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加工番茄PVY N:O HC-Pro、STV RdRp酵母双杂交诱饵载体的构建及自激活验证 预览
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作者 路遥 周东 《江苏农业科学》 2018年第17期49-52,共4页
马铃薯Y病毒(potato virus Y,简称PVY)和南方番茄病毒(southern tomato virus,简称STV)是加工番茄上非常普遍的病毒,以从加工番茄cDNA文库中筛选与病毒功能蛋白互作的基因为目标,构建PVY HC-Pro、STV RdRp Cyto Trap酵母双杂交诱饵载体... 马铃薯Y病毒(potato virus Y,简称PVY)和南方番茄病毒(southern tomato virus,简称STV)是加工番茄上非常普遍的病毒,以从加工番茄cDNA文库中筛选与病毒功能蛋白互作的基因为目标,构建PVY HC-Pro、STV RdRp Cyto Trap酵母双杂交诱饵载体,为抗病基因的筛选工作奠定基础。通过PCR技术,扩增PVY HC-Pro、STV RdRp片段分别克隆到诱饵载体pSos,用酶切、测序结果正确的2个诱饵载体重组质粒转化酵母感受态cdc25H,进行自激活检测及毒性验证。将不同组合的酵母转化液涂布于SD/Glu(-UL)培养基(SD/Glu指含有葡萄糖的SD培养基,-UL指缺失尿嘧啶、亮氨酸2种氨基酸)平板上,于25℃培养4 d后,挑取3个单菌落分别划线于2个SD/Glu(-UL)和2个SD/Gal(-UL)培养基上,并分别置于25、37℃继续培养5 d。结果表明,在25℃培养条件下,SD/Glu(-UL)和SD/Gal(-UL)培养基上酵母菌生长正常;在37℃培养条件下,SD/Glu(-UL)培养基上无酵母菌的生长,SD/Gal(-UL)培养基上阳性组合酵母生长正常,阴性组合酵母均不生长。构建的pSos-HC-Pro、pSos-RdRp诱饵载体没有转录自激活活性和毒害作用,可用于Cyto Trap酵母双杂交系统。 展开更多
关键词 加工番茄 PVY STV 酵母双杂交 自激活 诱饵载体
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新疆辣椒CMV基因组序列分析与CP基因多克隆抗体制备 预览
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作者 周东 刘贞 +2 位作者 刘丽 许鹏程 《生物技术通报》 CSCD 北大核心 2017年第8期88-94,共7页
克隆新疆辣椒LJ-10 CMV基因组片段,并进行序列分析,构建CMV CP基因的原核表达载体,并制备CP基因的多克隆抗体。利用RT-PCR技术,克隆新疆辣椒LJ-10 CMV的RNA1(3 357 nt)、RNA2(3 042 nt),RNA3(2 212 nt)全基因组片段,与Gen Bank上... 克隆新疆辣椒LJ-10 CMV基因组片段,并进行序列分析,构建CMV CP基因的原核表达载体,并制备CP基因的多克隆抗体。利用RT-PCR技术,克隆新疆辣椒LJ-10 CMV的RNA1(3 357 nt)、RNA2(3 042 nt),RNA3(2 212 nt)全基因组片段,与Gen Bank上登陆的CMV亚组IA、亚组IB、亚组Ⅱ分离物进行序列分析和系统进化树分析。将LJ-10 CMV CP基因克隆到原核表达载体p ET-22b中,在大肠杆菌BL21(DE3)中表达纯化,以纯化的重组蛋白为抗原免疫兔子,制备CMV特异性抗血清,并进行间接ELISA和Western blotting分析。结果显示,成功克隆了新疆辣椒LJ-10 CMV的RNA1、RNA2、RNA3全基因组片段,序列分析及系统进化树分析表明,该分离物属于CMV亚组IB。成功构建了LJ-10 CMV CP基因的原核表达载体p ET-CMV-CP,在大肠杆菌BL21(DE3)中经IPTG诱导获得了与预期大小一致的分子量约为27 k D的重组蛋白,制备了CMV的特异性抗血清。间接ELISA和Western blotting分析表明,制备的抗血清效价为1:500-1 000。新疆辣椒LJ-10 CMV分离物属于CMV亚组IB,成功构建了LJ-10 CMV CP基因的原核表达载体,制备了相应的多克隆抗体。 展开更多
关键词 黄瓜花叶病毒 序列分析 外壳蛋白 原核表达 蛋白质印迹检测
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番茄OPA3-like基因的生物信息学分析及原核表达
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作者 刘丽娜 周东 +2 位作者 张丽丽 崔百明 《生物技术》 北大核心 2017年第3期264-270,共7页
[目的]获得高效表达的类视神经萎缩蛋白3(OPA3-like),并分析其生物信息学功能。[方法]利用Vector NTI和ExPASy,Signal P,Plant-mPLoc等在线工具对OPA3-like蛋白基本理化性质、信号肽、跨膜区及亚细胞定位进行分析;构建原核表达载体pET... [目的]获得高效表达的类视神经萎缩蛋白3(OPA3-like),并分析其生物信息学功能。[方法]利用Vector NTI和ExPASy,Signal P,Plant-mPLoc等在线工具对OPA3-like蛋白基本理化性质、信号肽、跨膜区及亚细胞定位进行分析;构建原核表达载体pET22b-OPA3-like、pET28a-OPA3-like、pET32a-OPA3-like并分别转化至大肠杆菌BL21(DE3)和Rosetta(DE3)中,经IPTG诱导融合蛋白表达,SDS-PAGE对结果进行验证。[结果]OPA3-like蛋白是不稳定蛋白,含有跨膜区,可能位于叶绿体;原核表达表明,对于同一重组质粒而言,融合蛋白在两种菌中的表达量无明显差别,其中,转化pET28a-OPA3-like可表达20kDa的融合蛋白;转化pET32a-OPA3-like可表达37kDa的融合蛋白,且主要都以包涵体形式存在,转化pET22b-OPA3-like无融合蛋白的表达。[结论]转化pET32a-OPA3-like的表达菌可以高效表达融合蛋白(37 kDa),有利于进一步研究OPA3-like在植物中的亚细胞定位及功能。 展开更多
关键词 番茄 类视神经萎缩蛋白3(OPA3-like) 生物信息学分析 重组质粒 原核表达
新疆番茄病毒病检测及南方番茄病毒全基因组序列测定与传播特性分析 被引量:2
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作者 杨海燕 崔百明 +3 位作者 张强 向本春 《植物保护学报》 CSCD 北大核心 2017年第2期253-259,共7页
为了解新疆番茄上病毒病的发生情况,利用一步法RT-PCR技术检测了南北疆番茄上南方番茄病毒(Southern tomato virus,STV)、黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)、番茄花叶病毒(Tomato mosaic virus,ToMV)以及马铃薯Y病毒(Pot... 为了解新疆番茄上病毒病的发生情况,利用一步法RT-PCR技术检测了南北疆番茄上南方番茄病毒(Southern tomato virus,STV)、黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)、番茄花叶病毒(Tomato mosaic virus,ToMV)以及马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)的感染情况,并利用分段克隆的方法进行全基因组测序,通过RT-PCR方法检测健康植株与携带病毒植株杂交育种的F1代植株带毒率以分析STV的种子传播特性。结果显示,新疆番茄上CMV、STV、ToMV和PVY在北疆的检出率分别为52%、37%、27%和14%;在南疆的检出率分别为79%、60%、69%和0;且以STV、CMV及ToMV的复合侵染为主。从我国加工番茄上首次获得了长3 437 nt的STV SHZ-1核苷酸序列,序列比对分析发现其与已报道STV只有1~9个核苷酸的变异,且序列变异与地域无相关性。分析杂交F1代加工番茄植株上STV的传播特性,发现其除可由种子传播外,也可通过花粉传播。表明STV是侵染新疆番茄的主要病毒之一,且该病毒可通过种子或杂交育种途径进行传播。 展开更多
关键词 南方番茄病毒 RT-PCR检测 基因组序列分析 种子传播
加工番茄SlAGO4A基因过表达及干扰载体构建与遗传转化 被引量:1
5
作者 许鹏程 路遥 +3 位作者 周东 刘丽 刘丽娜 《生物技术》 北大核心 2017年第6期511-516,共6页
[目的]构建加工番茄SlAGO4A基因过表达及干扰载体,获得相应的转基因番茄植株。[方法]利用PCR技术从番茄c DNA文库中获得2 727 bp的加工番茄SlAGO4A基因。构建SlAGO4A基因的过量表达载体35S:SlAGO4A。以获得的SlAGO4A基因为模板,获得了S... [目的]构建加工番茄SlAGO4A基因过表达及干扰载体,获得相应的转基因番茄植株。[方法]利用PCR技术从番茄c DNA文库中获得2 727 bp的加工番茄SlAGO4A基因。构建SlAGO4A基因的过量表达载体35S:SlAGO4A。以获得的SlAGO4A基因为模板,获得了SlAGO4A PIWI的220 bp的片段,构建SlAGO4A基因的RNAi干扰载体RNAi-PIWI,通过农杆菌介导的遗传转化,获得SlAGO4A过表达及干扰转基因番茄阳性植株,并利用实时荧光定量PCR(QRTPCR)技术检测过表达番茄阳性植株中的SlAGO4A基因的表达水平。[结果]经PCR鉴定获得5株独立转化的里格87-5干扰转基因加工番茄株系,获得6株独立转化的里格87-5过量表达转基因加工番茄株系,其6株SlAGO4A基因过表达的阳性植株的表达量均有不同程度的上调。[结论]为阐明SlAGO4A基因在加工番茄抗病毒信号通路中的功能奠定基础。 展开更多
关键词 加工番茄 SlAGO4A 遗传转化 PCR
来源于西洋梨的苹果茎沟病毒分离物基因组分子特性研究 预览
6
作者 张雪娇 王利平 +3 位作者 赵振军 陈婕 崔百明 《江苏农业科学》 北大核心 2017年第18期43-47,共5页
为了获得来源于西洋梨红贝雷沙寄主潜带苹果茎沟病毒(ASGV)分离物的基因组全长序列,并明确其分子特性,采用RT-PCR、RACE末端克隆及生物信息学方法,对ASGV分离物基因组全长进行序列测定,并对其序列特点进行分析。结果 发现,来源于西洋... 为了获得来源于西洋梨红贝雷沙寄主潜带苹果茎沟病毒(ASGV)分离物的基因组全长序列,并明确其分子特性,采用RT-PCR、RACE末端克隆及生物信息学方法,对ASGV分离物基因组全长进行序列测定,并对其序列特点进行分析。结果 发现,来源于西洋梨的ASGV-HB分离物的基因组全长序列为6 496 nt(Gen Bank登录号:KU605672),含有2个开放阅读框ORF1、ORF2及2个可变区Ⅵ、Ⅶ。序列分析表明ASGV-HB与Gen Bank登录的18个ASGV分离物的基因组全长核苷酸序列同源性为80.6%-87.7%;ORF1和ORF2编码的氨基酸同源性分别为84.3%-92.3%和94.4%-98.7%;Ⅵ和Ⅶ可变区的氨基酸序列同源性分别为22.9%-68.8%和48.8%-92.2%;系统发育树分析显示,来源于不同国家的相同寄主的ASGV分离物聚集为同一分支。结果表明,ASGV的分子变异无地域相关性,具有一定的寄主选择性,研究结果为进一步探究ASGV的群体遗传进化机制及其防治提供了重要的分子信息。 展开更多
关键词 苹果茎沟病毒 基因组全长序列 系统发育树分析 同源性
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用草本植物番茄鉴定五种柑橘类病毒 预览 被引量:1
7
作者 董艳娜 徐文兴 《中国农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2016年第4期784-790,共7页
【目的】通过嫁接木本指示植物进行柑橘类病毒鉴定需要合适的季节和较长的显症时间,并且柑橘木本指示植物的遗传转化和基因功能验证体系尚不成熟,研究其与寄主间的互作较为困难。因此,寻找合适的草本鉴定和实验寄主对于更好地进行柑橘... 【目的】通过嫁接木本指示植物进行柑橘类病毒鉴定需要合适的季节和较长的显症时间,并且柑橘木本指示植物的遗传转化和基因功能验证体系尚不成熟,研究其与寄主间的互作较为困难。因此,寻找合适的草本鉴定和实验寄主对于更好地进行柑橘类病毒的鉴定及研究其与寄主间的互作具有重要意义。论文旨在明确中国报道的5种主要柑橘类病毒,包括柑橘裂皮类病毒(Citrus exocortis viroid,CEVd)、柑橘曲叶类病毒(Citrus bent leaf viroid,CBLVd)、啤酒花矮化类病毒(Hop stunt viroid,HSVd)、柑橘矮化类病毒(Citrus dwarfing viroid,CDVd)和柑橘树皮裂纹类病毒(Citrus bark cracking viroid,CBCVd)对番茄(Solanum lycopersicum)的侵染能力,进而明确其可否作为5种类病毒的鉴别寄主或实验寄主。【方法】将5种柑橘类病毒的野生型分子变种(分别为CEVd.188,长370 nt;CBLVd.032,长328 nt;HSVd.cit106,长296 nt;CVd-III.072,长295 nt;CVd IV Ca,长285 nt)二聚体c DNA克隆质粒(克隆于p GEM-T载体),采用限制性内切酶Nde I在37℃条件下进行酶切线性化处理,经琼脂糖凝胶电泳分析鉴定酶切成功后,将该含有目标片段的线性化重组质粒采用T7 RNA多聚酶在37℃条件下进行体外转录,获得类病毒RNA二聚体溶解于1%K2HPO4接种缓冲液中,机械摩擦接种Alisa Craig和Rutgers番茄(S.lycopersicum var.Alisa Craig和var.Rutgers)叶片,置于24℃温室条件下培养。接种60 d后,采集新生叶片釆用CTAB法提取番茄叶片总RNA,通过RT-PCR对接种的类病毒进行检测。将PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分析后,切胶回收目标片段,与p MD18-T载体连接,热击转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。经PCR鉴定后挑取阳性克隆进行序列测定,采用DNAMAN version 6.0软件对获得的c DNA序列进行相似性分析。【结果】线性化质粒体外转录后经琼脂糖凝胶电泳分析显示,每个质粒转录产物均可检测到目� 展开更多
关键词 柑橘类病毒 番茄 草本指示植物 侵染性RNA
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新疆加工番茄马铃薯Y病毒株系鉴定 被引量:1
8
作者 梁学超 路遥 +2 位作者 刘丽娜 向本春 《植物病理学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第6期739-747,共9页
马铃薯Y病毒(Potato virusy,PVY)是世界范围内对茄科属植物造成影响的重要病毒,为了解PVY对新疆加工番茄的危害,本文采集205份加工番茄样品进行血清学检测,结果PVYo、PVYO/N/C、PVYN检出率分别为20%、18.05%O%,且PVY不同... 马铃薯Y病毒(Potato virusy,PVY)是世界范围内对茄科属植物造成影响的重要病毒,为了解PVY对新疆加工番茄的危害,本文采集205份加工番茄样品进行血清学检测,结果PVYo、PVYO/N/C、PVYN检出率分别为20%、18.05%O%,且PVY不同株系总检出率达24.9%。根据血清学检测结果,在苋色藜(Chenopodium amaranticolor)上进行单斑分离获得2个PVY分离物S1-10、S2—12,其基因组序列分析结果显示,S1-10分离物是PVYO与PVYN的重组体,属于PVYN-O株系,S2-12属于PVYO株系。本研究表明新疆加工番茄上的PVY主要为PVY-NO。和PVYO株系。 展开更多
关键词 血清学 基因组 序列分析 重组分析
新疆加工番茄上南方番茄病毒外壳蛋白基因的克隆与原核表达 预览 被引量:3
9
作者 张强 崔百明 +1 位作者 向本春 《西北农林科技大学学报:自然科学版》 CSCD 北大核心 2015年第4期118-122,共5页
【目的】克隆南方番茄病毒(STV)的外壳蛋白(CP)基因,构建其原核表达载体并进行诱导表达,为制备检测该病毒的高效价血清提供参考。【方法】利用一步法RT-PCR从新疆加工番茄上克隆STVCP基因,将其连接到原核表达载体pET-28a(+)上,获得重... 【目的】克隆南方番茄病毒(STV)的外壳蛋白(CP)基因,构建其原核表达载体并进行诱导表达,为制备检测该病毒的高效价血清提供参考。【方法】利用一步法RT-PCR从新疆加工番茄上克隆STVCP基因,将其连接到原核表达载体pET-28a(+)上,获得重组质粒pET-28a-STV CP。将重组质粒转化大肠杆菌BL21后用IPTG进行诱导表达。【结果】成功克隆了STVCP基因,其长度为1 134bp。构建了原核重组表达质粒pET-28a-STV CP,其在1mmol/L IPTG诱导下,成功表达出分子质量约47ku的蛋白。【结论】成功克隆了STV CP基因,并诱导了pET-28a-STV CP重组蛋白的原核表达。 展开更多
关键词 南方番茄病毒 外壳蛋白基因 原核表达
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番茄黄化曲叶病毒侵染性克隆的构建 预览
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作者 张玉祥 袁伦 +1 位作者 向本春 《石河子大学学报:自然科学版》 CAS 2015年第6期672-676,共5页
为研究番茄黄化曲叶病毒(TYLCV)的基因功能及相关致病机理,构建了2种TYLCV的侵染性克隆。将两端含有间隔序列(intergenic sequence,IR)的TYLCV全基因组片段分别克隆到质粒p UC57和p CAMBIA2300上得到侵染性隆p TYLCV1.X和p CB2300-... 为研究番茄黄化曲叶病毒(TYLCV)的基因功能及相关致病机理,构建了2种TYLCV的侵染性克隆。将两端含有间隔序列(intergenic sequence,IR)的TYLCV全基因组片段分别克隆到质粒p UC57和p CAMBIA2300上得到侵染性隆p TYLCV1.X和p CB2300-1.X。利用质粒p TYLCV1.X直接注射法与p CB2300-1.X的农杆菌浸润法分别接种番茄植株。结果显示:侵染性克隆p TYLCV1.X在注射番茄6周后出现系统症状,侵染效率为23.1%-42.1%;农杆菌浸润法接种的植株4周后观察到明显的病害症状,侵染效率为87.5%-100%。PCR检测结果证明2种侵染性克隆均可在番茄体内产生完整的病毒基因组DNA,实时定量PCR测定病毒浓度可达102个/番茄细胞。以上结果表明,含有2个IR的TYLCV基因组载体具有侵染活性。 展开更多
关键词 番茄黄化曲叶病毒 侵染性克隆 间隔序列
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小西葫芦黄花叶病毒石河子分离物的分子变异 预览 被引量:1
11
作者 王志江 杨海燕 +1 位作者 向本春 《石河子大学学报:自然科学版》 CAS 2015年第6期677-682,共6页
为了解内共生菌Wolbachia对土耳其斯坦叶螨(Tetranychus turkestani)的生殖调控作用和对适合度的影响,本研究通过人工培养得到完全感染Wolbachia的品系和完全不感染的品系,从2个品系中挑取不同感染类型的雌雄螨,设立感染Wolbachia(... 为了解内共生菌Wolbachia对土耳其斯坦叶螨(Tetranychus turkestani)的生殖调控作用和对适合度的影响,本研究通过人工培养得到完全感染Wolbachia的品系和完全不感染的品系,从2个品系中挑取不同感染类型的雌雄螨,设立感染Wolbachia(♀)、感染Wolbachia(♂),感染Wolbachia(♀)×不感染Wolbachia(♂)、不感染Wolbachia(♀)×感染Wolbachia(♂)、不感染Wolbachia(♀)×不感染Wolbachia(♂)4种组合单独进行杂交试验,通过比较各组合杂交后代情况以及感染Wolbachia品系和不感染品系的产卵量、性比、寿命以及发育历期,研究内共生菌Wolbachia对寄主土耳其斯坦叶螨的影响。结果显示:不感染Wolbachia的雌螨(♀)与感染雄螨(♂)交配后会产生胞质不亲和(CI)现象,表现为产生的F1代雌螨数比其它3种组合明显减少,孵化率、成活率和F1雌雄性比明显下降,而亲本雌螨产卵量无明显变化,其它3种组合各参数之间无明显差异;Wolbachia可诱导CI现象,缩短雌螨的寿命,同时又缩短了雌雄螨发育历期,Wolbachia对寄主适合度的影响既有利又有弊。本试验结果为深入研究Wolbachia的感染机制和生殖调控作用提供了重要的理论基础。 展开更多
关键词 小西葫芦黄花叶病毒 DAS—ELISA PCR—SSCP 分子变异
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马铃薯Y病毒辅助成分蛋白酶与加工番茄OPA3-like蛋白结合及其定位研究 预览 被引量:1
12
作者 张丽丽 崔百明 +2 位作者 黄先忠 向本春 《石河子大学学报:自然科学版》 CAS 2014年第4期403-408,共6页
为了研究加工番茄OPA3-like蛋白与马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)的辅助成分蛋白酶(helper component proteinase,HC-Pro)的相互作用,进行了2种蛋白的结合及其定位研究。通过PCR的方法从加工番茄中克隆OPA3-like基因,同时利用Blas... 为了研究加工番茄OPA3-like蛋白与马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)的辅助成分蛋白酶(helper component proteinase,HC-Pro)的相互作用,进行了2种蛋白的结合及其定位研究。通过PCR的方法从加工番茄中克隆OPA3-like基因,同时利用Blast方法对其分析,进行了OPA3-like蛋白基因氨基酸序列同源性分析。通过构建双分子荧光互补载体pSPYCE-35S-OPA3-like和pSPYNE-35S-HC-Pro,利用农杆菌介导法共侵染洋葱表皮细胞60 h后,在共聚焦显微镜下观察洋葱表皮细胞中的黄色荧光。结果显示:加工番茄OPA3-like基因ORF长510 bp,编码169个氨基酸,编码蛋白属OPA3蛋白家族。激光共聚焦显微镜下可观察到沿细胞膜呈小泡状分布黄色荧光,说明PVY的HC-Pro蛋白与加工番茄OPA3-like蛋白结合并且共定位在细胞膜附近。这为进一步研究PVY的HC-Pro蛋白与加工番茄OPA3-like蛋白的相互作用机制奠定了一定的基础。 展开更多
关键词 HC-Pro蛋白 OPA3-like蛋白 相互作用 双分子荧光互补 洋葱表皮细胞
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转基因棉花室内种质筛选新方法研究 预览 被引量:2
13
作者 寇伟 李榕 +2 位作者 崔百明 《中国棉花》 2014年第2期22-26,共5页
为进一步改进转基因棉花室内筛选系统,使用5000mg·L^-1浓度卡那霉素分别对转Bt基因棉花和非转基因棉花品种新陆早33的种子进行卡那霉素影响侧根生成的实验研究,经过卡那霉素溶液处理的棉花种子在基质中培养5d后进行数据统计,然... 为进一步改进转基因棉花室内筛选系统,使用5000mg·L^-1浓度卡那霉素分别对转Bt基因棉花和非转基因棉花品种新陆早33的种子进行卡那霉素影响侧根生成的实验研究,经过卡那霉素溶液处理的棉花种子在基质中培养5d后进行数据统计,然后分别提取生成和不生成侧根的棉花幼苗子叶DNA,进一步经聚合酶链式反应(PCR)鉴定确认。结果表明:用5000mg·L’的卡那霉素对2个品种进行筛选时,Bt棉89%有侧根形成,而新陆早33仅2%有侧根发生。PCR鉴定结果也显示有侧根生成的棉花幼苗具有卡那霉素抗性基因NPTII和抗虫基因Bt。实验结果-9预期结果一致,所以这种筛选新方法可以作为有效快捷的转基因棉花室内筛选方案。 展开更多
关键词 卡那霉素(kanamycin) 侧根 筛选 转基因 棉花
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抗CMV和ToMV RNAi载体的构建及加工番茄遗传转化 预览 被引量:2
14
作者 乔亚红 田桂 +3 位作者 崔百明 李诗林 向本春 《西北农林科技大学学报:自然科学版》 CSCD 北大核心 2014年第1期102-110,共9页
【目的】利用农杆菌介导法将抗CMV和ToMV的RNAi表达载体pBi35STC12转入红番3号加工番茄,获得抗CMV和ToMV的加工番茄植株,为加工番茄病毒病的防治奠定基础。【方法】采用RT-PCR扩增,选取新疆加工番茄CMV分离物NS0-4 1a复制酶第1 051-1 35... 【目的】利用农杆菌介导法将抗CMV和ToMV的RNAi表达载体pBi35STC12转入红番3号加工番茄,获得抗CMV和ToMV的加工番茄植株,为加工番茄病毒病的防治奠定基础。【方法】采用RT-PCR扩增,选取新疆加工番茄CMV分离物NS0-4 1a复制酶第1 051-1 350bp序列和ToMV分离物SCS-2 130/180ku复制酶第1 920-2 200bp序列,作为干扰片段CR12和To12。通过T克隆载体将CR12和To12连接成拼接片段TC12,构建成含反向重复结构拼接片段的RNAi表达载体pBi35STC12。通过农杆菌介导法,用其转化红番3号加工番茄,经过筛选、PCR检测得到转基因植株。【结果】成功构建了抗CMV和ToMV的RNAi表达载体pBi35STC12,并用其转化番茄植株,从转化的1 500个愈伤组织中获得33株再生植株,利用PCR对再生植株进行检测,显示从33株再生植株中获得了19株转基因植株,转化率为1.26%。【结论】构建了抗CMV和ToMV的RNAi表达载体pBi35STC12,用其转化红番3号加工番茄,获得了转基因植株。 展开更多
关键词 CMV TOMV RNAI载体 加工番茄 遗传转化
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棉花DELLA蛋白GhGAI2b基因的克隆和功能初步分析 预览 被引量:4
15
作者 詹杰鹏 +2 位作者 王志江 崔百明 《石河子大学学报:自然科学版》 CAS 2014年第5期635-640,共6页
DELLA蛋白是赤霉素信号途径的负调节因子,在棉花纤维发育中有着重要作用。本研究采用同源克隆方法,从棉花中克隆DELLA蛋白GhGAI2b基因,构建pBP35S:GhGAI2b和pBP35S:Ghgai2b植物过表达载体,通过农杆菌介导的滴花法转化Col野生型拟... DELLA蛋白是赤霉素信号途径的负调节因子,在棉花纤维发育中有着重要作用。本研究采用同源克隆方法,从棉花中克隆DELLA蛋白GhGAI2b基因,构建pBP35S:GhGAI2b和pBP35S:Ghgai2b植物过表达载体,通过农杆菌介导的滴花法转化Col野生型拟南芥。结果表明,棉花DELLA蛋白GhGAI2b包含了DELLA蛋白家族中所有的典型保守区域;转基因拟南芥表现出莲座叶半径变短,植株矮化,花序紧凑,花器官发育迟缓等生长发育受抑制表型。说明棉花DELLA蛋白GhGAI2b基因可能参与GA信号途径抑制植物生长发育。 展开更多
关键词 棉花 赤霉素 DELLA蛋白 GhGAI2b基因
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辣椒上CMV亚组ⅠB CP基因克隆与原核表达 预览 被引量:1
16
作者 张强 +1 位作者 向本春 《新疆农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2014年第12期2257-2261,共5页
【目的】克隆辣椒上黄瓜花叶病毒外壳蛋白(CMV CP)基因,诱导CP蛋白表达,为下一步制备高效、特异的抗血清奠定基础。【方法】根据已知的新疆石河子辣椒上的CP基因序列设计引物,克隆CMV CP基因,经测序、NocⅠ/Bam HⅠ酶切鉴定,成功构建... 【目的】克隆辣椒上黄瓜花叶病毒外壳蛋白(CMV CP)基因,诱导CP蛋白表达,为下一步制备高效、特异的抗血清奠定基础。【方法】根据已知的新疆石河子辣椒上的CP基因序列设计引物,克隆CMV CP基因,经测序、NocⅠ/Bam HⅠ酶切鉴定,成功构建了原核表达载体p ET-CMV CP,转化大肠杆菌BL21 DE3,用终浓度为1 mmol/L IPTG诱导蛋白表达,SDS-PAGE检测目的蛋白表达。【结果】成功构建了新疆辣椒上CMV CP原核表达载体p ET-CMV CP,获得了与预期大小一致的30 k Da蛋白。【结论】新疆石河子辣椒上CMV CP在原核中获得了正确表达。 展开更多
关键词 辣椒 黄瓜花叶病毒 外壳蛋白 原核表达
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红番3号加工番茄遗传转化再生体系的建立 预览 被引量:3
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作者 乔亚红 +4 位作者 李诗林 田桂 张丽丽 林涛 向本春 《核农学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第11期1636-1643,共8页
本研究以加工番茄红番3号子叶为外植体,对加工番茄再生体系无菌苗的苗龄、培养基激素的配比和培养基基质选择方面进行优化。结果表明:8~10d的子叶为最佳的外植体。以MS为基本培养基,附加不同浓度IAA(0.05、0.10、0.15、0.20mg&... 本研究以加工番茄红番3号子叶为外植体,对加工番茄再生体系无菌苗的苗龄、培养基激素的配比和培养基基质选择方面进行优化。结果表明:8~10d的子叶为最佳的外植体。以MS为基本培养基,附加不同浓度IAA(0.05、0.10、0.15、0.20mg·L^-1)分别与不同浓度6-BA(1.0、1.5、2.0、2.5mg·L^-1)/ZT(0.1、0.5、1.5、2.0mg·L^-1)的组合。经诱芽比较,在不同浓度6-BA/ZT与不同浓度IAA组合中,诱导出愈伤组织和不定芽分化最高的培养基为MS+ZT0.5mg·L^-1+IAA0.1mg·L^-1+植物凝胶2g·L^-1。以1/2MS添加不同浓度IAA(0.05、0.10、0.15、0.20mg·L^-1)进行生根比较,再生芽在1/2MS+IAA0.1mg·L^-1生根培养基上生根最好。 展开更多
关键词 加工番茄 子叶 遗传转化 再生体系
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新疆加工番茄上一种类似南方番茄病毒的分子检测 预览 被引量:8
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作者 苏海娣 梁学超 +3 位作者 崔百明 王建江 向本春 《石河子大学学报:自然科学版》 CAS 2013年第3期271-275,共5页
在对加工番茄里格87-5进行RNA测序时,我们发现存在南方番茄病毒的基因组序列,序列包含STV除5’末端12bp和3’末端35bp的其它全部3390bp的RNA序列,其中只有5个碱基存在差异(与EF442780相比),说明里格87—5感染了STV。为了快速检测... 在对加工番茄里格87-5进行RNA测序时,我们发现存在南方番茄病毒的基因组序列,序列包含STV除5’末端12bp和3’末端35bp的其它全部3390bp的RNA序列,其中只有5个碱基存在差异(与EF442780相比),说明里格87—5感染了STV。为了快速检测加工番茄品种的病毒感染情况,我们设计了STV特异性的PCR引物STVl68F/sTv745R,用一步法RT—PCR方法,从里格87—5的总RNA中扩增得到了预期的577bp的扩增产物,回收、克隆到pGEM-T上,提取质粒经EcoRI酶切鉴定后进行序列测定,与已报道的STV的序列同源性为99%~100%,表明该片段是STV特异性的。运用这项技术调查了20份加工番茄材料,结果显示,有3份材料的全部植株均带毒,13份材料均不带毒,另外4份材料部分带毒。同时,在新疆石河子蔬菜花卉研究所随机采集了加工番茄叶片样品,统计大田检出率约为28%。 展开更多
关键词 新疆 加工番茄 南方番茄病毒 一步法RT-PCR检测
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应用RNAi技术获得抗ToMV和CMV转基因烟草 预览 被引量:2
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作者 林涛 +2 位作者 崔百明 乔亚红 向本春 《石河子大学学报:自然科学版》 CAS 2013年第4期430-435,共6页
为了获得同时抗ToMV和CMV的转基因烟草,采用以ToMV和CMV部分CP基因片段作为干扰病毒的靶序列,构建了pHi35sG12RNAi表达载体。利用农杆菌介导法转化西方烟(Nicotiana occidentalis),经卡那霉素筛选、PCR鉴定证明干扰序列已整合到烟... 为了获得同时抗ToMV和CMV的转基因烟草,采用以ToMV和CMV部分CP基因片段作为干扰病毒的靶序列,构建了pHi35sG12RNAi表达载体。利用农杆菌介导法转化西方烟(Nicotiana occidentalis),经卡那霉素筛选、PCR鉴定证明干扰序列已整合到烟草基因组中,并对ToMV和CMV混合侵染表现抗性。 展开更多
关键词 番茄花叶病毒 黄瓜花叶病毒 RNAI载体 转基因烟草
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加工番茄马铃薯Y病毒一步法RT—PCR检测及CP基因的克隆与序列分析 预览 被引量:1
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作者 梁学超 向本春 +2 位作者 程朝玲 苏海娣 《西南农业学报》 CSCD 北大核心 2013年第6期2340-2344,共5页
本文通过一步法RT-PCR技术,检测新疆加工番茄马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)感染率。结果表明,新疆加工番茄马铃薯Y病毒感染率为25%。选取10个样品利用RT-PCR技术,克隆CP基因,获得807bp全长CP基因,编码268个氨基酸。CP基因... 本文通过一步法RT-PCR技术,检测新疆加工番茄马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)感染率。结果表明,新疆加工番茄马铃薯Y病毒感染率为25%。选取10个样品利用RT-PCR技术,克隆CP基因,获得807bp全长CP基因,编码268个氨基酸。CP基因序列比对分析与系统进化树分析表明,侵染新疆加工番茄的马铃薯Y病毒属于PVY^N:O株系。 展开更多
关键词 马铃薯Y病毒 加工番茄 一步法RT—PCR CP基因
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