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重组谷氨酰胺转胺酶的表达、复性及纯化 预览 被引量:1
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作者 彭宝玉 +2 位作者 叶程 刘威 何冬兰 《华中农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第1期14-18,共5页
以吸水链霉菌基因组DNA为模板,通过PCR扩增得到谷氨酰胺转胺酶基因片段,构建pGEX-TGase重组质粒,并转化到大肠杆菌中得到重组菌BL21/pGEX-TGase。重组菌经乳糖诱导产生融合蛋白,并对诱导条件进行了优化。表达产物主要以包涵体形式... 以吸水链霉菌基因组DNA为模板,通过PCR扩增得到谷氨酰胺转胺酶基因片段,构建pGEX-TGase重组质粒,并转化到大肠杆菌中得到重组菌BL21/pGEX-TGase。重组菌经乳糖诱导产生融合蛋白,并对诱导条件进行了优化。表达产物主要以包涵体形式存在,采取稀释及尿素梯度液相色谱结合的方法,成功地实现了包涵体蛋白的复性。通过GST亲和柱纯化目的蛋白,得到酶活为29U/mg的电泳纯目的蛋白。 展开更多
关键词 谷氨酰胺转胺酶 乳糖诱导 包涵体蛋白 纯化 复性
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重叠延伸PCR法定点突变微生物产谷氨酰胺转氨酶基因 被引量:3
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作者 叶程 +3 位作者 王亚南 覃桂 代风娇 何冬兰 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2013年第5期670-674,共5页
目的 通过重叠延伸PCR法,定点突变微生物产谷氨酰胺转氨酶(Microbial transglutaminase,MTG)基因。方法 根据GenBank中登录的Streptomyces sp.H197基因中MTG序列及重叠延伸PCR定点突变技术的原理,利用DNA-MAN5.0软件设计引物,以提取的... 目的 通过重叠延伸PCR法,定点突变微生物产谷氨酰胺转氨酶(Microbial transglutaminase,MTG)基因。方法 根据GenBank中登录的Streptomyces sp.H197基因中MTG序列及重叠延伸PCR定点突变技术的原理,利用DNA-MAN5.0软件设计引物,以提取的Streptomyces sp.H197基因组DNA为模板,PCR扩增MTG基因,以扩增的MTG基因片段为模板,采用重叠延伸PCR技术对一个位点进行定点突变,胶回收PCR产物,与克隆载体pMD19-T连接后,转化感受态E.coliDH5α,提取质粒,经PCR及单、双酶切鉴定,并测序。结果 重叠延伸PCR产物可见含有酶切位点和突变位点的特异性片段;重组质粒pMD19-T-MTG经PCR及单、双酶切鉴定,证明构建正确;测序结果表明,与野生型序列比对,仅有一个碱基发生改变,即第773位腺嘌呤突变为胞嘧啶,突变位点与预期一致,实现了目标位点的定点突变。结论 重叠延伸PCR法对MTG基因序列预定位点突变成功,证明阳性克隆子含突变位点,为下阶段突变型功能表达奠定基础。 展开更多
关键词 谷氨酰胺转氨酶 重叠延伸聚合酶链反应 点突变
利用RT-PCR快速检测黄瓜绿斑驳花叶病毒 预览
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作者 彭宝玉 +2 位作者 余金龙 张莹 何冬兰 《湖北植保》 2012年第4期20-23,共4页
根据黄瓜绿斑驳花叶病毒(CGMMV)的外壳蛋白基因(CP基因)保守序列设计、合成引物,以感病西瓜、南瓜、玉米叶片组织总RNA为模板,进行cDNA合成和PCR扩增,并将扩增产物连接到pMD18-T载体上测序鉴定。核苷酸序列测定结果表明,此CP基因全... 根据黄瓜绿斑驳花叶病毒(CGMMV)的外壳蛋白基因(CP基因)保守序列设计、合成引物,以感病西瓜、南瓜、玉米叶片组织总RNA为模板,进行cDNA合成和PCR扩增,并将扩增产物连接到pMD18-T载体上测序鉴定。核苷酸序列测定结果表明,此CP基因全长为654个核苷酸,与已报道的CGMMV的CP基因同源性为97%-100%。RT-PCR方法为检测CGMMV提供了操作更为简便、特异性更强的快速、准确的检测鉴定方法,是一种控制该潜在危险性有害生物蔓延的有效途径。 展开更多
关键词 黄瓜绿斑驳花叶病毒 RT-PCR CP基因
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微生物谷氨酰胺转胺酶的乳糖诱导表达与纯化 预览 被引量:1
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作者 何冬兰 +2 位作者 叶程 黄俊 尚敏邦 《中南民族大学学报:自然科学版》 CAS 2012年第3期26-32,共7页
对已构建的工程菌株pET22b-MTG/E.coli BL21(DE3)进行质粒酶切和PCR鉴定,优化诱导温度、时间、pH和乳糖浓度等反应条件,采用乳糖自诱导培养基培养重组菌.并将重组菌上清液经凝胶过滤,离子交换及镍柱亲和层析后,对谷氨酰胺转胺酶纯化和... 对已构建的工程菌株pET22b-MTG/E.coli BL21(DE3)进行质粒酶切和PCR鉴定,优化诱导温度、时间、pH和乳糖浓度等反应条件,采用乳糖自诱导培养基培养重组菌.并将重组菌上清液经凝胶过滤,离子交换及镍柱亲和层析后,对谷氨酰胺转胺酶纯化和SDS-PAGE电泳分析.结果表明:谷氨酰胺转胺酶在28℃,添加乳糖为1.2g/L诱导18 h,pH为7.0,培养11.5 h时升温至50℃诱导1 h,再放至28℃培养,表达效果较好,超过IPTG诱导效果.纯化后酶活为7.5 U/mL,比活力为10.9 U/mg. 展开更多
关键词 谷氨酰胺转胺酶 乳糖 表达 纯化
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链霉菌H197 mtg基因毕赤酵母表达载体的构建与鉴定 预览
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作者 何冬兰 王亚南 +1 位作者 叶程 《中南民族大学学报:自然科学版》 CAS 2012年第1期 30-33,共4页
将酵母胞内表达质粒pPIC3.5k重组成带有谷氨酰胺转胺酶的新型表达载体pPIC3.5k/MTG,为谷氨酰胺转胺酶(MTG)在毕赤酵母中的表达研究提供了实验基础.利用PCR的方法扩增出MTG基因片段,将目的片段和质粒pPIC3.5k进行双酶切后进行连接,构... 将酵母胞内表达质粒pPIC3.5k重组成带有谷氨酰胺转胺酶的新型表达载体pPIC3.5k/MTG,为谷氨酰胺转胺酶(MTG)在毕赤酵母中的表达研究提供了实验基础.利用PCR的方法扩增出MTG基因片段,将目的片段和质粒pPIC3.5k进行双酶切后进行连接,构成重组质粒,然后转化至E.coli DH5α感受态细胞中,筛选阳性克隆,经测序证明为目的基因片段.结果表明:经过PCR和酶切均证明已经将目的片段转到酵母表达载体pPIC3.5k内. 展开更多
关键词 谷氨酰胺转胺酶 表达 载体 构建
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一种快速提取质粒DNA鉴别重组克隆的方法 预览
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作者 何冬兰 余金龙 +1 位作者 洁云 《中南民族大学学报:自然科学版》 CAS 2011年第1期 37-38,共2页
依据快检缓冲液筛选重组子克隆的方法,结合碱裂解法提取质粒DNA的原理,经过试验摸索,应用了快检缓冲液直接裂解菌液,电泳后筛选重组质粒的方法,避免了提取质粒鉴定等繁琐步骤,其结果与菌液PCR、质粒酶切鉴定结果一致,可快速筛选出重组克隆.
关键词 碱裂解法 快检缓冲液 重组质粒
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