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Vasorin蛋白特异单链DNA适配体的筛选与鉴定
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作者 李慧 王玮 +7 位作者 丁红梅 董洁 黄皑雪 罗昭锋 李洁 白琛俊 李少华 邵宁 《生物技术通讯》 CAS 2018年第4期459-464,共6页
目的:筛选能特异识别vasorin(VASN)蛋白的单链DNA(ss DNA)适配体并对其进行鉴定。方法:利用SPRSELEX技术筛选VASN蛋白特异ss DNA适配体,通过基因克隆测序、MEME在线软件和RNA structure软件分析富集文库序列并挑选出候选适配体序... 目的:筛选能特异识别vasorin(VASN)蛋白的单链DNA(ss DNA)适配体并对其进行鉴定。方法:利用SPRSELEX技术筛选VASN蛋白特异ss DNA适配体,通过基因克隆测序、MEME在线软件和RNA structure软件分析富集文库序列并挑选出候选适配体序列,利用EMSA、ELISA、流式细胞术对候选适配体进行特异性与亲和力鉴定。结果:经过5轮SELEX筛选,获得了与VASN蛋白特异结合的ss DNA适配体富集文库,合成候选适配体,经EMSA和ELISA检测分析,证实适配体V4-2能与VASN蛋白特异结合,而不与无关对照牛血清白蛋白结合,其平衡解离常数为281.3±103.7 nmol/L;流式细胞术证实V4-2能够特异识别高表达VASN蛋白的Hep G2细胞。结论:筛选获得特异识别VASN蛋白的ss DNA适配体V4-2。 展开更多
关键词 vasorin 指数富集的配基系统进化(SELEX) 适配体 单链DNA
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基质细胞衍生因子-1对骨髓间充质干细胞迁移能力及其信号轴的影响
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作者 宁宇 刘想忠 +5 位作者 许海甲 汪伟 杨傲飞 邵宁 邹季 李章华 《军事医学》 CSCD 北大核心 2018年第7期522-527,共6页
目的利用基质细胞衍生因子-1(SDF-1α)腺病毒载体,观察其对骨髓间充质干细胞(MSC)体外迁移能力及迁移信号轴缺氧诱导因子-1 (HIF-1α)/血管内皮生长因子(VEGF)/SDF-1α/趋化因子受体(CXCR4)的影响。方法将前期构建的Ad-SDF-1α、阴性对... 目的利用基质细胞衍生因子-1(SDF-1α)腺病毒载体,观察其对骨髓间充质干细胞(MSC)体外迁移能力及迁移信号轴缺氧诱导因子-1 (HIF-1α)/血管内皮生长因子(VEGF)/SDF-1α/趋化因子受体(CXCR4)的影响。方法将前期构建的Ad-SDF-1α、阴性对照Ad-GFP及CXCR4抑制剂AMD3100转染MSC。转染后48 h观察Ad-SDF-1α的转染效果,Transwell小室检测处理后MSC的迁移能力,q PCR检测各组MSC HIF-1α/VEGF/CXCR4的mRNA表达,Western印迹检测各组HIF-1α/CXCR4的蛋白表达,ELISA检测各组培养基上清VEGF表达水平。结果 Ad-SDF-1α转染效果良好;其细胞迁移数量较其他组多(P <0. 05),且Ad-SDF-1α组与Ad-SDF-1α+AMD3100组的细胞数量均较空白组多(P <0. 05),抑制剂AMD3100组细胞数量明显低于其他各组(P <0. 05);Ad-SDF-1α组及Ad-SDF-1α+AMD3100组的HIF-1α、VEGF及CXCR4 mRNA及蛋白表达水平显著高于空白组,差异有统计学意义(P <0. 05);而Ad-SDF-1α+AMD3100组的HIF-1α、VEGF及CXCR4 mRNA及蛋白表达水平表达水平较Ad-SDF-1α组低,差异有统计学意义(P <0. 05)。结论 Ad-SDF-1α可提高MSC的体外迁移能力,同时SDF-1α基因能促进HIF-1α、VEGF及CXCR4表达,因此MSC迁移能力的提高是通过HIF-1α/VEGF/SDF-1α/CXCR4信号轴实现的。 展开更多
关键词 骨髓间充质干细胞 Ad-SDF-1α 迁移能力
Ku70基因稳定敲除HeLa细胞株的建立及其生物学功能研究
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作者 李达 沈雪莲 +9 位作者 李少华 丁红梅 李慧 黄皑雪 耿介 王超男 白琛俊 张坦 董洁 邵宁 《生物技术通讯》 CAS 2018年第2期155-161,共7页
目的:利用CRISPR/Cas9技术构建人Ku70基因稳定敲除的HeLa细胞株,并检测其生物学功能。方法:设计并构建向导RNA载体pCas-gRNA和同源重组供体DNA载体pBackZero-T-Ku70,2种重组质粒共转染HeLa细胞,加入潮霉素B进行抗性筛选,通过基因... 目的:利用CRISPR/Cas9技术构建人Ku70基因稳定敲除的HeLa细胞株,并检测其生物学功能。方法:设计并构建向导RNA载体pCas-gRNA和同源重组供体DNA载体pBackZero-T-Ku70,2种重组质粒共转染HeLa细胞,加入潮霉素B进行抗性筛选,通过基因组PCR和Western印迹检验Ku70基因是否被敲除;进而,选择Ku70稳定敲除的细胞株,分别采用CCK-8和Transwell实验检测细胞增殖和迁移能力;此外,提取细胞总RNA,反转录成cDNA后用荧光定量PCR仪检测5种miRNA(hsa-miR-649、hsa-miR-544a、hsa-miR-562、hsa-miR-548a、hsa-miR-492)的表达水平。结果:gRNA表达质粒pCas-gRNA和DNA供体质粒pBackZero-T-Ku70构建成功;2种重组质粒共转染HeLa细胞,基因组PCR扩增出特异的基因重组DNA片段,Western印迹结果显示Ku70蛋白已基本无表达。细胞增殖和迁移实验显示敲除Ku70基因的HeLa细胞增殖和迁移能力均有所减弱。qRT-PCR结果显示,敲除Ku70基因致hsa-miR-649、hsa-miR-544a和hsa-miR-562水平有所升高,而hsa-miR-548a和hsa-miR-492水平未有明显变化。结论:获得Ku70基因稳定敲除的细胞株;Ku70蛋白可能参与了HeLa细胞增殖和迁移过程;其还可能调节部分miRNA的表达。 展开更多
关键词 CRISPR/Cas9技术 基因敲除 同源重组 Ku70基因 HELA细胞
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Vasorin基因稳定敲除HepG2细胞株的建立及其生物学功能研究
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作者 耿介 王超男 +9 位作者 李少华 丁红梅 李慧 黄皑雪 李洁 李达 白琛俊 张坦 董洁 邵宁 《生物技术通讯》 CAS 2018年第2期162-167,共6页
目的:利用CRISPR/Cas9技术建立人Vasorin(VASN)基因稳定敲除的HepG2细胞株,并研究VASN蛋白对细胞增殖和迁移等生物学功能的影响。方法:根据人VASN序列设计向导RNA,将其克隆至表达载体pCas-Guide,获得质粒pCas-gRNA;PCR扩增VASN... 目的:利用CRISPR/Cas9技术建立人Vasorin(VASN)基因稳定敲除的HepG2细胞株,并研究VASN蛋白对细胞增殖和迁移等生物学功能的影响。方法:根据人VASN序列设计向导RNA,将其克隆至表达载体pCas-Guide,获得质粒pCas-gRNA;PCR扩增VASN编码基因左、右同源臂及潮霉素B抗性基因,通过重叠PCR将三者拼接为一条片段,并克隆至载体pBackZero-T,获得质粒pBackZero-T-VASN;上述2种重组质粒共转染HepG2细胞,经潮霉素B筛选,通过基因组PCR、RT-qPCR和Western印迹实验检测VASN基因是否被敲除。利用CCK-8法和Transwell法检测VASN稳定敲除细胞株的增殖和迁移能力。结果:向导RNA表达质粒pCas-gRNA和DNA供体质粒pBackZero-T-VASN构建成功;基因组PCR结果显示,潮霉素B基因正确重组至VASN基因中;RT-PCR显示VASNmRNA水平显著降低,Western免疫印迹结果显示VASN蛋白表达水平显著降低;VASN稳定敲除细胞株的增殖和迁移能力比野生型细胞明显减弱。结论:构建了pCas-gRNA和pBackZero-T-VASN质粒,获得了VASN缺失的细胞株,验证了VASN蛋白参与细胞的增殖和迁移过程,为深度探讨VASN的生物学功能及其分子机制奠定了基础。 展开更多
关键词 CRISPR/Cas9技术 基因敲除 Vasorin(VASN)基因 细胞增殖 细胞迁移
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识别多种种属来源间充质干细胞核酸适配体的筛选及鉴定
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作者 郭晓华 李章华 +4 位作者 汪伟 董洁 丁红梅 李少华 邵宁 《军事医学》 CAS CSCD 北大核心 2017年第3期178-183,198共7页
目的筛选能识别多种属来源的间充质干细胞(MSC)的核酸适配体,并对其进行鉴定。方法从幼兔股骨骨片分离MSC并进行成骨、成脂诱导分化鉴定。以分离得到的兔源性MSC为筛选靶标,利用细胞SELEX技术筛选核酸适配体。将第5轮富集文库进行克... 目的筛选能识别多种属来源的间充质干细胞(MSC)的核酸适配体,并对其进行鉴定。方法从幼兔股骨骨片分离MSC并进行成骨、成脂诱导分化鉴定。以分离得到的兔源性MSC为筛选靶标,利用细胞SELEX技术筛选核酸适配体。将第5轮富集文库进行克隆、测序,利用RNA structure、MEME软件分析获得候选序列,利用流式细胞仪鉴定候选适配体与兔、大鼠、人源性MSC的结合。结果从兔股骨骨片分离得到的MSC可诱导向成骨、成脂分化。经过5轮SELEX筛选获得兔MSC富集文库。候选适配体5-1-12不仅结合兔MSC,也识别大鼠和人源性MSC。结论活细胞SELEX筛选获得与多种属来源MSC结合的核酸适配体5-1-12。 展开更多
关键词 间充质干细胞 适配体 活细胞-SELEX
miR-216b在体外培养细胞中加速长非编码RNAUCA1的降解 被引量:1
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作者 郑伟 郭晓华 +10 位作者 董洁 李少华 丁红梅 李慧 黄皑雪 夏伟 白琛俊 李达 耿介 李洁 邵宁 《生物技术通讯》 CAS 2017年第3期227-232,共6页
目的:探讨长非编码RNA(1ncRNA)UCA1作为miR216b的“分子海绵”结合miR-216b后的命运变化。方法:提取人HEK293T细胞基因组,以特异性引物PCR扩增UCA1基因并克隆至pcDNA6.0b载体,用氨苄西林抗性筛选阳性克隆,重组质粒pcDNA6-UCA1转... 目的:探讨长非编码RNA(1ncRNA)UCA1作为miR216b的“分子海绵”结合miR-216b后的命运变化。方法:提取人HEK293T细胞基因组,以特异性引物PCR扩增UCA1基因并克隆至pcDNA6.0b载体,用氨苄西林抗性筛选阳性克隆,重组质粒pcDNA6-UCA1转染HEK293T和HeLa细胞并鉴定其表达水平。向HEK293T和HeLa细胞转染miR-216b类似物,同时用放线菌素D抑制细胞转录,收取3个时间点的细胞总RNA并鉴定其完整性,反转录获得cDNA后,采用实时荧光定量PCR技术检测各时间点UCA1的水平,测定其半衰期。pcDNA6-UCA1转染细胞24h后,转染miR-216b类似物或miR-216b抑制剂,并使用放线菌素D抑制转录,收取3个时间点的细胞总RNA,qRT—PCR检测UCA1半衰期。结果:构建的pcDNA6-UCA1过表达质粒转入HEK293T细胞后,qRT—PCR检测UCA1表达水平显著提高;miR-216b能够降低细胞内源或外源过表达的UCA1稳定性,加速UCA1的降解,显著缩短其半衰期;使用miR-216b的抑制剂,UCA1的半衰期延长。结论:miR-216b能够加速lncRNA—UCA1的降解,为研究miRNA与lncRNA的相互作用提供了新的思路。 展开更多
关键词 UCA1 长非编码RNA miR-216b 降解
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LncRNA-GAS5抑制miR-21介导的非完全匹配靶mRNA降解 被引量:1
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作者 郑伟 董洁 +10 位作者 李少华 丁红梅 李慧 黄皑雪 夏伟 白琛俊 郭晓华 李达 耿介 李洁 邵宁 《生物化学与生物物理进展》 CSCD 北大核心 2017年第7期580-590,共11页
LncRNA-GAS5作为miR-21的"分子海绵",通过"吸收"miR-21从而调控miR-21对靶基因的抑制.此外,miR-21直接调控非完全匹配靶基因PTEN和TPM1的表达.我们首先在HEK293T和HeLa细胞中确认,miR-21通过碱基互补配对调控非完全匹配靶基因PTEN和... LncRNA-GAS5作为miR-21的"分子海绵",通过"吸收"miR-21从而调控miR-21对靶基因的抑制.此外,miR-21直接调控非完全匹配靶基因PTEN和TPM1的表达.我们首先在HEK293T和HeLa细胞中确认,miR-21通过碱基互补配对调控非完全匹配靶基因PTEN和TPM1的蛋白表达,但不影响PTEN和TPM1mRNA的水平.此外,过表达miR-21后,qRT-PCR检测PTEN和TPM1mRNA的半衰期,发现它们的半衰期显著缩短,miR-21加速PTEN和TPM1mRNA的降解.通过转染lncRNA-GAS5的过表达质粒,发现lncRNA-GAS5竞争性地与miR-21结合能够延长PTEN和TPM1mRNA的半衰期,而miR-21与lncRNA-GAS5碱基互补配对结合后,又对lncRNA-GAS5存在调节作用,减弱lncRNA-GAS5的稳定性并加速lncRNA-GAS5的降解.LncRNA-GAS5作为miR-21的"分子海绵"能够抑制miR-21对非完全匹配靶mRNAPTEN和TPM1的降解,同时,miR-21与lncRNA-GAS5结合后又存在对lncRNA-GAS5的反馈调节,这些相互作用机制的发现有助于了解lncRNA、miRNA、mRNA之间这个复杂又精细的调控环路. 展开更多
关键词 LncRNA-GAS5 MIR-21 PTEN TPM1 RNA稳定性
不同pH条件下高低致龋性变异链球菌sRNA SpR19及其潜在靶标GroEL的表达变化
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作者 胡桐楠 郑伟 +5 位作者 李少华 董洁 王心玲 王成龙 邵宁 储冰峰 《南方医科大学学报》 CSCD 北大核心 2017年第6期802-806,共5页
目的研究在不同pH培养条件下,变异链球菌菌株的sRNA SpR19及其潜在靶向的GroEL蛋白在不同致龋力菌株中的表达变化,探讨其作为高致龋变异链球菌的分子鉴别标志物的可能性。方法提取高致龋性变异链球菌的临床分离株(菌株17)和低致龋性... 目的研究在不同pH培养条件下,变异链球菌菌株的sRNA SpR19及其潜在靶向的GroEL蛋白在不同致龋力菌株中的表达变化,探讨其作为高致龋变异链球菌的分子鉴别标志物的可能性。方法提取高致龋性变异链球菌的临床分离株(菌株17)和低致龋性变异链球菌的临床分离株(菌株5)的总RNA,建库后进行高通量测序获得差异表达的sRNA;结合生物信息学与文献,挑选关键sRNA与蛋白进行不同致龋菌株表达水平的研究:qRT-PCR验证目的sRNA SpR19在pH5.5和pH7培养条件下不同致龋能力菌株中的表达水平;合成变异链球菌GroEL蛋白抗原多肽并制备多克隆抗体,Western blotting鉴定不同pH培养条件下高、低致龋菌中GroEL的表达水平;qRT-PCR验证不同pH培养条件下不同致龋能力菌株GroEL的mRNA的表达水平。结果生物信息学提示SpR19可能靶向GroEL的mRNA及上下游基因间区;不同pH条件下,相较于低致龋菌,高致龋菌中sRNA SpR19表达下降(P〈0.05),而GroEL蛋白与mRNA高表达(P〈0.05),二者表达趋势相反。结论不同pH条件培养的高致龋性变异链球菌中,sRNA SpR19均低表达,GroEL的蛋白水平与RNA水平均存在高表达,结合生物信息学分析提示sRNA SpR19可能通过靶向GroEL负调控变异链球菌的致龋能力。 展开更多
关键词 变异链球菌 GROEL SRNA SpR19 致龋
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乙醇刺激HepG2细胞分泌VASN蛋白的生物学功能研究
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作者 孙乐桥 王超男 +10 位作者 郑伟 黄皑雪 沈雪莲 丁红梅 李少华 李洁 李慧 白琛俊 郭晓华 董洁 邵宁 《医学分子生物学杂志》 CAS 2016年第2期63-67,共5页
目的:探究乙醇对HepG2细胞VASN蛋白表达与分泌水平的影响,及其对HUVEC细胞迁移的影响。方法乙醇刺激HepG2细胞,定量PCR ( qPCR)检测HepG2细胞VASN mRNA水平的变化, Western印迹检测HepG2细胞与细胞上清中VASN蛋白水平的变化。划... 目的:探究乙醇对HepG2细胞VASN蛋白表达与分泌水平的影响,及其对HUVEC细胞迁移的影响。方法乙醇刺激HepG2细胞,定量PCR ( qPCR)检测HepG2细胞VASN mRNA水平的变化, Western印迹检测HepG2细胞与细胞上清中VASN蛋白水平的变化。划痕愈合实验检测细胞共培养条件下,乙醇刺激的HepG2细胞培养上清对HUVEC细胞迁移的影响。结果 qPCR结果显示,乙醇可上调HepG2细胞VASN mRNA水平。 Western印迹结果显示,细胞VASN蛋白表达与分泌水平升高。划痕愈合实验结果表明乙醇刺激HepG2细胞VASN蛋白的分泌增加,可以促进HUVEC细胞的迁移。结论乙醇刺激导致HepG2细胞VASN蛋白表达水平和分泌水平升高,并可促进与其共培养的HUVEC细胞迁移。 展开更多
关键词 乙醇 肝癌 VASN蛋白 人脐静脉血管内皮细胞 细胞迁移
人vasorin蛋白胞外结构域单克隆抗体的纯化及应用
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作者 王超男 孙乐桥 +9 位作者 沈雪莲 李少华 李洁 丁红梅 李慧 黄皑雪 郭晓华 郑伟 董洁 邵宁 《生物技术通讯》 CAS 2016年第2期216-218,共3页
目的:纯化人vasorin(VASN)蛋白胞外结构域的单克隆抗体并鉴定。方法:用表达人VASN蛋白胞外结构域单克隆抗体的杂交瘤细胞免疫小鼠,收集腹水,纯化抗体;ELISA检测单抗的特异性和亲和力,Western印迹、免疫共沉淀、细胞免疫荧光等实验... 目的:纯化人vasorin(VASN)蛋白胞外结构域的单克隆抗体并鉴定。方法:用表达人VASN蛋白胞外结构域单克隆抗体的杂交瘤细胞免疫小鼠,收集腹水,纯化抗体;ELISA检测单抗的特异性和亲和力,Western印迹、免疫共沉淀、细胞免疫荧光等实验检测单抗的特异性与可能的用途。结果:纯化获得2株抗VASN胞外结构域单抗V20和V21,ELISA结果显示二者均特异性强、亲和力高;Western印迹显示2株单抗均可结合HepG2细胞中的VASN蛋白,以V20为佳;免疫共沉淀实验结果显示V21能够钓取HepG2细胞中的VASN蛋白及细胞培养上清中的分泌型VASN;免疫荧光实验结果显示V21能与HepG2细胞的VASN蛋白结合。结论:纯化获得2株抗人VASN胞外结构域单抗,为进一步研究VASN蛋白的生物学功能提供了实验工具。 展开更多
关键词 vasorin蛋白 胞外段结构域 单克隆抗体
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ADAM17在膜蛋白胞外结构域剪切机制中的作用
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作者 王超男 董洁 邵宁 《医学分子生物学杂志》 CAS 2016年第6期345-349,共5页
ADAM17蛋白属于解聚素金属蛋白酶家族,是Ⅰ型多结构域跨膜蛋白,表达于多种组织及肿瘤细胞中。该蛋白是剪切跨膜蛋白胞外结构域的关键蛋白,对膜结合型蛋白的翻译后修饰及蛋白活性的产生具有重要的调节作用,与免疫反应、肿瘤的发生发... ADAM17蛋白属于解聚素金属蛋白酶家族,是Ⅰ型多结构域跨膜蛋白,表达于多种组织及肿瘤细胞中。该蛋白是剪切跨膜蛋白胞外结构域的关键蛋白,对膜结合型蛋白的翻译后修饰及蛋白活性的产生具有重要的调节作用,与免疫反应、肿瘤的发生发展、神经发育、病毒传播及衰老等过程密切相关。对ADAM17跨膜蛋白胞外段的剪切功能及其生物学意义进行深入研究,对相关疾病的诊断与治疗具有重要的理论与临床应用价值。 展开更多
关键词 ADAM17蛋白 跨膜蛋白 胞外剪切 翻译后修饰
人肿瘤坏死因子α特异性结合miR-146b的新生物学特性研究
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作者 沈雪莲 李洁 +9 位作者 黄皑雪 王超男 孙乐桥 李少华 丁红梅 李慧 郭晓华 郑伟 董洁 邵宁 《生物技术通讯》 CAS 2016年第2期183-187,共5页
目的:探讨人肿瘤坏死因子α(TNF-α)作为micro RNA(mi RNA)结合蛋白的生物学特性。方法:Western印迹检测LPS激活的U937细胞中TNF-α蛋白表达水平,RT-PCR检测几种炎症相关的mi RNA在激活前后表达水平的变化;用RNA结合蛋白免疫共沉... 目的:探讨人肿瘤坏死因子α(TNF-α)作为micro RNA(mi RNA)结合蛋白的生物学特性。方法:Western印迹检测LPS激活的U937细胞中TNF-α蛋白表达水平,RT-PCR检测几种炎症相关的mi RNA在激活前后表达水平的变化;用RNA结合蛋白免疫共沉淀(RIP)技术钓取U937细胞中TNF-α结合的miRNA,RT-PCR检测RIP产物中上述几种mi RNA的含量;用凝胶阻滞实验检测TNF-α与mi RNA是否直接结合。结果:LPS激活的U937细胞中能检测到膜结合型和可溶性2种形式的TNF-α,细胞激活前后miR-16和miR-21的表达水平在检测的几种miRNA中最高,miR-146b和miR155次之;而RIP产物中miR-146b的水平在实验组和对照组中有显著差异,其他mi RNA差异不明显;凝胶阻滞实验结果显示miR-146b能与人TNF-α直接结合。结论:首次证实人TNF-α能够直接特异地结合miR-146b,提示TNF-α可能作为miRNA结合蛋白发挥生物学功能。 展开更多
关键词 人肿瘤坏死因子Α MICRORNA RNA结合蛋白 RNA结合蛋白免疫共沉淀
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哺乳动物细胞中不同长度非编码RNA识别靶分子的方式及生物学功能特性
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作者 李洁 黄皑雪 邵宁 《生命科学》 CSCD 2016年第5期562-568,共7页
非编码RNA(nc RNA)是指非蛋白质编码的其他所有RNA,大小为20~10 000 nt,广泛存在于各种生物尤其是哺乳动物细胞中。nc RNA在细胞的各种生命活动中发挥重要生物学功能。nc RNA按生物学功能特性可以分为看家nc RNA和调节性nc RNA两类,... 非编码RNA(nc RNA)是指非蛋白质编码的其他所有RNA,大小为20~10 000 nt,广泛存在于各种生物尤其是哺乳动物细胞中。nc RNA在细胞的各种生命活动中发挥重要生物学功能。nc RNA按生物学功能特性可以分为看家nc RNA和调节性nc RNA两类,按大小可以分为小nc RNA(〈50 nt)、中等长度nc RNA(50~200 nt)和长nc RNA(〉200 nt)三类。不同长度的nc RNA与靶分子的作用方式有各自特点,从而也决定了各自具有相对独特的生物学作用。以哺乳动物细胞中常见的不同长度非编码RNA为例,对各类长度nc RNA识别靶分子的方式及生物学作用特点做一综述,以期为全面认识nc RNA的结构及生物学功能多样性提供帮助。 展开更多
关键词 非编码RNA 小ncRNA 中等长度ncRNA lncRNA 看家性RNA 调节性RNA
大鼠成骨细胞特异单链DNA适配体的筛选与鉴定
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作者 李慧 丁红梅 +7 位作者 李洁 黄皑雪 苏雪婷 梁超 张令强 赵强 李少华 邵宁 《生物技术通讯》 CAS 2015年第1期81-84,共4页
目的:筛选能特异识别大鼠成骨细胞的单链DNA(ssDNA)适配体并对其进行鉴定。方法:利用完整细胞为靶标的消减细胞SELEX技术筛选大鼠成骨细胞特异ssDNA适配体,通过荧光显微镜、流式细胞术、基因克隆测序、MEME在线软件和RNA structure... 目的:筛选能特异识别大鼠成骨细胞的单链DNA(ssDNA)适配体并对其进行鉴定。方法:利用完整细胞为靶标的消减细胞SELEX技术筛选大鼠成骨细胞特异ssDNA适配体,通过荧光显微镜、流式细胞术、基因克隆测序、MEME在线软件和RNA structure分析软件,分析适配体的一、二级结构,并对筛选得到的适配体进行鉴定。结果:经过6轮消减细胞SELEX筛选,荧光显微镜鉴定文库已富集;通过流式细胞术检测及测序分析,得到2条适配体L54和L66与大鼠成骨细胞特异结合,其平衡解离常数分别为494.4±133.3和511.4±160.7 nmol/L。结论:筛选获得特异识别大鼠成骨细胞的ssDNA适配体。 展开更多
关键词 大鼠成骨细胞 DNA文库 适配体 SELEX筛选 鉴定
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用改良的非同位素凝胶电泳迁移实验鉴定核酸适配体与靶蛋白的结合 被引量:1
15
作者 葛兴枫 李慧 +6 位作者 李少华 丁红梅 黄皑雪 白琛俊 刘雪梅 李洁 邵宁 《生物技术通讯》 CAS 2015年第2期249-251,共3页
目的:在核酸适配体与靶蛋白特异结合的凝胶电泳迁移实验(EMSA)测定方法中,探索使用非同位素标记取代同位素标记。方法:取一定量的生物素标记的核酸适配体与靶蛋白(或无关蛋白)于室温孵育,聚丙烯酰胺非变性凝胶电泳后将核酸适配... 目的:在核酸适配体与靶蛋白特异结合的凝胶电泳迁移实验(EMSA)测定方法中,探索使用非同位素标记取代同位素标记。方法:取一定量的生物素标记的核酸适配体与靶蛋白(或无关蛋白)于室温孵育,聚丙烯酰胺非变性凝胶电泳后将核酸适配体湿转至带正电荷的尼龙膜上,紫外交联,经蛋白酶K消化后,用化学发光法检测。结果:与未使用蛋白酶K消化组相比,经蛋白酶K消化后,可明显呈现核酸适配体与靶蛋白特异结合后产生的阻滞条带,其灵敏度不次于同位素标记的检测方法。结论:经蛋白酶K消化步骤优化的生物素标记的EMSA方法,可以替代放射性同位素标记的EMSA方法,用于核酸适配体与靶蛋白结合情况的鉴定。 展开更多
关键词 凝胶电泳迁移实验 适配体 凝胶电泳 非同位素标记
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人vasorin蛋白的基因克隆、表达及纯化 被引量:2
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作者 丁红梅 赵强 +8 位作者 王玮 李慧 刘农乐 李洁 苏雪婷 黄皑雪 房涛 李少华 邵宁 《生物技术通讯》 CAS 2014年第1期38-41,共4页
目的:克隆、表达人vasorin(VASN)蛋白。方法:利用PCR方法从HepG2细胞的cDNA中扩增获得目的基因,并插入带有6xHis标签的原核高效可溶性表达载体pET28a中,构建重组表达质粒pET28a-VASN,将重组表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),经I... 目的:克隆、表达人vasorin(VASN)蛋白。方法:利用PCR方法从HepG2细胞的cDNA中扩增获得目的基因,并插入带有6xHis标签的原核高效可溶性表达载体pET28a中,构建重组表达质粒pET28a-VASN,将重组表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导后目的基因获得表达,对融合目的蛋白进行Ni^2+金属螯合柱纯化。结果:内切酶鉴定及基因序列测定证实重组表达质粒构建成功;对目的蛋白进行了原核表达,SDS-PAGE显示相对分子质量为61x10^3的特异表达条带;Western印迹证实目的蛋白为VASN,且主要以包涵体形式存在;对经尿素变性的表达产物进行了亲和层析纯化,有利于以后的变性、复性过程。结论:获得了人VASN融合蛋白,为其进一步的生物学功能研究奠定了基础。 展开更多
关键词 人vasorin蛋白 原核表达 纯化
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含p53保守结合位点的microRNA表达载体的构建及应用
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作者 秦性良 苏雪婷 +6 位作者 丁红梅 黄皑雪 李慧 侯绿滨 葛兴枫 李洁 邵宁 《生物技术通讯》 CAS 2014年第2期183-188,共6页
目的:构建含p53保守结合位点的microRNA(miRNA)表达载体,促进相关miRNA在具有野生型p53蛋白细胞中的高效表达。方法:改构miRNA表达载体pCMV-miR,在其多克隆位点前插入p53保守结合位点,分别将miR-138、miR-34a和miR-21前体序列pre... 目的:构建含p53保守结合位点的microRNA(miRNA)表达载体,促进相关miRNA在具有野生型p53蛋白细胞中的高效表达。方法:改构miRNA表达载体pCMV-miR,在其多克隆位点前插入p53保守结合位点,分别将miR-138、miR-34a和miR-21前体序列pre-miR-138、pre-miR-34a和pre-miR-21插入上述改构的载体pCMV/p53-miR,将构建的pCMV/p53-miR-138、pCMV/p53-miR-34a和pCMV/p53一miR一21表达载体转染具有野生型p53的HeLa细胞和不表达p53的H1299细胞,分析p53对上述miRNA表达调控的影响。结果:转染改构的miRNA表达载体后,HeLa细胞中miR-138、miR-34a和miR-21的表达水平明显提高,它们对应的已知靶基因CyclinD3、CDK2和PTEN的表达同时被显著下调。结论:在p53转录调控作用下,具有p53保守结合位点的miRNA表达载体能够更加有效地提高miRNA的表达水平;构建的载体不但可用于促进相关miRNA的表达,也能用于miRNA是否受p53调控的检测。 展开更多
关键词 P53 p53保守结合位点 转录调控 MICRORNA
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Argonaute蛋白的结构与功能 被引量:1
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作者 苏雪婷 李洁 邵宁 《医学分子生物学杂志》 CAS 2014年第1期37-42,共6页
Argonaute蛋白是RNA介导的转录后基因调控的关键蛋白。它为非编码小RNA提供锚位点,达到降解靶基因或者抑制翻译的目的。Argonaute蛋白广泛存在于真核生物中,在进化上高度保守。有关Argonaute蛋白的最新研究进展主要集中在人源AGO蛋白... Argonaute蛋白是RNA介导的转录后基因调控的关键蛋白。它为非编码小RNA提供锚位点,达到降解靶基因或者抑制翻译的目的。Argonaute蛋白广泛存在于真核生物中,在进化上高度保守。有关Argonaute蛋白的最新研究进展主要集中在人源AGO蛋白的晶体结构解析以及在此基础上对于非编码小RNA转录后调控机制的进一步理解;翻译后修饰对Argonaute蛋白功能的调控及Argonaute蛋白的新功能,譬如Argonaute蛋白在基因转录和DNA损伤修复过程中所发挥的作用。文章主要就哺乳动物Argonaute蛋白的结构与功能研究最新进展做一综述。 展开更多
关键词 Argonaute蛋白 基因沉默 转录后调控 翻译后修饰
用于未纯化蛋白样品核酸适配体筛选的Western印迹-SELEX筛选技术的建立
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作者 李慧 赵强 +7 位作者 梁超 丁红梅 李洁 黄皑雪 苏雪婷 张令强 李少华 邵宁 《生物技术通讯》 CAS 2014年第6期824-827,共4页
目的:建立一种基于Western印迹的指数式富集的配体系统进化(SELEX)技术,用于未纯化蛋白样品核酸适配体筛选。方法:将目的蛋白经SDS-PAGE分离后转移到PVDF膜上,用生物素标记的ssDNA与PVDF膜上的蛋白共同孵育,获得能与靶蛋白特异... 目的:建立一种基于Western印迹的指数式富集的配体系统进化(SELEX)技术,用于未纯化蛋白样品核酸适配体筛选。方法:将目的蛋白经SDS-PAGE分离后转移到PVDF膜上,用生物素标记的ssDNA与PVDF膜上的蛋白共同孵育,获得能与靶蛋白特异结合的适配体,最后通过生物素-链霉亲和素-辣根过氧化物酶系统、基因克隆测序、MEME在线软件和RNAstructure软件分析适配体的一、二级结构,并对筛选得到的适配体进行鉴定。结果:经过4轮筛选,获得了能特异识别靶蛋白而不识别无关蛋白的适配体,原库Gp45则与上述蛋白均没有结合。结论:建立了Western印迹-SELEX技术,可用于未纯化蛋白样品核酸适配体筛选。 展开更多
关键词 WESTERN印迹 电泳 适配体 未纯化蛋白样品
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miR-1273g-3p通过靶向CNR1调节A549细胞迁移能力 被引量:1
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作者 侯绿滨 苏雪婷 +7 位作者 秦性良 丁红梅 黄皑雪 李慧 葛兴枫 赵强 李洁 邵宁 《医学分子生物学杂志》 CAS 2014年第3期125-131,共7页
目的寻找hsa-miR-1273g-3p在人肺腺癌细胞A549中的特异性靶标并探索其生物学功能。方法定量PCR(qPCR)检测miR-1273g-3p在人肺癌细胞A549、H460和H1299中表达情况,利用生物信息学方法预测miR-1273g-3p靶基因,qPCR、免疫印迹(Western... 目的寻找hsa-miR-1273g-3p在人肺腺癌细胞A549中的特异性靶标并探索其生物学功能。方法定量PCR(qPCR)检测miR-1273g-3p在人肺癌细胞A549、H460和H1299中表达情况,利用生物信息学方法预测miR-1273g-3p靶基因,qPCR、免疫印迹(Western Blot)和荧光素酶实验确证靶标,划痕实验和MTS实验验证miR-1273g-3p的生物学功能。结果miR-1273g-3p在非小细胞肺癌细胞系A549、I-1460和H1299中高表达:qPCR、Western印迹和荧光素酶实验证实miR-1273g-3p能够靶向CNR1,可以在mRNA与蛋白水平上调控CNR1的表达;miR-1273g-3p能够通过改变CNR1的表达水平影响A549的细胞迁移能力,对细胞增殖影响不明显。结论研究证明CNR1是miR-1273g-3p的靶基因,揭示miR-1273g-3p通过靶向CNR1影响A549细胞迁移的新功能。 展开更多
关键词 miR-1273g-3p CNR1 细胞迁移
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