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脊尾白虾2种血蓝蛋白大亚基变体的克隆及功能分析 预览
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作者 窦全伟 李吉涛 +5 位作者 刘萍 李健 刘九美 孙东方 蔡影 《水生生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第1期37-44,共8页
为了探究血蓝蛋白的分子多样性,对脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)血蓝蛋白大亚基变体进行了研究。基于脊尾白虾转录组文库血蓝蛋白大亚基变体EcHcL1和2序列,利用RACE和生物信息学技术,对2种变体进行全长cDNA扩增和序列分析。结果发... 为了探究血蓝蛋白的分子多样性,对脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)血蓝蛋白大亚基变体进行了研究。基于脊尾白虾转录组文库血蓝蛋白大亚基变体EcHcL1和2序列,利用RACE和生物信息学技术,对2种变体进行全长cDNA扩增和序列分析。结果发现EcHcL1和2cDNA全长分别为2239和2132bp,编码685和676个氨基酸。EcHcL1和2氨基酸序列在进化上相对保守,且均具有血蓝蛋白的典型结构域,包括铜离子结合区域、保守His位点和Ig-like区等,其中EcHcL1多了一个酪氨酸酶结构域,推测可能与色素代谢及酚氧化酶活性有关。组织表达分布结果显示EcHcL1和2在血细胞、肝胰腺、肠、腹神经节、心脏、卵巢、眼柄、胃、鳃和肌肉等组织中均有表达,且均在肝胰腺和血细胞中表达较高。采用Real-timePCR方法对病原感染后2种变体的mRNA表达情况进行分析。结果发现,EcHcL1在金黄色葡萄球菌、副溶血弧菌和白斑综合征病毒(WSSV)胁迫脊尾白虾12—48h中出现较高表达量,最高表达量约为对照组的1.5—4倍;EcHcL2在胁迫后24—48h后,与对照组相比,表达量约上升2—9倍。由此说明,脊尾白虾血蓝蛋白大亚基变体与免疫防御密切相关,可能在抵抗病原微生物感染中发挥作用。 展开更多
关键词 脊尾白虾 血蓝蛋白大亚基 变体 表达分析
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三疣梭子蟹心激肽基因克隆及在低盐适应中的功能验证 预览
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作者 孙东方 吕建建 +3 位作者 高保全 蔡影 刘萍 《中国水产科学》 CAS CSCD 北大核心 2019年第2期261-270,共10页
采用RACE技术克隆获得三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)心激肽(CCAP)基因。该基因全长606 bp, 5¢端非编码区72bp,3¢端非编码区108bp,开放阅读框426bp,编码141个氨基酸,预测分子量15.6kD,理论等电点9.55。同源性分析表明,三疣梭子... 采用RACE技术克隆获得三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)心激肽(CCAP)基因。该基因全长606 bp, 5¢端非编码区72bp,3¢端非编码区108bp,开放阅读框426bp,编码141个氨基酸,预测分子量15.6kD,理论等电点9.55。同源性分析表明,三疣梭子蟹CCAP与拟穴青蟹(Scylla paramamosain)和蓝蟹(Callinectes sapidus)的CCAP同源性较高,分别为85%和82%。系统进化树分析显示,三疣梭子蟹与蓝蟹首先聚为一支,之后再与拟穴青蟹相聚。组织表达分析发现, CCAP基因在胸神经节中的相对表达量最高,其次是脑和眼柄组织。通过分析CCAP基因在低盐胁迫过程中的表达规律发现,低盐可显著改变CCAP在胸神经节中的表达模式,在24 h, 48 h和72 h实验组的表达量显著高于对照组(P<0.05),分别为对照组的1.73, 2.16和2.19倍。体外注射CCAP多肽可降低三疣梭子蟹在低盐条件下的死亡率,并诱发钠钾ATP酶(Na~+/K~+-ATPase)和V型ATP酶(V-ATPase)酶活力显著提高。本实验结果暗示CCAP通过调控Na~+/K~+-ATPase和V-ATPase活力以达到盐度适应的作用。 展开更多
关键词 三疣梭子蟹 甲壳动物心激肽 基因克隆 盐度胁迫 多肽注射
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脊尾白虾血蓝蛋白大亚基基因的克隆及表达分析 预览 被引量:2
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作者 窦全伟 李吉涛 +5 位作者 刘萍 李健 刘九美 孙东方 蔡影 《水生生物学报》 CSCD 北大核心 2018年第1期86-93,共8页
应用RACE技术克隆脊尾白虾血蓝蛋白大亚基基因,并通过攻毒实验揭示脊尾白虾血蓝蛋白基因的先天免疫防御作用,为脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)的免疫防治研究提供依据和思路。研究成功克隆了脊尾白虾血蓝蛋白大亚基基因全长cDNA序... 应用RACE技术克隆脊尾白虾血蓝蛋白大亚基基因,并通过攻毒实验揭示脊尾白虾血蓝蛋白基因的先天免疫防御作用,为脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)的免疫防治研究提供依据和思路。研究成功克隆了脊尾白虾血蓝蛋白大亚基基因全长cDNA序列,该大亚基cDNA全长2192 bp,开放式阅读框长2034 bp,5′非编码区长21 bp,3′非编码区长137 bp,将该基因命名为EcHcL。EcHcL编码667个氨基酸,前21个氨基酸组成信号肽,推测成熟肽的分子量为78.5 k D。Blast比对结果显示,由脊尾白虾血蓝蛋白EcHcL序列推导的氨基酸序列与日本沼虾、凡纳滨对虾血蓝蛋白氨基酸序列的同源性分别达到87%、73%,其M结构域氨基酸序列与斑节对虾、日本对虾等物种同源性性高达90%左右,由此推断该cDNA序列属于血蓝蛋白家族。组织表达分析结果显示,EcHcL基因在脊尾白虾鳃、卵巢、肝胰腺、心脏、肠、肌肉、胃、腹神经节、眼柄、血细胞中均有表达,肝胰腺中相对表达量最高。Real-time PCR分析发现EcHcL基因在金黄色葡萄球菌、副溶血弧菌和对虾白斑综合征病毒(WSSV)感染后脊尾白虾肝胰腺和血细胞中的表达量显著增加,并具有不同的时空表达模式,推测脊尾白虾EcHcL基因在免疫防御中具有重要作用。 展开更多
关键词 脊尾白虾 血蓝蛋白大亚基 基因克隆 表达分析
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三疣梭子蟹PtDNMT1基因的克隆及其在低盐适应中的表达分析 预览
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作者 吕建建 +2 位作者 孙东方 高保全 刘萍 《渔业科学进展》 CSCD 北大核心 2019年第1期92-100,共9页
甲基转移酶是维持基因组甲基化状态的重要基因,本研究利用SMART-RACE技术克隆了三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)甲基转移酶基因(PtDNMT1)。PtDNMT1基因cDNA序列全长5919bp,包括4832bp的开放阅读框,编码1610个氨基酸,预测分子量为1... 甲基转移酶是维持基因组甲基化状态的重要基因,本研究利用SMART-RACE技术克隆了三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)甲基转移酶基因(PtDNMT1)。PtDNMT1基因cDNA序列全长5919bp,包括4832bp的开放阅读框,编码1610个氨基酸,预测分子量为148.15kDa,理论等电点为4.68。结构预测发现,PtDNMT1有2个特殊的结构域,分别是锌指结构域(zf-CXXC)和甲基转移酶家族特有的Dcm结构域。进化树分析显示,PtDNMT1基因与昆虫类的DNMT基因聚为一支。组织表达分析发现,PtDNMT1基因在肝胰腺、鳃、卵巢、肌肉、胃、心脏、血液中均有表达,其中在肝胰腺中表达最高,卵巢和鳃次之。进一步研究了低盐胁迫后PtDNMT1基因在鳃、肝胰腺和肌肉组织中的表达变化规律为胁迫6h时鳃组织中PtDNMT1基因的表达即达到峰值(5.3倍),并一直持续到12h(4倍),随后逐步下降,在72h时仍显著高于对照组(2.3倍);PtDNMT1基因在肝胰腺中的表达规律类似于鳃,然而其达到峰值的时间稍晚于鳃(24h),且上调倍数高于鳃(8倍);低盐胁迫后PtDNMT1基因在肌肉中的表达最初呈现下调趋势,之后(24h)上调表达至峰值(2.2倍),且一直上调表达至72h。本研究首次克隆了PtDNMT1基因,根据其在各组织中的表达分布特征以及盐度胁迫后的表达变化情况,推测DNA甲基化在三疣梭子蟹低盐适应中发挥了重要作用。 展开更多
关键词 三疣梭子蟹 PtDNMT1 盐度胁迫 基因克隆 基因表达
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三疣梭子蟹UHRF1基因在胚胎、幼体和性腺发育过程中的表达分析 预览
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作者 蔡影 孟宪亮 +3 位作者 刘萍 李健 孙东方 《水生生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第2期291-297,共7页
为探讨泛素样含PHD和环指域蛋白1(UHRF1)基因在三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)发育过程中的作用,实验采用SMART RACE方法,克隆了三疣梭子蟹UHRF1(PtUHRF1)基因。该基因cDNA全长为2849 bp,开放阅读框(ORF)为2298 bp,预测其编码1... 为探讨泛素样含PHD和环指域蛋白1(UHRF1)基因在三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)发育过程中的作用,实验采用SMART RACE方法,克隆了三疣梭子蟹UHRF1(PtUHRF1)基因。该基因cDNA全长为2849 bp,开放阅读框(ORF)为2298 bp,预测其编码1个含有765个氨基酸的蛋白质。结构域分析显示,该蛋白质包含UBL、PHD、TTD、SRA、RING finger 5个功能结构域。同源分析表明,三疣梭子蟹PtUHRF1的氨基酸序列与其他物种有较高的同源性。qRT-PCR结果显示,PtUHRF1基因在三疣梭子蟹所有组织中均有表达,但在精巢中表达量显著高于其他组织。该基因在胚胎和幼体发育不同时期表达差异显著,在受精卵中的表达量最高,并显著高于胚胎发育其他时期,是多细胞时期表达量的2.5倍。PtUHRF1基因在性腺发育不同时期表达存在显著差异,在卵巢II期表达量达到峰值,之后逐渐下降;在精巢Ⅰ期的表达量最高,随着精巢发育逐渐下降。实验结果表明,PtUHRF1参与了三疣梭子蟹胚胎、幼体和性腺发育调控,为进一步深入研究该基因在三疣梭子蟹及甲壳动物生长发育中的作用提供参考。 展开更多
关键词 三疣梭子蟹 PtUHRF1 基因克隆 发育调控 表观遗传
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三疣梭子蟹甲基转移酶2基因克隆及在胚胎、幼体和性腺发育过程中的表达分析 预览
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作者 蔡影 孟宪亮 +3 位作者 刘萍 李健 孙东方 《中国水产科学》 CSCD 北大核心 2018年第5期928-935,共8页
本研究采用SMART RACE方法克隆了三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)Dnmt2(PtDnmt2)基因。该基因cDNA全长为1291 bp,开放阅读框为1203 bp,编码400个氨基酸。结构域分析显示,PtDnmt2基因有典型的C5-DNA甲基化酶结构域。同源分析表明,P... 本研究采用SMART RACE方法克隆了三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)Dnmt2(PtDnmt2)基因。该基因cDNA全长为1291 bp,开放阅读框为1203 bp,编码400个氨基酸。结构域分析显示,PtDnmt2基因有典型的C5-DNA甲基化酶结构域。同源分析表明,PtDnmt2氨基酸序列与其他物种有较高的同源性。系统进化分析显示,三疣梭子蟹PtDnmt2氨基酸序列与罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)Dnmt2关系最近。qRT-PCR结果显示,PtDnmt2基因在三疣梭子蟹所有组织中均有表达,在卵巢中表达量显著高于其他组织(P<0.05)。PtDnmt2基因在胚胎和幼体发育过程中的表达量随发育时期而变化,其在受精卵和多细胞时期无表达,从囊胚期开始出现,随着胚胎的发育表达量逐渐上升。在性腺发育不同时期PtDnmt2基因表达量存在显著差异,其在卵巢II期表达量最高,之后逐渐下降;在精巢中该基因的表达量随着精巢的发育逐渐上升,在IV期达到峰值。本研究结果表明,PtDnmt2基因参与了三疣梭子蟹胚胎、幼体和性腺发育调控。 展开更多
关键词 三疣梭子蟹 PtDnmt2 DNA甲基化 发育调控
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低盐胁迫下三疣梭子蟹蝗抗利尿肽基因的表达 预览
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作者 孙东方 吕建建 +2 位作者 高保全 刘萍 《中国水产科学》 CSCD 北大核心 2018年第5期967-975,共9页
本研究采用RACE技术克隆了三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)蝗抗利尿肽(neuroparsin,PtNP)基因。该基因全长1920 bp,5?端非编码区237 bp,3?端非编码区1373 bp,开放阅读框309 bp,编码102个氨基酸,预测分子量10.8 kD,理论等电点7.42... 本研究采用RACE技术克隆了三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)蝗抗利尿肽(neuroparsin,PtNP)基因。该基因全长1920 bp,5?端非编码区237 bp,3?端非编码区1373 bp,开放阅读框309 bp,编码102个氨基酸,预测分子量10.8 kD,理论等电点7.42。PtNP含有12个半胱氨酸残基,具十足目动物蝗抗利尿肽典型的特征。同源性和系统进化分析表明,PtNP与拟穴青蟹(Scylla paramamosain)NP4的同源性最高(89%),并且三疣梭子蟹与拟穴青蟹首先聚为一支。组织表达分析发现,PtNP基因在脑组织中的相对表达量最高,其次是鳃和眼柄,在卵巢、肌肉、心脏和肝胰腺中表达量较低或不表达。通过分析PtNP基因在低盐胁迫过程中的表达规律发现,低盐胁迫可显著改变PtNP基因在脑、鳃和眼柄组织中的表达模式,整体呈现上调表达趋势,其中在脑、鳃和眼柄中表达量分别最高上调至7.7倍、2.8倍和2.6倍,且存在显著差异(P<0.05)。去除眼柄后该基因在鳃中的表达呈上升趋势,且去除双侧眼柄组的表达量显著高于去除单侧眼柄组(P<0.05)。本研究结果表明PtNP基因在三疣梭子蟹盐度适应中可能发挥一定作用且受神经内分泌系统的调控。 展开更多
关键词 三疣梭子蟹 蝗抗利尿肽 基因克隆 盐度胁迫 去除眼柄 表达分析
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