛病毒性腹泻病毒的各种检测方法。 展开更多
关键词 牛病毒性腹泻病毒 检测 进展
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