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肝细胞生长因子调节的酪氨酸激酶底物过表达促进心肌细胞自噬 预览
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作者 王添乐 李振华 +1 位作者 杨晓 王剑 《生物技术通讯》 CAS 2017年第6期737-741,共5页
目的:构建和包装携带肝细胞生长因子调节的酪氨酸激酶底物(Hgs)全长基因的重组腺病毒,并研究Hgs过表达对心肌细胞自噬的影响。方法:PCR扩增Hgs全长cDNA,将其连接到pMD18-T载体上,测序确认正确后将其克隆到腺病毒穿梭载体pAdTrack... 目的:构建和包装携带肝细胞生长因子调节的酪氨酸激酶底物(Hgs)全长基因的重组腺病毒,并研究Hgs过表达对心肌细胞自噬的影响。方法:PCR扩增Hgs全长cDNA,将其连接到pMD18-T载体上,测序确认正确后将其克隆到腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV,该载体线性化后转化大肠杆菌BJ5183感受态细胞,与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1同源重组,构建重组腺病毒质粒pAd-Hgs;将pAd-Hgs线性化后经脂质体转染293A细胞进行Ad-Hgs病毒的包装与扩增;用得到的Ad-Hgs腺病毒感染心肌细胞,通过荧光显微镜观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达,Western印迹、real-timePCR确认病毒感染的有效性以及Hgs过表达情况;通过Western印迹检测自噬标志物LC3的转换(LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ),以分析Hgs过表达对心肌细胞自噬的影响。结果:包装了携带Hgs基因的重组腺病毒Ad-Hgs;Ad-Hgs重组腺病毒感染心肌细胞后,荧光显微镜观察到明显的GFP表达;real-timePCR、Western印迹结果显示Hgs在心肌细胞中得到过表达;Western印迹结果证明,Hgs过表达导致心肌细胞LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ比值明显升高。结论:通过包装携带HgscDNA的重组腺病毒,发现Hgs过表达促进心肌细胞自噬。 展开更多
关键词 肝细胞生长因子调节的酪氨酸激酶底物(Hgs) 重组腺病毒载体 心肌细胞 自噬
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大鼠Rars基因siRNA重组腺病毒载体的构建与鉴定 预览
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作者 沈寅 符荣 +3 位作者 赵洪洋 王海均 王文良 张立志 《中国临床神经外科杂志》 2016年第5期290-293,共4页
目的构建针对大鼠Rars基因的siRNA重组腺病毒载体,并观察大鼠神经元细胞病毒转染前后目的蛋白表达量变化。方法将原代培养的大鼠神经元细胞随机分为观察组、阴性对照组及空白对照组。观察组细胞转染携带RarssiRNA序列的重组腺病毒,阴... 目的构建针对大鼠Rars基因的siRNA重组腺病毒载体,并观察大鼠神经元细胞病毒转染前后目的蛋白表达量变化。方法将原代培养的大鼠神经元细胞随机分为观察组、阴性对照组及空白对照组。观察组细胞转染携带RarssiRNA序列的重组腺病毒,阴性对照组细胞转染携带Scramble无意义序列的重组腺病毒,空白对照组不转染任何病毒。观察各对照组表达绿色荧光蛋白(GFP)的阳性细胞数,计算转染率,并检测转染前后Rars基因对应产物精氨酰-tRNA合成酶(ArgRS)蛋白的表达量,评价基因沉默效率。结果成功构建包含Rars基因干扰序列及Scramble序列的重组腺病毒,病毒滴度达10^10级。利用重组腺病毒感染大鼠神经元细胞48h后,绝大部分细胞表达GFP,转染率〉95%。含Rats干扰序列的病毒转染细胞可使ArgRS蛋白表达量显著降低(P〈0.01),沉默效率〉60%。含Scramble对照序列的病毒则不能产生明显的基因沉默效应。结论本实验所构建的siRNA重组腺病毒载体可有效沉默大鼠Rars基因,降低ArgRS蛋白表达。 展开更多
关键词 Rars基因 小分子干扰RNA 重组腺病毒载体 精氨酰-TRNA合成酶
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突变型Rad50腺病毒载体的制备及其在人鼻咽癌细胞株CNE1中的最适感染量测定 被引量:2
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作者 严睿成 黄健聪 +5 位作者 朱玲 常利红 黎景佳 吴喜福 叶进 张革化 《临床耳鼻咽喉头颈外科杂志》 CAS 北大核心 2015年第24期2143-2146,共4页
目的:测定携带突变型Rad50基因的重组腺病毒载体Ad-Rad50-GFP在人鼻咽癌细胞株CNE1中的表达及其对CNE1的最适感染倍率(MOI)。方法:终点稀释法测定Ad-Rad50-GFP生物滴度,细胞生长曲线观察重组腺病毒载体对CNE1生长的影响,荧光显微镜... 目的:测定携带突变型Rad50基因的重组腺病毒载体Ad-Rad50-GFP在人鼻咽癌细胞株CNE1中的表达及其对CNE1的最适感染倍率(MOI)。方法:终点稀释法测定Ad-Rad50-GFP生物滴度,细胞生长曲线观察重组腺病毒载体对CNE1生长的影响,荧光显微镜下计算重组腺病毒载体的转染效率;免疫印迹实验检测以最适感染量感染后CNE1细胞内突变型Rad50蛋白的表达。结果:Ad-Rad50-GFP生物滴度为1.26×10~(11)pfu/ml,重组腺病毒载体以不高于50的感染倍率转染时对CNE1生长无明显影响,且MOI=50时转染24h后GFP表达水平最高,可检出高表达的突变型Rad50蛋白,在转染72h后仍维持约70%的转染效率。结论:重组腺病毒载体Ad-Rad50-GFP能有效转染CNE1细胞并使其表达突变型Rad50蛋白,MOI=50为Ad-Rad50-GFP对CNE1的最适感染倍率。 展开更多
关键词 重组腺病毒 鼻咽肿瘤 感染倍率
SDF-1α-GFP基因重组腺病毒载体的构建及其转染大鼠心肌细胞的条件优化研究
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作者 郑栋 郭军 +1 位作者 李海瑞 李自成 《临床心血管病杂志》 CAS CSCD 北大核心 2014年第12期1086-1090,共5页
目的:构建基质细胞衍生因子1α-绿色荧光蛋白(SDF-1α-GFP)重组腺病毒载体并摸索其转染大鼠心肌细胞系的最佳条件。方法:人工合成SDF-1α基因并插入线性化表达载体,转化感受态E.coliDH5a细胞。筛选阳性菌落,采用DNA测序技术测定目... 目的:构建基质细胞衍生因子1α-绿色荧光蛋白(SDF-1α-GFP)重组腺病毒载体并摸索其转染大鼠心肌细胞系的最佳条件。方法:人工合成SDF-1α基因并插入线性化表达载体,转化感受态E.coliDH5a细胞。筛选阳性菌落,采用DNA测序技术测定目的基因序列。用获得的重组腺病毒(adenovirus,Ad)载体转染293T细胞,采用qPCR技术测定SDF-1α的mRNA表达水平。用不同滴度感染复数Ad-SDF-1α-GFP转染H9C2心肌细胞系,采用倒置相差显微镜及荧光显微镜分别在24和48h检测细胞形态及GFP蛋白阳性的细胞比率。结果:DNA测序证实SDF-1α基因构建成功。qPCR结果显示,与阴性对照组相比,MOI 2000组的SDF-1α的表达水平增加了约10 000倍,MOI 8000组的SDF-1α表达水平增加了约210 000倍。转染H9C2心肌细胞系的结果显示,MOI值为2 000、3 000、4 000、5 000、6 000、7 000及8 000的SDF-1α-GFP转染H9C2细胞48h后,其转染率分别为(45±5.04)%、(75±5.70)%、(80±5.67)%、(85±6.45)%、(90%±6.90)%、(90±5.22)%和(95±5.36)%,但是当MOI值区间为5 000~8 000时,细胞形态上出现明显损伤。结论:MOI值为4 000的Ad-SDF-1α-GFP转染H9C2细胞系48h能达到最佳的转染效率,并最小程度损伤细胞。 展开更多
关键词 基质细胞衍生因子1α基因 重组腺病毒 载体构建 H9C2细胞
表达产肠毒素性大肠埃希菌STa-K99融合蛋白重组腺病毒的免疫学特性研究 预览
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作者 包少文 庄佩佩 +5 位作者 石娟 杨佳丽 曾瑾 李武 刘晓明 邓光存 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第12期975-978,共4页
为研究表达产肠毒素性大肠埃希菌(ETEC)耐热性肠毒素STa与粘附素K99融合蛋白重组腺病毒rAd.STa-K99的免疫学特性,本实验将rAd.STa-K99经肌肉注射免疫小鼠,采用ELISA法分别检测了特异性IgG、SIgA、脾脏淋巴细胞增殖活性水平及CD4^+、C... 为研究表达产肠毒素性大肠埃希菌(ETEC)耐热性肠毒素STa与粘附素K99融合蛋白重组腺病毒rAd.STa-K99的免疫学特性,本实验将rAd.STa-K99经肌肉注射免疫小鼠,采用ELISA法分别检测了特异性IgG、SIgA、脾脏淋巴细胞增殖活性水平及CD4^+、CD8^+T淋巴细胞分型比值;并通过攻毒保护试验对其免疫效果进行评价.结果表明,免疫后小鼠特异性IgG、SIgA及脾脏淋巴细胞增殖活性水平显著升高;CD4+/CD8+值显著增大;动物攻毒保护率达到70%.结果表明rAd.STa-K99可以刺激小鼠机体产生较高水平的体液免疫、特异性细胞免疫和肠道粘膜免疫反应,并对小鼠提供有效保护.本实验为研制预防由ETEC引起的新生动物腹泻重组腺病毒疫苗奠定了基础. 展开更多
关键词 产肠毒素性大肠埃希菌 腺病毒载体 耐热性肠毒素 黏附素
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大鼠组织激肽释放酶8重组腺病毒载体的构建及鉴定 预览
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作者 曹步清 刘铁牛 《国际检验医学杂志》 CAS 2013年第18期2355-2357,共3页
目的构建大鼠组织激肽释放酶8(KLK8)的腺病毒表达载体,为进一步研究KLK8对心肌细胞的作用提供实验基础。方法采用AdEasy系统构建携带外源性KLK8编码基因的重组腺病毒载体pAd-KLK8,转染AD-293细胞包装产生重组腺病毒Ad-KLK8,TCID50法... 目的构建大鼠组织激肽释放酶8(KLK8)的腺病毒表达载体,为进一步研究KLK8对心肌细胞的作用提供实验基础。方法采用AdEasy系统构建携带外源性KLK8编码基因的重组腺病毒载体pAd-KLK8,转染AD-293细胞包装产生重组腺病毒Ad-KLK8,TCID50法对收获病毒进行滴度鉴定,RT-PCR及Western-blot方法检测目的基因在Hela细胞的表达。结果 PCR、序列测定以及限制性酶切证实KLK8基因正确插入腺病毒表达载体,并在AD-293细胞中包装出重组腺病毒;收获病毒的滴度为3.16×1012 IU/mL。结论成功构建pAd-KLK8重组腺病毒表达载体,且重组腺病毒在Hela细胞能有效表达。 展开更多
关键词 组织激肽释放酶8 腺病毒载体 逆转录聚合酶链反应
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产肠毒素大肠埃希菌STa-K99融合蛋白重组腺病毒载体的构建及表达 预览 被引量:2
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作者 邓光存 包少文 +3 位作者 杨继辉 曾瑾 李武 刘晓明 《动物医学进展》 CSCD 北大核心 2013年第10期30-36,共7页
为构建产肠毒素大肠埃希菌(ETEC) STa-K99融合蛋白重组腺病毒载体Ad STa-K99,通过PCR技术分别克隆了STa及K99基因,并与腺病毒穿梭质粒连接构建了穿梭质粒pAd5 STa-K99,将pAd5STa-K99和骨架质粒(含GFP基因)分别用Pac Ⅰ酶切线性化,利... 为构建产肠毒素大肠埃希菌(ETEC) STa-K99融合蛋白重组腺病毒载体Ad STa-K99,通过PCR技术分别克隆了STa及K99基因,并与腺病毒穿梭质粒连接构建了穿梭质粒pAd5 STa-K99,将pAd5STa-K99和骨架质粒(含GFP基因)分别用Pac Ⅰ酶切线性化,利用LipofectamineTM LTX&-PLUS共转染293细胞进行同源重组包装重组腺病毒,通过PCR及Western blot对重组腺病毒进行鉴定.结果显示,重组腺病毒Ad5 STa-K99构建正确并表达融合蛋白,且表达的融合蛋白能够被抗体所识别,为研制由ETEC引起的新生动物腹泻重组腺病毒载体疫苗奠定了基础. 展开更多
关键词 产肠毒素大肠埃希菌 耐热性肠毒素 黏附素 重组腺病毒载体
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人LMP-1基因腺病毒重组体的构建及其在骨肉瘤细胞U2OS中的表达 预览
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作者 刘会文 黄路 +5 位作者 韩智敏 罗嘉全 杨东 詹平 戴闽 曹凯 《重庆医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第7期589-594,共6页
目的:构建表达人LIM矿化蛋白-1(LIM mineralization protein-1,LMP-1)基因的腺病毒重组体,体外感染骨肉瘤(Osteosarcoma,OS)细胞系U2OS,并鉴定LMP-1基因在U2OS中的表达。方法:以K562细胞的cDNA为文库,采用PCR方法对LMP-1进行扩增... 目的:构建表达人LIM矿化蛋白-1(LIM mineralization protein-1,LMP-1)基因的腺病毒重组体,体外感染骨肉瘤(Osteosarcoma,OS)细胞系U2OS,并鉴定LMP-1基因在U2OS中的表达。方法:以K562细胞的cDNA为文库,采用PCR方法对LMP-1进行扩增,通过TA克隆与pGEM-T载体连接并DNA测序。双酶切后并将目的基因插入至腺病毒穿梭质粒pAdtrack-CMV,对腺病毒穿梭质粒pAdtrack-CMV-LMP-1行双酶切和DNA测序鉴定,并通过荧光显微镜、RT-qPCR和Western blot检测pAdtrack-CMV-LMP-1在HEK-293T细胞中的表达。线性化pAdtrack-CMV-LMP-1,在BJ5183菌内完成与骨架质粒pAdeasy-1的同源重组,构建重组腺病毒质粒Ad-LMP-1。通过脂质体介导,在HEK-293A细胞内包装出复制缺陷的重组腺病毒Ad-LMP-1,大量扩增、纯化并测定滴度。用Ad-LMP-1感染OS细胞系U2OS,通过荧光显微镜、RT-qPCR和Western blot检测LMP-1在U2OS细胞中的表达。结果:双酶切和DNA测序鉴定穿梭质粒pAdtrack-CMV-LMP-1构建成功,荧光显微镜证实转染了pAdtrack-CMV-LMP-1质粒的HEK-293T细胞内有绿色荧光蛋白表达,RT-qPCR和Western blot验证了LMP-1基因的表达量明显高于对照组。通过扩增、纯化,Ad-LMP-1滴度达到1.5×109pfu/ml。荧光显微镜下观察重组腺病毒感染的U2OS内有绿色荧光蛋白表达,RT-qPCR和Western blot检测发现重组腺病毒感染U2OS后,LMP-1的mRNA和蛋白表达量明显高于对照组。结论:成功构建了人LMP-1基因腺病毒重组体,为进一步的实验研究奠定了基础。 展开更多
关键词 LIM矿化蛋白-1 重组腺病毒载体 表达载体构建 骨肉瘤细胞
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KGF和EGFP双基因共表达的重组腺病毒转染小鼠骨髓间充质干细胞的研究 预览 被引量:1
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作者 王美华 胡锴勋 李晓兵 《中国实验血液学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2012年第2期 427-432,共6页
为了将角质生长因子(KGF)基因通过腺病毒载体转染到间充质干细胞(MSC)中,增强MSC胸腺修复功能,利用DNA重组技术,将目的基因KGF克隆到含有报告基因EGFP的穿梭质粒中,然后再将构建的重组穿梭质粒转移至pAdxsi载体中,构建重组腺病毒载... 为了将角质生长因子(KGF)基因通过腺病毒载体转染到间充质干细胞(MSC)中,增强MSC胸腺修复功能,利用DNA重组技术,将目的基因KGF克隆到含有报告基因EGFP的穿梭质粒中,然后再将构建的重组穿梭质粒转移至pAdxsi载体中,构建重组腺病毒载体质粒,继而在H293细胞中包装、扩增,并测定病毒滴度。转染至小鼠骨髓MSC中,为胸腺组织修复免疫功能恢复提供前期实验基础。结果表明:重组穿梭质粒pShuttle-GFP-mKGF重组穿梭质粒经酶切鉴定得到0.6 kb和5.1 kb 2个条带;重组腺病毒载体质粒pAdxsi-mKGF病毒质粒经酶切鉴定得到阳性克隆;测定重组腺病毒Ad-EGFP-mKGF半数组织培养感染量的滴度为1.6×1010 pfu/ml。转染后10 hMSC开始表达荧光,6-8 d达高峰,转染率可达92.3%,28 d仍有表达。结论:pAdxsi-mKGF病毒质粒构建成功并能高效、安全地转染MSC。 展开更多
关键词 KGF EGFP 重组腺病毒载体 MSC
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CXCR4-siRNA重组腺病毒载体沉默人卵巢癌细胞株CXCR4基因表达的研究 预览 被引量:1
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作者 刘瑜 袁瑞 《重庆医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第10期 1168-1171,共4页
目的:研究CXCR4-siRNA重组腺病毒载体对人卵巢癌细胞株SKOV3的CXCR4基因表达的影响。方法:PacⅠ酶切CXCR4-siRNA重组腺病毒载体使其线性化,应用HEK293细胞大量包装扩增病毒,收集病毒液,转染人卵巢癌细胞株SKOV3。细胞分为3组:siRNA组... 目的:研究CXCR4-siRNA重组腺病毒载体对人卵巢癌细胞株SKOV3的CXCR4基因表达的影响。方法:PacⅠ酶切CXCR4-siRNA重组腺病毒载体使其线性化,应用HEK293细胞大量包装扩增病毒,收集病毒液,转染人卵巢癌细胞株SKOV3。细胞分为3组:siRNA组,转染空病毒载体的阴性对照组,细胞不做任何处理的空白对照组。通过PCR、Western blot、免疫组化检测CXCR4基因沉默效果。结果:包装扩增后病毒滴度为6×108 PFU/ml,荧光显微镜下可观察到SKOV3细胞中绿色荧光蛋白的大量表达,重组腺病毒能够有效抑制SKOV3细胞中CXCR4的表达。结论:CXCR4-siRNA重组腺病毒载体可高效转染靶细胞和沉默CXCR4基因的表达,为RNA干扰技术应用于卵巢癌的临床基因治疗奠定基础。 展开更多
关键词 CXCR4 RNA干扰 重组腺病毒载体 卵巢癌
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IL-7和EGFP双基因共表达重组腺病毒载体的构建 预览 被引量:1
11
作者 宁昌 余长林 +1 位作者 李建军 胡锴勋 《现代肿瘤医学》 CAS 2011年第12期 2401-2404,共4页
目的:构建白细胞介素7(IL-7)和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)共表达的重组腺病毒载体,为进一步感染干细胞奠定基础。方法:将目的基因IL-7克隆到含有报告基因EGFP的穿梭质粒中,然后再将构建的重组穿梭质粒转移至pAdxsi载体中,构建重组... 目的:构建白细胞介素7(IL-7)和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)共表达的重组腺病毒载体,为进一步感染干细胞奠定基础。方法:将目的基因IL-7克隆到含有报告基因EGFP的穿梭质粒中,然后再将构建的重组穿梭质粒转移至pAdxsi载体中,构建重组腺病毒载体质粒,继而在H293细胞中扩增,纯化后测定病毒滴度。结果:pShuttle-EGFP-mIL7重组穿梭质粒经酶切鉴定得到0.5kb和5.1kb 2条带;pAdxsi-EGFP-mIL7重组腺病毒载体质粒经酶切鉴定得到14K、11.8K、3.1kb、2.66kb、2.47K、1.45K、0.6K 7条带;TCID50法测定纯化后的病毒滴度为2×10^10pfu/ml。结论:pAdxsi-EGFP-mIL7重组腺病毒载体构建成功。 展开更多
关键词 白细胞介素7 增强型绿色荧光蛋白 重组腺病毒载体 构建
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结核分枝杆菌抗原的重组腺病毒载体的有效构建编码 预览
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作者 陈水木 何秀云 +2 位作者 王艳军 黄香玉 邓洪平 《西南大学学报:自然科学版》 CAS CSCD 北大核心 2008年第1期 75-78,共4页
以AdEasy腺病毒载体系统为基础,建立了一套简单有效构建编码结核分枝杆菌抗原的重组腺病毒载体的方法.依此方法挑取的重组腺病毒质粒阳性率高达90%,线性化的重组腺病毒质粒转染293A细胞24 h后可观察到报告基因GFP的表达.
关键词 化学转化法 重组腺病毒载体 重组腺病毒疫苗 结核分枝杆菌
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NT-3基因修饰及维甲酸预诱导的骨髓间充质干细胞在脊髓损伤处分化为神经元样细胞的研究 被引量:3
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作者 张巍 曾园山 +4 位作者 张雪宝 王俊梅 闫清 唐久余 陈穗君 《解剖学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第1期 12-17,共6页
目的探讨移植在脊髓损伤处的神经营养素-3(NT-3)基因修饰及维甲酸(RA)预诱导的骨髓间充质干细胞(MSCs)分化为神经元样细胞的潜能。方法将MSCs、RA诱导的MSCs、LacZ基因修饰的MSCs、NT-3基因修饰的MSCs和NT-3基因修饰及RA预诱导的M... 目的探讨移植在脊髓损伤处的神经营养素-3(NT-3)基因修饰及维甲酸(RA)预诱导的骨髓间充质干细胞(MSCs)分化为神经元样细胞的潜能。方法将MSCs、RA诱导的MSCs、LacZ基因修饰的MSCs、NT-3基因修饰的MSCs和NT-3基因修饰及RA预诱导的MSCs分别立即移植到脊髓全横断处(T10脊髓),术后67d取材和冷冻切片,用免疫荧光组织化学染色方法检测MSCs的分化潜能,计算各细胞移植组脊髓损伤处的MSCs分化为神经元样细胞的百分率。结果移植的MSCs在受损伤的脊髓内可分化为神经干细胞(nestin阳性)、神经胶质样细胞(GFAP阳性)和神经元样细胞(NF和MAP2阳性),有些还可以向含有某种神经递质和有形成突触潜能的神经元样细胞分化(ChAT、5-HT和PSD95阳性)。联合应用NT-3基因修饰和RA预诱导的MSCs能在受损伤的脊髓内更有效地提高MSCs向神经元样细胞分化的百分率。结论NT-3基因修饰和RA预诱导的MSCs能在脊髓损伤处更好地分化为神经元样细胞。 展开更多
关键词 骨髓间充质干细胞 神经营养素-3 维甲酸 脊髓损伤 重组腺病毒载体 神经元样细胞 免疫组织化学 大鼠
Constructing recombinant replication-defective adenoviral vectors that express glucose transporter-1 through in vitro ligation 预览
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作者 Fangcheng Li Junliang Li +3 位作者 Ranyi Liu Xinke Xu Kaichang Yuan Zhonghua Wu 《中国神经再生研究:英文版》 SCIE CAS CSCD 2008年第4期 456-460,共5页
BACKGROUND: We constructed a homologous recombination bacterial method based on the pAdEasy system, a widely used system, for generating recombinant adenoviral vectors that express glucose transporter-1 (GLUT1) in rat... BACKGROUND: We constructed a homologous recombination bacterial method based on the pAdEasy system, a widely used system, for generating recombinant adenoviral vectors that express glucose transporter-1 (GLUT1) in rats. OBJECTIVE: This study was designed to investigate the feasibility of generating recombinant replication-defective adenoviral vectors that express GLUT1 in rats by in vitro ligation based on the Adeno-XTM system. DESIGN: An in vitro cell-based experiment. SETTING: This study was performed at the Linbaixin Medical Research Center of the Second Hospital Affiliated to Sun Yat-sen University and Central Laboratory for Prevention and Treatment of Tumor, Sun Yat-sen University between January and August 2004. MATERIALS: Male, adult, Sprague Dawley rats were used to extract total RNA from brain tissue. E. coli DH5 α and human embryonic kidney 293 cells (HEK293 cells) used in the present study were cryo-preserved by the Second Hospital Affiliated to Sun Yat-sen University. Rabbit anti-rat GLUT1 polyclonal antibody (Chemicon, U.S.A.) and primers (Shanghai Boya Bioengineering Co., Ltd) were also used. METHODS: E1/E3-deleted replication-defective adenoviral vectors were used. Using in vitro ligation, the target gene was first sub-cloned into a shuttle vector plasmid to obtain the fragment containing target gene expression cassettes by enzyme digestion. Subsequently, the fragment was co-transformed with linearized adenoviral backbone vector into the E. coli strain. The recombinant adenoviral plasmid was transfected into HEK293 cells to assembly recombinant adenoviral vectors with replication capabilities. The procedure was repeated several times for recombinant adenoviral vectors amplification. MAIN OUTCOME MEASURES: Efficiency of recombinant adenoviral vectors to express the target gene was measured by gene and protein expression through polymerase chain reaction and Western Blot assays, respectively. RESULTS: Results demonstrated that recombinant adenoviral vectors successfully expressed GLUT1 protein, with 展开更多
关键词 重组体 葡萄糖 基因克隆 病毒复制
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Ad-vcam-1-gfp重组腺病毒转染人脐血源基质细胞的实验研究 预览 被引量:1
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作者 张曦 司英健 +5 位作者 陈幸华 刘耀 高力 高蕾 彭贤贵 王庆余 《中国实验血液学杂志》 CAS CSCD 2008年第3期 598-604,共7页
本研究探讨血管细胞黏附分子(vcam-1)修饰的人脐血源基质细胞(human umbilical cord blood derived strom cells,CBDSC)在造血调控中的作用。采用DNA重组技术,将目的基因vcam-1克隆至含有报告基因gfp的穿梭质粒;在BJ5183细胞中与... 本研究探讨血管细胞黏附分子(vcam-1)修饰的人脐血源基质细胞(human umbilical cord blood derived strom cells,CBDSC)在造血调控中的作用。采用DNA重组技术,将目的基因vcam-1克隆至含有报告基因gfp的穿梭质粒;在BJ5183细胞中与pAdeasy—1质粒进行同源重组,产生重组腺病毒载体转染人脐血源基质细胞并进行鉴定。结果表明:vcam-1基因与pAdTrack—CMV载体成功连接,经NotⅠ/XhoⅠ双酶切后电泳可见2个大小约为9kb和2kb左右条带,经PCR法扩增后电泳可见1个600bp左右条带,证明pAdTrack—CMV—vcam-1重组质粒构建成功。pAdTrack—CMV—vcam-1质粒与pAdeasy—1质粒同源重组后,产物经PACⅠ酶切后电泳可观察到2个大小约为31kb、4kb左右条带,与预期结果相符。腺病毒载体转染人脐血源基质细胞后免疫化学、RT—PCR、荧光显微镜等方法均检测到目的基因vcam-1的表达。结论:构建ad—vcam-1-gfP重组腺病毒载体可成功转染人脐血源基质细胞并使其vcam-1表达增高。 展开更多
关键词 vcanl-1 CBDSC GFP 重组腺病毒载体
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VCAM-1和EGFP双基因共表达重组腺病毒的构建 预览 被引量:1
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作者 司英健 张曦 +6 位作者 陈幸华 刘耀 高蕾 高力 张诚 彭贤贵 王庆余 《重庆医学》 CAS CSCD 2007年第17期 1699-1703,共5页
目的构建VCAM-1和EGFP双基因共表达重组腺病毒载体。方法采用DNA重组技术,将目的基因VCAM-1克隆至含有报告基因EGFP的穿梭质粒;在BJ5183细胞中与pAdeasy-l质粒进行同源重组,产生重组腺病毒载体。结果(1)VCAM-1基因与pAdTrack-CMV... 目的构建VCAM-1和EGFP双基因共表达重组腺病毒载体。方法采用DNA重组技术,将目的基因VCAM-1克隆至含有报告基因EGFP的穿梭质粒;在BJ5183细胞中与pAdeasy-l质粒进行同源重组,产生重组腺病毒载体。结果(1)VCAM-1基因与pAdTrack-CMV载体成功连接,经NotⅠ/XhoⅠ双酶切后电泳可见2个大小约为9kb和2kb左右条带,经PCR法扩增后电泳可见一个600bp左右条带,证明pAdTrack-CMV-VCAM-1重组质粒构建成功;(2)pAdTrack-CMV-VCAM-1质粒与pAdeasy-l质粒同源重组后,产物经PacⅠ酶切后电泳可观察到2个大小约为31kb和4kb左右条带,与预期结果相符。结论Ad-VCAM-1-EGFP重组腺病毒载体构建成功。 展开更多
关键词 VCAM-1 EGFP 重组腺病毒载体 构建
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Cx43和GFP双基因共表达重组腺病毒载体的构建和鉴定 预览 被引量:2
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作者 司英健 张曦 +6 位作者 陈幸华 刘耀 高蕾 高力 彭贤贵 光丽霞 王庆余 《重庆医学》 CAS CSCD 2007年第10期 927-929,共3页
目的构建间隙连接蛋白43(Cx43)和绿色荧光蛋白(GFP)双基因共表达重组腺病毒载体。方法利用PCR方法从真核表达载体pcDNA3.0-Cx43扩增Cx43片断,利用DNA重组技术,将目的基因Cx43克隆至含有报告基因GFP的穿梭质粒pAdTrack-CMV,然后在BJ5... 目的构建间隙连接蛋白43(Cx43)和绿色荧光蛋白(GFP)双基因共表达重组腺病毒载体。方法利用PCR方法从真核表达载体pcDNA3.0-Cx43扩增Cx43片断,利用DNA重组技术,将目的基因Cx43克隆至含有报告基因GFP的穿梭质粒pAdTrack-CMV,然后在BJ5183细胞中将重组穿梭质粒pAdTrack-Cx43与pAdeasy-l质粒进行同源重组,产生重组腺病毒载体pAd-Cx43-GFP,用PacⅠ单酶切鉴定重组载体;将pAd-Cx43-GFP转入293细胞中包装,荧光显微镜观察报告基因GFP的表达,Western blot方法检测293细胞中Cx43表达。结果(1)通过PCR方法从载体pcDNA3.0-Cx43扩增出单一条带,与Cx43片断大小相符;(2)重组穿梭质粒pAdTrack-Cx43经NotⅠ/XhoⅠ双酶切后,电泳可见2个大小约为9、1kb条带,证明pAdTrack-Cx43构建成功;(3)同源重组产物pAd-Cx43-GFP经PacⅠ酶切后,电泳可观察到2个大小约为31、4kb左右条带,与预期结果相符,提示同源重组成功;(4)荧光显微镜下观察可见转染pAd-Cx43-GFP后293细胞在培养1-2d即有绿色荧光表达;(5)利用WesternBlot法检测到转染pAd-Cx43-GFP后293细胞中Cx43的表达较未转染组增强。结论Ad-Cx43-GFP重组腺病毒载体构建成功。 展开更多
关键词 连接蛋白43 绿色荧光蛋白 同源重组 重组腺病毒载体 构建
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人骨形态发生蛋白2重组腺病毒载体的构建及其生物学活性检测 预览 被引量:5
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作者 廉凯 胡蕴玉 +4 位作者 李立文 李丹 白建萍 孟国林 吕荣 《临床骨科杂志》 2006年第4期 356-359,共4页
目的构建人骨形态发生蛋白2(hBMP-2)重组腺病毒载体(Ad-hBMP-2),并检测其转染后的骨髓基质细胞hBMP-2表达以及成骨能力的改变。方法采用Cre—lox重组方法构建含有hBMP-2基因的复制缺陷型重组腺病毒,并利用原位杂交和免疫组化手段... 目的构建人骨形态发生蛋白2(hBMP-2)重组腺病毒载体(Ad-hBMP-2),并检测其转染后的骨髓基质细胞hBMP-2表达以及成骨能力的改变。方法采用Cre—lox重组方法构建含有hBMP-2基因的复制缺陷型重组腺病毒,并利用原位杂交和免疫组化手段观察转染后的骨髓基质细胞hBMP-2 mRNA和蛋白表达情况:通过Ⅰ型胶原原位杂交、碱性磷酸酶测定、透射电镜观察以及裸鼠肌袋试验评价Ad—hBMP-2转染对兔骨髓基质细胞成骨能力的影响。结果病毒培养上清液的聚合酶链式反应证实构建的重组腺病毒含有Ad-hBMP-2基因,重组腺病毒滴度达3.8×10^10pfu/L;感染增殖率为100的Ad-hBMP-2转染兔骨髓基质细胞24h和48h后即可分别检测到显著的hBMP-2 mRNA和蛋白表达,转染效率几乎达100%;Ad—hBMP-2转染可以明显刺激兔骨髓基质细胞Ⅰ型胶原mRNA表达、碱性磷酸酶分泌、细胞内蛋白质合成以及异位骨形成等。结论Ad—hBMP-2具有高效转染能力,并能够诱导骨髓基质细胞向成骨细胞转化,进而促进骨形成。 展开更多
关键词 重组腺病毒载体 骨形态发生蛋白质类 转染 骨髓基质细胞
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细菌内同源重组法构建LEDGFp52基因腺病毒载体及体外表达 预览
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作者 赵海生 王一 《国际眼科杂志》 CAS 2006年第5期 979-983,共5页
目的:构建表达人类晶状体来源的上皮生长因子p52(LEDGFp52)重组腺病毒载体,检测LEDGFp52重组腺病毒能否在真核细胞中有效表达目的基因。 方法:将LEDGFp52基因片段亚克隆到腺病毒穿梭质粒pAd Track—CMV上构建腺病毒穿梭载体pAd Tr... 目的:构建表达人类晶状体来源的上皮生长因子p52(LEDGFp52)重组腺病毒载体,检测LEDGFp52重组腺病毒能否在真核细胞中有效表达目的基因。 方法:将LEDGFp52基因片段亚克隆到腺病毒穿梭质粒pAd Track—CMV上构建腺病毒穿梭载体pAd Track—CMV—LEDGFp52,将腺病毒穿梭载体pAdTrack—CMV—LEDGFp52与5型腺病毒骨架质粒pAdeasy—1共转染BJ5183细菌,经细菌内同源重组产生携带LEDGFp52基因的重组腺病毒载体pAd—LEDGFp52,将pAd—LEDGFp52经脂质体法转化293细胞包装产生重组腺病毒Ad—LEDGFp52,将Ad—LEDGFp52体外转染293细胞,CPE法及westernblot观察目的基因的表达. 结果:构建了表达LEDGFp52基因的重组腺病毒质粒,E.coli内成功同源重组腺病毒,在293细胞内包装产生重组腺病毒Ad—LEDGFp52,滴度可达5×10^12pfu/L。在真核细胞中有效表达目的基因LEDGFp52,出现显著的CPE效应。 结论:成功构建表达LEDGFp52的重组腺病毒载体,为进一步进行LEDGFp52基因功能的研究提供了实验基础. 展开更多
关键词 LEDGFp52基因 腺病毒载体 体外表达
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反向克隆法大鼠anti—ERK2腺病毒载体构建 预览 被引量:4
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作者 董冲 刘云 +5 位作者 宫念樵 陈曦林 唐莉 朱国超 陈知水 叶启发 《中国现代医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2006年第1期 21-23,共3页
目的正义基因反向克隆法构建大鼠and—ERK2腺病毒栽体。方法酶切质粒p3XFLAG—CMV7.1-ERK2,得到ERK2cDNA片段,连接到T载体进行测序,经测序正确反向克隆法插入质粒pShuttle中,最后转入AdEasy(tm)XL Adenoviral Vector System系统... 目的正义基因反向克隆法构建大鼠and—ERK2腺病毒栽体。方法酶切质粒p3XFLAG—CMV7.1-ERK2,得到ERK2cDNA片段,连接到T载体进行测序,经测序正确反向克隆法插入质粒pShuttle中,最后转入AdEasy(tm)XL Adenoviral Vector System系统中得到anti—ERK2基因腺病毒载体。结果DraI和NotI双酶切鉴定anti—ERK2基因腺病毒载体,发现插入的基因序列与插入方向均符合预期目标。结论成功构建了大鼠anti—ERK2腺病毒载体,为研究移植排斥中ERK2基因治疗的作用提供了良好工具。 展开更多
关键词 反向克隆 anti—ERK2 腺病毒载体
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