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siRNA可降低IL-1β刺激椎间盘细胞所致凋亡敏感性 预览
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作者 韩敦富 尹荷珊 +4 位作者 王延 王鹏云 汪震 魏超 时明 《安徽医科大学学报》 CAS 北大核心 2019年第1期64-68,共5页
目的明确siRNA是否可降低大鼠椎间盘细胞对IL-1β预刺激导致的凋亡敏感性,并初步探讨其机制。方法用阴性对照siRNA转染原代大鼠腰椎间盘细胞后,用含10ng/mlIL-1β的1%胎牛血清(FBS)培养基和被转染椎间盘细胞共培养,分别在4、8、16、32h... 目的明确siRNA是否可降低大鼠椎间盘细胞对IL-1β预刺激导致的凋亡敏感性,并初步探讨其机制。方法用阴性对照siRNA转染原代大鼠腰椎间盘细胞后,用含10ng/mlIL-1β的1%胎牛血清(FBS)培养基和被转染椎间盘细胞共培养,分别在4、8、16、32h检测其对Fas受体(Fas)表达的影响。利用Fas-siRNA和阴性对照siRNA分别对原代大鼠椎间盘细胞进行转染48h后,实验分组和处理:共分5组,N、N-20ng、N-IL为阴性对照siRNA转染细胞,Si-20ng、Si-IL为Fas-siRNA2转染的细胞。N为对照组,只加1%FBS培养基;N-20ng和Si-20ng在1%FBS培养基培养8h后,更换为含20ng/mlFas配体(FasL)的1%FBS培养基;NIL和Si-IL:与10ng/mlIL-1β在1%FBS培养基中培养8h后,更换为含20ng/mlFasL的1%FBS培养基;以上各组加入20ng/mlFasL后均继续培养24h,观察细胞的凋亡情况,Annexin V-FITC/PI双染流式细胞仪检测各组细胞凋亡率,RT-PCR、Western blot分别检测FasmRNA和蛋白表达水平。结果①与10ng/mlIL-1β共培养的阴性对照siRNA转染细胞的FasmRNA在4h时开始升高,但32h时才出现统计学差异;而蛋白检测各时间点均未出现表达差异。②经IL-1β预处理的Si-IL、N-IL细胞组较相应的未经IL-1β预处理的Si-20ng、N-20ng细胞组,细胞凋亡率均升高;Fas-siRNA转染的Si-IL细胞组较阴性siRNA转染的N-IL细胞组的细胞凋亡率明显下降。③细胞凋亡率与Fas的表达具有相关性。结论siRNA可降低大鼠椎间盘细胞对IL-1β预刺激导致的凋亡敏感性,但其确切机制尚需进一步研究。 展开更多
关键词 椎间盘细胞 凋亡 SIRNA IL-1Β RNA干扰
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干扰foxM1基因表达可增强骨髓间充质干细胞的成骨分化能力 预览
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作者 陈钦桂 曾勉 +2 位作者 何婉媚 张莉珊 郑海崇 《中国组织工程研究》 CAS 北大核心 2019年第5期673-679,共7页
背景:foxM1基因被认为参与了干细胞分化命运的调控,但其对间充质干细胞成骨分化的影响尚未见报道,关于foxM1基因的研究也主要集中于肿瘤领域。目的:探索干扰foxM1基因表达水平对骨髓间充质干细胞成骨分化能力的影响。方法:全骨髓贴壁法... 背景:foxM1基因被认为参与了干细胞分化命运的调控,但其对间充质干细胞成骨分化的影响尚未见报道,关于foxM1基因的研究也主要集中于肿瘤领域。目的:探索干扰foxM1基因表达水平对骨髓间充质干细胞成骨分化能力的影响。方法:全骨髓贴壁法培养SD大鼠(中山大学实验动物中心提供)骨髓间充质干细胞,构建含嘌呤霉素抗性基因的foxM1shRNA重组慢病毒载体并转染大鼠骨髓间充质干细胞,经嘌呤霉素筛选建立foxM1稳定敲低细胞株,另设置空病毒载体组以及未转染组。使用骨髓间充质干细胞成骨诱导分化培养基诱导培养并行茜素红染色检测其成骨分化能力,使用定量RT-PCR检测成骨相关基因的表达水平,同时提取胞核蛋白,Westernblot检测β-catenin蛋白表达水平。结果与结论:①与空病毒载体组以及未转染组比较,foxM1敲低的大鼠骨髓间充质干细胞经成骨诱导分化后形成的骨结节数量明显增多,成骨相关基因col1a1和runx2表达水平均显著升高,但胞核β-catenin蛋白水平无明显改变;②干扰foxM1基因表达可增强骨髓间充质干细胞的成骨能力。 展开更多
关键词 骨髓间充质干细胞 成骨 诱导分化 慢病毒载体 foxM1基因 基因干扰 β-catenin 国家自然科学基金 叉头转录因子类 RNA干扰 骨髓 间质干细胞 细胞分化 成骨细胞 组织工程
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大鼠Adrb3基因重组慢病毒干扰载体的构建及其对血管平滑肌细胞Adrb3表达的影响 预览
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作者 宋衍秋 毛用敏 +1 位作者 秦勤 丛洪良 《天津医药》 CAS 北大核心 2019年第2期122-126,226-227共6页
目的构建大鼠Adrb3(rAdrb3)基因慢病毒干扰载体,筛选高效率rAdrb3基因干扰序列,观察其对大鼠血管平滑肌细胞(VSMC)Adrb3基因表达的影响,为进一步研究Adrb3在心力衰竭中的作用机制提供实验工具。方法设计2条rAdrb3基因shRNA寡核苷酸序列... 目的构建大鼠Adrb3(rAdrb3)基因慢病毒干扰载体,筛选高效率rAdrb3基因干扰序列,观察其对大鼠血管平滑肌细胞(VSMC)Adrb3基因表达的影响,为进一步研究Adrb3在心力衰竭中的作用机制提供实验工具。方法设计2条rAdrb3基因shRNA寡核苷酸序列,构建慢病毒干扰质粒并进行测序鉴定。三质粒法共转染293T细胞包装慢病毒,测定慢病毒滴度。大鼠VSMC设置正常对照组(Normal组),空载慢病毒组(Lv-rAdrb3-shRNA-control组),携带rAdrb3基因慢病毒干扰载体1组(Lv-rAdrb3-shRNA-1组),携带rAdrb3基因慢病毒干扰载体2组(Lv-rAdrb3-shRNA-2组),感染5 d后,收集细胞。提取细胞总RNA和蛋白,Real-time PCR检测rAdrb3 mRNA表达,Western blot检测rAdrb3蛋白表达。结果构建2个携带rAdrb3基因慢病毒干扰载体,滴度均为2×10~8TU/mL。慢病毒感染大鼠VSMC 72 h后,感染效率可达80%。与Normal组比较,Lv-rAdrb3-shRNA-1、Lv-rAdrb3-shRNA-2组Adrb3 mRNA水平沉默效率为87.18%、65.27%(P<0.05);与Normal组比较,Lv-rAdrb3-shRNA-1、Lv-rAdrb3-shRNA-2组rAdrb3蛋白水平沉默效率为85.57%、70.04%(P<0.05)。结论成功构建并筛选出有效携带rAdrb3基因慢病毒干扰载体,可显著抑制大鼠VSMC Adrb3的表达。 展开更多
关键词 受体 肾上腺素能β3 RNA干扰 慢病毒 慢性心力衰竭 血管平滑肌细胞
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肢体和心脏发育基因在前列腺癌中的表达
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作者 朱东风 王雷 赫志强 《中华男科学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2019年第1期22-28,共7页
目的:探讨肢体和心脏发育(LBH)基因的表达在前列腺癌中的作用。方法:采用实时荧光定量PCR(q PCR)、免疫组化(IHC)和Western印迹方法检测20例前列腺癌与正常前列腺组织中LBH的表达;构建si RNA-1、si RNA-2和阴性对照序列转染PC-3、LNCa ... 目的:探讨肢体和心脏发育(LBH)基因的表达在前列腺癌中的作用。方法:采用实时荧光定量PCR(q PCR)、免疫组化(IHC)和Western印迹方法检测20例前列腺癌与正常前列腺组织中LBH的表达;构建si RNA-1、si RNA-2和阴性对照序列转染PC-3、LNCa P前列腺癌细胞以沉默LBH的表达,采用CCK-8、Transwell小室法观察细胞增殖、迁移及侵袭能力的变化。结果:q PCR检测结果显示前列腺癌组织中LBHm RNA表达水平明显高于正常前列腺组织(4. 8±2. 4 vs 1. 8±1. 1,P=0. 032);IHC结果显示LBH蛋白在前列腺癌组织中表达阳性率为90. 0%(18/20),正常前列腺组织中为15. 0%(3/20),差异具有统计学意义(P=0. 006);Western印迹结果也显示前列腺癌组织中LBH表达显著高于正常前列腺组织(3. 5±1. 2 vs 1. 3±0. 6,P=0. 019)。干扰LBH表达后,PC-3和LNCa P细胞的增殖能力均显著下降,96 h时,PC-3细胞中si RNA-1和si RNA-2组的A450值显著低于阴性对照组(1. 2±0. 1、1. 1±0. 1 vs 1. 8±0. 2,P <0. 01);LNCa P细胞中si RNA-1和si RNA-2组的A450值也显著低于阴性对照组(1. 4±0. 2、1. 1±0. 2 vs 1. 9±0. 2,P <0. 01)。细胞迁移实验显示,si RNA转染PC-3细胞后,si RNA-1和si RNA-2组透过基底膜的细胞数显著低于阴性对照组[(55. 5±6. 4)、(44. 9±4. 5)个vs (175. 6±25. 8)个,P <0. 05];LNCa P细胞中si RNA-1和si RNA-2组也显著低于阴性对照组[(46. 4±5. 8)、(40. 2±8. 2)个vs (125. 3±13. 5),P <0. 05]。细胞侵袭实验显示,si RNA转染PC-3细胞后,si RNA-1和si RNA-2组透过基底膜的细胞数显著低于阴性对照组[(82. 5±7. 5)、(68. 4±5. 5)个vs (138. 2±10. 7)个,P <0. 05];LNCa P细胞中si RNA-1和si RNA-2组也显著低于阴性对照组[(46. 4±5. 8)、(23. 1±6. 2)个vs (92. 1±10. 5)个,P <0. 05]。结论:高表达的LBH可能在前列腺癌的发病过程中发挥重要作用,可作为前列腺癌治疗的潜在靶标。 展开更多
关键词 前列腺癌 肢体和心脏发育基因 RNA干扰 细胞增殖 细胞迁移 细胞侵袭
慢病毒介导HIF-1α 沉默对缺氧肝癌细胞HepG2增殖和凋亡的影响
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作者 李国平 刘丽璇 +3 位作者 蒲泽锦 胡敏敏 黄聪武 吴灵飞 《武汉大学学报:医学版》 CAS 2019年第1期27-32,104共7页
目的:构建缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)-短发夹RNA(shRNA)慢病毒表达载体,观察慢病毒介导的HIF-1α基因沉默对体外模拟缺氧条件下的肝癌细胞HepG2增殖和凋亡的影响及其机制。方法:设计合成1条针对HIF-1α基因的shRNA干扰序列,构建于慢病... 目的:构建缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)-短发夹RNA(shRNA)慢病毒表达载体,观察慢病毒介导的HIF-1α基因沉默对体外模拟缺氧条件下的肝癌细胞HepG2增殖和凋亡的影响及其机制。方法:设计合成1条针对HIF-1α基因的shRNA干扰序列,构建于慢病毒载体质粒GV248中,转染293T细胞包装产生慢病毒,转染人肝癌细胞株HepG2细胞,嘌呤霉素筛选出稳定转染的细胞株。将HepG2细胞分为正常对照组、干扰对照组(转染NC-shRNA)、干扰组(转染HIF-1α-shRNA),应用化学缺氧法(150μmol/LCoCl2)模拟肿瘤细胞缺氧微环境,应用WesternBlot检测HepG2细胞中HIF-1α蛋白表达证实基因沉默效果,CCK-8检测沉默HIF-1α基因对HepG2细胞增殖的影响,AnnexinV-FITC凋亡检测试剂盒和流式细胞仪检测沉默HIF-1α基因对细胞凋亡的影响。WesternBlot检测HepG2细胞内凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、Cleavedcaspase-3、Cleavedcaspase-9和细胞质细胞色素C(Cyt-C)表达的变化。结果:①成功构建HIF1α-shRNA慢病毒载体并转染HepG2细胞,缺氧培养细胞24h后,与正常对照组及干扰对照组相比,干扰组细胞内HIF-1α蛋白表达明显降低(P<0.01),证实慢病毒载体能够有效沉默HIF-1α基因。②沉默HIF-1α基因后缺氧培养的HepG2细胞增殖率下降(P<0.05),而细胞凋亡比例升高(P<0.01)。③WesternBlot结果显示,与正常对照组及干扰对照组相比,沉默HIF-1α基因后细胞内凋亡相关蛋白Bax、Cleavedcaspase-3、Cleavedcaspase-9和细胞质Cyt-C表达上调(P<0.05或P<0.01),而抗凋亡蛋白Bcl-2表达下调(P<0.01),Bax/Bcl-2蛋白表达比例升高。结论:通过shRNA慢病毒载体途径可有效沉默缺氧HepG2肝癌细胞HIF-1α基因,HIF-1α沉默能显著抑制缺氧HepG2细胞增殖活性,促进细胞凋亡,其凋亡途径可能与激活内源性线粒体凋亡通路有关。 展开更多
关键词 慢病毒 SHRNA RNA干扰 HEPG2细胞 HIF-1Α
RNA干扰abcg-5基因对犬弓首蛔虫感染性的影响
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作者 罗永莉 江艾耘 +4 位作者 胡志刚 李相兰 杨晓迪 旷策嫣 周荣琼 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第2期390-397,共8页
为研究犬弓首蛔虫(Toxocara canis,T.canis)腺苷三磷酸结合盒G5基因(ATP-binding cassette G5,abcg-5)的功能,通过体外合成Tc-abcg-5基因的特异性siRNA,利用RNAi技术对T.canis的成虫和虫卵进行干扰。结果显示,干扰24、48h后siRNA-744组T... 为研究犬弓首蛔虫(Toxocara canis,T.canis)腺苷三磷酸结合盒G5基因(ATP-binding cassette G5,abcg-5)的功能,通过体外合成Tc-abcg-5基因的特异性siRNA,利用RNAi技术对T.canis的成虫和虫卵进行干扰。结果显示,干扰24、48h后siRNA-744组Tc-abcg-5的相对表达量比siRNA-1020组和siRNA-432组显著性降低,表明siRNA-744有较高的沉默效率。采用电穿孔法和浸泡法对siRNA-744的递送效率进行比较,结果显示浸泡法更有利于将siRNA-744导入到T.canis虫卵内。用siRNA-744经浸泡法干扰T.canis感染性虫卵,经口灌服小鼠,感染后第7天对小鼠的脑、肝和肺组织进行病理学研究,结果显示RNA干扰使T.canis感染性虫卵的感染力下降,从而降低了肺、肝的病变程度。研究表明Tc-abcg-5基因可能通过影响虫卵的发育从而参与T.canis的生长、发育过程。 展开更多
关键词 犬弓首蛔虫 abcg-5基因 RNA干扰
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反义寡核苷酸治疗的分子影像技术进展 预览
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作者 孔繁磊 刘思耘 +4 位作者 张宝平 石喻 赵相轩 赵周社 郭启勇 《医学综述》 2019年第3期556-560,565共6页
反义寡核苷酸治疗在许多疾病的治疗中具有巨大的潜力。同时,反义寡核苷酸治疗药物在生物体内转运至靶点发挥作用过程中也面临许多障碍,并存在一些不可预期的不良反应。分子影像技术可以对反义寡核苷酸治疗的生物进程进行成像,并对治疗... 反义寡核苷酸治疗在许多疾病的治疗中具有巨大的潜力。同时,反义寡核苷酸治疗药物在生物体内转运至靶点发挥作用过程中也面临许多障碍,并存在一些不可预期的不良反应。分子影像技术可以对反义寡核苷酸治疗的生物进程进行成像,并对治疗效果进行监测,对于优化反义寡核苷酸治疗至关重要。目前,多种分子影像模式已经应用在反义寡核苷酸治疗相关的研究上,每一个成像方式都有其独特的优势,但同样也有其固有的缺陷,多模态成像成为未来发展的趋势。 展开更多
关键词 RNA干扰 反义寡核苷酸治疗 分子影像
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甜菜内向整流K^+通道BvAKT1基因RNAi载体的构建
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作者 伍国强 刘海龙 +2 位作者 李胜胜 蔺丽媛 谢玲玲 《分子植物育种》 CAS CSCD 北大核心 2019年第1期112-118,共7页
植物细胞质中维持较高的K^+/Na^+是植物抵御盐胁迫的有效策略之一。内向整流K+通道AKT1(Arabidopsis K^+transporter)在这一过程中发挥着重要作用。本研究以嗜盐作物甜菜(Beta vulgaris L.)幼苗为材料,提取其根总RNA,采用RT-PCR方法扩... 植物细胞质中维持较高的K^+/Na^+是植物抵御盐胁迫的有效策略之一。内向整流K+通道AKT1(Arabidopsis K^+transporter)在这一过程中发挥着重要作用。本研究以嗜盐作物甜菜(Beta vulgaris L.)幼苗为材料,提取其根总RNA,采用RT-PCR方法扩增得到甜菜K^+通道BvAKT1基因的RNAi靶片段,以中间载体pHANNIBAL和植物表达载体pART27为基础,采用酶切和连接的方法构建了由CaMV 35S启动子驱动、含BvAKT1基因片段反向重复序列的RNAi (RNA interference)植物表达载体pART-BvAKT1-RNAi,采用冻融法将其分别导入根癌农杆菌GV3101和发根农杆菌LBA9402,对揭示BvAKT1在甜菜K^+吸收及离子稳态平衡中的作用研究具有推动作用。 展开更多
关键词 甜菜 内向整流K^+通道 K^+吸收 RNA干扰
蓬乱蛋白2干扰和过表达慢病毒载体的构建及其在hUVECs中的表达 预览
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作者 生欣 王俊华 +3 位作者 刘月华 郜双林 谢夏丹 范芳 《中国现代医学杂志》 CAS 2019年第1期15-22,共8页
目的获得蓬乱蛋白2(DVL2)基因干扰和过表达慢病毒表达系统,并在人脐静脉内皮细胞中(hUVECs)稳定表达。方法①聚合酶链反应扩增目的基因,设计合成shRNA,以慢病毒表达质粒为基础构建DVL2干扰和过表达载体,酶切电泳、实时荧光定量聚合酶链... 目的获得蓬乱蛋白2(DVL2)基因干扰和过表达慢病毒表达系统,并在人脐静脉内皮细胞中(hUVECs)稳定表达。方法①聚合酶链反应扩增目的基因,设计合成shRNA,以慢病毒表达质粒为基础构建DVL2干扰和过表达载体,酶切电泳、实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)和测序技术鉴定载体构建是否成功;②以3质粒系统在HEK293T细胞中包装病毒,通过荧光显微镜观察计数并计算病毒滴度;以嘌呤霉素筛选稳定转染的hUVECs,通过荧光显微镜观察计数获得转染效率。将感染好的细胞分为BC组(hUVECs空白对照)、NC组(HBLV-GFP-PURO阴性对照)、干扰组(pHB-shRNA-HDVL2)及过表达组(pHBLV-HDVL2)。③通过qRT-PCR与Western blotting检测分别从mRNA和蛋白表达水平验证目的基因的干扰和过表达水平。结果①插入慢病毒表达载体的基因片段与目的基因的碱基序列完全一致。干扰序列峰形图为单峰,无突变。②病毒包装后,NC组、干扰组、过表达组滴度分别为2×10^8、2×10^8和1×10^8TU/ml,感染人脐静脉内皮细胞的感染效率达98%。③干扰组DVL2的表达较BC组降低,差异有统计学意义(P<0.05),过表达组较BC组升高,差异有统计学意义(P<0.05),其中干扰效率为61%,蛋白质过表达水平为BC组的2.7倍。结论DVL2基因干扰和过表达慢病毒载体构建成功,并能够在原代hUVECs中稳定表达。 展开更多
关键词 蓬乱蛋白2/Wnt蛋白质类 慢病毒载体 内皮细胞 RNA干扰 过表达
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甜菜夜蛾卵黄原蛋白受体基因的RNA干扰 预览
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作者 赵静 陶蓉 +2 位作者 郝德君 肖留斌 谭永安 《中国农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2019年第1期56-64,共9页
【目的】卵黄原蛋白受体(vitellogenin receptor,VgR)是介导昆虫卵黄原蛋白胞吞作用的主要受体,通过RNA干扰(RNAi)方法研究甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)VgR的功能,为深入了解甜菜夜蛾生殖生理的分子机制及开发有效防治新方法提供依据。... 【目的】卵黄原蛋白受体(vitellogenin receptor,VgR)是介导昆虫卵黄原蛋白胞吞作用的主要受体,通过RNA干扰(RNAi)方法研究甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)VgR的功能,为深入了解甜菜夜蛾生殖生理的分子机制及开发有效防治新方法提供依据。【方法】以甜菜夜蛾雌成虫腹部的cDNA为模板,通过PCR克隆得到甜菜夜蛾VgR基因片段,其包含配体结合域功能区。绿色荧光蛋白基因(GFP)片段通过特异性引物从笔者实验室保存的GFP质粒上扩增。将VgR和GFP目的片段连入pMD-19T载体后进行测序,利用DNAMAN软件分析基因序列的准确性。以测序验证正确的质粒作为DNA模板,利用带T7启动子的引物进行PCR扩增。用T7 RiboMAX^TM Express RNAi System合成试剂盒合成VgR-dsRNA和GFP-dsRNA。应用10μL微量进样器在化蛹第2、6天的甜菜夜蛾雌蛹腹部注射3μL双链RNA(2μg·μL^-1).利用RT-qPCR技术检测甜菜夜蛾刚羽化、羽化24 h、羽化48 h雌成虫的VgR表达量变化,同时统计对照组(空白对照、注射GFP-dsRNA)和处理组(注射VgR-dsRNA)甜菜夜蛾的羽化率及单雌产卵量。【结果】扩增得到VgR和GFP基因片段,大小分别为327和417 bp。RT-qPCR检测结果表明,与对照组相比,注射dsRNA后甜菜夜蛾的VgR表达水平显著下降。对于刚羽化、羽化24 h、羽化48 h的雌成虫,注射VgR-dsRNA处理组的VgR表达量相比注射GFP-dsRNA的对照组分别下降了79.35%、84.22%、67.68%。通过解剖观察刚羽化、羽化24 h、羽化48 h的甜菜夜蛾卵巢,发现注射VgR-dsRNA处理组与注射GFP-dsRNA对照组相比,卵巢发育进度显著推迟。对于羽化24 h的甜菜夜蛾,与注射GFP-dsRNA组相比,注射VgR-dsRNA处理组卵巢管长度下降了23.92%;注射GFP-dsRNA组的卵巢成熟卵粒较多,平均直径为(0.46±0.05)mm,而注射VgR-dsRNA处理组成熟卵粒数量较少且相对较小,平均直径为(0.23±0.02)mm。注射GFP-dsRNA组和VgR-dsRNA组的羽化率无显著差异。注射VgR-ds 展开更多
关键词 甜菜夜蛾 卵黄原蛋白受体基因 RNA干扰 卵巢发育
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沉默NF-κB/p65基因抑制C反应蛋白诱导的人气道上皮细胞凋亡
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作者 胡根 朱彬 +2 位作者 赵田甜 许飞 张绍新 《国际呼吸杂志》 2019年第1期36-40,共5页
目的运用RNA干扰(RNAi)技术沉默人气道上皮细胞株9HTE的核因子κB(NF-κB)/p65基因,探讨NF-κB/p65的活化在C反应蛋白(CRP)诱导的人气道上皮细胞凋亡中的作用及调控机制。方法体外培养人气道上皮细胞株9HTE,利用阳离子脂质体Lipofectami... 目的运用RNA干扰(RNAi)技术沉默人气道上皮细胞株9HTE的核因子κB(NF-κB)/p65基因,探讨NF-κB/p65的活化在C反应蛋白(CRP)诱导的人气道上皮细胞凋亡中的作用及调控机制。方法体外培养人气道上皮细胞株9HTE,利用阳离子脂质体LipofectamineTM2000将化学合成的NF-κB/p65小干扰RNA(siRNA)转染入9HTE细胞,给予终浓度50μg/L的CRP刺激24h,免疫组织化学检测NF-κB/p65的活化,反转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测NF-κB/p65、Bcl-2和BaxmRNA的表达,Western blot检测Bcl-2和Bax蛋白的表达,流式细胞术检测细胞凋亡率的变化。结果化学合成的NF-κB/p65 siRNA可以抑制9HTE细胞NF-κB/p65 mRNA的表达及NF-κB/p65的活化,与CRP组和CRP+scramble siRNA组相比,NF-κB/p65 siRNA组Bcl-2 mRNA和蛋白表达明显减少(P﹤0.05),BaxmRNA和蛋白表达明显增加(P﹤0.05),流式细胞仪显示NF-κB/p65 siRNA组细胞凋亡率明显降低(P﹤0.05)。结论利用siRNA干扰沉默NF-κB/p65基因,可以有效抑制CRP介导的气道上皮细胞凋亡,表明NF-κB的活化可以促进气道上皮细胞中的凋亡,其机制之一可能是通过调控Bcl-2和Bax的表达发挥诱导细胞凋亡的作用。 展开更多
关键词 RNA干扰 C反应蛋白质 核因子ΚB 细胞凋亡 上皮细胞
钙调蛋白依赖性激酶Ⅱγ RNA干扰载体构建及对破骨细胞分化和骨吸收的影响
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作者 王艺睿 王会 +3 位作者 戚孟春 董伟 冯晓洁 孙红 《实用医学杂志》 CAS 北大核心 2019年第4期557-561,共5页
目的研究钙调蛋白依赖性激酶Ⅱγ(CaMKⅡγ)RNA干扰对破骨细胞分化和骨吸收的影响。方法构建3个CaMKⅡγRNA慢病毒重组干扰载体;阴性载体转染RAW264.7细胞,确定最适转染滴度值(MOI)和转染效率。用重组载体转染细胞,确定干扰效果最佳的... 目的研究钙调蛋白依赖性激酶Ⅱγ(CaMKⅡγ)RNA干扰对破骨细胞分化和骨吸收的影响。方法构建3个CaMKⅡγRNA慢病毒重组干扰载体;阴性载体转染RAW264.7细胞,确定最适转染滴度值(MOI)和转染效率。用重组载体转染细胞,确定干扰效果最佳的重组载体用于后续实验。细胞分为对照组、阴性载体组、干扰载体组;病毒转染5d后通过TRAP染色及牙本质磨片骨吸收陷窝检测3组破骨细胞生成及骨吸收情况。结果成功构建了3个CaMKⅡγ重组干扰载体;最适MOI值为30,转染效率>80%。#3重组载体干扰效果最佳,干扰效率在mRNA及蛋白水平分别为78.16%和67.02%(P<0.01)。3组细胞中,干扰载体组多核破骨细胞数、牙本质吸收陷窝数和面积较对照组分别下降了59.99%、54.19%和57.94%(P<0.01),而阴性载体组和对照组比较差异无显著性(P>0.05)。结论CaMKⅡγRNA干扰可显著抑制破骨细胞生成和骨吸收功能。 展开更多
关键词 钙调蛋白依赖性激酶IIγ 破骨细胞 RNA干扰 慢病毒
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胰岛素受体基因InR调控褐飞虱海藻糖代谢研究 预览
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作者 王莎莎 陈坚毅 +5 位作者 杨慧利 刘永康 罗雨嘉 邓颖梅 王世贵 唐斌 《环境昆虫学报》 CSCD 北大核心 2019年第1期119-128,共10页
在昆虫中已发现成熟的典型胰岛素信号通路,但是其调控海藻糖代谢途径的机制还未清晰。为探讨胰岛素受体基因在褐飞虱海藻糖代谢平衡及其发育的调控作用,本文采用RNAi技术抑制胰岛素受体(InR)基因的表达,测定处理后海藻糖、糖原和葡萄糖... 在昆虫中已发现成熟的典型胰岛素信号通路,但是其调控海藻糖代谢途径的机制还未清晰。为探讨胰岛素受体基因在褐飞虱海藻糖代谢平衡及其发育的调控作用,本文采用RNAi技术抑制胰岛素受体(InR)基因的表达,测定处理后海藻糖、糖原和葡萄糖含量及海藻糖酶活变化,并检测InR、类胰岛素多肽(Ilp)、海藻糖代谢途径中关键基因的表达。研究结果表明dsRNA注射后能够显著抑制Ilp和InR基因的表达;InR1低表达后72h能够显著抑制3种糖类物质的含量;InR表达抑制后72h可溶性海藻糖酶活性上升,而膜结合型海藻糖酶活性下降;当InR表达受抑制后3个海藻糖酶和2个海藻糖合成酶基因的表达都显著下降。这些结果说明InR能够影响海藻糖等糖类物质的平衡。从而为将来通过调控昆虫血糖平衡来控制害虫提供理论依据。 展开更多
关键词 褐飞虱 海藻糖代谢 胰岛素受体 RNA干扰
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慢病毒介导Notch1基因shRNA沉默大鼠骨髓间充质干细胞Notch信号通路的表达 预览
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作者 闫锦玉 邢万红 《中国组织工程研究》 CAS 北大核心 2019年第17期2659-2664,共6页
背景:对于骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化中Notch信号通路的机制研究较多,但是沉默Notch信号通路在工程化心肌样组织血管网络中的机制研究还比较少。目的:构建慢病毒载体介导Notch1基因sh RNA表达体系,观察骨髓间充质干细胞中r Notch... 背景:对于骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化中Notch信号通路的机制研究较多,但是沉默Notch信号通路在工程化心肌样组织血管网络中的机制研究还比较少。目的:构建慢病毒载体介导Notch1基因sh RNA表达体系,观察骨髓间充质干细胞中r Notch基因沉默效果。方法:构建p LV[shRNA]-EGFP:T2A:Puro-U6]{rNotch1[shRNA]19 nt}(PLV-Notch)和p LV[sh RNA]-EGFP:T2A:Puro-U6>ScrambleshRNA(PLV-Scramble)拼装慢病毒表达载体,并将该慢病毒载体包装质粒形成混合物共转染到HEK-293T细胞中。收集慢病毒悬液,通过定量PCR检测重组病毒滴度。将构建的PLV-Notch与PLV-Scramble分别感染骨髓间充质干细胞,经荧光显微镜观察和RT-qPCR、Western blot鉴定转染后两组骨髓间充质干细胞中增强型绿色荧光蛋白基因和目的基因rNotch1表达情况。结果与结论:慢病毒载体滴度大于1×108 TU?mL,稳定转染筛选得到成熟的细胞株。病毒转导效果良好,荧光率达80%,rNotch1基因在干扰组中的表达量是scrambled对照组的75.2%。由此可见,慢病毒介导转染rNotch1基因的骨髓间充质干细胞稳转株构建成功,并对Notch信号通路的表达有沉默作用。 展开更多
关键词 骨髓间充质干细胞 NOTCH基因 慢病毒载体 RNA干扰 NOTCH信号通路 山西省自然科学基金
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白细胞介素-23 p19 RNA干扰对结肠炎小鼠模型的治疗作用 预览
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作者 任渝棠 姜泊 林欣 《胃肠病学》 2019年第1期10-16,共7页
背景:炎症性肠病(IBD)是一种肠道自身免疫性疾病,具有不良临床结局,目前其生物治疗的靶点主要为促炎细胞因子。白细胞介素-23(IL-23)是近期被关注的重要促炎细胞因子,临床试验显示针对IL-23亚基的单抗类药物可能使IBD患者获益。目的:应... 背景:炎症性肠病(IBD)是一种肠道自身免疫性疾病,具有不良临床结局,目前其生物治疗的靶点主要为促炎细胞因子。白细胞介素-23(IL-23)是近期被关注的重要促炎细胞因子,临床试验显示针对IL-23亚基的单抗类药物可能使IBD患者获益。目的:应用结肠炎小鼠模型,尝试采用RNA干扰抑制IL-23表达,验证其治疗作用并探讨可能的作用机制。方法:使用三硝基苯磺酸(TNBS)灌肠建立结肠炎小鼠模型。模型动物分别经尾静脉注射IL-23 p19 shRNA慢病毒和对照shRNA慢病毒,同时设立不予干预的模型对照组。2周后行疾病活动指数和结肠组织炎症活动度评分,采集血清和结肠组织检测IL-23、IL-17、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)表达水平,并检测结肠组织Th17细胞数量。结果:IL-23 p19 RNA干扰治疗能显著降低结肠炎临床和组织学活动度(P<0.05),有效抑制IL-23表达(P<0.05),减少结肠组织中的Th17细胞数量(P<0.05),进而降低血清和结肠组织IL-17、TNF-α表达水平(P<0.05)。结论:以RNA干扰抑制IL-23表达对结肠炎小鼠模型具有治疗作用,其机制在于抑制Th17细胞及其效应细胞因子IL-17表达。 展开更多
关键词 炎症性肠病 白细胞介素23 RNA干扰 TH17细胞
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慢病毒介导的RNA干扰抑制白血病细胞增殖的应用 预览
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作者 方金勇 王雍 +3 位作者 张熠玲 王志龙 徐玲玲 赵铁军 《浙江师范大学学报:自然科学版》 CAS 2019年第1期50-55,共6页
通过慢病毒载体介导的RNA干扰(RNAi)技术,沉默成人T细胞白血病(ATL)中关键的病毒基因HBZ,并研究RNA干扰后对白血病细胞增殖的影响.首先根据HBZ基因序列设计RNA干扰片段,构建其慢病毒载体,并将其包装成病毒.然后用HBZsiRNA慢病毒感染白... 通过慢病毒载体介导的RNA干扰(RNAi)技术,沉默成人T细胞白血病(ATL)中关键的病毒基因HBZ,并研究RNA干扰后对白血病细胞增殖的影响.首先根据HBZ基因序列设计RNA干扰片段,构建其慢病毒载体,并将其包装成病毒.然后用HBZsiRNA慢病毒感染白血病细胞株TL-Om1,通过RT-PCR和Westernblot检测HBZ基因和蛋白表达情况,MTT技术检测沉默HBZ后TL-Om1细胞的增殖情况,利用RT-PCR检测病毒感染后下游生长相关基因的表达.实验结果表明:利用慢病毒介导的RNA干扰技术能有效降低HBZ的表达,进而抑制了白血病细胞的增殖;沉默HBZ后,细胞内E2F1,PCNA和Myc等下游生长相关基因的表达受到了明显抑制.这将为慢病毒介导的RNA干扰技术应用于临床治疗成人T细胞白血病提供重要的实验依据. 展开更多
关键词 慢病毒载体 RNA干扰 成人T细胞白血病 HBZ 细胞增殖
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STAT5A 及 NANOG 基因 mRNA 在前列腺癌细胞雄激素非依赖性转化中的表达及作用
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作者 吴锐浩 张美娟 +3 位作者 季丽丽 屠鸿翔 周武 王忠永 《中国卫生检验杂志》 CAS 2019年第1期44-47,共4页
目的探讨信号传导及转录激活因子5A(signal transducers and activators of transcription 5A,STAT5A)及NANOG基因mRNA在前列腺癌雄激素非依赖性转化过程中的作用。方法通过RT-PCR法比较LNCa P细胞与LNCa P-AI细胞中STAT5A及NANOG相关基... 目的探讨信号传导及转录激活因子5A(signal transducers and activators of transcription 5A,STAT5A)及NANOG基因mRNA在前列腺癌雄激素非依赖性转化过程中的作用。方法通过RT-PCR法比较LNCa P细胞与LNCa P-AI细胞中STAT5A及NANOG相关基因mRNA的差异表达,利用siRNA沉默STAT5A mRNA的表达检测LNCa P-AI细胞增殖情况的改变。结果LNCa P-AI细胞较LNCa P细胞STAT5A、NANOG、OCT4基因mRNA均上调,差异倍数分别为(14.60±9.77)倍、(182.33±98.97)倍、(7.44±1.01)倍(P<0.05);下调STAT5A后,SOX2、NANOG基因mRNA表达受抑制,实验组相对对照组表达量分别为(26.60±13.12)%、(15.43±1.89)%(P<0.05)。CCK-8法检测沉默STAT5A后LNCa P-AI细胞,其生长受抑制,抑制率为(30.24±6.64)%,上述差异均有统计学意义(P<0.05)。结论STAT5A及NANOG在前列腺癌雄激素非依赖性转化过程中可能有重要作用,下调STAT5A mRNA的表达可以下调NANOG mRNA的表达,并且在一定程度上影响LNCa P-AI细胞的增殖。 展开更多
关键词 信号传导及转录激活因子5A 前列腺癌 RNA干扰 雄激素非依赖性
抑制缺氧诱导因子1α表达对原代血管瘤内皮细胞增殖、凋亡的影响及其机制探讨 预览
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作者 陈德才 王雅 +3 位作者 马从乾 杨轲 陈辉 陈德霞 《现代肿瘤医学》 CAS 2019年第3期372-376,共5页
目的:探讨抑制缺氧诱导因子1α(HIF-1α)基因表达对体外培养的血管瘤内皮细胞增殖、凋亡的影响。方法:用组织块结合酶消化法提取原代血管瘤内皮细胞,取第3代细胞用于实验。实验分为空白组、阴性对照组和HIF-1α转染组,转染48 h后Western... 目的:探讨抑制缺氧诱导因子1α(HIF-1α)基因表达对体外培养的血管瘤内皮细胞增殖、凋亡的影响。方法:用组织块结合酶消化法提取原代血管瘤内皮细胞,取第3代细胞用于实验。实验分为空白组、阴性对照组和HIF-1α转染组,转染48 h后Western bloting检测各组细胞中HIF-1α、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Cleaved caspase3)、Fas、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)、磷酸化的丝氨酸苏氨酸激酶(p-AKT)的蛋白表达;CCK8和流式细胞仪分别检测细胞的增殖及凋亡情况。结果:阴性对照组HIF-1α的蛋白表达与空白组比较差异无统计学意义(P >0.05),而HIF-1α转染组HIF-1α的蛋白表达显著低于空白组(P<0.05);HIF-1α转染组细胞存活率显著降低,细胞凋亡率显著升高,Cleaved caspase3、Fas蛋白显著上调表达,PI3K、p-AKT蛋白显著下调表达,与空白组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。结论:抑制HIF-1α基因表达可降低血管瘤内皮细胞增殖及诱导细胞凋亡,其机制与下调PI3K/AKT信号通路有关。 展开更多
关键词 HIF-1Α基因 血管瘤 RNA干扰 增殖 凋亡
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Omentin-1基因沉默后对结肠癌细胞增殖和凋亡的影响 预览
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作者 李雪婷 万丽娟 +4 位作者 张群慧 陈明卫 夏同佳 许敏 唐松涛 《安徽医科大学学报》 CAS 北大核心 2019年第1期60-64,共5页
目的探讨网膜素-1(Omentin-1)基因沉默后对结肠癌(CRC)细胞增殖、凋亡的影响。方法培养人SW480结肠癌细胞株,通过脂质体转染介导的小分子干扰RNA(siRNA)干扰技术转染人SW480结肠癌细胞,实验设置转染组、阴性组(转染无关序列siRNA)、正... 目的探讨网膜素-1(Omentin-1)基因沉默后对结肠癌(CRC)细胞增殖、凋亡的影响。方法培养人SW480结肠癌细胞株,通过脂质体转染介导的小分子干扰RNA(siRNA)干扰技术转染人SW480结肠癌细胞,实验设置转染组、阴性组(转染无关序列siRNA)、正常对照组(未转染组)、MAX组(只含转染试剂),转染24h后,分别采用实时定量荧光PCR(RT-PCR)检测各组SW480结肠癌细胞中Omentin-1基因的相对表达水平,以鉴定转染组Omentin-1基因表达水平变化;MTT法检测各组细胞增殖变化;流式细胞术鉴定各组细胞凋亡变化。结果转染24h后,与其余三组比较,转染组Omentin-1mRNA相对表达量降低、吸光度值(OD值)下降,转染组凋亡率明显升高,差异均有统计学意义(P<0.05),而与正常对照组比较,阴性组和MAX组Omentin-1mRNA相对表达量、OD值、凋亡率均无明显变化,差异均无统计学意义(P>0.05)。结论Omentin-1基因沉默后可抑制人SW480结肠癌细胞增殖、促进其凋亡。 展开更多
关键词 结肠癌 网膜素-1 RNA干扰
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Notch信号通路在胰腺癌中的表达及其作用研究 预览
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作者 罗干 易超 +3 位作者 依马木买买提江·阿布拉 徐林 尹继炜 丁伟 《实用肿瘤学杂志》 CAS 2019年第1期1-7,共7页
目的研究Notch信号通路成员在胰腺癌组织中的异常表达及其在胰腺癌发生发展中的重要作用。方法应用Affymetrix基因表达谱芯片筛选10例胰腺癌组织及其癌旁组织中Notch信号通路存在差异表达的成员,并应用实时定量PCR和Westernblot印迹法... 目的研究Notch信号通路成员在胰腺癌组织中的异常表达及其在胰腺癌发生发展中的重要作用。方法应用Affymetrix基因表达谱芯片筛选10例胰腺癌组织及其癌旁组织中Notch信号通路存在差异表达的成员,并应用实时定量PCR和Westernblot印迹法加以验证;利用携锯齿2(Jagged2,JAG2)基因siRNA片段的慢病毒表达载体转染胰腺癌原代细胞构建JAG2基因阻遏表达胰腺癌细胞株,并采用MTT法、流式细胞术、侵袭小室实验法观察与分析该细胞株增殖、细胞周期及侵袭转移能力的变化。结果Affymetrix基因表达谱芯片共检测到差异表达基因512个,其中表达上调的基因419个,表达下调的基因93个;Notch信号通路中存在差异表达的为JAG2(上调表达8.20倍)、NOTCH1(上调表达3.74倍)、HES1(上调表达3.27倍)、NOTCH2(上调表达3.16倍);PCR和Westernblot法验证结果与基因芯片结果相符;与对照组相比,JAG2基因阻遏表达胰腺癌细胞株的生长明显受到抑制;经流式细胞仪分析两组细胞周期示JAG2基因阻遏表达胰腺癌细胞株的凋亡与S期阻滞明显增强;侵袭小室侵实验结果示JAG2基因阻遏表达胰腺癌细胞株袭转移能力明显减弱(P<0.05)。结论Notch信号通路部分成员在胰腺癌组织中存在显著差异表达,且阻遏该成员表达可影响胰腺癌细胞生长、细胞周期及侵袭转移。 展开更多
关键词 NOTCH信号通路 胰腺癌 RNA干扰 Jagged2基因
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