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SUMO-TAT-Klf4融合蛋白的原核表达及纯化
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作者 钟美娟 张华华 +6 位作者 项丽 周汝滨 曹定国 梁朋 张国平 何滔 《基因组学与应用生物学》 CAS CSCD 北大核心 2019年第3期977-982,共6页
Klf4是体细胞诱导成多能干细胞的重要转录因子之一,参与细胞增殖分化。本研究通过将小鼠Klf4基因、穿膜肽TAT以及小分子泛素样修饰蛋白SUMO融合并转入大肠杆菌Rosseta(DE3)中进行表达,经PCR鉴定和酶切验证后,用IPTG诱导后表达出约78kD... Klf4是体细胞诱导成多能干细胞的重要转录因子之一,参与细胞增殖分化。本研究通过将小鼠Klf4基因、穿膜肽TAT以及小分子泛素样修饰蛋白SUMO融合并转入大肠杆菌Rosseta(DE3)中进行表达,经PCR鉴定和酶切验证后,用IPTG诱导后表达出约78kD的融合蛋白,利用Ni-NTA亲和层析胶纯化获得了高质量的SUMO-TAT-Klf4蛋白,使用Western blotting检测显示特异性良好。本研究成功构建了pET3c-SUMO-TAT-Klf4原核表达载体,有利于获得大量的Klf4蛋白,并以期提高其穿透细胞膜的能力,为后续利用重编程因子融合蛋白诱导体细胞成为iPS细胞奠定基础。 展开更多
关键词 细Klf4 SUMO TAT 原核表达 蛋白纯化
小鼠c-Myc基因的克隆表达及其纯化 被引量:1
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作者 项丽 王申 +7 位作者 田海山 钟美娟 周汝滨 曹定国 梁朋 张国平 何滔 《中国生物工程杂志》 CAS CSCD 北大核心 2017年第2期20-25,共6页
目的:克隆小鼠c-Myc基因,构建原核表达载体并对其进行蛋白表达及纯化。方法:以TetO-FUW-OSKM质粒为模板经PCR扩增c-Myc基因,再通过基因重组技术与pET-3C载体相连转化大肠杆菌DH5α。经抗性筛选,PCR鉴定阳性重组子,测序正确后,重组质... 目的:克隆小鼠c-Myc基因,构建原核表达载体并对其进行蛋白表达及纯化。方法:以TetO-FUW-OSKM质粒为模板经PCR扩增c-Myc基因,再通过基因重组技术与pET-3C载体相连转化大肠杆菌DH5α。经抗性筛选,PCR鉴定阳性重组子,测序正确后,重组质粒转化大肠杆菌Rosetta(DE3),IPTG诱导蛋白表达,SDS-PAGE对重组蛋白进行鉴定分析。结果:DNA电泳结果证实PCR扩增产物与预期大小一致,DNA测序结果显示与GenBank公布的c-Myc基因序列一致,IPTG诱导SDS-PAGE电泳后,在分子量64kDa左右出现诱导后蛋白新增条带,与预测的c-Myc分子量大小一致。结论:成功地构建了pET3C-Myc原核表达载体,表达并纯化出了c-Myc蛋白,为今后研究c-Myc蛋白及相关蛋白诱导体细胞成多能干细胞打下基础。 展开更多
关键词 C-MYC基因 基因克隆 基因表达
番茄不同基因型对植株再生能力的影响 预览 被引量:1
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作者 薛萍 肖艳双 +3 位作者 徐岩 史俊卿 杜金霞 《陕西农业科学》 2016年第3期57-59,共3页
以浙粉202、GBS-傲兰六号、中域·胜宝、中杂九号、中蔬6号5个市售番茄品种为研究对象,设计正交试验对不同品种的植株再生情况进行比较,为后期提供优良的基因工程番茄材料奠定基础。以不同品种番茄的7日龄子叶和下胚轴为外植体诱导... 以浙粉202、GBS-傲兰六号、中域·胜宝、中杂九号、中蔬6号5个市售番茄品种为研究对象,设计正交试验对不同品种的植株再生情况进行比较,为后期提供优良的基因工程番茄材料奠定基础。以不同品种番茄的7日龄子叶和下胚轴为外植体诱导愈伤组织,继而将其诱导分化成再生植株,对不同番茄品种在种子发芽率、愈伤组织形成率、分化率及生根率方面进行比较。综合发芽率、愈伤诱导及器官再生这三方面因素,中蔬6号番茄的再生效率较高,并将其初步确定为遗传转化受体用于后期药用蛋白的表达。 展开更多
关键词 番茄 基因型 组织培养 再生植株
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番茄不同基因型对植株再生能力的影响 预览
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作者 薛萍 肖艳双 +3 位作者 徐岩 史俊卿 杜金霞 《陕西农业科学》 2016年第5期38-39,44共3页
以浙粉202、GBS-傲兰六号、中域·胜宝、中杂九号、中蔬6号5个市售番茄品种为研究对象,设计正交试验对不同品种的植株再生情况进行比较,为后期提供优良的基因工程番茄材料奠定基础。笔者以不同品种番茄的7日龄子叶和下胚轴为外植体... 以浙粉202、GBS-傲兰六号、中域·胜宝、中杂九号、中蔬6号5个市售番茄品种为研究对象,设计正交试验对不同品种的植株再生情况进行比较,为后期提供优良的基因工程番茄材料奠定基础。笔者以不同品种番茄的7日龄子叶和下胚轴为外植体诱导愈伤组织,继而将其诱导分化成再生植株,对不同番茄品种在种子发芽率、愈伤组织形成率、分化率及生根率方面进行比较。综合发芽率、愈伤诱导及器官再生这三方面因素,中蔬6号番茄的再生效率较高,并将其初步确定为遗传转化受体用于后期药用蛋白的表达。 展开更多
关键词 番茄 基因型 组织培养 再生植株
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FGF21腺病毒表达载体的构建及鉴定 预览
5
作者 严莉莉 项丽 +7 位作者 段杏华 曹定国 梁朋 张国平 丁银润 胡传银 郑克勤 《广东医学院学报》 2015年第1期39-44,共6页
目的构建成纤维生长因子21(FGF21)表达载体。方法将FGF21基因克隆到腺病毒穿梭质粒p AdTrack经DH5α感受态菌扩增,Pme I酶切后热激转化到含腺病毒骨架质粒p Ad Easy-1的BJ5183感受态菌内同源重组,经卡那霉素筛选及Pac I酶切鉴定,并在... 目的构建成纤维生长因子21(FGF21)表达载体。方法将FGF21基因克隆到腺病毒穿梭质粒p AdTrack经DH5α感受态菌扩增,Pme I酶切后热激转化到含腺病毒骨架质粒p Ad Easy-1的BJ5183感受态菌内同源重组,经卡那霉素筛选及Pac I酶切鉴定,并在DH5α菌中扩增得到Ad-FGF21重组腺病毒质粒,再经Pac I酶切线性化后转染到293A细胞包装成重组腺病毒。结果基因测序结果表明成功合成穿梭载体p Ad-Track-FGF21。PCR和酶切鉴定结果证实含FGF21基因的重组腺病毒表达载体构建成功。Ad-FGF21转染293A细胞并制备出高滴度的重组腺病毒。结论利用腺病毒表达载体获得了携带FGF21的重组腺病毒表达载体。 展开更多
关键词 腺病毒 成纤维细胞生长因子 基因治疗
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红花高效再生体系的建立 预览 被引量:1
6
作者 薛萍 付宏岐 +3 位作者 史俊卿 刘秀明 董圆圆 《人参研究》 2015年第1期28-30,共3页
目的筛选红花不定芽高效诱导条件,结合红花茎尖微嫁接技术,解决转基因红花再生效率低的问题。方法以新疆塔城裕民无刺红花的子叶作为外植体,子叶--愈伤组织--不定芽分化--伸长--生根/嫁接,分别对红花不定芽高效诱导培养基、伸长培养基... 目的筛选红花不定芽高效诱导条件,结合红花茎尖微嫁接技术,解决转基因红花再生效率低的问题。方法以新疆塔城裕民无刺红花的子叶作为外植体,子叶--愈伤组织--不定芽分化--伸长--生根/嫁接,分别对红花不定芽高效诱导培养基、伸长培养基和生根培养基进行筛选。结果确定了不定芽分化培养基:MS+1.0mg/L TDZ+0.5mg/L NAA,不定芽伸长培养基:MS+1%蔗糖,生根培养基:White+3mg/L IBA+Ag NO3 10mg/L+2%蔗糖+0.2g/L活性炭,生根率为12.5%;以14d红花实生苗做砧木,劈接法嫁接再生植株的成活率为53.3%。结论本研究采用不定芽高效诱导与茎尖微嫁接技术相结合的方法,成功的获得了再生植株。 展开更多
关键词 红花 不定芽诱导 再生体系
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Oleosin-bFGF融合基因转化红花 预览
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作者 薛萍 付宏岐 +4 位作者 史俊卿 李海燕 姜潮 李校堃 《中国油料作物学报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第6期759-765,共7页
利用油体蛋白融合技术,为实现oleosin-b FGF油体蛋白在转基因红花中表达奠定基础,通过农杆菌介导法将含有Ca MV35S启动子和oleosin-b FGF融合基因的T-DNA转入到红花基因组中,对潮霉素抗性红花植株的基因组进行PCR检测,提取抗性植株叶片... 利用油体蛋白融合技术,为实现oleosin-b FGF油体蛋白在转基因红花中表达奠定基础,通过农杆菌介导法将含有Ca MV35S启动子和oleosin-b FGF融合基因的T-DNA转入到红花基因组中,对潮霉素抗性红花植株的基因组进行PCR检测,提取抗性植株叶片总蛋白进行SDS-PAGE分析和Western blotting检测。PCR检测结果表明,目的基因已经转入到红花基因组,蛋白检测结果证明oleosin-b FGF融合蛋白在转基因红花叶片中有表达,但融合蛋白不稳定,发生降解。 展开更多
关键词 转基因红花 生物反应器 碱性成纤维细胞生长因子(b FGF) 油体蛋白
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大豆油体与EGF融合基因的克隆及其在红花种子中的表达 被引量:3
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作者 姜潮 +5 位作者 李文荣 冯治国 刘敏 楚生辉 李校堃 郑克勤 《中国生物工程杂志》 CAS CSCD 北大核心 2014年第4期71-77,共7页
目的:旨在建立一种在红花油体中表达EGF的转基因植物的方法。方法:通过PCR技术把大豆油体基因(DDoil)与EGF构建成融合基因,克隆至植物表达载体pcAMBIA1390R中,构建成植物表达载体p1390Do—EGF,然后转化进农杆菌LBA4404中用于侵... 目的:旨在建立一种在红花油体中表达EGF的转基因植物的方法。方法:通过PCR技术把大豆油体基因(DDoil)与EGF构建成融合基因,克隆至植物表达载体pcAMBIA1390R中,构建成植物表达载体p1390Do—EGF,然后转化进农杆菌LBA4404中用于侵染红花外植体,通过甘露糖筛选培养基培养可获得红花转化苗。通过PCR、实时荧光相对定量RT-PCR、SDS.PAGE和Westernblot分析目的基因的表达情况,通过MTT法检测EGF的促细胞增殖活性。结果:PCR结果显示,红花叶片中能检测到EGF基因;实时荧光相对定量R_T—PCR结果显示,在红花种子中EGF能成功实现转录;SDS—PAGE和Western blot检测证明,在转基因红花种子中能有效表达出EGF,并具有其原有的免疫原性,MTT法实验结果表明EGF具有促进balb/c3T3细胞增殖的生物活性。结论:大豆油体和EGF融合基因已经成功转化进红花细胞的基因组中,并实现了EGF外源蛋白在红花种子油体中的表达,为EGF蛋白的产业化生产探讨了一种新的生产途径。 展开更多
关键词 油体 表皮生长因子 转基因红花 融合基因
马铃薯X病毒载体介导的人成纤维细胞生长因子21(hFGF21)在烟草中的表达 预览 被引量:2
9
作者 付宏岐 薛萍 +1 位作者 杨莉芳 《西北农林科技大学学报:自然科学版》 CSCD 北大核心 2013年第4期45-51,共7页
【目的】利用马铃薯x病毒(PVX)表达载体(pgR107),在本氏烟草中表达人成纤维细胞生长因子21(Fibroblastgrowthfactor21,FGF21),旨在寻求一种低成本、方便、安全,且保持hFGF21蛋白生物活性的方法。【方法】将包含组氨酸(His)... 【目的】利用马铃薯x病毒(PVX)表达载体(pgR107),在本氏烟草中表达人成纤维细胞生长因子21(Fibroblastgrowthfactor21,FGF21),旨在寻求一种低成本、方便、安全,且保持hFGF21蛋白生物活性的方法。【方法】将包含组氨酸(His)标签序列的hFGF21smGFP融合基因和hFGF21基因克隆进PVX表达载体,构建重组表达质粒pgR107-HishFGF21-smGFP和pgR107-His—hFGF21。采用冻融法将质粒pgR107-HishFGF21-smGFP、pgR107-smGFP和pgR107His—hFGF21转入根瘤农杆菌GV3101中,通过农杆菌介导注射侵染接种本氏烟的叶片,采用SDS—PAGE、Westernblotting和EI。ISA检测hFGF21-smGFP和hFGF21蛋白的表达情况。烟草叶片表达的融合蛋白经Ni—NTA柱纯化后,再用重组牛肠激酶(rhEK)裂解,获得纯度较高的重组hFGF21活性蛋白。hFGF21调节葡萄糖吸收活性用微量化的GODPOD法检测。【结果】成功构建了植物病毒双元表达载体pgR107His—hFGF21-smGFP和pgR107-His—hFGF21。表型观察发现,侵染第7天,烟草外源蛋白积累最高,smGFP和hFGF21-smGFP蛋白的积累主要在细胞质中。SDs-PAGE、Westernblotting和EI。ISA分析表明,hFGF21重组蛋白可在烟草中有效表达,表达量高达500μg(鲜叶质量)。生物活性检测结果表明,纯化的hFGF21蛋白可以促进3T3-L1脂肪细胞对葡萄糖的吸收。【结论】利用PVX病毒载体,在本氏烟草中表达的重组hFGF21蛋白具备生物活性。 展开更多
关键词 成纤维细胞生长因子21(FGF21) 融合蛋白 烟草 马铃薯X病毒
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Mpl基因RNA干扰载体的构建及荧光显微镜筛选 预览 被引量:1
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作者 邹宇光 莫玉叶 +6 位作者 张强 杨芳 易文君 何国 喻巍巍 郑克勤 《贵阳医学院学报》 CAS 2012年第6期587-592,共6页
目的:建立荧光显微镜快速筛选对血小板生成素受体(Mpl)基因RNA干扰片段的方法。方法:通过体外重组技术将Mpl与绿色荧光蛋白(GFP)构建成融合基因,克隆进pDs载体中产生pDs-Mpl-GFP载体,将人u6启动子及5个MplshRNA发夹结构(shMpl-... 目的:建立荧光显微镜快速筛选对血小板生成素受体(Mpl)基因RNA干扰片段的方法。方法:通过体外重组技术将Mpl与绿色荧光蛋白(GFP)构建成融合基因,克隆进pDs载体中产生pDs-Mpl-GFP载体,将人u6启动子及5个MplshRNA发夹结构(shMpl-A,shMpl-B,shMpl-C,shMpl-D,shMpl-E)分别克隆至pDs-Mpl-GFP真核载体中,构建出针对Mpl5个不同位点的RNA干扰载体,然后将获得的上述干扰载体通过脂质体方法转染至293T细胞中,用荧光显微镜观察293T细胞的荧光发光强度及荧光细胞数,判定构建的RNA干扰载体对靶基因RNA的干扰效果。结果:构建的5个干扰载体都能对转染的293T细胞中的Mpl-GFP融合基因进行有效的基因敲减作用,在pDs-Mpl-GFP-TK-U6-shMpl-A、pDs-Mpl-GFP-TK-U6一shMpl-B与pDs-Mpl-GFP-TK-U6-shMpl-E的干扰作用下,293T细胞中的荧光强度及发荧光细胞数目变得更少和更弱,干扰效果较好,而其它两个效果较差;在这三个较好的干扰载体中,pDs-Mpl-GFP-TK-U6-shMpl-A的干扰效果最好。结论:成功构建Mpl基因的真核RNA干扰载体,并筛选出有效的RNA干扰片段。 展开更多
关键词 绿色荧光蛋白 RNA干扰 基因融合
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医学细胞生物学教学方法浅谈 预览 被引量:1
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作者 《时代教育:教育教学刊》 2012年第7期 154-155,共2页
本文基于医科学生人才素质培养的要求,提出了以学生发展为中心,要着力提高学生的学习兴趣,激发学生的主动思维和创新能力。本文指出要综合运用多媒体辅助教学及适当的双语教学,对传统的教学模式要进行继承与发展,医学细胞生物学的教学... 本文基于医科学生人才素质培养的要求,提出了以学生发展为中心,要着力提高学生的学习兴趣,激发学生的主动思维和创新能力。本文指出要综合运用多媒体辅助教学及适当的双语教学,对传统的教学模式要进行继承与发展,医学细胞生物学的教学在理论中要注意讲授一些最新的科学发展情况,在实验教学环节中就加强培养学生的实验技能。本文对医学细胞生物学教学改革的相关方法进行了有益的探讨,对教学模式中诸多教学元素的优缺点进行了相应的阐述,取长补短,进一步深化医学细胞生物学教学改革,这对提高医学细胞生物学的教学效果有一定的促进作用。 展开更多
关键词 传统教学模式 启发式教学 多媒体辅助教学
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用流式细胞仪进行人核迁移蛋白shRNA有效干扰片段的分析和筛选 预览
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作者 廖霞 邹宇光 +5 位作者 郑克勤 周汝滨 曹定国 梁朋 胡传银 《南昌大学学报:医学版》 CAS 2012年第8期1-5,9共6页
目的为了更好地利用流式细胞仪筛选出有效的RNA干扰片段,构建了一系列真核表达载体pDs-NUDC-RFP-TK-U6-shNUDC-A、B、C、D、E、F、H。方法将NUDC-RFP融合基因克隆至pDs载体中,构建出pDs-NUDC-RFP.载体;将人U6启动子克隆至pDs-NUDC-RFP.... 目的为了更好地利用流式细胞仪筛选出有效的RNA干扰片段,构建了一系列真核表达载体pDs-NUDC-RFP-TK-U6-shNUDC-A、B、C、D、E、F、H。方法将NUDC-RFP融合基因克隆至pDs载体中,构建出pDs-NUDC-RFP.载体;将人U6启动子克隆至pDs-NUDC-RFP.载体中;将shNUDC-A、B、C、D、E、F、H各个片段分别克隆至含有U6启动子的载体中,形成一系列RNA干扰载体pDs-NUDC-RFP-TK-U6-shNUDC-A、B、C、D、E、F、H;将提取高质量的质粒通过脂质体方法转染293T细胞。用流式细胞仪分析转染的293T细胞的荧光强度和荧光细胞数量,用实时荧光相对定量RT-PCR(real-time PCR)检测NUDC-RFP mRNA的转录情况,用Western Blot法检测NUDC-RFP融合蛋白的表达水平。结果流式细胞仪检测结果显示:空白对照组的293T细胞无发光细胞;阴性对照组的293T细胞能正常发光,且发光细胞数量较多;实验组的293T细胞发光细胞数量少,荧光强度低,说明其能有效干扰NUDC-RFP融合基因的表达,pDs-NUDC-RFP-TK-U6-shNUDC-F干扰下调效果约90%左右;pDs-NUDC-RFP-TK-U6-shNUDC-A可干扰hNUDC-RFP融合基因的表达,下调效果约85%左右;其他干扰片段pDs-NUDC-RFP-TK-U6-shNUDC-B、C、D、E、H下调效果在62%~75%;阴性对照组对融合基因无干扰效果;流式细胞仪检测结果与real-time PCR检测结果一致,也与Western Blot法的鉴定结果基本符合,并确定了shNUDC-F为RNA干扰效果最佳的干扰片段。结论流式细胞仪分析方法是一种有效的带荧光标记的RNA干扰载体的筛选方法,为后期研究打下了基础。 展开更多
关键词 人核迁移蛋白 红色荧光蛋白 融合基因 流式细胞仪
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人核迁移蛋白shRNA慢病毒载体的构建及转导
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作者 廖霞 +5 位作者 郑克勤 周汝滨 梁朋 曹定国 张国平 李文荣 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2012年第7期688-690,695共4页
目的:通过绿色荧光蛋白(GFP)标记,构建可示踪的人核迁移蛋白(hNUDC)慢病毒RNA干扰载体,并实现其对靶细胞的转导。方法:通过分子克隆技术将人核迁移蛋白的发夹RNA(shNUDC-F)克隆至慢病毒表达载体中,构建成靶向针对hNUDC的RNA... 目的:通过绿色荧光蛋白(GFP)标记,构建可示踪的人核迁移蛋白(hNUDC)慢病毒RNA干扰载体,并实现其对靶细胞的转导。方法:通过分子克隆技术将人核迁移蛋白的发夹RNA(shNUDC-F)克隆至慢病毒表达载体中,构建成靶向针对hNUDC的RNA干扰载体,通过磷酸钙转染法,将获得的慢病毒高纯度质粒转染进低次代293T细胞中进行包装,通过高速离心收获慢病毒颗粒,经滴度测定后,对Dami巨核细胞进行转导实验。用显微镜观察转导效率,用Westernblot检测RNA干扰效果。结果:慢病毒携带的shNUDC-F片段对Dami巨核细胞能高效转导,并使其内源hNUDC基因发生基因沉默,干扰效果较好。结论:成功构建出慢病毒hNDUCRNA干扰载体,并在293T细胞中实现包装并成功转入Dami细胞。 展开更多
关键词 慢病毒 RNA干扰 发夹RNA 巨核细胞
红花茎尖微嫁接技术研究 预览 被引量:5
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作者 付宏岐 辛梅 +3 位作者 宋金东 薛萍 史俊卿 《人参研究》 2012年第4期29-31,共3页
目的探讨红花茎尖微嫁接技术,为解决转基因红花植株生根困难问题提供一个新的途径。方法光照条件下培养红花实生苗用作砧木,以红花组培苗茎尖为接穗,采用劈接法和顶接法进行茎尖微嫁接试验,并对影响嫁接成活率的因素进行研究。结果成功... 目的探讨红花茎尖微嫁接技术,为解决转基因红花植株生根困难问题提供一个新的途径。方法光照条件下培养红花实生苗用作砧木,以红花组培苗茎尖为接穗,采用劈接法和顶接法进行茎尖微嫁接试验,并对影响嫁接成活率的因素进行研究。结果成功获得了红花茎尖微嫁接苗,并优化了嫁接的条件:选取苗龄为14 d的红花实生苗为砧木,嫁接成活率较高;采用劈接法进行茎尖微嫁接,效果较好,嫁接成活率可达56.7%,而顶接法成活率仅为16.7%。结论本研究建立了红花茎尖微嫁接的方法,获得了嫁接成活苗。 展开更多
关键词 红花 茎尖微嫁接 成活率
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人成纤维细胞生长因子-21的拟南芥油体表达系统构建 预览 被引量:1
15
作者 付宏岐 李海燕 +7 位作者 杨晶 薛萍 刘秀明 王艳芳 李营 李洪志 李校堃 《西北农林科技大学学报:自然科学版》 CSCD 北大核心 2011年第8期190-196,共7页
【目的】利用拟南芥(Arabidopsis thaliana)油体系统表达人成纤维细胞生长因子-21(Fibroblastgrowth factor-21,FGF21),为利用植物油体表达系统规模化生产FGF21奠定基础。【方法】以磷酸甘露糖异构酶(PMI)基因作为转基因植物的安... 【目的】利用拟南芥(Arabidopsis thaliana)油体系统表达人成纤维细胞生长因子-21(Fibroblastgrowth factor-21,FGF21),为利用植物油体表达系统规模化生产FGF21奠定基础。【方法】以磷酸甘露糖异构酶(PMI)基因作为转基因植物的安全筛选标记,将带有组氨酸标签的人源FGF21基因与大豆油体蛋白基因融合,克隆至大豆油体蛋白启动子驱动的表达载体pCAMBIA1390MDo(p1390MDo)上,构建植物双元表达载体p1390MDoFGF21。采用冻融法将植物双元表达载体p1390MDoFGF21转入农杆菌GV3101,花粉管导入法转化拟南芥,采用PCR检测、Southern blot筛选转基因拟南芥阳性植株(T0),并对FGF21蛋白在转基因拟南芥种子(T1)中的表达进行Western blot分析。【结果】成功构建了带PMI安全筛选标记的植物双元表达载体p1390MDoFGF21。PCR扩增和Southern blot分析结果表明,重组FGF21融合基因以单拷贝和多拷贝2种方式已整合到转基因拟南芥基因组中。BandScand 5.0软件和Western blot分析结果显示,FGF21融合蛋白约占转基因拟南芥种子可溶性蛋白的3.76%,并具有良好的免疫原性。【结论】FGF21融合基因已经转入拟南芥中,并在以PMI为选择标记的转基因拟南芥种子中成功高效表达。 展开更多
关键词 拟南芥 成纤维细胞生长因子-21 油体表达 磷酸甘露糖异构酶
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利用转基因番茄表达人成纤维细胞生长因子21(FGF21) 预览 被引量:4
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作者 付宏岐 李海燕 +7 位作者 杨晶 李洪志 薛萍 刘秀明 李营 王艳芳 李校堃 《西北农林科技大学学报:自然科学版》 CSCD 北大核心 2011年第7期163-170,共8页
【目的】在番茄中表达人成纤维细胞生长因子-21(Fibroblast growth factor-21,FGF21),为利用植物反应器规模化生产FGF21奠定基础。【方法】以甘露糖-6-磷酸异构酶基因(pmi)作为转基因植物的选择标记,将人源fgf21基因克隆至表达载体p... 【目的】在番茄中表达人成纤维细胞生长因子-21(Fibroblast growth factor-21,FGF21),为利用植物反应器规模化生产FGF21奠定基础。【方法】以甘露糖-6-磷酸异构酶基因(pmi)作为转基因植物的选择标记,将人源fgf21基因克隆至表达载体pCAMBIA1390RⅡ(简写为p1390RⅡ)上,构建重组表达质粒p1390 RⅡMFGF21。采用冻融法将质粒p1390RⅡMFGF21转入根瘤农杆菌EHA105,叶盘法转化番茄(Lycopersicon esculentum)"中蔬6号",采用PCR检测、Southern杂交筛选转基因番茄阳性植株,并对FGF21蛋白在转基因番茄叶片中的表达进行了Western blot分析。【结果】成功构建了带pmi安全选择标记基因的植物双元表达载体p1390RⅡMFGF21,在番茄中初步建立了以pmi为选择标记基因的遗传转化体系,共获得了26株转基因番茄植株,其中5株为阳性克隆,转化率为19.2%。采用PCR扩增和Southern blot分析进行检测,结果表明,重组fgf21基因已整合到转基因番茄基因组中。Western blot分析检测结果显示,FGF21蛋白在转基因番茄叶片中有一定水平的表达,并具有良好的抗原性。【结论】获得了以pmi为选择标记成功表达FGF21蛋白的转基因番茄遗传体系。 展开更多
关键词 农杆菌 成纤维细胞生长因子-21 甘露糖-6-磷酸异构酶 生物反应器 番茄 遗传转化
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大豆24kDa油体蛋白与人bFGF融合基因转化拟南芥的研究 预览 被引量:2
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作者 薛萍 +6 位作者 李洪志 李营 柳月英 于勤明 熊丽冬 李海燕 李校堃 《中国油料作物学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第4期 344-350,共7页
为探索大豆油体蛋白与人bFGF(碱性成纤维细胞生长因子)蛋白在植物油体中融合表达的可行性,以大豆总DNA为模板,通过PCR扩增得到大豆油体蛋白基因(Ddoil)及启动子(Ddprm),构建Ddprm启动的Ddoil基因与植物偏好密码子改造的bFGF基因... 为探索大豆油体蛋白与人bFGF(碱性成纤维细胞生长因子)蛋白在植物油体中融合表达的可行性,以大豆总DNA为模板,通过PCR扩增得到大豆油体蛋白基因(Ddoil)及启动子(Ddprm),构建Ddprm启动的Ddoil基因与植物偏好密码子改造的bFGF基因融合表达载体p1390Ddprm-Ddoil-bFGF,花侵染法转化拟南芥,对T2拟南芥抗性植株基因组进行PCR检测,对种子总蛋白进行SDS-PAGE分析、Western blot检测、ELISA检测及细胞活性测定,为bFGF在其他油料作物的油体系统的表达提供参考。 展开更多
关键词 大豆油体蛋白 碱性成纤维细胞生长因子(bFGF) 拟南芥
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haFGF改构体的温控表达及其活性测定 预览
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作者 付宏岐 +2 位作者 郑克勤 曹定国 周汝滨 《贵阳医学院学报》 CAS 2011年第4期 351-354,358,共5页
目的:构建温控表达载体,采用温控表达haFGF,为降低其生产成本打下基础。方法:采用PCR法扩增截去其N端19个氨基酸的haFGF DNA,克隆到温控表达载体PBV220中,然后转化进BL21(DE3)Star plysS中进行温控表达。结果:经SDS-PAGE和Western ... 目的:构建温控表达载体,采用温控表达haFGF,为降低其生产成本打下基础。方法:采用PCR法扩增截去其N端19个氨基酸的haFGF DNA,克隆到温控表达载体PBV220中,然后转化进BL21(DE3)Star plysS中进行温控表达。结果:经SDS-PAGE和Western blot分析表明,温控表达载体表达的haFGF具有其原来的免疫原性,MTT活性检测结果表明,haFGF纯化产物与野生型haFGF活性相当,差异无显著性(P〉0.05)。结论:成功构建了haFGF的温控表达载体,为提高目的蛋白的表达量和降低其生产成本打下基础。 展开更多
关键词 酸性成纤维细胞生长因子 基因克隆 温控表达 聚含酶链反应
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红色荧光蛋白核迁移蛋白shRNA干扰载体的构建 被引量:2
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作者 廖霞 +5 位作者 张强 杨芳 郑克勤 周汝滨 曹定国 邹宇光 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2011年第7期 740-743,共4页
目的:利用红色荧光蛋白(RFP),建立一种直观、快速筛选有效RNA干扰片段的方法。方法:通过分子克隆技术将核迁移蛋白(NUDC)与RFP构建成融合基因,克隆至真核表达载体pDs中,以实现其融合表达;同时,将人U6启动子及9个NUDC的发夹结构分... 目的:利用红色荧光蛋白(RFP),建立一种直观、快速筛选有效RNA干扰片段的方法。方法:通过分子克隆技术将核迁移蛋白(NUDC)与RFP构建成融合基因,克隆至真核表达载体pDs中,以实现其融合表达;同时,将人U6启动子及9个NUDC的发夹结构分别克隆至上述同一真核载体中,构建成一系列针对NUDC不同干扰位点的RNA干扰载体,通过采用酶切及DNA序列鉴定,然后转染293T细胞,通过荧光显微镜观察293T细胞的荧光发光强度及荧光细胞数。结果:酶切及测序结果证实质粒为所需的序列;荧光显微镜观察结果显示,shNUDC-A的干扰效果最好。结论:成功构建了含RFP的NUDC真核shRNA干扰载体。 展开更多
关键词 融合基因 RNA干扰 SHRNA
一种具杀菌功能的haFGF融合基因在毕氏酵母中的表达 预览
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作者 付宏岐 +5 位作者 郑克勤 廖霞 梁朋 曹定国 陈小萍 周汝滨 《南昌大学学报:医学版》 CAS 2010年第12期 53-57,共5页
目的构建一种双功能活性多肽,实现其在酵母中的表达。方法通过体外DNA重组技术将cecropin AD连接在haFGF的5′端,构建成融合基因CADAF,将其克隆到分泌表达载体pPICZαA上,然后转化到毕氏酵母受体菌X-33中进行甲醇诱导表达。结果经SDS P... 目的构建一种双功能活性多肽,实现其在酵母中的表达。方法通过体外DNA重组技术将cecropin AD连接在haFGF的5′端,构建成融合基因CADAF,将其克隆到分泌表达载体pPICZαA上,然后转化到毕氏酵母受体菌X-33中进行甲醇诱导表达。结果经SDS PAGE和Western blot分析,构建的CADAF基因在酵母中获得了表达,经抑菌实验及MTT实验结果表明,融合蛋白具有一定的抗菌功能和促细胞分裂活性。结论成功实现了haFGF与抗菌肽的在酵母中的融合表达,为多功能细胞生长因子在创伤治疗中的应用打下了基础。 展开更多
关键词 人酸性成纤维细胞生长因子 抗菌肽 融合基因 毕氏酵母
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