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CsWRKY22启动子的克隆及响应柑橘溃疡病菌侵染的表达特征
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作者 王丽娟 龙俊宏 +6 位作者 谢竹 吴柳 彭爱红 何永睿 龙琴 陈善春 修平 《园艺学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第4期677-690,共14页
由柑橘黄单胞杆菌致病变种(Xanthomonas citri subsp. citri,Xcc)引起的柑橘溃疡病严重危害着柑橘产业的健康可持续发展。前期研究表明,CsWRKY22可能是溃疡病感病基因。从‘晚锦橙’(Citrus sinensis Osbeck)中克隆了CsWRKY22的两个等... 由柑橘黄单胞杆菌致病变种(Xanthomonas citri subsp. citri,Xcc)引起的柑橘溃疡病严重危害着柑橘产业的健康可持续发展。前期研究表明,CsWRKY22可能是溃疡病感病基因。从‘晚锦橙’(Citrus sinensis Osbeck)中克隆了CsWRKY22的两个等位启动子pCsWRKY22-1和pCsWRKY22-2,长度分别为1 428和1406bp。序列分析表明两个等位启动子序列一致性为91.76%。两个等位启动子含有多种参与植物防御反应和生长发育的顺式作用元件,相同元件的数量和位置基本一致,不同的是,在TATA-box下游,pCsWRKY22-1含有2个22 bp长的TA-rich转录增强序列,而pCsWRKY22-2只含有1个。构建CsWRKY22启动子控制GUS报告基因的植物表达载体pC sW RKY22::GUS,并用农杆菌介导法转化‘晚锦橙’,经GFP活性检测和PCR鉴定获得pCsWRKY22-1::GUS和pCsWRKY22-2::GUS转基因植株各8株和4株。GUS组织化学染色、GUS酶活性及定量PCR分析表明,CsWRKY22启动子具有较强的机械伤诱导活性和柑橘溃疡病病原菌诱导活性,同时具有一定水平的基础表达特性。pCsWRKY22-1机械伤诱导活性高于pCsWRKY22-2,而pCsWRKY22-2溃疡病菌诱导活性高于pCsWRKY22-1。 展开更多
关键词 柑橘溃疡病 CsWRKY22 启动子 诱导 GUS
柑橘R2R3-MYB类转录因子CitMYB20的克隆与表达分析
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作者 范海芳 彭蕴 +8 位作者 张庆雯 何永睿 修平 李强 彭爱红 许兰珍 雷天刚 陈善春 姚利晓 《分子植物育种》 CAS CSCD 北大核心 2019年第10期3199-3207,共9页
为解析柑橘R2R3-MYB转录因子家族成员CitMYB20基因的分子生物学特征及受柑橘黄龙病病菌和溃疡病病菌的诱导表达情况。本研究同源克隆了不同柑橘品种中CitMYB20基因的开放阅读框序列,利用生物信息学方法预测其生物学功能并分析比较该基... 为解析柑橘R2R3-MYB转录因子家族成员CitMYB20基因的分子生物学特征及受柑橘黄龙病病菌和溃疡病病菌的诱导表达情况。本研究同源克隆了不同柑橘品种中CitMYB20基因的开放阅读框序列,利用生物信息学方法预测其生物学功能并分析比较该基因在不同品种间的序列差异。在洋葱表皮细胞中瞬时表达观察CitMYB20的亚细胞定位。利用qRT-PCR技术分析黄龙病病菌胁迫和溃疡病病菌胁迫时CitMYB20的表达量变化。研究结果显示柑橘CitMYB20基因在晚锦橙、酸柚、纽荷尔脐橙和四季橘中的相似度达到99.01%,高度保守。晚锦橙中该基因含有3个外显子和2个内含子,其开放阅读框为804 bp,编码267个氨基酸残基。CitMYB20蛋白的N端高度保守,具有两个R结构域,属于典型的R2R3类型的MYB转录因子家族的成员。洋葱表皮细胞亚细胞定位分析结果表明该基因定位于细胞核中。CitMYB20基因受黄龙病病菌胁迫时,在黄龙病敏感品种晚锦橙和耐性品种酸柚中均显著上调表达,其中在耐病品种酸柚中上调表达24倍,在感病品种晚锦橙中上调表达34倍;而在溃疡病病菌胁迫时,CitMYB20基因仅在溃疡病抗性品种四季橘中显著差异表达,感病后上调表达3倍。推测该基因对黄龙病和溃疡病的应答差异可能是因为不同的调控机制造成的,构建CitMYB20基因过表达载体拟对不同病原的应答情况进行深入研究。 展开更多
关键词 柑橘 R2R3-MYB转录因子 亚细胞定位 黄龙病 溃疡病
柑橘溃疡病相关基因CsPGIP的克隆与表达 预览
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作者 胡安华 祁静静 +9 位作者 张庆雯 陈善春 修平 许兰珍 彭爱红 雷天刚 姚利晓 龙琴 何永睿 李强 《中国农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2019年第4期639-650,共12页
【目的】克隆CsPGIP并分析其表达特性,转化柑橘得到超表达转基因株系,并进行柑橘溃疡病抗性评价,为柑橘溃疡病分子育种提供理论依据。【方法】从晚锦橙和四季橘中克隆柑橘CsPGIP,使用MEGA6进行多序列比对并构建系统发育树;采用在线软件B... 【目的】克隆CsPGIP并分析其表达特性,转化柑橘得到超表达转基因株系,并进行柑橘溃疡病抗性评价,为柑橘溃疡病分子育种提供理论依据。【方法】从晚锦橙和四季橘中克隆柑橘CsPGIP,使用MEGA6进行多序列比对并构建系统发育树;采用在线软件BaCelLo和SignalP 4.0进行亚细胞定位和信号肽预测并用GFP瞬时表达确定CsPGIP在细胞内的定位;利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)比较接种溃疡病菌前后高感品种和高抗品种中柑橘CsPGIP的表达特性,分析溃疡病菌侵染与CsPGIP表达的相关性;农杆菌介导遗传转化晚锦橙,采用GUS染色初筛、PCR鉴定和qRT-PCR相结合的方法鉴定超表达转基因株系;观察转基因和野生型株系表型变化,分析其株高、叶片表型;离体针刺法对超表达转基因株系和野生型株系进行柑橘溃疡病抗性评价,统计病斑面积和病情指数,分析CsPGIP表达对柑橘抗、感溃疡病的影响。【结果】晚锦橙和四季橘CsPGIP均编码328个氨基酸,与已报道的柑橘中的PGIP同源性高达99.39%,都包含2个PGIP基因典型的LRR结构域(LRR1和LRR2);构建系统进化树发现甜橙中的CsPGIP与葡萄中的PGIP(GSVIVT01033370001)遗传距离最近,相似度达到62.97%,推测CsPGIP与葡萄中的PGIP具有类似的抗病效果。亚细胞定位和信号肽预测结果表明CsPGIP属于分泌蛋白,GFP洋葱瞬时表达证明柑橘CsPGIP定位在细胞膜和细胞壁,与预测结果一致。高感品种晚锦橙和高抗品种四季橘接种溃疡病菌后CsPGIP的表达特性不同,在高感品种中表达显著下调,而高抗品种中表达显著上调且维持在较高水平,推测CsPGIP与柑橘溃疡病的抗性相关。构建CsPGIP超表达载体并转化晚锦橙,通过PCR鉴定和qRT-PCR确定其中9个(OE1、OE3、OE4、OE5、OE6、OE9、OE10、OE12和OE14)为CsPGIP超表达阳性株系。通过对转基因株系的表型观察发现OE3、OE14株系表型与野生型株系相比差异明显,植株表 展开更多
关键词 柑橘溃疡病 多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白 CsPGIP 超表达 溃疡病抗性
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CRISPR/Cas9介导柑橘CsLOB1基因启动子的多位点编辑 被引量:1
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作者 修平 范迪 +7 位作者 彭爱红 何永睿 许兰珍 雷天刚 姚利晓 李强 罗克明 陈善春 《园艺学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第2期337-344,共8页
为了获得CsLOB1启动子较大片段删除的突变体,利用CRISPR/Cas9技术对CsLOB1启动子进行多位点编辑。通过在CsLOB1启动子的EBEPthA4区域及其上、下游设计不同的靶标位点,构建了2个植物表达载体pCas9CsLOB1:2sites和pCas9CsLOB1:3sites,分别... 为了获得CsLOB1启动子较大片段删除的突变体,利用CRISPR/Cas9技术对CsLOB1启动子进行多位点编辑。通过在CsLOB1启动子的EBEPthA4区域及其上、下游设计不同的靶标位点,构建了2个植物表达载体pCas9CsLOB1:2sites和pCas9CsLOB1:3sites,分别对CsLOB1启动子同时进行2个位点和3个位点的编辑。测序结果表明pCas9CsLOB1:2sites和pCas9CsLOB1:3sites的基因编辑效率分别为64.7%和80.0%,突变体植株在2个sgRNA之间发生了DNA片段的删除。进一步的分析发现,不同的sgRNA具有不同的突变效率,其差异是由于不同的sgRNA对CsLOB1-识别和结合能力的差异造成的。本结果表明对CsLOB1启动子进行多位点编辑可以获得删除较大DNA片段的突变体。 展开更多
关键词 柑橘 CRISPR/Cas9系统 CsLOB1 多位点 基因编辑
柑橘响应黄龙病侵染的韧皮部蛋白2基因CsPP2B15的克隆与表达分析
5
作者 文庆利 谢竹 +3 位作者 吴柳 何永睿 陈善春 修平 《园艺学报》 CSCD 北大核心 2018年第12期2347-2357,共11页
黄龙病病原菌诱导柑橘筛孔胼胝体过度积累是其致病的一个重要因素。柑橘韧皮部蛋白(Phloem Protein,PP)在筛孔胼胝体积累中起着重要作用。为研究柑橘韧皮部蛋白响应黄龙病亚洲种(Candidatus Liberibacter asiaticus,CLas)侵染的功能,克... 黄龙病病原菌诱导柑橘筛孔胼胝体过度积累是其致病的一个重要因素。柑橘韧皮部蛋白(Phloem Protein,PP)在筛孔胼胝体积累中起着重要作用。为研究柑橘韧皮部蛋白响应黄龙病亚洲种(Candidatus Liberibacter asiaticus,CLas)侵染的功能,克隆获得了一个响应黄龙病侵染差异表达的PP基因CsPP2B15的编码区和长1.5kb的启动子序列,并以高感品种锦橙和耐病品种酸柚老叶和嫩叶为材料,进行基因表达分析。结果发现,CsPP2B15在高感品种锦橙嫩叶中受CLas诱导显著上调表达,而在耐病品种酸柚嫩叶中受CLas诱导显著下调表达,且在叶肉中的表达量显著高于叶脉。嫩叶和嫩梢被认为是柑橘响应黄龙病侵染的早期原初侵染部位。因此,CsPP2B15可能在CLas侵染柑橘早期中起重要作用。CsPP2B15启动子的顺式作用元件预测分析发现,CsPP2B15启动子含有许多与逆境和激素有关的顺式作用元件。进一步构建了CsPP2B15启动子控制GUS报告基因的植物表达载体,转化枳[Poncirus trifoliata(L.)Raf.]上胚轴。GUS组织化学染色和GUS酶活性测定均表明,CsPP2B15启动子具有较强的韧皮部组织特异性。 展开更多
关键词 柑橘 黄龙病 CsPP2B15 韧皮部特异性启动子 基因表达
响应黄龙病侵染的柑桔韧皮部蛋白2基因筛选及表达分析
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作者 文庆利 吴柳 +3 位作者 白晓晶 许兰珍 陈善春 修平 《中国南方果树》 北大核心 2018年第1期17-21,共5页
为了探索柑桔韧皮部蛋白2(Phloem Protein 2,PP2)在寄主与黄龙病菌互作中的功能,以嫁接传毒后的高感种质锦橙Citrus sinensis和耐病种质酸柚Citrus grandis病枝叶片为材料,通过实时荧光定量PCR方法从全基因组水平初步筛选到6个响应黄... 为了探索柑桔韧皮部蛋白2(Phloem Protein 2,PP2)在寄主与黄龙病菌互作中的功能,以嫁接传毒后的高感种质锦橙Citrus sinensis和耐病种质酸柚Citrus grandis病枝叶片为材料,通过实时荧光定量PCR方法从全基因组水平初步筛选到6个响应黄龙病侵染诱导的PP2基因,并比较了其在锦橙和酸柚中的相对表达量。结果表明,CsPP2B15可能与耐病有关,CsPP2B2和CsPP2B10可能与感病相关。采用生物信息学的方法对6个基因编码氨基酸序列从结构组成、基本理化性质、亲疏水性进行分析并构建了系统发育树,发现在柑桔中CsPP2B15和CsPP2A与拟南芥PP2的亲缘关系较近,而CsPP2B2、CsPP2B10、CsPP2B12-1、CsPP2B12-2与大豆PP2亲缘关系较近,CsPP2A与拟南芥PP2的亲缘关系最近。 展开更多
关键词 柑桔黄龙病 柑桔韧皮部蛋白2基因 表达分析
柑橘黄龙病病原菌Las在叶圆片嫁接接种的‘锦橙'中早期扩散研究 被引量:2
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作者 吴柳 白晓晶 +5 位作者 文庆利 谢竹 何永睿 王丽娟 陈善春 修平 《园艺学报》 CSCD 北大核心 2018年第11期2121-2128,共8页
为了探究黄龙病(Citrus Huanglongbing,HLB)病原菌在柑橘韧皮部的早期运动情况,以柑橘黄龙病亚洲致病种Candidatus Liberibacter asiaticus(Las)为毒源,黄龙病高感品种‘锦橙’实生苗为受体材料进行叶圆片嫁接传毒。利用定量PCR技术对... 为了探究黄龙病(Citrus Huanglongbing,HLB)病原菌在柑橘韧皮部的早期运动情况,以柑橘黄龙病亚洲致病种Candidatus Liberibacter asiaticus(Las)为毒源,黄龙病高感品种‘锦橙’实生苗为受体材料进行叶圆片嫁接传毒。利用定量PCR技术对嫁接口处近端主脉、远端主脉、叶柄以及缘周叶组织进行了为期84d的菌量测定。结果发现,病原菌在近端主脉中积累最快,其次是远端主脉、叶柄和缘周叶组织。以近端主脉为原初侵染部位,Las在嫁接叶片中1~84d的早期运动可分为潜伏期(1~42d)、指数期(43~70d)和稳定期(71~84d)。在早期侵染过程中,Las病原菌主要沿叶主脉从原初侵染部位由近向远扩散,其扩散趋势与症状从原初侵染部位向外扩散紧密相关。证实叶圆片嫁接法可作为柑橘HLB一种有效的传毒方式。 展开更多
关键词 柑橘黄龙病 早期运动 叶片传毒 qPCR
柑橘4个WRKY转录因子基因的克隆及其响应柑橘溃疡病菌侵染的表达分析 被引量:5
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作者 周鹏飞 贾瑞瑞 +8 位作者 陈善春 许兰珍 彭爱红 雷天刚 李强 陈敏 白晓晶 修平 何永睿 《园艺学报》 CAS CSCD 北大核心 2017年第3期452-462,共11页
以纽荷尔脐橙和四季橘为试验材料,基于溃疡病菌诱导的柑橘转录组数据库,利用PCR方法克隆获得4个WRKY家族基因Cs WRKY22、Cs WRKY50、CsWRKY72-1和CsWRKY72-2的cDNA全长序列。序列分析结果表明,这4个基因的cDNA全长分别为1 123、1 312、1... 以纽荷尔脐橙和四季橘为试验材料,基于溃疡病菌诱导的柑橘转录组数据库,利用PCR方法克隆获得4个WRKY家族基因Cs WRKY22、Cs WRKY50、CsWRKY72-1和CsWRKY72-2的cDNA全长序列。序列分析结果表明,这4个基因的cDNA全长分别为1 123、1 312、1 809和2 208 bp,开放阅读框长度分别为921、480、1 809和1 767 bp,各编码306、159、602和588个氨基酸。氨基酸序列和结构分析显示,这4个基因属于第Ⅱ类WRKY蛋白。进化树分析显示,所克隆的4个柑橘WRKY蛋白与可可、葡萄等WRKY蛋白亲缘关系较近。亚细胞定位显示,所克隆的4个WRKY基因定位于细胞核,与亚细胞定位预测相符。对纽荷尔脐橙和四季橘中4个基因受溃疡病菌诱导的表达分析表明,CsWRKY22参与寄主的感病反应,而CsWRKY50参与抗溃疡病的免疫应答反应。柑橘溃疡病菌能抑制CsWRKY72-1和CsWRKY72-2介导的寄主基础免疫。水杨酸(SA)和茉莉酸甲酯(MeJA)处理表明,4个Cs WRKY基因均不参与SA和MeJA介导的寄主抗病和抗逆反应。 展开更多
关键词 柑橘 CsWRKY 基因克隆 表达分析
柑橘黄龙病相关水杨酸羧基甲基转移酶基因CsSAMT-1的克隆与表达分析 被引量:3
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作者 白晓晶 许兰珍 +9 位作者 贾瑞瑞 周鹏飞 陈敏 何永睿 彭爱红 雷天刚 李强 姚利晓 陈善春 修平 《园艺学报》 CSCD 北大核心 2017年第12期2265-2274,共10页
为研究水杨酸羧基甲基转移酶(Salicylic acid carboxyl methyltransferase,SAMT)在柑橘防御黄龙病(Huanglongbing,HLB)中的作用,克隆获得Cs SAMT^-1基因,并以易感HLB锦橙和耐HLB酸柚为试材进行基因表达分析。q RT-PCR结果表明,易感... 为研究水杨酸羧基甲基转移酶(Salicylic acid carboxyl methyltransferase,SAMT)在柑橘防御黄龙病(Huanglongbing,HLB)中的作用,克隆获得Cs SAMT^-1基因,并以易感HLB锦橙和耐HLB酸柚为试材进行基因表达分析。q RT-PCR结果表明,易感病锦橙中CsSAMT^-1在感染HLB后上调表达,且在叶脉中的表达量显著高于叶肉;而耐病酸柚中CsSAMT^-1呈组成型表达。外源水杨酸(SA)和茉莉酸甲酯(MeJA)处理锦橙和酸柚,均可诱导CsSAMT^-1上调表达。HLB侵染前,耐病酸柚叶脉中SA和水杨酸甲酯(MeSA)含量分别为11.85和18.18 ng·g^-1,显著高于锦橙(0.82和0.01 ng·g^-1);HLB侵染后,锦橙中SA和MeSA含量明显上升,酸柚中SA含量明显下降,MeSA含量基本保持原有水平。研究表明,Cs SAMT^-1可能通过调节SA和Me SA信号分子转换来增强对柑橘黄龙病的抗性。 展开更多
关键词 柑橘 黄龙病 SAMT MESA 基因表达
柑橘响应溃疡病菌转录因子基因CsAP2-09的克隆与功能分析
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作者 贾瑞瑞 胡安华 +8 位作者 陈善春 修平 彭爱红 许兰珍 雷天刚 姚利晓 白晓晶 何永睿 李强 《园艺学报》 CSCD 北大核心 2017年第10期1881-1893,共13页
对柑橘中AP2转录因子进行注释,并克隆柑橘溃疡病相关的Cs AP2-09,研究外源水杨酸、茉莉酸甲酯、乙烯利、机械损伤以及溃疡病菌对该基因的诱导表达,确定其表达模式。从柑橘全基因组公共数据库一共注释出12个AP2成员,据系统发育和结构可... 对柑橘中AP2转录因子进行注释,并克隆柑橘溃疡病相关的Cs AP2-09,研究外源水杨酸、茉莉酸甲酯、乙烯利、机械损伤以及溃疡病菌对该基因的诱导表达,确定其表达模式。从柑橘全基因组公共数据库一共注释出12个AP2成员,据系统发育和结构可以将其分为4个亚类;可能与抗、感溃疡病相关的Cs AP2-09基因全长4 159 bp,开放阅读框1 467 bp,编码488个氨基酸,具有典型的AP2结构,同时也具有一些结构特殊性;该基因在细胞核中优势表达,与定位信号预测结果吻合;上游启动子元件含多个与植物逆境或激素应答相关的顺式作用元件,如BOX-W1、CGTCA-motif、TCA-element、WUN-motif等;诱导结果表明Cs AP2-09对外源水杨酸、茉莉酸甲酯、乙烯利及机械损伤均有响应;柑橘溃疡病菌侵染可诱导抗病品种四季橘中此基因明显上调表达,而在感病品种纽荷尔中变化趋势不显著。上述研究表明Cs AP2-09是一个响应溃疡病菌侵染的,可作为研究柑橘抗溃疡病的候选基因。目前已将其在锦橙中超表达,共筛选出8个转基因植株,后期将对其进行抗病性评价以确定其分子育种价值。 展开更多
关键词 柑橘 柑橘溃疡病 AP2 转录因子 亚细胞定位 基因表达
柑橘溃疡病相关基因CitEX3的克隆与表达分析 预览
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作者 段敏杰 陈善春 +5 位作者 周鹏飞 陈敏 许兰珍 彭爱红 何永睿 修平 《西南师范大学学报:自然科学版》 CAS 北大核心 2016年第5期213-218,共6页
利用RT-PCR和PCR扩增技术,获得纽荷尔脐橙富亮氨酸重复序列受体样蛋白激酶EXS(EXTRA SPOROGENOUS CELLS)基因CDs全长,命名为Cit EX3.生物信息学分析表明,该基因CDs全长2 667bp,编码888个氨基酸,最大开放阅读框2 667bp,属于富亮氨酸重... 利用RT-PCR和PCR扩增技术,获得纽荷尔脐橙富亮氨酸重复序列受体样蛋白激酶EXS(EXTRA SPOROGENOUS CELLS)基因CDs全长,命名为Cit EX3.生物信息学分析表明,该基因CDs全长2 667bp,编码888个氨基酸,最大开放阅读框2 667bp,属于富亮氨酸重复序列蛋白激酶家族(LRR-RLKs).Cit EX3基因所编码蛋白EXS3分为胞外域、跨膜域和胞内激酶结构域,胞外域中存在保守的LRR重复序列,胞内激酶结构域中存在一个保守的丝/苏氨酸催化域重复序列.Southern Blot分析表明,在纽荷尔、椪柑、四季桔和金柑中该基因都以单拷贝形式存在.实时荧光定量PCR分析表明,接种溃疡病病菌后,该基因受溃疡病诱导上调表达,推测该基因可能与柑橘溃疡病抗性相关. 展开更多
关键词 纽荷尔脐橙 CIT EX3 LRR-RLKs SOUTHERN BLOT 实时荧光定量PCR
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转基因柑橘外源基因拷贝数的实时荧光定量PCR检测 被引量:1
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作者 许兰珍 何永睿 +6 位作者 雷天刚 彭爱红 姚利晓 姜国金 李强 修平 陈善春 《园艺学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第6期1186-1194,共9页
为分析转基因柑橘中外源基因整合拷贝数,基于实时荧光定量PCR法,建立通用、准确、简便的转基因柑橘外源基因拷贝数检测体系,利用该体系成功检测了150个转基因柑橘单株系外源基因整合拷贝数。结果表明,转基因柑橘中外源基因整合最低拷贝... 为分析转基因柑橘中外源基因整合拷贝数,基于实时荧光定量PCR法,建立通用、准确、简便的转基因柑橘外源基因拷贝数检测体系,利用该体系成功检测了150个转基因柑橘单株系外源基因整合拷贝数。结果表明,转基因柑橘中外源基因整合最低拷贝数为1,最高达5个,其中1、2和≥3拷贝的单株数分别占总数的40.0%、18.0%和42.0%;采用Southern blot技术进行检测,结果基本一致,极少数单株经实时荧光定量PCR分析的拷贝数比Southern blot检测的数值高。说明本研究建立的实时荧光定量PCR方法检测转基因柑橘外源基因整合拷贝数更加准确可靠。拷贝数为1~2的转基因株系可作为将来开展转基因目标性状研究及转基因生物安全性评价有利用价值的试验材料。 展开更多
关键词 柑橘 实时荧光定量PCR 转基因 拷贝数 Southern BLOT
枳根cDNA全长文库的构建与分析
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作者 姚利晓 王金萍 +5 位作者 何永睿 雷天刚 许兰珍 彭爱红 修平 陈善春 《园艺学报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第1期149-156,共8页
为了解柑橘优良砧木枳(Poncirus trifoliata)根部的基因表达信息,利用SMART技术构建了枳的根组织全长c DNA文库。检测结果显示所建枳根原始文库的容量为1.08×106 cfu·m L-1,扩增后文库容量为1.30×109 cfu·m L-1,... 为了解柑橘优良砧木枳(Poncirus trifoliata)根部的基因表达信息,利用SMART技术构建了枳的根组织全长c DNA文库。检测结果显示所建枳根原始文库的容量为1.08×106 cfu·m L-1,扩增后文库容量为1.30×109 cfu·m L-1,重组率为95%。通过文库随机测序获得182个长度大于100 bp的ESTs序列(Gen Bank登录号为JK316116~JK316297),序列拼接后得到96个Unigenes,包括12个Contigs和84个singletons。其中,68个Unigenes可与Gen Bank中登录的基因相匹配,56个与已知的柑橘基因相匹配,36个为全长基因。对24个全长基因完成了功能注释,并进一步开展了生物信息学分析,发现有6个应激反应基因和3个根发育相关基因。 展开更多
关键词 全长c DNA文库 表达序列标签 生物信息学分析
贵州部分柑橘地方品种遗传背景的SSR分析 被引量:5
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作者 雷天刚 何永睿 +5 位作者 彭爱红 许兰珍 修平 姚利晓 李金强 陈善春 《西南大学学报:自然科学版》 CAS CSCD 北大核心 2015年第11期30-35,共6页
利用SSR分子标记技术对5个贵州柑橘地方品种的遗传背景进行分析.结果表明,24对SSR引物在5个地方品种和参与D N A指纹比对的14个栽培品种中共检测到92个等位基因,每个位点的等位基因数变幅为2~7个,平均为3.8个;多态性信息含量(PI... 利用SSR分子标记技术对5个贵州柑橘地方品种的遗传背景进行分析.结果表明,24对SSR引物在5个地方品种和参与D N A指纹比对的14个栽培品种中共检测到92个等位基因,每个位点的等位基因数变幅为2~7个,平均为3.8个;多态性信息含量(PIC)变化范围在0.36~0.78之间,平均为0.49.经过DNA指纹比对,发现其中5对引物扩增的8条特征谱带可作为地方品种鉴别的参考性标记.利用NTSYS软件进行相似性系数计算,采用 UP‐GM A法聚类,结果显示,相似性系数为0.80,可将5个地方品种划分在不同的亚组中;地方品种米柑和牛肉红金橘均单独成组,其遗传背景独特;土柑与皱皮柑的亲缘关系较近;大果型冰糖橙与冰糖橙的遗传背景相同;红香柚与强德勒柚的遗传背景基本一致. 展开更多
关键词 柑橘 地方品种 遗传背景 SSR标记
抗菌肽-人溶菌酶融合基因的构建及转入锦橙后的表达分析 预览
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作者 解栋梁 修平 +4 位作者 许兰珍 何丹丹 彭爱红 何永睿 陈善春 《中国南方果树》 北大核心 2015年第2期1-4,共4页
为了研究抗菌肽和人溶菌酶对柑桔溃疡病和黄龙病等的协同抗性,利用连接多肽2A编码序列连接抗菌肽cecropin B(CB)和人溶菌酶human lysozyme(HLy)基因,构建了融合基因CB:HLy及其超量表达载体p35S::CB:HLy。利用农杆菌介导法,将该... 为了研究抗菌肽和人溶菌酶对柑桔溃疡病和黄龙病等的协同抗性,利用连接多肽2A编码序列连接抗菌肽cecropin B(CB)和人溶菌酶human lysozyme(HLy)基因,构建了融合基因CB:HLy及其超量表达载体p35S::CB:HLy。利用农杆菌介导法,将该载体转化至锦橙上胚轴。通过GUS化学染色及PCR鉴定,获得转基因植株32株。Real-time PCR证明了融合基因在转基因锦橙中得到了高效表达。本研究为柑桔溃疡病的抗性研究提供了材料。 展开更多
关键词 抗菌肽 人溶菌酶 融合基因 连接多肽2A 遗传转化
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应用抑制性消减杂交技术从枳中筛选根特异表达基因 被引量:2
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作者 姚利晓 何永睿 +4 位作者 许兰珍 雷天刚 彭爱红 修平 陈善春 《园艺学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第12期2481-2488,共8页
为筛选分离植物根组织特异表达基因,以枳根RNA为试验组,叶RNA为驱动组,构建了枳根消减文库。从该消减文库中共获得有效序列1 177个,其片段长度主要分布在200~500 bp;序列拼接后得到455个非重复序列,其中245个与已知基因匹配,具有结合功... 为筛选分离植物根组织特异表达基因,以枳根RNA为试验组,叶RNA为驱动组,构建了枳根消减文库。从该消减文库中共获得有效序列1 177个,其片段长度主要分布在200~500 bp;序列拼接后得到455个非重复序列,其中245个与已知基因匹配,具有结合功能、催化活性和转运活性等生物学功能,可参与植物的代谢、细胞生长、个体发育、应激反应等生物学过程。实时定量PCR检测结果显示这些基因中的主要乳液蛋白、早期结瘤素样蛋白和贝壳杉烯酸氧化酶等基因在根中高表达。 展开更多
关键词 根特异表达基因 抑制性消减杂交技术 定量PCR
分泌型CecropinB抗菌肽基因转化血橙提高其抗溃疡病水平 被引量:6
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作者 修平 彭爱红 +6 位作者 刘琦琦 何永睿 王军政 许兰珍 雷天刚 姚利晓 陈善春 《园艺学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第3期417-428,共12页
为了利用Cecropin B(CB)抗菌肽基因提高柑橘对溃疡病的抗性,人工合成了两个含有信号肽的Cecropin B抗菌肽基因PR1αCB和AATCB。洋葱表皮瞬时表达分析表明,与非分泌型CB抗菌肽相比,PR1αCB和AATCB抗菌肽在细胞间隙中优势积累。进一... 为了利用Cecropin B(CB)抗菌肽基因提高柑橘对溃疡病的抗性,人工合成了两个含有信号肽的Cecropin B抗菌肽基因PR1αCB和AATCB。洋葱表皮瞬时表达分析表明,与非分泌型CB抗菌肽相比,PR1αCB和AATCB抗菌肽在细胞间隙中优势积累。进一步构建了CaMV 35S调控PR1αCB和AATCB基因的植物表达载体,转化塔罗科血橙(Citrus sinensis Osbeck)上胚轴,获得转基因植株。GUS组织化学染色、PCR和Southern blot分析表明外源基因己成功整合入柑橘基因组。Real-timePCR定量分析表明,抗菌肽基因在转基因植株中成功表达。柑橘叶片离体抗性分析表明,转PR1αCB和AATCB基因植株的抗性显著强于非转基因植株,其抗性水平与高抗品种‘南丰蜜橘’(CsuccosaHort.Ex Tan)和‘四季橘’(C.madurensis)相当。 展开更多
关键词 柑橘 信号肽 抗菌肽 柑橘溃疡病 遗传转化 抗性
异源韧皮部特异启动子在转基因枳中的表达 被引量:8
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作者 许兰珍 彭爱红 +6 位作者 何永睿 姚利晓 雷天刚 刘小丰 姜国金 修平 陈善春 《园艺学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第1期1-8,共8页
为了筛选在柑橘韧皮部中特异表达的启动子,构建GRP、Rolc、RSS1异源韧皮部特异启动子控制GUS报告基因的植物表达载体,转化枳[Poncirustrifoliata(L.)Raf.]上胚轴。GUS组织化学染色分析表明,3个启动子均显示了维管束组织特异性。... 为了筛选在柑橘韧皮部中特异表达的启动子,构建GRP、Rolc、RSS1异源韧皮部特异启动子控制GUS报告基因的植物表达载体,转化枳[Poncirustrifoliata(L.)Raf.]上胚轴。GUS组织化学染色分析表明,3个启动子均显示了维管束组织特异性。其中,GRP启动子活性强,且具有严格的韧皮部组织特异性;Rolc启动子活性最强,在根和茎中呈组成型表达;RSS1启动子活性最弱。Real-timeRT-PCR和GUS酶活性分析进一步证明了GRP启动子具有较强的韧皮部组织特异性,该启动子有望应用于柑橘抗黄龙病基因工程育种。 展开更多
关键词 翻车机 重型板式给料机 振动给料器 活化给煤机 工艺适应性
短童期柑桔资源“早花枳”遗传转化技术体系的建立 预览 被引量:1
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作者 彭爱红 曹立 +5 位作者 许兰珍 修平 雷天刚 何永睿 姚利晓 陈善春 《中国南方果树》 北大核心 2014年第3期64-67,共4页
早花枳是中国农业科学院柑桔研究所自田间发现的一个短童期资源,播种1年后即可开花结果,是验证柑桔类果树基因功能的模式植物。以早花枳上胚轴为外植体,通过研究早花枳在GFP(绿色荧光蛋白)基因遗传转化过程中,细胞分裂素(6-BA)浓度... 早花枳是中国农业科学院柑桔研究所自田间发现的一个短童期资源,播种1年后即可开花结果,是验证柑桔类果树基因功能的模式植物。以早花枳上胚轴为外植体,通过研究早花枳在GFP(绿色荧光蛋白)基因遗传转化过程中,细胞分裂素(6-BA)浓度和卡那霉素(Km)筛选压对不定芽的再生频率和GFP表达率的影响,以及成苗方式对不定芽成苗率的影响,建立了早花枳遗传转化技术体系。结果表明,在共培养基和筛选培养基中加入6-BA 1.5mg/L,筛选培养时以Km 100mg/L作为筛选压,可获得138%的再生频率和32.5%的GFP表达率;早花枳在含有NAA 0.5~2.0mg/L的生根培养基上生根能力都较差,以酸桔为砧木进行试管内茎尖嫁接可获得98%的不定芽成苗率。 展开更多
关键词 早花枳 遗传转化 GFP表达率
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柠檬苦素类似物糖基转移酶基因(citLGT)在转基因锦橙中的异位表达分析 预览 被引量:1
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作者 马园园 修平 +3 位作者 彭爱红 许兰珍 何永睿 陈善春 《果树学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第2期181-186,I0001共7页
【目的】分析柠檬苦素类似物糖基转移酶基因(citLGT)在柑橘中的异位表达。【方法】构建了CaMV35S启动子控制下ci比Gr的超量和RNAi抑制表达载体。采用农杆菌介导的遗传转化方法将上述植物表达载体分别转化‘锦橙’[Citrussinensis(Lin... 【目的】分析柠檬苦素类似物糖基转移酶基因(citLGT)在柑橘中的异位表达。【方法】构建了CaMV35S启动子控制下ci比Gr的超量和RNAi抑制表达载体。采用农杆菌介导的遗传转化方法将上述植物表达载体分别转化‘锦橙’[Citrussinensis(Linn.)Osbeck‘Jincheng’]上胚轴。经GUS组织化学染色及PCR检测共获得20株转基因阳性植株。利用qRT—PCR分析转基因植株中citLGT基因的表达。【结果】超量表达citLGT的转基因植株中ci比Gr的表达量显著高于对照,而RNAi转基因植株中citLGT的表达量则被显著抑制。[结论]本实验为阐明了citLGT基因影响后苦味性状的分子机制和基因工程改良柑橘延迟苦味性状提供了有价值的材料。 展开更多
关键词 柠檬苦素类似物葡萄糖基转移酶基因 RNAI 遗传转化 表达分析 转基因'锦橙’
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