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PK-15细胞敲除TANK结合激酶1基因促进猪伪狂犬病病毒复制的研究 预览
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作者 刘晓贺 巴根 +7 位作者 李坚 韩莹倩 张爽 明胜利 杜永坤 贝贝 杨国宇 王江 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第6期1239-1248,共10页
TANK结合激酶1(TBK1)是病毒感染时IRF3、IRF7磷酸化及Ⅰ型干扰素表达的关键酶,在抗病毒天然免疫应答和获得性免疫应答中发挥重要作用。为研究TBK1基因敲除对猪伪狂犬病病毒(PRV)复制的影响,首先利用CRISPR/Cas9技术构建猪TBK1基因稳定敲... TANK结合激酶1(TBK1)是病毒感染时IRF3、IRF7磷酸化及Ⅰ型干扰素表达的关键酶,在抗病毒天然免疫应答和获得性免疫应答中发挥重要作用。为研究TBK1基因敲除对猪伪狂犬病病毒(PRV)复制的影响,首先利用CRISPR/Cas9技术构建猪TBK1基因稳定敲除PK-15细胞系,并利用CCK-8检测敲除TBK1对PK-15细胞活力的影响。然后利用流式细胞术检测PRV-GFP荧光强度,用RT-qPCR检测PRV-gB、PRV-gE、PRV-TK、IL-1β、IFN-β和ISG15的转录水平,用Westernblot检测PRV-gB和PRV-gE蛋白表达水平,以及通过滴度测定检测子代病毒的感染力,综合评价TBK1基因稳定敲除PK-15细胞对PRV病毒复制的影响。结果显示:T7E1检测结果显示TBK1基因外显子2区的3个sgRNA靶位点均切出了目的条带,选取编辑效率最高的TBK1-sgRNA1细胞系进行单克隆化培养,获取6株稳定敲除TBK1基因的单克隆细胞,随机选取4号细胞株进行CCK-8检测,结果显示敲除TBK1对PK-15细胞活力无影响。流式检测结果显示PRV-GFP感染阳性细胞占总PK-15细胞的56.89%,PRV-GFP感染阳性细胞占总PK-15-TBK1-/-细胞的77.95%,表明PK-15-TBK1-/-细胞可以促进PRV-GFP复制。RT-qPCR及WB检测显示该细胞系可以促进PRVmRNA转录和蛋白表达。滴度测定结果显示,PRV-QXX在PK-15细胞复制后TCID50为10^6.8TCID50·0.1mL^-1,而在PK-15-TBK1-/-细胞中复制后TCID50为10^8.5TCID50·0.1mL^-1。另外,RT-qPCR结果显示该细胞系可以抑制PRV感染引起的IL-1β、IFN-β和ISG15转录上调。以上结果表明TBK1基因敲除PK-15细胞系促进PRV复制,可能与IL-1β、IFN-β和ISG15转录水平抑制有关。 展开更多
关键词 CRISPR/Cas9 TANK结合激酶1 基因敲除 猪伪狂犬病病毒
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干扰素调节因子3基因敲除对伪狂犬病病毒增殖的影响 预览
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作者 张爽 樊爽爽 +7 位作者 常雯茹 丁光绪 郭瑞珍 段利芳 杜永坤 贝贝 杨国宇 王江 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2019年第5期1253-1262,共10页
试验旨在研究敲除干扰素调节因子3 (interferon regulatory factor 3,IRF3)对伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)复制的影响。使用慢病毒介导的CRISPR/Cas9基因编辑技术建立了IRF3基因敲除PK15细胞系。通过构建重组质粒pIRF3-sgRNA,... 试验旨在研究敲除干扰素调节因子3 (interferon regulatory factor 3,IRF3)对伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)复制的影响。使用慢病毒介导的CRISPR/Cas9基因编辑技术建立了IRF3基因敲除PK15细胞系。通过构建重组质粒pIRF3-sgRNA,转染至HEK293T/17细胞,收获慢病毒并感染PK15细胞,经嘌呤霉素筛选获得多克隆细胞系,T7酶切鉴定后通过有限稀释法获得PK15-IRF3-/-单克隆稳定细胞系。为验证敲除IRF3基因稳定细胞系是否构建成功,采用实时荧光定量PCR、Western blotting方法检测PRV相关基因及蛋白的表达,应用荧光显微镜和流式细胞术观察病毒复制情况并进行病毒滴度检测。结果显示,PK15-IRF3-/-细胞系感染PRV-GFP后PK15-IRF3-/-细胞荧光强度明显强于PK15细胞。感染PRV野毒(PRV-QXX)后PK15-IRF3-/-病毒滴度明显强于PK15细胞,PRV的gE蛋白水平明显高于PK15细胞。在mRNA水平检测两种细胞中PRV TK基因的变化也得到相同的结果。进一步研究表明,在感染PRV-QXX后,PK15细胞中IFN-βmRNA会随着时间增加显著增高(P<0.05),但PK15-IRF3-/-细胞中IFN-βmRNA则无明显变化。上述结果表明,敲除IRF3基因后显著促进PRV的增殖,IRF3在病毒的复制中发挥着重要作用,为伪狂犬病的防控提供了新的方法和策略。 展开更多
关键词 干扰素调节因子3 (IRF3) 伪狂犬病病毒(PRV) CRISPR/Cas9
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萌发对薏米种子蛋白质营养价值的影响
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作者 贝贝 陈星光 +2 位作者 雷俊 邓丹雯 黄赣辉 《食品科技》 CAS 北大核心 2019年第4期61-65,共5页
通过研究萌发对薏米种子蛋白质营养价值的影响,实现更合理利用薏米种子的目的。测定不同萌发阶段薏米种子蛋白质含量和氨基酸含量,结果表明,经24、48、72 h萌发后的薏米种子蛋白质含量、氨基酸总量、必需氨基酸总量随萌发时间增长而增高... 通过研究萌发对薏米种子蛋白质营养价值的影响,实现更合理利用薏米种子的目的。测定不同萌发阶段薏米种子蛋白质含量和氨基酸含量,结果表明,经24、48、72 h萌发后的薏米种子蛋白质含量、氨基酸总量、必需氨基酸总量随萌发时间增长而增高,且在萌发时间48~72h时急剧增加。采用国际上通用的营养价值评价的方法,全面评价薏米种子蛋白在萌发0、24、48、72 h后的营养价值,结果表明,薏米种子蛋白的化学评分(CS)、氨基酸评分(AAS)、必需氨基酸指数(EAAI)、营养指数(NI)和必需氨基酸系数分(SRC)在萌发时间低于48 h时差异不显著,在48~72 h时明显升高。综上所述,薏米种子蛋白在萌发过程中营养价值得到了提高。 展开更多
关键词 薏米种子 蛋白质 氨基酸 营养价值
奶牛BTN1A1基因超表达促进乳腺上皮细胞脂滴合成
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作者 张梦璐 樊晓娜 +5 位作者 邢智洋 王月影 王江 贝贝 韩立强 杨国宇 《农业生物技术学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第5期856-863,共8页
嗜乳脂蛋白(butyrophilin subfamily 1 member A1, BTN1A1)作为一种脂滴蛋白,与乳脂肪球的形成和分泌有关。为研究奶牛(Bos taurus) BTN1A1基因超表达对乳腺上皮细胞脂滴合成的影响,本研究PCR扩增了奶牛BTN1A1基因的CDS,构建Lenti-BTN1A... 嗜乳脂蛋白(butyrophilin subfamily 1 member A1, BTN1A1)作为一种脂滴蛋白,与乳脂肪球的形成和分泌有关。为研究奶牛(Bos taurus) BTN1A1基因超表达对乳腺上皮细胞脂滴合成的影响,本研究PCR扩增了奶牛BTN1A1基因的CDS,构建Lenti-BTN1A1慢病毒重组载体,用包装好的病毒感染奶牛乳腺上皮细胞,通过嘌呤霉素筛选获得超表达BTN1A1的乳腺上皮细胞株,提取细胞DNA,对超表达细胞株进行基因型鉴定,采用qRT-PCR和Western blot分析细胞株中BTN1A1基因和蛋白的表达;用尼罗红对细胞脂滴进行荧光标记,分析BTN1A1超表达对细胞脂滴的影响,构建BTN1A1-pEGFP-N1载体,观察BTN1A1蛋白与脂滴的共定位。结果显示,克隆的BTN1A1基因CDS区序列大约1 580 bp,成功构建重组的BTN1A1慢病毒载体,用5 μg/mL嘌呤霉素筛选得到BTN1A1超表达细胞株,基因型鉴定表明细胞株基因组中成功插入BTN1A1基因;与对照组细胞相比,超表达细胞株的BTN1A1基因mRNA表达增加489倍(P<0.001),蛋白表达也明显增强;检测脂滴的荧光值发现,随着细胞培养时间的延长,BTN1A1超表达显著增加了细胞脂滴含量(P<0.01),共定位发现BTN1A1蛋白主要分布于细胞脂滴上。结果表明,超表达BTN1A1促进乳腺上皮细胞的脂滴合成。本研究为阐明奶牛乳腺上皮细胞的脂滴合成机制提供了基础数据。 展开更多
关键词 嗜乳脂蛋白 乳腺上皮细胞 超表达 脂滴
猪Gasp1和Gasp2基因对C2C12细胞分化的影响 预览
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作者 樊爽爽 张雪梅 +5 位作者 刘晓贺 刘姣扬 明胜利 贝贝 杨国宇 王江 《河南农业科学》 CSCD 北大核心 2018年第3期121-127,共7页
为研究猪Gasp1、Gasp2对成肌细胞分化的影响,采用RT-PCR技术从猪肌肉组织中扩增Gasp1和Gasp2基因片段,将其克隆入phi C31载体,构建重组质粒phi C31-Gasp1和phi C31-Gasp2。将重组质粒转染至C2C12小鼠成肌细胞,经嘌呤霉素筛选在荧光显微... 为研究猪Gasp1、Gasp2对成肌细胞分化的影响,采用RT-PCR技术从猪肌肉组织中扩增Gasp1和Gasp2基因片段,将其克隆入phi C31载体,构建重组质粒phi C31-Gasp1和phi C31-Gasp2。将重组质粒转染至C2C12小鼠成肌细胞,经嘌呤霉素筛选在荧光显微镜下观察,获得稳定表达Gasp1和Gasp2基因的细胞系后,应用CCK-8法检测细胞增殖能力。分别在细胞分化1、2、3、4、5 d时收集细胞,采用实时荧光定量PCR检测MyoD、MyoG、P21及MHC肌细胞分化相关基因的表达变化,进而分析Gasp1和Gasp2基因对肌肉分化的影响。结果显示,成功克隆了猪Gasp1和Gasp2基因,构建了phi C31-Gasp1和phi C31-Gasp2重组质粒,荧光显微镜下可见phi C31载体和Gasp1、Gasp2基因共转染的C2C12细胞表达强烈的绿色荧光,经CCK-8检测发现,过表达Gasp1、Gasp2基因对细胞的生长增殖影响为初期促进、后期抑制;实时荧光定量PCR检测结果表明,猪Gasp1和Gasp2可以促进细胞分化因子MyoD、MyoG、P21、MHC基因的表达。以上结果表明,Gasp1、Gasp2基因可以促进肌肉分化。 展开更多
关键词 猪Gasp1和Gasp2 基因克隆 真核表达 C2C12细胞分化
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奶牛SREBP1蛋白对FASN基因启动子的转录调控分析 被引量:1
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作者 张菡 朱河水 +6 位作者 樊晓娜 王林枫 王月影 王江 贝贝 杨国宇 韩立强 《农业生物技术学报》 CSCD 北大核心 2018年第4期652-659,共8页
脂肪酸合成酶(fatty acid synthase,FASN)是动物组织合成脂肪酸的关键酶,为研究奶牛(Bos taurus)FASN基因的调控机制,本研究从奶牛基因组DNA中克隆构建了3个不同片段长度的FASN基因启动子并分析其结构,在L02肝脏细胞中转染固醇调节... 脂肪酸合成酶(fatty acid synthase,FASN)是动物组织合成脂肪酸的关键酶,为研究奶牛(Bos taurus)FASN基因的调控机制,本研究从奶牛基因组DNA中克隆构建了3个不同片段长度的FASN基因启动子并分析其结构,在L02肝脏细胞中转染固醇调节元件结合蛋白1(sterol regulatory element binding protein1,SREBP1)真核表达载体和FASN启动子,Western blot检测SREBP1核蛋白的表达,双荧光素酶系统和q RT-PCR技术研究对FASN基因启动子活性的调控作用,结果发现,构建的pGL3-FSAN1、pGL3-FASN2和pGL3-FASN3启动子片段长度分别为177、255和399 bp,其中pGL3-FASN2和pGL3-FASN3包含SREBP1转录因子结合位点。在人(Homo sapiens)源L02肝脏细胞中转染SREBP1质粒后检测发现,SREBP1核蛋白表达升高。肝脏细胞中转染pGL3-FSAN1、pGL3-FASN2和pGL3-FASN3启动子并用SREBP1质粒处理后,pGL3-FASN2和pGL3-FASN3启动子活性极显著增加(P〈0.01)。与对照组相比,SREBP1处理后细胞FASN基因m RNA的表达显著增加1.67倍(P〈0.05)。本研究揭示奶牛SREBP1蛋白可以促进对FASN基因的转录激活。这一结果为研究奶牛FASN基因的转录调控机制提供了基础资料。 展开更多
关键词 肝脏细胞 脂肪酸合成酶 固醇调节元件结合蛋白(1SREBP1)
AAV-SaCas9敲除MSTN基因病毒的构建及鉴定 预览 被引量:1
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作者 汪新建 樊爽爽 +3 位作者 翁少亭 杨国宇 贝贝 王江 《河南农业科学》 CSCD 北大核心 2018年第1期118-121,共4页
为了研究肌肉生长抑制素(MSTN)的相关功能,应用分子生物学方法构建敲除MSTN的AAVSaCas9载体,通过转染293T细胞提取基因组后进行T7酶切鉴定、TA克隆及测序确定该基因的敲除效果;将鉴定正确的AAV-SaCas9重组质粒与pHelper质粒共转染AAV-... 为了研究肌肉生长抑制素(MSTN)的相关功能,应用分子生物学方法构建敲除MSTN的AAVSaCas9载体,通过转染293T细胞提取基因组后进行T7酶切鉴定、TA克隆及测序确定该基因的敲除效果;将鉴定正确的AAV-SaCas9重组质粒与pHelper质粒共转染AAV-293细胞3 d后,分离纯化病毒并用实时荧光定量PCR法检测病毒滴度。结果显示,成功构建了敲除MSTN基因的AAV-SaCas9重组载体,T7酶切和测序鉴定出sgRNA2位点可以对MSTN进行编辑,并成功将其包装成病毒,经荧光定量PCR鉴定病毒滴度为2.73×10~(12)vg/mL。 展开更多
关键词 肌肉生长抑制素基因 CRISPR-Cas9 腺相关病毒载体 293T细胞
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猪cripto促进C2C12细胞分化
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作者 樊爽爽 张雪梅 +7 位作者 郭珍珍 曾磊 鲁绍芳 鲁维飞 韩立强 贝贝 杨国宇 王江 《中国兽医学报》 CSCD 北大核心 2018年第4期802-808,共7页
应用分子生物学方法、荧光显微镜和实时荧光定量PCR技术,对cripto基因进行克隆、真核表达载体的构建,探讨cripto对C2C12细胞生长增殖的影响和肌细胞分化相关基因MyoD、MyoG、P21、MHC的表达变化。结果显示,phiC31cripto真核表达载体... 应用分子生物学方法、荧光显微镜和实时荧光定量PCR技术,对cripto基因进行克隆、真核表达载体的构建,探讨cripto对C2C12细胞生长增殖的影响和肌细胞分化相关基因MyoD、MyoG、P21、MHC的表达变化。结果显示,phiC31cripto真核表达载体构建成功,荧光显微镜下可见转染phiC31载体和(ripto基因共转染的C2C12细胞表达强烈的绿色荧光,且对细胞的生长增殖无显著性影响;Q_PCR检测MyoD、MyoG、P21、MHC结果证实,猪cripto可以促进细胞分化因子MyoD、MyoG、P21、MHC的表达。结果表明,本试验成功地构建了C2C12-phiC31fripto过表达细胞系,Q—PCR结果分析发现cripto基因可以促进肌肉分化,为进一步探索cripto基因在肌肉分化中的分子机制提供理论依据。 展开更多
关键词 肌肉生长抑制(MSTN)素 猪cripto基因 基因克隆 载体构建 C2C12细胞 真核表达 细胞分化
猴源cathepsin基因shRNA文库及其稳定敲减细胞系的构建 预览
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作者 魏宇双 刘姣扬 +7 位作者 韩莹倩 郭珍珍 刘晓贺 巴根 韩立强 王江 贝贝 杨国宇 《畜牧兽医学报》 CSCD 北大核心 2018年第6期1282-1290,共9页
目前关于组织蛋白酶(cathepsin)在猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)生活周期中发挥功能的研究较少。为了探究宿主细胞中cathepsin在PRRSV吸附、入侵、脱壳、生物合成、组装以及... 目前关于组织蛋白酶(cathepsin)在猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)生活周期中发挥功能的研究较少。为了探究宿主细胞中cathepsin在PRRSV吸附、入侵、脱壳、生物合成、组装以及释放过程中的作用,选取源于MA-104的非洲绿猴胚胎肾上皮细胞Marc145细胞系(对PRRSV易感);利用RNAi原理,构建了以pLKO.1为载体的cathepsin基因shRNA文库;并用puromycin筛选出稳定敲减cathepsin的细胞株。结果显示:本试验构建的cathepsin-shRNA文库包含45个克隆,涉及15种cathepsin基因,筛选出的稳定细胞株中相应cathepsin基因mRNA的表达量均有显著下降。这些细胞株的构建为进一步研究cathepsin在PRRSV生活周期中发挥的重要功能奠定了基础。 展开更多
关键词 CATHEPSIN SHRNA Marc145 慢病毒 稳定敲减细胞系
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猴源rab基因shRNA文库及其稳定细胞株的构建
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作者 郭珍珍 鲁绍芳 +7 位作者 樊爽爽 李国利 韩立强 鲁维飞 王江 陈丽颖 杨国宇 贝贝 《中国兽医学报》 CSCD 北大核心 2018年第3期469-475,共7页
为揭示Rab蛋白在猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)入侵进入宿主细胞后的功能,本研究以PRRSV易感的猴胚胎肾上皮细胞Marc-145为模型,构建了针对猴源rab基因的短发夹RNA(shRNA)文... 为揭示Rab蛋白在猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)入侵进入宿主细胞后的功能,本研究以PRRSV易感的猴胚胎肾上皮细胞Marc-145为模型,构建了针对猴源rab基因的短发夹RNA(shRNA)文库。此文库中的shRNA以pLKO.1为载体质粒,与pMD2.G和psPAX2包装质粒共同转染HEK293T/17细胞,获得慢病毒;利用慢病毒感染Marc-145,通过puromycin筛选获得稳定抑制猴源rab基因表达的细胞株。通过荧光定量PCR方法检测各细胞株中rab基因的敲减效率。本试验构建的文库包含187个克隆、涉及62种rab基因。荧光定量PCR结果证明,筛选出的稳定细胞株中相应rab基因mRNA的表达量均有显著下降。结果显示本试验成功构建了猴源rab基因shRNA文库并筛选出了稳定细胞株,可用于后续进一步研究Rab蛋白在PRRSV生活周期中发挥的重要功能。 展开更多
关键词 rab基因 shRNA文库 PRRSV 慢病毒 MARC-145细胞 稳定细胞系
豆渣梨渣曲奇饼干的研制 预览
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作者 杨洁 郝贵增 +2 位作者 江慧娟 陈星光 贝贝 《江西化工》 2018年第2期195-199,共5页
以豆渣、梨渣为原料,添加到曲奇饼干中,制成了具有豆渣、梨渣特有风味的曲奇饼干。通过单因素试验和正交实验确定了曲奇饼干的最佳比例:豆渣粉添加量8%,梨渣粉添加量8%,糖粉添加量28%,黄油添加量67%,蛋液14%,纯牛奶14%。由于添加豆渣粉... 以豆渣、梨渣为原料,添加到曲奇饼干中,制成了具有豆渣、梨渣特有风味的曲奇饼干。通过单因素试验和正交实验确定了曲奇饼干的最佳比例:豆渣粉添加量8%,梨渣粉添加量8%,糖粉添加量28%,黄油添加量67%,蛋液14%,纯牛奶14%。由于添加豆渣粉和梨渣粉使曲奇饼干组织结构受到了影响,通过曲奇饼干优化试验,确定出加入豆渣梨渣曲奇饼干的改良剂及其添加量:谷朊粉1%。最终产品的感官、理化性质、微生物含量均符合国家标准。 展开更多
关键词 豆渣 梨渣 曲奇饼干 研制
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奶牛SCAP基因的克隆,表达定位及对FASN基因启动子的转录调控
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作者 张菡 樊晓娜 +7 位作者 郭婉莹 郑月婷 王江 张超 贝贝 高腾云 杨国宇 韩立强 《基因组学与应用生物学》 CSCD 北大核心 2018年第9期3746-3752,共7页
固醇调节元件结合蛋白裂解激活蛋白(srebpcieavage activating protein,SCAP)是细胞脂肪合成酶的表达调控因子。本研究旨在肝脏L02细胞中研究SCAP对FASN基因启动子的转录调控作用,有助于进一步明确SCAP/SREBP1对于靶基因的转录调控机... 固醇调节元件结合蛋白裂解激活蛋白(srebpcieavage activating protein,SCAP)是细胞脂肪合成酶的表达调控因子。本研究旨在肝脏L02细胞中研究SCAP对FASN基因启动子的转录调控作用,有助于进一步明确SCAP/SREBP1对于靶基因的转录调控机制。本研究以荷斯坦奶牛组织c DNA为模板,克隆SCAP基因的编码序列,构建pc DNA3.1-SCAP表达载体,将SCAP表达载体转染L02肝脏细胞,采用荧光定量PCR检测SCAP基因m RNA在24 h、48 h、72 h的表达情况;采用免疫荧光的方法对SCAP标记,激光共聚焦观察SCAP蛋白的亚细胞定位;构建FASN基因启动子载体,转染至肝脏细胞,并分别转染pc DNA3.1-SREBP1和pc DNA3.1-SCAP作为处理,荧光素酶报告基因系统分析对FASN启动子活性的影响。结果发现克隆得到SCAP的PCR产物为3 836 bp的片段,通过与pc DNA3.1载体重组后获得pc DNA3.1-SCAP表达载体,经酶切和测序鉴定正确;将pc DNA3.1-SCAP载体转染肝脏细胞培养24 h、48 h、72 h后,Real-time PCR检测发现与对照组相比,48 h时细胞中SCAP基因m RNA的表达倍数增加了21倍(p〈0.001);激光共聚焦观察发现,DAPI染色的细胞核呈蓝色,免疫荧光标记的SCAP呈红色,二者融合后发现SCAP定位于细胞质;启动子活性检测发现,与对照组相比,SREBP1质粒处理的细胞FASN启动子活性增加了4.1倍(p〈0.001),而SCAP和SREBP1共同处理细胞FASN启动子活性极显著增加了7.4倍(p〈0.000 1)。试验克隆构建奶牛SCAP基因表达载体,亚细胞定位SCAP蛋白主要位于肝脏细胞质中,表明SCAP可以通过结合SREBP1促进FASN基因启动子的转录。 展开更多
关键词 奶牛 固醇调节元件结合蛋白裂解激活蛋白(SCAP) 肝脏细胞 细胞定位 转录调控
皇冠梨饮料的研制 预览
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作者 郝贵增 贝贝 陈星光 《饮料工业》 2017年第5期13-16,共4页
以皇冠梨为原料,研制皇冠梨饮料,探讨了皇冠梨汁的添加量、甜蜜素添加量、柠檬酸添加量、冰糖添加量对饮料品质的影响。在单因素实验的基础上进行正交试验,对饮料进行优化,最终确定了皇冠梨饮料的最佳配方,即皇冠梨汁添加量45%、甜蜜素... 以皇冠梨为原料,研制皇冠梨饮料,探讨了皇冠梨汁的添加量、甜蜜素添加量、柠檬酸添加量、冰糖添加量对饮料品质的影响。在单因素实验的基础上进行正交试验,对饮料进行优化,最终确定了皇冠梨饮料的最佳配方,即皇冠梨汁添加量45%、甜蜜素添加量0.04%、柠檬酸添加量0.05%、冰糖添加量1.25%。 展开更多
关键词 皇冠梨 饮料 研制 配方
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畜牧兽医类本科《分子生物学》理论及实践的改革探索 预览
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作者 王江 贝贝 +3 位作者 鲁维飞 张超 郑悦亭 杨国宇 《教育教学论坛》 2016年第10期94-95,共2页
分子生物学技术与畜牧兽医相结合是21世纪畜牧业发展的热点,给畜牧兽医业带来了广阔的发展前景。为了培养符合现代畜牧兽医需要的复合型人才,需重视《分子生物学》的理论及实践教学。本文针对《分子生物学》课程的教材内容、教学方法以... 分子生物学技术与畜牧兽医相结合是21世纪畜牧业发展的热点,给畜牧兽医业带来了广阔的发展前景。为了培养符合现代畜牧兽医需要的复合型人才,需重视《分子生物学》的理论及实践教学。本文针对《分子生物学》课程的教材内容、教学方法以及实验操作等方面提出探索性改革意见,以期提高学生的综合素质及竞争力。 展开更多
关键词 分子生物学 教学 探索
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猪TRIM11基因克隆及其促进猪伪狂犬病毒在体外增殖的研究 预览
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作者 宋爽 曾磊 +7 位作者 鲁绍芳 郭珍珍 鲁维飞 韩立强 王江 王月影 贝贝 杨国宇 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第6期1239-1246,共8页
为初步研究猪TRIM11的免疫学功能,以猪颌下淋巴结cDNA为模板扩增TRIM11基因cDNA并对该基因进行了蛋白质结构预测和组织表达谱分析,将该基因与PiggyBac载体相连获得真核表达载体PB-TRIM11,之后转染PK15细胞获得稳定表达细胞系。用猪伪狂... 为初步研究猪TRIM11的免疫学功能,以猪颌下淋巴结cDNA为模板扩增TRIM11基因cDNA并对该基因进行了蛋白质结构预测和组织表达谱分析,将该基因与PiggyBac载体相连获得真核表达载体PB-TRIM11,之后转染PK15细胞获得稳定表达细胞系。用猪伪狂犬病毒(PRV)刺激过表达TRIM11PK15细胞和对照组细胞后,于不同时间收获细胞上清,比较两组细胞上清中病毒滴度变化。结果表明,猪TRIM11的ORF长度为1 407bp,编码468个氨基酸,该氨基酸序列含有3个TRIM家族保守的结构域。组织表达谱分析显示,猪TRIM11在脂肪组织、肺的表达量较高,而在心、回肠、十二指肠、直肠中的转录量较低。成功克隆了猪TRIM11cDNA序列并构建了真核转录载体PB-TRIM11,qRT-PCR检测结果表明TRIM11在PK15细胞系中成功表达。检测感染PRV后过表达TRIM11PK15细胞和对照组细胞上清液病毒的TCID50发现过表达TRIM11组的病毒滴度始终高于对照组。过表达TRIM11有一定的促进PRV增殖的作用,为进一步研究猪TRIM11在天然免疫中的作用奠定了基础。 展开更多
关键词 三基序结合蛋白 猪伪狂犬病毒 病毒增殖 稳定细胞系
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使用phiC31整合酶构建奶牛INSIG1基因乳腺恒定表达细胞系
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作者 韩立强 王林枫 +6 位作者 王月影 朱河水 王江 贝贝 郑悦亭 张超 杨国宇 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第12期2135-2139,共5页
为了使用phiC31整合酶建立奶牛胰岛素诱导基因1(INSIG1)的稳定表达乳腺细胞系,首先从奶牛乳腺组织中克隆得到INSIG1基因的编码区,然后将克隆片段与phiC31载体进行BarnHI和KpnI双酶切构建INSIG1-C31真核表达质粒;将其与phiC31整合... 为了使用phiC31整合酶建立奶牛胰岛素诱导基因1(INSIG1)的稳定表达乳腺细胞系,首先从奶牛乳腺组织中克隆得到INSIG1基因的编码区,然后将克隆片段与phiC31载体进行BarnHI和KpnI双酶切构建INSIG1-C31真核表达质粒;将其与phiC31整合酶质粒共同转染到小鼠乳腺细胞中,采用嘌呤霉素筛选细胞,荧光显微镜观察细胞绿色荧光蛋白的表达,PCR鉴定细胞基因组中INSIG1基因的表达,荧光定量PCR检测细胞中INSIG1基因的表达。结果表明,试验成功构建INSIG1-C31真核载体,与phiC31整合酶共转染小鼠乳腺细胞,经过8mg/L嘌呤霉素筛选后获得完全表达绿色荧光蛋白的乳腺细胞系;对细胞系鉴定表明INSIG1基因已经整合到细胞基因组中,与对照组相比,INSIGl基因的mRNA表达丰度增加了597.98倍(P〈0.001)。本研究获得了稳定表达奶牛INSIG1基因的乳腺细胞系,为深入研究INSIGl基因功能打下基础。 展开更多
关键词 奶牛 胰岛素诱导基因1 phiC31整合酶 乳腺细胞
猪MC4R基因突变体真核表达载体的构建及功能研究 预览
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作者 韩立强 郭豫杰 +4 位作者 鲁维飞 张欣 贝贝 王江 杨国宇 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第4期679-685,共7页
为研究MC4R基因不同突变体的功能差异,本研究从猪肌肉组织中克隆得到MC4R基因的编码序列,将克隆片段与pcDNA3.1真核表达载体进行KpnⅠ和EcoRⅠ双酶切,连接形成重组表达载体MC4R1,将载体转染BHK细胞后Western blotting检测蛋白表达。通... 为研究MC4R基因不同突变体的功能差异,本研究从猪肌肉组织中克隆得到MC4R基因的编码序列,将克隆片段与pcDNA3.1真核表达载体进行KpnⅠ和EcoRⅠ双酶切,连接形成重组表达载体MC4R1,将载体转染BHK细胞后Western blotting检测蛋白表达。通过点突变法得到MC4R基因在707/892位点的3个突变载体,将突变载体瞬时转染到BHK细胞,采用免疫荧光对细胞进行标记,通过激光共聚焦显微镜和流式细胞检测荧光表达,结果发现,克隆的MC4R1基因序列长度大约1 000bp,在707/892位点序列为G/G,将构建的真核表达载体MC4R1转染BHK细胞,经过Western blotting检测发现MC4R1蛋白正常表达;通过点突变法得到在707/892位点突变的突变载体MC4R2(G/A)、MC4R3(A/G)、MC4R4(A/A),经过激光共聚焦观察荧光表达后发现,突变受体在细胞膜上均有正常表达,流式检测发现4个突变受体表达的荧光平均强度并没有显著差异(P〉0.05)。通过构建MC4R基因突变载体后发现,707/892位点突变对于MC4R受体在细胞膜的表达没有显著影响,其具体机制作用还需深入研究。 展开更多
关键词 黑素皮质素受体-4 突变体 表达
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奶牛SREBP1蛋白在乳腺上皮细胞的表达定位及对SCD1基因启动子的转录调控 预览 被引量:2
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作者 韩立强 王月影 +4 位作者 王林枫 朱河水 钟凯 贝贝 杨国宇 《中国农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2016年第24期4797-4805,共9页
【目的】固醇调节元件结合蛋白1(SREBP1)作为核转录因子,对于细胞脂肪合成酶基因的表达发挥着重要的调控作用。论文旨在奶牛乳腺上皮细胞中研究SREBP1对于SCD1基因启动子的转录调控作用,为进一步明确SREBP1对于靶基因的转录调控机制... 【目的】固醇调节元件结合蛋白1(SREBP1)作为核转录因子,对于细胞脂肪合成酶基因的表达发挥着重要的调控作用。论文旨在奶牛乳腺上皮细胞中研究SREBP1对于SCD1基因启动子的转录调控作用,为进一步明确SREBP1对于靶基因的转录调控机制提供理论基础。【方法】以荷斯坦奶牛乳腺组织的c DNA为模板,采用分段克隆的方法获得SREBP1基因的编码序列,通过重组酶与pc DNA3.1载体进行重组环化构建pc DNA3.1-SREBP1表达载体,将构建的载体测序验证后提取质粒,转染奶牛乳腺上皮细胞。以EIF3K基因为内参基因,采用荧光定量PCR检测SREBP1基因m RNA的表达差异;采用免疫荧光的方法对SREBP1进行标记,以DAPI复染细胞核,激光共聚焦观察SREBP1蛋白的亚细胞定位;转染含有不同调控元件的SCD基因启动子,同时转染1.0μg pc DNA3.1-SREBP1作为处理,荧光素酶报告基因系统分析启动子活性;分别转染0.25、0.5和1μg的pc DNA3.1-SREBP1载体,分析p GL3-SCD 2和p GL3-SCD3启动子活性与SREBP1之间的量效关系。【结果】分段克隆得到的PCR产物分别为1 170、1 116、363和900 bp的片段,经过与pc DNA3.1载体重组后获得pc DNA3.1-SREBP1表达载体,经酶切和测序验证,发现除1个无义突变外,与标准序列完全相同,整个序列长度达到3 510bp;将pc DNA3.1-SREBP1载体转染乳腺上皮细胞后,Real-time PCR检测发现与转染空载体的对照组相比,SREBP1基因的m RNA表达倍数增强130.4倍(P〈0.001);激光共聚焦观察发现,DAPI染色的细胞核呈蓝色,免疫荧光标记的SREBP1呈绿色,二者融合后呈现青色,共定位在乳腺上皮细胞核中;启动子活性检测发现,与p GL3-SCD1、p GL3SCD 2相比,SREBP1处理能够极显著增加p GL3-SCD3、p GL3-CD4启动子的活性(P〈0.001),分别比对照组提高了1.0倍和0.7倍,进一步分析发现,在用0.25—1μg的pc DNA3.1-SREBP1处理后,与p GL3-SCD2的启动子活性持续下降相比,p GL3-SCD3� 展开更多
关键词 奶牛 固醇调节元件结合蛋白1 乳腺上皮细胞 亚细胞定位 转录调控
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溶酶体与过氧化物酶体形成膜接触介导胆固醇转运 被引量:1
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作者 贝贝 宋保亮 《中国细胞生物学学报》 CAS CSCD 2015年第6期759-763,共5页
胆固醇是真核细胞中含量非常丰富的一类脂质小分子,其主要生物学功能是掺入到磷脂双分子层中,调节膜的性质。胆固醇在细胞内不同膜上的分布极不均匀而且高度动态运输,这对维持细胞的正常生命活动至关重要。然而,细胞内胆固醇运输的机制... 胆固醇是真核细胞中含量非常丰富的一类脂质小分子,其主要生物学功能是掺入到磷脂双分子层中,调节膜的性质。胆固醇在细胞内不同膜上的分布极不均匀而且高度动态运输,这对维持细胞的正常生命活动至关重要。然而,细胞内胆固醇运输的机制一直不清楚。针对这一胆固醇代谢领域的重要问题,同时也是一个基本的细胞生物学问题,通过巧妙设计、全基因组筛选,鉴定出341个参与细胞内胆固醇转运的候选基因,其中,过氧化物酶体相关基因被显著富集。进而发现溶酶体通过和过氧化物酶体相互接触,将胆固醇转移给后者。而介导该接触的分子分别是溶酶体上的Synaptotagmin VII(Syt7)和过氧化物酶体膜上的PI(4,5)P2磷脂。将这种新发现的溶酶体–过氧化物酶体膜接触命名为LPMC(lysosome-peroxisome membrane contacts)。过氧化物酶体功能缺失会导致一大类相关疾病—过氧化物酶体紊乱疾病,表现为发育和神经系统功能障碍,目前还没有有效的治疗手段。该工作第一次揭示在这些病人和小鼠模型的细胞中有大量胆固醇堆积,且该现象的出现大大早于神经症状,提示胆固醇堆积是过氧化物酶体紊乱疾病的发病原因之一。这项研究工作的意义在于:(1)发现了细胞内胆固醇运输的新途径;(2)揭示了过氧化物酶体这一细胞器的新功能;(3)证明胆固醇运输异常是导致过氧化物酶体紊乱疾病的病因之一,为治疗该类疾病提供了全新的思路。 展开更多
关键词 胆固醇 溶酶体 过氧化物酶体 Syt7 PI(4 5)P2
青年教师提高动物生物化学理论教学效果的方法 预览
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作者 王江 贝贝 杨国宇 《现代农业科技》 2014年第22期323-323,326共2页
动物生物化学是高等农业院校畜牧与兽医专业的一门必修专业基础课。针对该课程的特点并结合教学工作经验,阐述了提高动物生物化学理论教学的方法,以期为青年教师的教学工作提供借鉴。
关键词 动物生物化学 理论教学 青年教师 教学效果 方法
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