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1株犬副流感病毒的分离鉴定及生物学特性研究 预览
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作者 刘畅 秦彤 +5 位作者 梁琳 由欣月 王春凤 钱爱东 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2019年第3期891-897,共7页
试验旨在分离鉴定犬副流感病毒(canine parainfluenza virus,CPIV),并对其生物学特性进行研究。用Vero细胞接种感染CPIV阳性犬肺脏组织,盲传4代,收集72h病毒液进行RT-PCR鉴定、电镜观察、血凝试验、热敏性试验、紫外照射试验及病毒一步... 试验旨在分离鉴定犬副流感病毒(canine parainfluenza virus,CPIV),并对其生物学特性进行研究。用Vero细胞接种感染CPIV阳性犬肺脏组织,盲传4代,收集72h病毒液进行RT-PCR鉴定、电镜观察、血凝试验、热敏性试验、紫外照射试验及病毒一步生长曲线的测定,同时扩增N基因进行序列分析,并构建系统进化树。结果显示,试验成功从出现咳嗽、流鼻涕等呼吸系统疾病症状的病犬肺脏中分离出1株CPIV,命名为CPIV-BJ01;RT-PCR扩增结果发现,在534bp处有特异性目的条带。病毒电镜观察发现,其超微结构呈圆形、有囊膜、直径在80~200nm之间;血凝试验显示,病毒在4和37℃均能凝集1%猪红细胞,与报道的CPIV血凝特性一致;病毒对热敏感,长时间高温下病毒毒价会随之下降;紫外照射可使病毒在短时间内对细胞的感染性急剧下降。病毒一步生长曲线测定结果显示,在12~48h病毒高速增殖,细胞培养液中病毒滴度急剧上升,之后趋于稳定。CPIVN基因序列与19株有代表性的副流感病毒N基因相比,其核苷酸序列同源性为97.1%~99.8%。遗传进化分析表明,CPIV-BJ01与PIV51168-1(登录号:KC237064.1)和PIV5ZJQ221(登录号:KX100034.1)位于同一分支上,亲缘关系较近。 展开更多
关键词 犬副流感病毒(CPIV) 分离鉴定 生物学特性 进化分析
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一株猫泛白细胞减少症病毒的分离鉴定及其VP2和NS1基因的变异分析 预览
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作者 刘琪 史利军 +5 位作者 梁琳 张玲玲 袁维峰 梁瑞英 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第5期1106-1112,共7页
为分析当前猫泛白细胞减少症病毒(FPLV)基因组遗传变异情况,对FPLV胶体金试纸条检测结果为阳性的猫粪进行病毒分离,通过血凝、分子生物学等试验对分离株进行鉴定。结果表明:病毒在CRFK细胞上盲传5代后产生明显细胞病变,电镜观察病毒粒... 为分析当前猫泛白细胞减少症病毒(FPLV)基因组遗传变异情况,对FPLV胶体金试纸条检测结果为阳性的猫粪进行病毒分离,通过血凝、分子生物学等试验对分离株进行鉴定。结果表明:病毒在CRFK细胞上盲传5代后产生明显细胞病变,电镜观察病毒粒子直径约25nm,分离病毒的血凝效价为1∶256,将分离株命名为FPLV BJ04。基因组扩增结果显示,FPLV BJ04基因组大小为5118bp。决定病毒宿主范围和抗原性的VP2蛋白系统进化树分析表明,FPLVBJ04株与2017年意大利分离株KX434462株位于同一分支;分离株的VP2、NS1基因与GenBank收录的FPLVVP2、NS1基因相似性分别为99.1%~99.5%和99.0%~99.5%。动物回归试验中攻毒组猫出现临床症状和病理变化。本研究对分离的FPLV北京流行株的VP2和NS1基因进行遗传变异分析,可为更好地预防和控制FPLV提供基础。 展开更多
关键词 猫泛白细胞减少症病毒 病毒分离鉴定 序列分析
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A型猪塞内卡病毒TaqMan荧光定量PCR方法的建立 预览
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作者 李秀博 刘存 +2 位作者 鄢明华 玉东 《中国动物传染病学报》 CAS 北大核心 2019年第3期33-38,共6页
本研究针对A型猪塞内卡病毒(Senecavirus A, SVA)基因组保守区域设计了特异性引物及探针,建立了快速检测SVA的Taq Man荧光定量PCR方法。结果显示,以构建的重组质粒为标准品建立的Taq Man荧光定量PCR方法,标准曲线具有良好的线性关系,线... 本研究针对A型猪塞内卡病毒(Senecavirus A, SVA)基因组保守区域设计了特异性引物及探针,建立了快速检测SVA的Taq Man荧光定量PCR方法。结果显示,以构建的重组质粒为标准品建立的Taq Man荧光定量PCR方法,标准曲线具有良好的线性关系,线性相关系数达0.9974;特异性良好,与口蹄疫病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒不存在交叉反应;对SVA核酸最低检测下限为3.75 copies/μL,而普通PCR最低检测下限为3.75×103 copies/μL;批内和批间的变异系数为均小于5%,重复性良好。本研究建立的SVA TaqMan荧光定量PCR方法为检测猪水疱性疾病病原提供了一种快速、灵敏的检测方法,为开展SVA流行病学调查提供了技术支持。 展开更多
关键词 A型猪塞内卡病毒 TaqMan荧光定量PCR 诊断
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犬细小病毒高效纳米PCR检测方法的建立及初步应用 预览
4
作者 秦彤 周灵 +5 位作者 由欣月 梁琳 史利军 张建伟 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第6期1268-1274,共7页
为建立灵敏、快速的犬细小病毒(CPV)检测方法,本研究针对CPVVP2基因保守序列设计一对能扩增574bp片段的特异性引物,对纳米PCR的退火温度、引物浓度等反应条件进行了优化,并对其特异性和灵敏度进行了评估。结果表明,所建立的纳米PCR特异... 为建立灵敏、快速的犬细小病毒(CPV)检测方法,本研究针对CPVVP2基因保守序列设计一对能扩增574bp片段的特异性引物,对纳米PCR的退火温度、引物浓度等反应条件进行了优化,并对其特异性和灵敏度进行了评估。结果表明,所建立的纳米PCR特异性和灵敏性良好,最低核酸检出量为2拷贝·μL^-1,其敏感性比常规PCR高1000倍。分别采用纳米PCR和常规PCR,对广西、北京、吉林送检的75份疑似CPV的临床样品进行检测,CPV阳性率分别为89.3%(67/75)和70.7%(53/75),表明该方法具有更高的敏感性,适用于CPV低含量临床样品的检测。本方法的建立为CPV感染的早期快速、灵敏、准确的诊断提供了新方法,为CPV的防控奠定基础,具有重大的临床应用意义和价值。 展开更多
关键词 犬细小病毒 VP2基因 纳米PCR 临床检测
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ICTV第十次病毒分类报告中对瘟病毒属的修定
5
作者 刘存 梁琳 《病毒学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第3期565-568,共4页
国际病毒分类委员会(International Committee on Taxonomy of Viruses,ICTV)在第十次病毒分类报告中对黄病毒科瘟病毒属的命名方法及病毒种进行了修定。为及时了解瘟病毒属命名方法及病毒种的新变化,本文通过对ICTV第十次病毒分类报告... 国际病毒分类委员会(International Committee on Taxonomy of Viruses,ICTV)在第十次病毒分类报告中对黄病毒科瘟病毒属的命名方法及病毒种进行了修定。为及时了解瘟病毒属命名方法及病毒种的新变化,本文通过对ICTV第十次病毒分类报告及相关文献的总结,对瘟病毒属病毒种的分类依据及命名方法进行了概括和介绍,有助于从事兽医工作的科研工作者及时了解病毒分类中瘟病毒属的新变化。 展开更多
关键词 国际病毒分类委员会(ICTV) 瘟病毒属 病毒分类
北京地区犬冠状病毒的分离鉴定及遗传进化分析
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作者 王静 秦彤 +5 位作者 由欣月 刘畅 史利军 梁琳 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2019年第1期92-98,共7页
采集北京地区宠物医院2~4周龄发生腹泻的幼犬粪便样品,经胶体金和PCR,将其初筛为犬冠状病毒(CCoV)阳性。然后,将其处理液接种于MDCK细胞和CRFK细胞,进行连续传代培养,出现特征性细胞病变。通过形态学观察、RT-PCR鉴定、间接免疫荧光试验... 采集北京地区宠物医院2~4周龄发生腹泻的幼犬粪便样品,经胶体金和PCR,将其初筛为犬冠状病毒(CCoV)阳性。然后,将其处理液接种于MDCK细胞和CRFK细胞,进行连续传代培养,出现特征性细胞病变。通过形态学观察、RT-PCR鉴定、间接免疫荧光试验,证明该分离株为犬冠状病毒,遂将其命名为CCoV BJ02株。针对M基因通过RT-PCR法鉴定分离株的基因型,证明其为CCoV-Ⅱ型。Reed-Muench法测得CCoV BJ02株的TCID50为10^-5.2/100μL。通过绘制一步生长曲线发现,该病毒在48小时左右收毒效果最好。遗传进化分析表明,CCoV BJ02株与日本分离株CCoV fc1株位于同一分支中,同源性最高,有较近亲缘关系。上述研究结果为深入了解北京地区CCoV的流行情况,给犬冠状病毒病的诊断、防治及后续研究奠定了基础。 展开更多
关键词 犬冠状病毒 分离鉴定 进化分析
猪瘟疫苗在猪场的免疫评估 预览
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作者 翟志安 《猪业科学》 2018年第3期48-50,共3页
在生猪养殖过程中,猪瘟属于常见疾病,具有较强的传染性,所以疫苗免疫成为防控猪瘟的关键措施。制定科学合理的免疫程序对猪瘟防控尤为重要。但实际生产中,猪场免疫效果,并不是太乐观,需要不断优化免疫程序。利用先进的试剂盒技术... 在生猪养殖过程中,猪瘟属于常见疾病,具有较强的传染性,所以疫苗免疫成为防控猪瘟的关键措施。制定科学合理的免疫程序对猪瘟防控尤为重要。但实际生产中,猪场免疫效果,并不是太乐观,需要不断优化免疫程序。利用先进的试剂盒技术来及时检测猪瘟疫苗的免疫效果以便及时调整疫苗使用种类,不断优化免疫程序减少经济损失。 展开更多
关键词 猪瘟免疫现状 免疫程序 试剂盒诊断 效果评价
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猫泛白细胞减少症病毒北京株NS1基因克隆与生物信息学分析 预览
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作者 刘琪 史利军 +3 位作者 袁维峰 梁瑞英 《中国畜牧兽医》 北大核心 2018年第12期3327-3336,共10页
为分析猫泛白细胞减少症病毒(FPV)北京株(FPV-BJ 05株)NS1基因的分子特征及其编码蛋白的生物学功能,本研究对FPV-BJ 05株NS1基因进行PCR扩增、克隆及序列测定。应用生物信息学软件分析FPV-BJ 05株与GenBank上登录的11株FPV参考株NS1基... 为分析猫泛白细胞减少症病毒(FPV)北京株(FPV-BJ 05株)NS1基因的分子特征及其编码蛋白的生物学功能,本研究对FPV-BJ 05株NS1基因进行PCR扩增、克隆及序列测定。应用生物信息学软件分析FPV-BJ 05株与GenBank上登录的11株FPV参考株NS1基因的同源性,并预测NS1蛋白理化性质、信号肽、跨膜结构、B细胞抗原表位、磷酸化位点、亚细胞定位及蛋白结构与功能、高级结构等。结果显示,NS1基因全长2 007bp,编码668个氨基酸,且与其他FPV分离株NS1基因核苷酸序列同源性为98.8%~99.3%,氨基酸序列同源性为97.9%~98.8%。系统进化树分析结果显示,FPV-BJ 05株NS1蛋白与GenBank上登录的3株FPV参考株处于同一大分支,但由于氨基酸的突变导致其属于独立的一小分支。NS1蛋白既无信号肽也无跨膜结构域,属于非分泌型的疏水性蛋白。B细胞抗原表位预测结果显示,NS1蛋白柔韧性较好,抗原性及表面可及性较高,预测该蛋白含有13个优势抗原位点。修饰结构预测表明,NS1蛋白含有62个潜在磷酸化位点,27个O-糖基化位点和2个N-糖基化位点。亚细胞定位结果显示,NS1蛋白在细胞质和细胞核的概率较高,分别为69.6%和17.4%。NS1蛋白二级结构中α-螺旋、延伸链、无规则卷曲和β-转角分别占39.37%、15.42%、39.37%和5.84%。应用在线软件SWISS-Modle对NS1蛋白进行建模,预测其三级结构,结果发现NS1蛋白主要以α-螺旋为主。本试验结果将为北京地区FPV免疫诊断及核酸疫苗研究提供理论依据。 展开更多
关键词 猫泛白细胞减少症病毒(FPV) NS1基因 生物信息学 蛋白结构预测
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水貂肠炎细小病毒及犬瘟热病毒灭活后的联合免疫效果
9
作者 高窦 梁琳 +6 位作者 卞赛赛 周灵 王静 杨双双 雷程红 刘维全 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2018年第1期5-8,共4页
目的探讨水貂肠炎细小病毒(mink enteritis virus,MEV)和犬瘟热病毒(canine distemper virus,CDV)灭活后的联合免疫效果。方法用甲醛灭活MEV-L和CDV-L弱毒株,固定MEV-L的血凝效价为2-6,与CDV-L病毒液(CDV-L TCID5010^-5.29/mL)分... 目的探讨水貂肠炎细小病毒(mink enteritis virus,MEV)和犬瘟热病毒(canine distemper virus,CDV)灭活后的联合免疫效果。方法用甲醛灭活MEV-L和CDV-L弱毒株,固定MEV-L的血凝效价为2-6,与CDV-L病毒液(CDV-L TCID5010^-5.29/mL)分别按1∶1(Ⅰ组)、1∶2(Ⅱ组)、1∶3(Ⅲ组)的量混合,加入10%氢氧化铝胶,充分混匀后免疫大鼠,均为1 m L/只。分别于免疫前及免疫后第7、14、30、60、90天采血,分离血清,采用血凝抑制(hemagglutination inhibition,HI)试验和间接ELISA检测血清MEV抗体效价,血清中和试验和间接ELISA检测血清CDV抗体效价。结果大鼠在免疫后7 d时产生MEV和CDV抗体,30 d时抗体效价最高,随后下降,90 d时抗体效价仍较高;Ⅰ组CDV抗体效价较其他两组高。结论3组不同比例的CDV和MEV联合免疫大鼠均可产生较高的抗体水平,其中以1∶1比例的免疫效果最佳。 展开更多
关键词 水貂肠炎细小病毒 犬瘟热病毒 病毒灭活 联合免疫
A型塞内卡病毒病原学、流行病学和诊断研究进展 预览 被引量:1
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作者 刘存 刘畅 +4 位作者 刘琪 王静 李秀博 梁琳 《猪业科学》 2018年第1期104-108,共5页
为了进一步了解A型塞内卡病毒的特征,通过查阅与A型塞内卡病毒相关的文献,对A型塞内卡病毒流行病学、致病性、诊断方法等方面进行综述,以期提高人们对A型塞内卡病毒的认识及防控意识。
关键词 A型塞内卡病毒 新发 小RNA病毒 猪特发性水疱病
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非洲猪瘟病毒流行病学和致病机制研究及防控对策 预览
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作者 雷程红 刘存 《猪业科学》 2018年第9期100-102,共3页
非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)引起猪的一种急性、高度接触性传染病.非洲猪瘟最早于1909年在非洲的肯尼亚检测到.当时报道ASF为一种急性出血性疾病,感染的家猪的死亡率可达10... 非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)引起猪的一种急性、高度接触性传染病.非洲猪瘟最早于1909年在非洲的肯尼亚检测到.当时报道ASF为一种急性出血性疾病,感染的家猪的死亡率可达100%.1957年前,ASF在撒哈拉以南的非洲暴发.从1957年开始ASF进入欧洲地区并在接下来的六七十年代在欧洲地区传播. 展开更多
关键词 非洲猪瘟病毒 防控对策 致病机制 流行病学 接触性传染病 欧洲地区 VIRUS 出血性疾病
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牛病毒性腹泻病毒SYBR Green荧光定量PCR方法的建立及其应用 预览
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作者 刘存 《现代畜牧兽医》 2018年第12期9-13,共5页
为了建立BVDV快速诊断方法,针对BVDV基因组5’UTR序列保守区域设计了荧光定量PCR引物,并建立了快速检测BVDV的荧光定量PCR方法。结果表明,以构建的重组质粒pMD-5’UTR为标准品建立的SYBRGreen荧光定量PCR方法标准曲线具有良好的线性关系... 为了建立BVDV快速诊断方法,针对BVDV基因组5’UTR序列保守区域设计了荧光定量PCR引物,并建立了快速检测BVDV的荧光定量PCR方法。结果表明,以构建的重组质粒pMD-5’UTR为标准品建立的SYBRGreen荧光定量PCR方法标准曲线具有良好的线性关系,线性相关系数达0.9973;敏感性试验结果显示,该方法敏感性较好,其最低检测下限为10拷贝。重复性试验结果显示,该方法批内和批间的变异系数为均小于5%,表明该方法的重复性良好。特异性试验显示,该方法与牛副流感病毒3型、牛传染性鼻气管炎病毒不存在交叉反应,但其不可区别鉴定BVDV与猪瘟病毒。应用所建立的SY-BRGreen荧光定量PCR方法测定非致细胞病变型BVDV(BVDV-BJ-2016株)分离毒株的一步生长曲线,发现在感染后12~48h为其对数生长期。该研究为研究非致细胞病变型生长特性提供了参考。 展开更多
关键词 牛病毒性腹泻病毒 荧光定量PCR方法 检测方法
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犬冠状病毒SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR检测方法的建立 被引量:2
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作者 王静 梁琳 +3 位作者 逄春华 罗亚坤 袁维峰 《中国兽医科学》 CSCD 北大核心 2017年第10期1207-1213,共7页
参考GenBank上登录的犬冠状病毒(CCoV)S基因的保守序列设计并合成1对特异性引物,建立了一种快速、灵敏和特异的SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR方法,用于CCoV的检测。特异性试验结果表明,该方法特异性强,与犬瘟热病毒、犬腺病毒2型、副流... 参考GenBank上登录的犬冠状病毒(CCoV)S基因的保守序列设计并合成1对特异性引物,建立了一种快速、灵敏和特异的SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR方法,用于CCoV的检测。特异性试验结果表明,该方法特异性强,与犬瘟热病毒、犬腺病毒2型、副流感病毒和犬细小病毒等无交叉反应;敏感性试验结果表明,它的最低检测限为4×10^1~5×10^1 copies/L,高于常规RT-PCR方法 10倍左右;批内和批间重复试验的变异系数均小于1.20%。利用该方法和普通RT-PCR方法分别对76份临床样品进行检测;结果显示,普通RT-PCR的阳性率为69.7%,实时荧光定量RT-PCR的阳性率为78.9%。对于60份阳性病料,随机选择2份病料进行病毒分离,用阳性血清中和其他外源病毒后都出现了CPE,进行RT-PCR扩增后测序,结果证实为CCoV。以上结果表明,本研究建立的方法可以为犬冠状病毒病的快速诊断及流行病学调查提供技术手段。 展开更多
关键词 犬冠状病毒 荧光定量RT-PCR S基因
猪流行性腹泻病毒环介导等温扩增检测方法的建立及应用 预览 被引量:10
14
作者 罗亚坤 梁琳 +5 位作者 王静 刘存 刘琪 刘畅 蔺文成 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2017年第2期344-349,共6页
试验旨在建立一种快速检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)的环介导等温扩增方法(LAMP),为诊断PEDV提供简便、敏感、准确可靠的工具。参考GenBank中PEDV基因序列(登录号:KT799997),针对PEDV N基因设计了6条引物,对所建立的LAMP反应体系... 试验旨在建立一种快速检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)的环介导等温扩增方法(LAMP),为诊断PEDV提供简便、敏感、准确可靠的工具。参考GenBank中PEDV基因序列(登录号:KT799997),针对PEDV N基因设计了6条引物,对所建立的LAMP反应体系、反应温度进行优化,建立可特异性扩增PEDV的LAMP方法。结果显示,本试验成功建立了PEDV LAMP检测方法,在60℃恒温下反应60min,能特异性地检测PEDV,检测限量为91拷贝/μL,比常规PCR方法的敏感性高100倍。对比75份临床样本的LAMP和常规RT-PCR法检测结果,显示两种方法符合率为97.3%。综上所述,本试验建立的LAMP方法具有特异性强、敏感性高,操作简单,设备要求低的特点,适用于PEDV临床样本的快速检测。 展开更多
关键词 猪流行性腹泻病毒 环介导等温扩增技术 检测
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犬腺病毒作为载体在疾病治疗和预防中的作用研究进展 预览 被引量:1
15
作者 李秀博 +1 位作者 王春仁 梁琳 《现代畜牧兽医》 2017年第9期54-58,共5页
犬腺病毒是目前已知哺乳动物腺病毒属中致病性最强的一种,且世界分布范围较为广泛。犬腺病毒分为Ⅰ型和Ⅱ型,Ⅱ型可插入外源基因,诱导免疫反应、进行有效基因转移,其取代h Ad V-5载体,作为高效、安全载体被广泛用于基因治疗与疫苗。本... 犬腺病毒是目前已知哺乳动物腺病毒属中致病性最强的一种,且世界分布范围较为广泛。犬腺病毒分为Ⅰ型和Ⅱ型,Ⅱ型可插入外源基因,诱导免疫反应、进行有效基因转移,其取代h Ad V-5载体,作为高效、安全载体被广泛用于基因治疗与疫苗。本文就犬腺病毒Ⅱ型的生物学特性、作为载体在基因治疗及疫苗的作用进行综述。 展开更多
关键词 犬腺病毒 Ⅱ型 载体 基因治疗 疫苗
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猪脑心肌炎病毒非结构蛋白3C的原核表达及生物信息学分析 预览 被引量:1
16
作者 罗亚坤 梁琳 +4 位作者 朱禹 王静 刘琪 刘存 《中国畜牧兽医》 北大核心 2017年第6期1588-1595,共8页
为获得猪脑心肌炎病毒(EMCV)3C蛋白并进一步了解其结构,本研究以EMCV HB10株的RNA为模板,通过RT-PCR扩增3C基因,将其克隆至pMD18-T载体,经PCR、双酶切和测序鉴定,挑选测序正确的质粒经双酶切获得目的片段并将其克隆至pET32a载体以构... 为获得猪脑心肌炎病毒(EMCV)3C蛋白并进一步了解其结构,本研究以EMCV HB10株的RNA为模板,通过RT-PCR扩增3C基因,将其克隆至pMD18-T载体,经PCR、双酶切和测序鉴定,挑选测序正确的质粒经双酶切获得目的片段并将其克隆至pET32a载体以构建重组原核表达质粒。将重组质粒转化至大肠杆菌TranSetta(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导后,SDS-PAGE检测目的蛋白表达情况,Western blotting检测纯化后3C蛋白及其对EMCV的反应原性。结果显示,成功克隆3C基因,长度为615bp,编码205个氨基酸。SDS-PAGE结果显示,3C蛋白主要以包涵体形式表达,His-3C蛋白大小约为40ku。Western blotting分析可知,纯化后His-3C蛋白条带单一,同时3C蛋白与EMCV细胞毒有良好的反应原性。经生物分析软件预测可知,EMCV 3C蛋白为非分泌蛋白,无跨膜区,有多个磷酸化位点,参与蛋白的水解过程。3C蛋白酶作为EMCV基因组编码蛋白中唯一的蛋白酶,在病毒复制的过程中具有不可或缺的作用。本研究成功构建了EMCV 3C蛋白原核表达载体并对其结构进行了预测,为进一步研究3C蛋白的作用及催化机理奠定基础。 展开更多
关键词 脑心肌炎病毒 3C蛋白酶 原核表达 生物信息学分析
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PCV2和PCV3双重纳米PCR方法的建立及初步应用 预览
17
作者 梁琳 逄春华 +5 位作者 罗亚坤 周灵 王静 刘畅 刘琪 《中国畜牧兽医》 北大核心 2017年第12期3440-3445,共6页
本研究旨在建立一种同时检测猪圆环病毒2型(PCV2)和猪圆环病毒3型(PCV3)的双重纳米PCR(nano dPCR)方法,同时应用该方法对PCV2和PCV3进行检测。参考GenBank中登录的PCV2和PCV3型基因序列分别设计特异性引物,对nano dPCR的反应条件进行优... 本研究旨在建立一种同时检测猪圆环病毒2型(PCV2)和猪圆环病毒3型(PCV3)的双重纳米PCR(nano dPCR)方法,同时应用该方法对PCV2和PCV3进行检测。参考GenBank中登录的PCV2和PCV3型基因序列分别设计特异性引物,对nano dPCR的反应条件进行优化;同时考察所建立的nano dPCR检测方法的特异性和敏感性。结果显示,所建方法的特异性和敏感性良好,对PCV2和PCV3两种病毒的最低核酸检测量分别为93.2和91.6拷贝/μL,其敏感性比普通PCR高100倍。应用该方法对送检的265份临床样本进行检测,结果显示,PCV2和PCV3在猪群中存在普遍感染,PCV3和PCV2的阳性率分别为16.6%和14.7%,混合感染阳性率为6.8%。临床样品的检测结果表明,本试验建立的nano dPCR方法为PCV2和PCV3早期感染进行快速、敏感鉴别诊断提供了新方法。 展开更多
关键词 双重纳米PCR 猪圆环病毒2型(PCV2) 猪圆环病毒3型(PCV3) 病原检测
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猪圆环病毒3型检测及其Cap结构序列和抗原性预测分析 预览 被引量:27
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作者 湛洋 王东亮 +5 位作者 王乃东 蒋一凡 黄坤 姜平 杨毅 《畜牧兽医学报》 CSCD 北大核心 2017年第6期1076-1084,共9页
近期报道在美国多个州的养猪场发现了一种新型的猪圆环病毒3型毒株(porcine circovirus 3,PCV3)。为了确定PCV3是否已经在我国南方部分省份的猪场中广泛存在,并对目前PCV2疫苗是否对PCV3感染具有交叉保护作用作出科学预测,笔者对... 近期报道在美国多个州的养猪场发现了一种新型的猪圆环病毒3型毒株(porcine circovirus 3,PCV3)。为了确定PCV3是否已经在我国南方部分省份的猪场中广泛存在,并对目前PCV2疫苗是否对PCV3感染具有交叉保护作用作出科学预测,笔者对我国南方几个省份疑似猪皮炎肾病综合征的病猪组织样品进行PCV3巢式PCR检测及其核衣壳蛋白质(capsid protein,Cap)结构的PyMol和抗原表位服务器在线模拟分析。结果首次在这些病料中检测到PCV3的存在,部分病料表现为PCV2和PCV3共感染的特性。对其Cap结构及抗原性分析发现,PCV2和PCV3表现出很大的差异。因此,推测PCV2和PCV3不具有交叉免疫保护的特性,新的疫苗研究和开发,对于将来控制PCV3流行是必要的。 展开更多
关键词 猪圆环病毒3型 皮炎肾病综合征 巢式PCR 核衣壳蛋白质
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CDV、CPV、CAV-2及CPIV多重PCR的建立及应用 预览
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作者 刘畅 逄春华 +6 位作者 刘存 王静 刘琪 梁琳 袁维峰 钱爱东 《中国动物检疫》 CAS 2017年第11期89-93,共5页
为建立一种快速检测犬瘟热病毒(CDV)、犬细小病毒(CPV)、犬腺病毒Ⅱ型(CAV-2)和犬副流感病毒(CPIV)的多重PCR方法,参照Gen Bank中的相关病毒基因序列,分别设计了4对引物,用于特异性扩增CDV H基因、CPV VP2基因、CAV-2 E3基因和C... 为建立一种快速检测犬瘟热病毒(CDV)、犬细小病毒(CPV)、犬腺病毒Ⅱ型(CAV-2)和犬副流感病毒(CPIV)的多重PCR方法,参照Gen Bank中的相关病毒基因序列,分别设计了4对引物,用于特异性扩增CDV H基因、CPV VP2基因、CAV-2 E3基因和CPIV NP基因上的目的片段。通过优化反应条件,建立了同时扩增CDV(410 bp)、CPV(253 bp)、CVA-2(655 bp)和CPIV(868 bp)的多重PCR方法。利用建立的多重PCR方法,对CDV、CPV、CAV-2、CPIV、CDV+CPV+CAV-2+CPIV和犬冠状病毒(CCV)的DNA或c DNA模板进行扩增,发现该方法的特异性良好。利用建立的多重PCR方法与单一PCR方法进行敏感性比较,发现两者敏感性相差10倍,证明多重PCR方法敏感性良好。利用该方法对从北京市采集的30份犬病料样品进行检测,发现CDV阳性率为63.33%(19/30)、CPV阳性率为33.33%(10/30)、CAV-2阳性率为6.66%(2/30)、CPIV阳性率为0(0/30)。检测结果证明建立的多重PCR方法可用于临床诊断。 展开更多
关键词 多重PCR 犬瘟热病毒 犬细小病毒 犬腺病毒Ⅱ型 犬副流感病毒
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水貂肠炎病毒VP2基因的原核表达及多克隆抗体的制备
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作者 卞赛赛 梁琳 +6 位作者 高窦 周灵 李沛然 杨双双 雷程红 刘维全 《中国兽医科学》 CSCD 北大核心 2017年第5期597-602,共6页
利用原核表达系统表达水貂肠炎细小病毒(MEV)VP2衣壳蛋白,以制备抗VP2超免疫血清。根据VP2的基因序列,设计1对特异性引物,以MEV全基因组重组质粒p B-MEV-L为模板,利用PCR技术扩增出MEV VP2片段,并定向克隆到pET-32a载体中,经酶切与序... 利用原核表达系统表达水貂肠炎细小病毒(MEV)VP2衣壳蛋白,以制备抗VP2超免疫血清。根据VP2的基因序列,设计1对特异性引物,以MEV全基因组重组质粒p B-MEV-L为模板,利用PCR技术扩增出MEV VP2片段,并定向克隆到pET-32a载体中,经酶切与序列测定,证明成功构建了VP2基因原核表达质粒pET-MEV-VP2。将其转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导后实现了高效表达。免疫印迹试验表明,获得的重组蛋白具有较好的反应原性。以该蛋白为免疫原免疫新西兰兔,制备抗血清,四免后用ELISA方法检测其效价达到1∶1 024。免疫荧光试验证明,获得的抗体具有良好的结合活性。为MEV的病原生物学研究奠定基础。 展开更多
关键词 水貂肠炎病毒 VP2 原核表达 抗血清
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