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柑橘黄龙病菌亚洲种菌毛装配蛋白基因(PAP)序列分析、原核表达及抗血清制备 预览
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作者 李宾宾 余乃通 +3 位作者 杨毅 王健华 张秀春 刘志昕 《植物保护》 CAS CSCD 北大核心 2019年第5期214-220,共7页
菌毛装配蛋白(Flp pilus assembly protein,PAP)是一种分泌蛋白,参与细菌菌毛的组装,表达量高。本研究以感染柑橘黄龙病的海南琼海市绿橙叶片为材料提取总DNA,用其菌毛装配蛋白基因(PAP)的特异引物进行PCR扩增,获得该基因的目的片段,序... 菌毛装配蛋白(Flp pilus assembly protein,PAP)是一种分泌蛋白,参与细菌菌毛的组装,表达量高。本研究以感染柑橘黄龙病的海南琼海市绿橙叶片为材料提取总DNA,用其菌毛装配蛋白基因(PAP)的特异引物进行PCR扩增,获得该基因的目的片段,序列分析表明海南琼海柑橘黄龙病菌PAP基因与柑橘黄龙病菌亚洲种(GenBank登录号:CP001677.5)PAP基因序列一致。功能预测表明它含有两个与分泌功能相关的CpaC和Secretin结构域。PCR产物通过Eco RⅤ和XhoⅠ双酶切构建重组载体pET32a-PAP。将pET32a-PAP载体转化BL21(DE3)大肠杆菌,经终浓度为1 mmoL/L IPTG诱导,目的蛋白主要以包涵体形式表达。目的蛋白经Ni^2+-NTA层析柱纯化,并作为抗原腹腔免疫小白鼠,获得效价在1∶500~1∶1 000的多克隆抗血清。Western blot分析表明,PAP多克隆抗血清特异性强;以田间样品总蛋白做抗原时,能特异性检测染病样品。本研究为PAP蛋白功能研究和开发柑橘黄龙病菌的蛋白检测产品提供研究基础。 展开更多
关键词 柑橘黄龙病 基因表达 PAP蛋白 抗血清制备
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柑桔黄龙病菌亚洲种菌毛形成蛋白基因序列分析、原核表达及抗血清制备 预览
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作者 余乃通 李宾宾 +2 位作者 黎维丽 杨毅 刘志昕 《广东农业科学》 CAS 2018年第11期74-80,共7页
柑桔黄龙病菌菌毛形成蛋白(pilus formation protein, 408)是一种丰度较高的分泌蛋白。以感染柑桔黄龙病(HLB) 的海南琼海市绿橙叶片为材料提取总DNA,利用408 基因的特异引物进行PCR 扩增,获得该基因的目的片段。序列分析结果表明海南... 柑桔黄龙病菌菌毛形成蛋白(pilus formation protein, 408)是一种丰度较高的分泌蛋白。以感染柑桔黄龙病(HLB) 的海南琼海市绿橙叶片为材料提取总DNA,利用408 基因的特异引物进行PCR 扩增,获得该基因的目的片段。序列分析结果表明海南琼海黄龙病菌408 基因与柑桔黄龙病菌亚洲种psy62 株系(GenBank 登录号:CP001677.5)408 基因序列一致。功能预测结果表明其含有一个与菌毛形成相关的N端结构域,以及C 端含有两个高度保守的基序(Motif 1 和Motif 2)。通过EcoR Ⅴ和Xho Ⅰ双酶切构建重组载体pET32a-408 并将其转化BL21(DE3)大肠杆菌。重组菌经终浓度为1 mmoL/L IPTG 诱导,目的蛋白主要以包涵体形式表达。目的蛋白经Ni2+-NTA 层析柱纯化,并以此为抗原,腹腔免疫小白鼠,获得效价在1∶500~1∶10000 的多克隆抗血清;Western blot 进一步分析表明,408 蛋白多克隆抗血清特异性强。研究结果为柑桔黄龙病菌408 蛋白功能研究和柑桔黄龙病菌的蛋白检测产品开发提供重要科学依据。 展开更多
关键词 柑桔黄龙病 柑桔黄龙病菌 菌毛形成蛋白 分泌蛋白 抗血清制备
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百合斑驳病毒外壳蛋白基因原核表达、抗血清制备及其应用 被引量:1
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作者 徐品三 宋炯 张郑瑶 《植物保护学报》 CSCD 北大核心 2017年第4期630-635,共6页
为了建立百合斑驳病毒(Lily mottle virus,LMo V)的快速检测方法,采用RT-PCR方法从感染LMo V的百合叶片中克隆该病毒的外壳蛋白(coat protein,CP)基因,然后连接到原核表达载体p ET28a(+)上,导入大肠杆菌Escherichia coli BL21(... 为了建立百合斑驳病毒(Lily mottle virus,LMo V)的快速检测方法,采用RT-PCR方法从感染LMo V的百合叶片中克隆该病毒的外壳蛋白(coat protein,CP)基因,然后连接到原核表达载体p ET28a(+)上,导入大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)并诱导表达,以表达的重组蛋白为抗原制备该病毒的抗血清。结果显示:LMo V CP全长为822 bp,编码274个氨基酸;SDS-PAGE及Western blot检测结果表明,经IPTG诱导得到了分子量约为34 k D带有HIS标签的目的蛋白;用该蛋白制备的抗血清经间接ELISA和Western blot检测结果显示,其效价为1∶51 200,具有较高的特异性,可用于感染LMo V百合的检测,其检测结果与RT-PCR检测结果一致。 展开更多
关键词 百合斑驳病毒 外壳蛋白基因 原核表达 抗血清制备
黄瓜绿斑驳花叶病毒基因组全序列分析及病害的田间调查 被引量:2
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作者 肖彩利 郑红英 +3 位作者 吴晓花 李国景 燕飞 陈剑平 《植物保护学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第4期529-536,共8页
为明确近年来在浙江省葫芦科作物上发生的黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV)基因组特征及其发生分布情况,从浙江省及上海地区的甜瓜、西瓜和瓠瓜上采集疑似样品进行RT-PCR鉴定,通过分段扩增测序的方法拼... 为明确近年来在浙江省葫芦科作物上发生的黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV)基因组特征及其发生分布情况,从浙江省及上海地区的甜瓜、西瓜和瓠瓜上采集疑似样品进行RT-PCR鉴定,通过分段扩增测序的方法拼接获得基因组全序列并进行系统进化分析,利用特异性引物扩增获得CGMMV外壳蛋白(coat protein,CP)基因序列,制备CGMMV CP抗血清进行Western-blot和Dot-ELISA检测。结果显示,来自甜瓜、西瓜和瓠瓜的3个CGMMV分离物基因组全序列均具有烟草花叶病毒属典型基因组结构特征,全部由6 423 nt构成;3个全序列间的核苷酸同源性高达99.11%~99.67%,编码的CP氨基酸同源性为100%。系统进化分析发现,CGMMV不同分离物形成2个进化相关群体,3个浙江的CGMMV分离物均位于第I组内,与已报道的中国CGMMV分离物和韩国CGMMV分离物亲缘性较高。Western-blot检测表明CGMMV CP抗血清可以与感病植株中的病毒发生特异性反应,可用于CGMMV鉴定;Dot-ELISA检测发现CGMMV在浙江省和上海市的葫芦科作物上普遍存在。 展开更多
关键词 黄瓜绿斑驳花叶病毒 全序列 系统进化分析 原核表达 抗血清制备
百合无症病毒16kD基因的克隆、原核表达及抗血清制备
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作者 冀文婕 张郑瑶 徐品三 《园艺学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第5期998-1004,共7页
以感染百合无症病毒(LSV)的百合叶片为试材,克隆LSV16 k D基因,连接到原核表达载体p ET-28a(+)上。将获得的重组质粒p ET-28a(+)+16 k D转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导得到了高效表达的16 k D蛋白,融合蛋白分子量约为20 ... 以感染百合无症病毒(LSV)的百合叶片为试材,克隆LSV16 k D基因,连接到原核表达载体p ET-28a(+)上。将获得的重组质粒p ET-28a(+)+16 k D转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导得到了高效表达的16 k D蛋白,融合蛋白分子量约为20 k D。融合蛋白经过镍柱纯化后作为抗原免疫注射小鼠,制备得到16 k D蛋白抗血清。Western blot分析显示所制备的抗血清与诱导表达的融合蛋白发生特异性反应;通过ELISA检测和RT-PCR检测百合样品,证实制备的抗血清与LSV侵染的百合叶片发生了相同的特异性反应。结果表明,目的蛋白表达成功,所制备的抗血清具有特异性,可用于LSV的快速检测、免疫组织化学以及16 k D蛋白功能研究。 展开更多
关键词 百合 百合无症病毒 16 k D 基因克隆 原核表达 抗血清制备
在制备尖吻蝮蛇毒出血毒素抗血清中不同凝胶染色方法的比较 预览 被引量:1
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作者 韦传宝 曹佳敏 《中国免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2016年第12期1793-1796,共4页
目的:寻找在制备出血毒素抗血清中电泳后染色凝胶的好方法。方法:按照前人的方法从皖南产尖吻蝮蛇毒中初步分离3种出血毒素:Aa HⅠ、Aa HⅡ和Aa HⅣ并获得3种粗提取的出血毒素,用制备电泳的方法进一步纯化Aa HⅠ、Aa HⅡ和Aa HⅣ,对... 目的:寻找在制备出血毒素抗血清中电泳后染色凝胶的好方法。方法:按照前人的方法从皖南产尖吻蝮蛇毒中初步分离3种出血毒素:Aa HⅠ、Aa HⅡ和Aa HⅣ并获得3种粗提取的出血毒素,用制备电泳的方法进一步纯化Aa HⅠ、Aa HⅡ和Aa HⅣ,对每种出血毒素,配制6块制备电泳板并进行聚丙烯酰胺凝胶电泳,用6种不同的染色方法分别染色,将含出血毒素的凝胶切下,磨细后直接免疫注射小鼠并获得抗血清,用ELISA检测和中和出血毒素出血活性两种方法检测抗血清的质量。结果:不同染色方法制备的抗血清中有效Ig G浓度不同,用无毒型蛋白质快速染色试剂盒染色制备的抗血清有效Ig G浓度最高。结论:用无毒型蛋白质快速染色试剂盒染色是制备抗血清最好的染色方法。 展开更多
关键词 尖吻蝮蛇 出血毒素 抗血清制备 染色法 质量检测
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中国小麦花叶病毒CP和CRP蛋白的原核表达、抗血清制备及RNA2侵染性克隆构建 预览 被引量:1
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作者 孔凡惠 脱建波 +5 位作者 魏娇 唐伟 李向东 迟胜起 田延平 于金凤 《山东农业科学》 2015年第8期6-10,共5页
中国小麦花叶病毒(Chinese wheat mosaic virus,CWMV)引起的小麦土传花叶病在山东烟台、威海等地危害严重。本研究克隆了CWMV烟台分离物的衣壳蛋白(Coat protein,CP)及富含半胱氨酸蛋白(Cysteine-rich protein,CRP)基因,并将其连... 中国小麦花叶病毒(Chinese wheat mosaic virus,CWMV)引起的小麦土传花叶病在山东烟台、威海等地危害严重。本研究克隆了CWMV烟台分离物的衣壳蛋白(Coat protein,CP)及富含半胱氨酸蛋白(Cysteine-rich protein,CRP)基因,并将其连接到原核表达载体p EHISTEV,转化大肠杆菌Rosetta。经IPTG诱导,表达出分子量均为19 k D的CP和CRP。将二者从凝胶中切下,乳化后免疫新西兰大耳兔4次,获得了两种蛋白的多克隆抗体。ELISA检测表明,CWMV CP和CRP抗血清的效价分别为1∶4096和1∶2048。Western blot分析证明该抗血清只与感染CWMV的小麦有特异性反应,而与健康或感染小麦黄花叶病毒的小麦无反应。利用含T3启动子的引物通过RT-PCR扩增出CWMV RNA2全长片段,经T/A克隆连接到p MD18-T,获得质粒p MD18-T-CWMV-RNA2。该质粒经XbaⅠ线性化后,利用T3 RNA聚合酶进行体外转录,转录产物摩擦接种本氏烟,15℃培养3天后,利用Western blot可从接种叶片中检测到瞬时表达的CWMV CP蛋白。 展开更多
关键词 中国小麦花叶病毒 衣壳蛋白(CP) 富含半胱氨酸蛋白(CRP) 抗血清制备 侵染性克隆
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甘薯褪绿斑病毒外壳蛋白的分子变异及其特异抗血清制备 被引量:1
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作者 乔奇 秦艳红 +4 位作者 张德胜 田雨婷 王爽 王永江 张振臣 《植物病理学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第6期634-640,共7页
甘薯褪绿斑病毒(Sweetpotato chlorotic fleckvirus,SPCFV)是侵染甘薯的主要病毒之一。本研究利用RT—PCR方法克隆了SPCFV中国4个分离物的外壳蛋白(CP)基因。序列分析表明,印基因全长900bp,编码299个氨基酸残基。4个分离物印基... 甘薯褪绿斑病毒(Sweetpotato chlorotic fleckvirus,SPCFV)是侵染甘薯的主要病毒之一。本研究利用RT—PCR方法克隆了SPCFV中国4个分离物的外壳蛋白(CP)基因。序列分析表明,印基因全长900bp,编码299个氨基酸残基。4个分离物印基因的核苷酸序列一致性为78.3%-89.9%,推导的氨基酸序列一致性为91.3%-95.7%,存在较大的分子变异。不同分离物cP氨基酸序列N末端的第3-32位氨基酸为多变区。将四川分离物的印基因克隆到原核表达载体pET-28a(+)上,SDS-PAGE分析表明,经IPTG诱导,印基因在大肠杆菌BL21(DE3)中得到了高效表达。以表达的蛋白为抗原免疫家兔,制备了SPCFVCP的特异性抗血清。ACP-ELISA检测结果表明,制备的抗血清效价达1:128000,可用于田间甘薯样品的检测。 展开更多
关键词 甘薯褪绿斑病毒 外壳蛋白 分子变异 原核表达 抗血清制备
葡萄A病毒外壳蛋白原核表达及抗血清制备 被引量:2
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作者 任芳 董雅凤 +3 位作者 张尊平 范旭东 胡国君 朱红娟 《植物病理学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第3期327-331,共5页
葡萄A病毒(Grapevine virus A,GVA)为线性病毒科(Flexiviridae)葡萄病毒属(Vitivirus)的代表种,是葡萄皱木复合病(rugose wood complex disease)的重要病原之一,可引起葡萄嫁接成活率下降、春季萌芽延迟、生长减弱甚至衰退... 葡萄A病毒(Grapevine virus A,GVA)为线性病毒科(Flexiviridae)葡萄病毒属(Vitivirus)的代表种,是葡萄皱木复合病(rugose wood complex disease)的重要病原之一,可引起葡萄嫁接成活率下降、春季萌芽延迟、生长减弱甚至衰退死亡等危害。GVA为线状单链RNA病毒,基因组共编码5个开放阅读框(ORF1-5),其中ORF4 编码外壳蛋白(coat protein, CP),是病毒粒子包裹和系统移动所必需的功能蛋白。GVA自然寄主为葡萄,机械摩擦可侵染本氏烟等草本寄主,由于嫁接和无性繁殖材料调运等因素造成该病毒远距离传播,目前在世界多个国家和地区均有发生。 展开更多
关键词 病毒外壳蛋白 抗血清制备 葡萄 原核表达 complex 嫁接成活率 VIRUS RNA病毒
筇竹CBF1基因的原核表达和多克隆抗体的制备 被引量:4
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作者 肖艳 林华 +3 位作者 杨丽娟 陈世界 熊泽平 陈其兵 《园艺学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第2期375-381,共7页
以筇竹(Qiongzhuea tumidinodaHsueh et Yi)叶片为试材,采用RT-PCR方法克隆其CBF1基因,并将CBF1连接到原核表达载体pET32a(+)上,经克隆测序确定所构建的重组载体pET32-QZ开放阅读框正确。将重组载体pET32-QZ转化大肠杆菌Rosetta... 以筇竹(Qiongzhuea tumidinodaHsueh et Yi)叶片为试材,采用RT-PCR方法克隆其CBF1基因,并将CBF1连接到原核表达载体pET32a(+)上,经克隆测序确定所构建的重组载体pET32-QZ开放阅读框正确。将重组载体pET32-QZ转化大肠杆菌Rosetta2(DE3)菌株,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE凝胶电泳,考马斯亮蓝染色,证明CBF1蛋白得到了高效表达,所表达蛋白是大小约为45kD的融合蛋白。经镍柱纯化后作为抗原免疫家兔,制备CBF1蛋白特异性抗血清。所制备的多克隆抗体能够与融合蛋白和经冷诱导的筇竹叶片总蛋白在25kD处出现杂交条带。上述结果表明,表达的目的蛋白可用于免疫组织化学、蛋白质印迹检测。 展开更多
关键词 筇竹 CBF1 原核表达 抗血清制备
荒漠昆虫小胸鳖甲几丁质酶抗血清的制备及抗体效价检测 预览 被引量:1
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作者 陆雪莹 李洁琼 +2 位作者 庄淑珍 刘小宁 马纪 《四川动物》 CSCD 北大核心 2014年第5期659-664,共6页
目的几丁质酶是昆虫重要的防御物质,本研究采用DNA-蛋白质联合免疫策略制备荒漠昆虫小胸鳖甲几丁质酶(MpCHI786)的抗血清,用于检测小胸鳖甲在外界不良条件下几丁质酶的变化。方法从小胸鳖甲成虫中提取总RNA,反转录后RT-PCR扩增Mpchi78... 目的几丁质酶是昆虫重要的防御物质,本研究采用DNA-蛋白质联合免疫策略制备荒漠昆虫小胸鳖甲几丁质酶(MpCHI786)的抗血清,用于检测小胸鳖甲在外界不良条件下几丁质酶的变化。方法从小胸鳖甲成虫中提取总RNA,反转录后RT-PCR扩增Mpchi786 cDNA,构建原核表达载体pET30a-Mpchi786,在大肠杆菌BL21中用IPTG诱导表达获得融合蛋白His-MpCHI786。对融合蛋白切胶纯化后与弗氏佐剂混合作为抗原。另外,构建真核表达质粒pcDNA3.0-Mpchi786,对小鼠尾静脉高压注射,8 h后RT-PCR检测其在肝脏的瞬时表达。以pcDNA3.0-Mpchi786肌肉注射免疫小鼠3次后,再用His-MpCHI786融合蛋白加强免疫2次,DNA免疫和免疫结束后收集免疫小鼠的血清,ELISA和Western blot法检测抗血清效价和特异性。结果 RT-PCR结果显示尾静脉高压注射8 h后,pcDNA3.0-Mpchi786质粒在小鼠肝脏有特异性表达。Western blot检测表明,用His-MpCHI786融合蛋白作为抗原,pcDNA3.0-Mpchi786DNA质粒免疫3次的抗血清和His-MpCHI786融合蛋白加强免疫2次后的抗血清都显示了特异性反应条带。ELISA检测结果显示抗血清效价高达1∶204 800以上。结论利用DNA-蛋白质联合免疫法能够获得效价高、特异性的小胸鳖甲几丁质酶MpCHI786的抗血清。 展开更多
关键词 小胸鳖甲 几丁质酶 DNA-蛋白质联合免疫 抗血清 抗体效价
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小麦黄花叶病毒P2蛋白原核表达、抗血清制备及其在感病小麦细胞中的定位 预览 被引量:1
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作者 杨狄 周燕茹 +2 位作者 谢礼 孙丽英 陈剑平 《浙江农业学报》 CSCD 北大核心 2014年第3期742-747,共6页
通过RT-PCR获得小麦黄花叶病毒(Wheat yellow mosaic virus,WYMV)扬州分离物P2基因,并进行序列分析。P2基因编码区含有2 635个核苷酸,编码一个由875个氨基酸组成的分子量72 kDa的蛋白。在原核表达体系中,该基因的全长表达较困难,因此... 通过RT-PCR获得小麦黄花叶病毒(Wheat yellow mosaic virus,WYMV)扬州分离物P2基因,并进行序列分析。P2基因编码区含有2 635个核苷酸,编码一个由875个氨基酸组成的分子量72 kDa的蛋白。在原核表达体系中,该基因的全长表达较困难,因此将P2基因的5'端和3'端各设计大约1 kb亚克隆到原核表达载体pMAL-C2X中构建重组表达载体MBP-P2N,MBP-P2C,经IPTG诱导在大肠杆菌BL21(DE3)中表达MBP-P2N和MBP-P2C融合蛋白。MBP-P2C融合蛋白经大量诱导、纯化、制备相应抗血清。用制备的抗血清可以有效检测WYMV病叶中的P2蛋白。免疫胶体金标记实验表明在感病WYMV的小麦叶片细胞膜状内含体结构中发现有大量胶体金颗粒特异性分布,表明P2蛋白可能与膜状内含体结构有关。 展开更多
关键词 小麦黄花叶病毒 P2基因 原核表达 抗血清制备 免疫胶体金标记
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尖吻蝮蛇出血毒素Ⅲ分离、抗血清制备、与其他出血毒素血清学关系研究 预览 被引量:1
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作者 韦传宝 汪权 +2 位作者 胡玮 傅荣萍 钱柳青 《皖西学院学报》 2014年第2期95-97,共3页
先用DEAE-Sephadex A 50离子交换层析,然后用CM-Sephadex C 50离子交换层析,最后用12%SDS-PAGE制备电泳纯化尖吻蝮蛇出血毒素Ⅲ。将含出血毒素Ⅲ的聚丙烯酰胺凝胶磨细免疫小鼠,制备抗血清。ELISA检测显示制备的抗血清IgG能够与天然的出... 先用DEAE-Sephadex A 50离子交换层析,然后用CM-Sephadex C 50离子交换层析,最后用12%SDS-PAGE制备电泳纯化尖吻蝮蛇出血毒素Ⅲ。将含出血毒素Ⅲ的聚丙烯酰胺凝胶磨细免疫小鼠,制备抗血清。ELISA检测显示制备的抗血清IgG能够与天然的出血毒素Ⅲ结合,Western blot检测结果显示制备的抗血清只与出血毒素Ⅲ特异结合,制备的抗血清可以用于免疫组织化学实验,为以后检测血毒素Ⅲ的结合位点打下了基础。 展开更多
关键词 尖吻蝮蛇 出血毒素Ⅲ 分离纯化 抗血清制备
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氨基端PLCε基因的克隆、原核表达及抗血清的制备
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作者 宋学东 王胤 +4 位作者 杜红飞 范砚茹 梁勤东 吴小侯 罗春丽 《免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2014年第1期33-36,共4页
目的通过在原核系统中表达人磷脂酶Cε(phospholipaseCε,PLCε)基因,制备兔抗PLCε的抗血清,并验证其特异性。方法应用RT—PCR从人膀胱癌细胞的cDNA中克隆出部分PLCε基因,构建重组表达载体PGEX-6P-1/PLCε.并转化大肠杆菌BL2... 目的通过在原核系统中表达人磷脂酶Cε(phospholipaseCε,PLCε)基因,制备兔抗PLCε的抗血清,并验证其特异性。方法应用RT—PCR从人膀胱癌细胞的cDNA中克隆出部分PLCε基因,构建重组表达载体PGEX-6P-1/PLCε.并转化大肠杆菌BL21,以IPTG诱导表达GST—PLCε融合蛋白,通过GST亲和层析系统纯化重组蛋白,超滤后免疫家兔,获得家兔抗PLCε的抗血清。采用ELISA检测抗血清效价,Western blot测定其特异性。结果RT-PCR扩增出336bp的PLCε基因,并成功构建重组质粒PGEX-6P-1/PLCε.质粒测序结果显示,目的基因序列与GenBank中PLCε基因序列完全一致。将纯化后的GST-PLCε蛋白免疫家兔,获得抗血清:ELISA效价1:16000以上;Westernblot结果显示,该抗血清与原核表达的GST—PLCε融合蛋白和人膀胱癌T24细胞株表达的PLCε蛋白特异性结合。结论在原核细胞中表达了PLCε蛋白,制备了家兔抗人PLCε的抗血清,可用于相关肿瘤检测,为进一步研究PLCε蛋白功能和作用机制奠定了基础。 展开更多
关键词 人磷脂酶Cε 原核表达 抗血清制备
侵染浙贝母3种病毒CP基因的原核表达、抗血清制备及其病毒检测 预览 被引量:1
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作者 吴琪瑶 韦传宝 李进华 《植物研究》 CAS CSCD 北大核心 2013年第1期73-79,共7页
根据GenBank报道的浙贝母花叶病毒(Thunberg fritillary mosaic virus,TFMV)、浙贝母Y病毒(Fritillary virus Y,FVY)和百合斑驳病毒(Lily mottle virus,LMoV)序列设计引物,扩增其CP基因。将CP基因插入表达载体pSBET,转化大肠杆菌B... 根据GenBank报道的浙贝母花叶病毒(Thunberg fritillary mosaic virus,TFMV)、浙贝母Y病毒(Fritillary virus Y,FVY)和百合斑驳病毒(Lily mottle virus,LMoV)序列设计引物,扩增其CP基因。将CP基因插入表达载体pSBET,转化大肠杆菌BL21(DE3)Plys E菌株,IPTG诱导表达。经12%SDS-PAGE和5%~20%梯度SDS-PAGE两次纯化CP,分别免疫小鼠获得抗CP血清。采用Western blot分析确定抗体的特异性及其之间的血亲学关系;采用ELISA分析确定抗体是否能与天然病毒粒子结合。采用Western blot、间接ELISA法和Dot-ELISA法检测侵染浙贝母的3种病毒。结果表明,制备的抗体对CP有高度特异性,相互之间无交叉反应,且能与天然病毒离子结合。制备的抗血清可以用于检测3种病毒,其中间接ELISA法和Dot-ELISA法检测效果较好。 展开更多
关键词 浙贝母 病毒 原核表达 抗血清制备 病毒检测
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香蕉束顶病毒Haikou2分离物DNA2编码框原核表达及抗血清制备 预览
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作者 谭老喜 王洪星 +5 位作者 张雨良 王健华 章绍延 周朋 余乃通 刘志昕 《热带作物学报》 CSCD 北大核心 2012年第12期2246-2251,共6页
香蕉束顶病毒(Banana burichy top virus,BBTV)是危害香蕉的主要病毒之一,严重威胁着香蕉的生产。BBTV基因组至少由6个环状ssDNA组分组成,其中DNA2组分变异最大,是否编码蛋白及其功能缺乏研究。本研究通过PCR方法克隆了BBTV Haikou2... 香蕉束顶病毒(Banana burichy top virus,BBTV)是危害香蕉的主要病毒之一,严重威胁着香蕉的生产。BBTV基因组至少由6个环状ssDNA组分组成,其中DNA2组分变异最大,是否编码蛋白及其功能缺乏研究。本研究通过PCR方法克隆了BBTV Haikou2 DNA2 ORF,将其构建到pET32a载体中。进行原核表达和抗血清制备。结果表明重组表达载体pET32a—DNA20RF在表达菌Transetta(DE3)中表达一个约21ku的特异融合蛋白.通过超声波破碎仪破碎细胞和诱导条件优化,分析表明,该蛋白主要以可溶形式存在,最佳表达条件为30℃、1.0mmo1/IPTG诱导3h。融合蛋白经过Ni^2+-NTA琼脂糖亲和层析纯化,免疫家兔制备出抗血清。Westernblot实验表明抗血清具有特异性;酶联法(ID—ELISA)测定表明,抗血清效价达到25000。能够检测出香蕉汁液中加入的0.954μg/mL浓度的表达纯化蛋白。 展开更多
关键词 香蕉束顶病毒Haikou2分离物 BBTVDNA2 原核表达 抗血清制备
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大蒜B病毒CP基因的原核表达及抗血清制备 预览
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作者 韦传宝 李亚楠 +2 位作者 华俊雅 张灿灿 张业峰 《江苏农业学报》 CSCD 北大核心 2012年第1期 54-57,共4页
制备抗大蒜B病毒(Garlic virus B,GarV-B)CP血清,为研究侵染大蒜6种葱X病毒属(Allexivirus)病毒之间的血清学关系以及大田检测GarV-B奠定基础。该研究根据GenBank报道的GarV-B序列设计引物,扩增从六安市寿县分离获得的GarV-B外壳蛋... 制备抗大蒜B病毒(Garlic virus B,GarV-B)CP血清,为研究侵染大蒜6种葱X病毒属(Allexivirus)病毒之间的血清学关系以及大田检测GarV-B奠定基础。该研究根据GenBank报道的GarV-B序列设计引物,扩增从六安市寿县分离获得的GarV-B外壳蛋白基因(CP)并进行序列比对分析。将GarV-B的CP基因插入表达载体pS-BET,在大肠杆菌BL21(DE3)plys E菌株中诱导表达。表达的CP经12%SDS-PAGE和5%~20%梯度SDS-PAGE两次制备电泳纯化,免疫小鼠获得抗CP血清。Western blot分析抗体的特异性,采用ELISA分析抗体能否与天然GarV-B病毒结合。结果显示:GarV-B的CP基因与目前已报道的GarV-B不同分离物CP基因核苷酸序列的同源性为89%~90%,氨基酸序列同源性为92%~93%。表明制备的抗体对GarV-B的CP具有高度特异性,且能够与天然GarV-B病毒粒子结合。因此本研究制备的抗GarV-B的CP血清可以用于该病毒的检测。 展开更多
关键词 大蒜B病毒 外壳蛋白(CP)基因 原核表达 抗血清制备
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侵染浙贝母的浙贝母病毒Y(FVY)CP基因的原核表达及抗血清制备 被引量:2
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作者 韦传宝 隗洋洋 +3 位作者 杨宇 刘士亮 胡皓雨 何月 《中药材》 CAS CSCD 北大核心 2011年第10期 1498-1502,共5页
目的:制备抗侵染浙贝母的浙贝母病毒Y(Fritillary virus Y,FVY)CP血清,为大田检测FVY和研究FVY与其他病毒之间的血清学关系奠定基础。方法:根据Genbank报道的FVY CP基因序列设计引物,扩增其CP基因。Blast分析FVY CP基因核苷酸序列... 目的:制备抗侵染浙贝母的浙贝母病毒Y(Fritillary virus Y,FVY)CP血清,为大田检测FVY和研究FVY与其他病毒之间的血清学关系奠定基础。方法:根据Genbank报道的FVY CP基因序列设计引物,扩增其CP基因。Blast分析FVY CP基因核苷酸序列与其他马铃薯Y病毒属成员CP基因的同源性。将CP基因插入表达载体pSBET,转化大肠杆菌BL21(DE3)Plys E菌株,通过IPTG诱导表达。经12%SDS-PAGE和5%~20%梯度SDS-PAGE两次纯化CP,免疫小鼠获得抗CP血清,采用Western blot分析抗体的特异性。用原核表达的17种马铃薯Y病毒属病毒CP蛋白作为抗原,检测抗FVY CP血清是否能与其进行交叉反应。采用ELISA分析抗体能否与天然FVY病毒离子结合。结果:FVY CP基因与油点草病毒Y(TrVY)CP基因、大豆花叶病毒半夏分离物CP基因和小西葫芦黄花叶病毒六安分离物CP基因分别有81.2%、68.1%和67.2%的同源性。制备的抗体对FVY CP具有高度特异性,同时能与大豆花叶病毒半夏分离物(SMV-P)CP蛋白有中等强度的结合,与小西葫芦黄花叶病毒CP蛋白有弱的结合。结论:抗体能够与天然FVY病毒离子结合,因此可以作为该病毒的大田检测。 展开更多
关键词 浙贝母 浙贝母病毒Y CP基因 原核表达 抗血清制备
侵染浙贝母的百合斑驳病毒CP基因的原核表达及抗血清制备 被引量:3
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作者 韦传宝 姚厚军 +1 位作者 杨宇 刘春云 《中药材》 CAS CSCD 北大核心 2011年第8期 1182-1186,共5页
目的:制备抗百合斑驳病毒(Lily mottle virus,LMoV)CP血清,为研究侵染不同植物LMoV之间的血清学关系以及大田检测LMoV奠定基础。方法:根据Genbank报道的百合斑驳病毒CP基因序列设计引物,扩增其外壳蛋白基因并分析序列。将LMoV CP基... 目的:制备抗百合斑驳病毒(Lily mottle virus,LMoV)CP血清,为研究侵染不同植物LMoV之间的血清学关系以及大田检测LMoV奠定基础。方法:根据Genbank报道的百合斑驳病毒CP基因序列设计引物,扩增其外壳蛋白基因并分析序列。将LMoV CP基因插入表达载体pSBET,转化大肠杆菌BL21(DE3)Plys E菌株,通过IPTG诱导表达。经12%SDS-PAGE和5%~20%梯度SDS-PAGE两次纯化CP,免疫小鼠获得抗CP血清,采用Western blot分析抗体的特异性,采用ELISA分析抗体能否与天然LMoV病毒结合。结果:LMoV的CP与目前已报道的LMoV不同分离物CP基因核苷酸序列同源性为95%~99%,氨基酸序列同源性为98%~100%。制备的抗体对CP具有高度特异性,且能够与天然LMoV病毒离子结合。结论:本研究制备的抗血清可以作为百合斑驳病毒的检测。 展开更多
关键词 浙贝母 百合斑驳病毒 CP基因 原核表达 抗血清制备
水稻瘤矮病毒S11基因沉默抑制子的原核表达及抗血清制备 被引量:1
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作者 赵芹 沈文锦 +2 位作者 张翼翔 刘福秀 李华平 《植物病理学报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第6期 574-578,共5页
以采自广东省水稻瘤矮病的典型病株为材料,通过RT-PCR法扩增和克隆了水稻瘤矮病毒(Rice gall dwarf virus,RGDV)S11组分核苷酸序列全长。序列分析结果表明,RGDV广东分离物S11(登录号EF532326)核苷酸序列全长1168bp,含有一个1068bp... 以采自广东省水稻瘤矮病的典型病株为材料,通过RT-PCR法扩增和克隆了水稻瘤矮病毒(Rice gall dwarf virus,RGDV)S11组分核苷酸序列全长。序列分析结果表明,RGDV广东分离物S11(登录号EF532326)核苷酸序列全长1168bp,含有一个1068bp的开放阅读框,编码一条355个氨基酸的多肽,推测分子量约40kD,与泰国分离物基因结构基本一致,其核苷酸与氨基酸序列相似性分别为94.3%和98.8%。将广东分离物S11基因克隆至pBV221温敏表达载体上,在大肠杆菌DH5α中实现了高效表达。以诱导蛋白为抗原免疫家兔获得了抗血清。利用ELISA法测定抗血清的效价为1∶4096,Western blot分析结果表明,抗血清能与S11蛋白发生特异血清学反应。这可为进一步研究S11蛋白的结构和功能,揭示其抑制基因沉默的作用机制提供参考。 展开更多
关键词 水稻瘤矮病毒 基因沉默抑制子 原核表达 抗血清制备
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