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RBP-Jκ对结肠癌细胞增殖和移植瘤生长的影响及其在小鼠结肠癌组织的表达 预览
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作者 王文娟 刘梦洁 +1 位作者 徐瑞 王淑红 《山西医科大学学报》 CAS 2019年第3期282-289,共8页
目的探讨Notch信号通路转录抑制因子RBP-Jκ对结肠癌细胞增殖和裸鼠移植瘤生长的影响及其在小鼠模型结肠癌组织中的表达。方法用Western blot法和Real-time PCR法在8种结肠癌细胞中筛选出RBP-Jκ高表达的结肠癌细胞RKO及RBP-Jκ低表达... 目的探讨Notch信号通路转录抑制因子RBP-Jκ对结肠癌细胞增殖和裸鼠移植瘤生长的影响及其在小鼠模型结肠癌组织中的表达。方法用Western blot法和Real-time PCR法在8种结肠癌细胞中筛选出RBP-Jκ高表达的结肠癌细胞RKO及RBP-Jκ低表达的结肠癌细胞SW480。用RBP-Jκ基因重组慢病毒载体上调SW480细胞中RBP-Jκ及靶向RBP-Jκ的shRNA慢病毒载体沉默RKO细胞中RBP-Jκ的表达,构建RBP-Jκ过表达的SW480细胞(SW480-RBP)及其对照细胞SW480-NC和RBP-Jκ沉默表达的RKO细胞(RKO-shRBP)及其对照细胞RKO-NC。MTT法检测SW480细胞和RKO细胞增殖能力的变化。构建转染细胞裸鼠皮下移植瘤模型,连续观察28 d,绘制移植瘤生长曲线,监测移植瘤生长情况;氧化偶氮甲烷(Azoxymethane,AOM)诱导构建C57BL/6小鼠结肠癌模型,在结肠癌形成过程中每8周留取小鼠结肠组织,Western blot法和Real-time PCR法检测结肠组织中RBP-JκmRNA和蛋白表达的变化。结果MTT检测显示,SW480-RBP细胞的增殖速度较对照组SW480-NC细胞显著增快(P<0.05),RKO-shRBP细胞的增殖速度较对照组RKO-NC细胞显著降低(P<0.05)。裸鼠皮下移植瘤实验显示,SW480-RBP细胞所成肿瘤的体积、质量均高于对照组细胞(SW480-NC);RKO-shRBP细胞所成肿瘤的体积、质量均低于对照组细胞(RKO-NC)。在AOM诱导的C57BL/6小鼠结肠癌形成过程中,小鼠结肠组织中的RBP-JκmRNA和蛋白表达随着肿瘤形成逐渐升高。结论RBP-Jκ可以促进结肠癌细胞的增殖和裸鼠移植瘤生长,在AOM诱导的小鼠结肠癌中,RBP-Jκ蛋白表达增加与其发生发展相关。 展开更多
关键词 RBP-Jκ 移植瘤 结肠癌 慢病毒载体 基因沉默 细胞增殖
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慢病毒Hoxa3载体的构建及其对人脐静脉内皮细胞迁移和血管新生的影响
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作者 毕雪飞 陶贵周 黄建华 《中国动脉硬化杂志》 CAS 2019年第1期18-22,共5页
目的构建慢病毒Hoxa3载体,观察其对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的转染效率,研究其对细胞迁移和血管新生的影响,并探讨Hoxa3促进血管新生的机制。方法以基因合成法从聚合酶链式反应文库获取人Hoxa3基因,酶切后插入慢病毒骨架载体,以三质粒... 目的构建慢病毒Hoxa3载体,观察其对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的转染效率,研究其对细胞迁移和血管新生的影响,并探讨Hoxa3促进血管新生的机制。方法以基因合成法从聚合酶链式反应文库获取人Hoxa3基因,酶切后插入慢病毒骨架载体,以三质粒联合转染293T细胞获得慢病毒Hoxa3载体,并进行滴度测定。转染HUVEC,获取最大转染效率。转染HUVEC后分对照组和慢病毒Hoxa3转染组,进行HUVEC迁移实验和小管形成实验,观察Hoxa3对HUVEC迁移和小管形成的影响。Western blot检测慢病毒Hoxa3载体转染HUVEC后尿激酶型纤溶酶原激活物受体(uPAR)和基质金属蛋白酶14(MMP-14)蛋白表达的变化。结果成功构建慢病毒Hoxa3载体,病毒的滴度为8×10^11TU/L;30 MOI慢病毒载体对HUVEC的转染效率达到99%以上。Western blot结果显示慢病毒Hoxa3载体转染HUVEC后Hoxa3能够有效在HUVEC中表达。与对照组比较,慢病毒Hoxa3载体转染HUVEC后显著增强HUVEC的迁移和小管形成,显著增加uPAR和MMP-14蛋白的表达(P<0.05)。结论成功构建的慢病毒Hoxa3载体可促进HUVEC的迁移和小管形成,其作用机制可能为上调HUVEC的uPAR和MMP-14蛋白表达。 展开更多
关键词 慢病毒载体 Hoxa3 人脐静脉内皮细胞 细胞迁移 血管新生
HIF-1α基因慢病毒载体的构建及其转染骨髓间充质干细胞后的表达 预览
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作者 曾雯 巨容 +2 位作者 高淑强 胡旭红 马骄 《四川医学》 CAS 2019年第1期17-21,共5页
目的构建携带缺氧诱导因子-1α(Hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)的慢病毒载体pLVX-HIF-1α-IRES-ZsGreen1,并转染骨髓间充质干细胞(Bone marrow derived stem cells,BMSCs),检测该慢病毒载体在BMSCs的表达。方法从Puc-57-HIF-1... 目的构建携带缺氧诱导因子-1α(Hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)的慢病毒载体pLVX-HIF-1α-IRES-ZsGreen1,并转染骨髓间充质干细胞(Bone marrow derived stem cells,BMSCs),检测该慢病毒载体在BMSCs的表达。方法从Puc-57-HIF-1α载体中扩增出HIF-1α基因片段,将HIF-1α基因片段与载体连接,获得慢病毒载体pLVX-HIF-1α-IRES-ZsGreen1,将其与慢病毒包装系统共同转染到293T细胞内进行病毒包装,通过观察报告基因绿色荧光蛋白的表达来测定病毒滴度。将pLVX-HIF-1α-IRES-ZsGreen1转染到BMSCs细胞内,通过Real-Time PCR和CCK-8法分别检测HIF-1αmRNA表达及BMSCs增殖能力。结果PCR及测序结果显示慢病毒载体pLVX-HIF-1α-IRES-ZsGreen1构建正确,病毒滴度为3×10 8 TU/mL。pLVX-HIF-1α-IRES-ZsGreen1转染BMSCs后,BMSCs中HIF-1αmRNA表达水平及BMSCs细胞增殖能力明显高于非转染组(P﹤0.05)。结论成功构建HIF-1α基因慢病毒载体pLVX-HIF-1α-IRES-ZsGreen1,该慢病毒载体可以介导HIF-1α基因在BMSCs中稳定表达,并提高BMSCs增殖能力。 展开更多
关键词 骨髓间质干细胞 缺氧诱导因子-1Α 慢病毒载体
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猪Hsp40基因过表达与干扰重组慢病毒载体的构建
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作者 吕其壮 卓严玲 +3 位作者 章烨雯 邓家华 谭小梅 林谦 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2019年第1期76-84,共9页
热休克蛋白40(Hsp40)作为Hsp70蛋白的分子伴侣,在病毒生命周期中扮演重要角色,笔者拟通过慢病毒感染技术分别建立Hsp40基因过表达和沉默的猪肺泡巨噬细胞系,为以后开展猪Hsp40蛋白调控猪圆环病毒2型(PCV2)复制的机制研究提供有效模型。... 热休克蛋白40(Hsp40)作为Hsp70蛋白的分子伴侣,在病毒生命周期中扮演重要角色,笔者拟通过慢病毒感染技术分别建立Hsp40基因过表达和沉默的猪肺泡巨噬细胞系,为以后开展猪Hsp40蛋白调控猪圆环病毒2型(PCV2)复制的机制研究提供有效模型。提取猪肺泡巨噬细胞(PAM)的总RNA,反转录成cDNA后用于Hsp40基因编码区的扩增,并将其克隆到慢病毒过表达载体pCDH-CMV-MCS-EF1-Green-Puro。测序正确后,设计针对Hsp40基因的4条shRNA干扰序列和1条阴性对照序列,并将其分别插入到慢病毒干扰载体pCDH-U6-MCS-EF1-GreenPuro。将上述6个载体分别与3个辅助载体pVSV-G、pRev和pGag/Pol共转染293T细胞进行病毒包装,测定其滴度后用于感染PAM细胞,采用RT-qPCR和Western-blot方法对Hsp40的表达效果进行鉴定。猪Hsp40基因过表达和沉默重组慢病毒的获得为进一步研究Hsp40蛋白对PCV2复制的影响和机制奠定了基础。 展开更多
关键词 Hsp40基因 过表达 RNA干扰 慢病毒载体
靶向PRL-3基因的shRNA慢病毒载体的构建及鉴定 预览
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作者 王燕 乔立娇 陈耀平 《宁夏医科大学学报》 2019年第1期28-32,共5页
目的构建PRL-3基因特异性shRNA慢病毒干扰载体,感染结肠癌SW480细胞,研究PRL-3基因在结肠癌细胞株中的表达抑制情况。方法设计并合成3对特异性针对PRL-3基因的shRNA 序列,构建到慢病毒载体中,测序鉴定载体构建情况,转染293T细胞,荧光显... 目的构建PRL-3基因特异性shRNA慢病毒干扰载体,感染结肠癌SW480细胞,研究PRL-3基因在结肠癌细胞株中的表达抑制情况。方法设计并合成3对特异性针对PRL-3基因的shRNA 序列,构建到慢病毒载体中,测序鉴定载体构建情况,转染293T细胞,荧光显微镜下观察转染效率。收集到的病毒上清感染结肠癌SW480细胞,RT-PCR检测各组细胞中PRL-3 mRNA表达水平。结果经测序鉴定成功构建3对PRL-3基因的RNAi重组慢病毒载体,包装、浓缩后其滴度为5×10^8 TU·mL^-1,3对PRL-3 shRNA病毒载体感染结肠癌SW480细胞株后,Real-time PCR显示,各组PRL-3基因敲减效率分别达到89.6%、83.2%和88.8%,PRL-3 shRNA1重组慢病毒载体干扰效率最佳。结论本研究成功构建了靶向 PRL-3 基因的shRNA 慢病毒载体,PRL-3 shRNA1可抑制SW480细胞中PRL-3基因表达水平。 展开更多
关键词 结肠癌 PRL-3基因 慢病毒载体
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携带NT-3和BDNF基因重组慢病毒载体的构建及在脊髓损伤中的意义 预览
6
作者 蒋婉婷 李令民 +3 位作者 张旗 吴静 姬文晨 艾红 《河北医药》 CAS 2019年第4期507-510,共4页
目的构建携带神经营养素3(NT-3)和脑源性神经营养因子(BDNF)基因的重组慢病毒载体及探讨其在脊髓损伤中的意义。方法利用PCR方法获取NT-3和BDNF基因,将所得目的基因与慢病毒载体(p+LV-CMV-EF1a-green和pLV-CMV-EF1a-RFP)分别进行双切酶... 目的构建携带神经营养素3(NT-3)和脑源性神经营养因子(BDNF)基因的重组慢病毒载体及探讨其在脊髓损伤中的意义。方法利用PCR方法获取NT-3和BDNF基因,将所得目的基因与慢病毒载体(p+LV-CMV-EF1a-green和pLV-CMV-EF1a-RFP)分别进行双切酶后定向重组和连接,其产物转化细菌感受态细胞后,对阳性克隆进行测序和分析比对。质粒载体构建成功后,利用病毒包装体系,转入293T细胞,获得的重组慢病毒液,采用孔稀释法测定病毒滴度。结果成功获得携带NT-3和BDNF基因的重组慢病毒载体,二者滴度分别为3×10~7 TU/ml和2×10~7 TU/ml。结论成功获得携带NT-3和BDNF基因的重组慢病载体,为后续实验运用重组慢病载体共转染脂肪干细胞奠定基础,进而为治疗脊髓损伤提供给了新思维。 展开更多
关键词 BDNF基因 NT-3基因 慢病毒载体
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慢病毒介导Notch1基因shRNA沉默大鼠骨髓间充质干细胞Notch信号通路的表达 预览
7
作者 闫锦玉 邢万红 《中国组织工程研究》 CAS 北大核心 2019年第17期2659-2664,共6页
背景:对于骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化中Notch信号通路的机制研究较多,但是沉默Notch信号通路在工程化心肌样组织血管网络中的机制研究还比较少。目的:构建慢病毒载体介导Notch1基因sh RNA表达体系,观察骨髓间充质干细胞中r Notch... 背景:对于骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化中Notch信号通路的机制研究较多,但是沉默Notch信号通路在工程化心肌样组织血管网络中的机制研究还比较少。目的:构建慢病毒载体介导Notch1基因sh RNA表达体系,观察骨髓间充质干细胞中r Notch基因沉默效果。方法:构建p LV[shRNA]-EGFP:T2A:Puro-U6]{rNotch1[shRNA]19 nt}(PLV-Notch)和p LV[sh RNA]-EGFP:T2A:Puro-U6>ScrambleshRNA(PLV-Scramble)拼装慢病毒表达载体,并将该慢病毒载体包装质粒形成混合物共转染到HEK-293T细胞中。收集慢病毒悬液,通过定量PCR检测重组病毒滴度。将构建的PLV-Notch与PLV-Scramble分别感染骨髓间充质干细胞,经荧光显微镜观察和RT-qPCR、Western blot鉴定转染后两组骨髓间充质干细胞中增强型绿色荧光蛋白基因和目的基因rNotch1表达情况。结果与结论:慢病毒载体滴度大于1×108 TU?mL,稳定转染筛选得到成熟的细胞株。病毒转导效果良好,荧光率达80%,rNotch1基因在干扰组中的表达量是scrambled对照组的75.2%。由此可见,慢病毒介导转染rNotch1基因的骨髓间充质干细胞稳转株构建成功,并对Notch信号通路的表达有沉默作用。 展开更多
关键词 骨髓间充质干细胞 NOTCH基因 慢病毒载体 RNA干扰 NOTCH信号通路 山西省自然科学基金
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慢病毒介导的RNA干扰抑制白血病细胞增殖的应用 预览
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作者 方金勇 王雍 +3 位作者 张熠玲 王志龙 徐玲玲 赵铁军 《浙江师范大学学报:自然科学版》 CAS 2019年第1期50-55,共6页
通过慢病毒载体介导的RNA干扰(RNAi)技术,沉默成人T细胞白血病(ATL)中关键的病毒基因HBZ,并研究RNA干扰后对白血病细胞增殖的影响.首先根据HBZ基因序列设计RNA干扰片段,构建其慢病毒载体,并将其包装成病毒.然后用HBZsiRNA慢病毒感染白... 通过慢病毒载体介导的RNA干扰(RNAi)技术,沉默成人T细胞白血病(ATL)中关键的病毒基因HBZ,并研究RNA干扰后对白血病细胞增殖的影响.首先根据HBZ基因序列设计RNA干扰片段,构建其慢病毒载体,并将其包装成病毒.然后用HBZsiRNA慢病毒感染白血病细胞株TL-Om1,通过RT-PCR和Westernblot检测HBZ基因和蛋白表达情况,MTT技术检测沉默HBZ后TL-Om1细胞的增殖情况,利用RT-PCR检测病毒感染后下游生长相关基因的表达.实验结果表明:利用慢病毒介导的RNA干扰技术能有效降低HBZ的表达,进而抑制了白血病细胞的增殖;沉默HBZ后,细胞内E2F1,PCNA和Myc等下游生长相关基因的表达受到了明显抑制.这将为慢病毒介导的RNA干扰技术应用于临床治疗成人T细胞白血病提供重要的实验依据. 展开更多
关键词 慢病毒载体 RNA干扰 成人T细胞白血病 HBZ 细胞增殖
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应用双靶标CRISPR慢病毒载体在间充质干细胞中稳定敲除lncRNA DANCR基因 预览
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作者 彭丹 钟小敏 《中山大学学报(医学版)》 CAS CSCD 北大核心 2019年第1期14-22,共9页
【目的】应用CRISPR/Cas9方法,构建特异性靶向长链非编码RNA DANCR基因两端的双靶标慢病毒载体,稳定敲除间充质干细胞(MSC)中的DANCR基因,为研究DANCR的生物学功能奠定基础。【方法】首先设计靶向DANCR的5’和3’端的sgRNA(single-guide... 【目的】应用CRISPR/Cas9方法,构建特异性靶向长链非编码RNA DANCR基因两端的双靶标慢病毒载体,稳定敲除间充质干细胞(MSC)中的DANCR基因,为研究DANCR的生物学功能奠定基础。【方法】首先设计靶向DANCR的5’和3’端的sgRNA(single-guide RNA),转染293FT细胞,提取293FT细胞基因组DNA,验证靶向序列的有效性。然后通过gateway和酶切连接的方法,将分别靶向5’和3’端的两条有效sgRNA序列连接至同一慢病毒CRISPR载体。最终使用293FT进行慢病毒包装,收获病毒感染MSC,检测MSC中DANCR敲除效率。【结果】在证明靶向DANCR基因两端的sgRNA序列均单独有效的基础上,将靶向5’和3’端的sgRNA进行组合,成功构建靶向DANCR的双靶标慢病毒载体。将载体进行慢病毒包装后感染MSC,成功获得DANCR敲除的MSC。【结论】应用CRISPR方法成功构建敲除DANCR的慢病毒载体,能高效稳定地敲除MSC中的DANCR基因。 展开更多
关键词 CRISPR 慢病毒载体 长链非编码RNA DANCR MSC
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携带CUEDC1基因的慢病毒载体的构建及其对MOLT-4细胞株增殖和集落形成能力的影响
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作者 庄万传 吴庆运 +1 位作者 孟凡静 徐开林 《中国实验血液学杂志》 CSCD 北大核心 2018年第5期1257-1262,共6页
目的:构建过表达人CUEDC1的慢病毒载体pCDH-CUEDC1,利用慢病毒介导的感染获得稳定表达重组质粒的MOLT-4细胞,分析过表达CUEDC1对MOLT-4细胞增殖和集落形成能力的影响。方法:利用RT-PCR的方法获得CUEDC1全长片段,将CUEDC1DNA片段酶切回... 目的:构建过表达人CUEDC1的慢病毒载体pCDH-CUEDC1,利用慢病毒介导的感染获得稳定表达重组质粒的MOLT-4细胞,分析过表达CUEDC1对MOLT-4细胞增殖和集落形成能力的影响。方法:利用RT-PCR的方法获得CUEDC1全长片段,将CUEDC1DNA片段酶切回收后克隆至慢病毒转移质粒pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP-T2A-Puro(以下简称pCDH),获得pCDH-CUEDC1慢病毒重组质粒。经三质粒包装系统包装后获得高滴度慢病毒颗粒并感染人白血病细胞系MOLT-4,通过流式细胞仪分选获得稳定表达的白血病细胞系,应用real-timePCR和Westernblot方法分别检测稳定转染细胞系的CUEDC1mRNA和CUEDC1的表达。应用CCK-8法和集落形成试验测定CUEDC1对MOLT-4细胞增殖和集落形成能力的影响。结果:经限制性内切酶检测及基因测序证实成功构建了携带CUEDC1的重组慢病毒载体;病毒感染MOLT-4细胞后经流式细胞仪分选获得GFP阳性细胞。实时定量PCR及Westernblot证实,病毒感染后CUEDC1的mRNA和蛋白表达上调;CCK-8法及集落形成试验显示,过表达CUEDC1促进MOLT-4细胞的增殖和集落形成能力,与对照组相比,均有统计学差异(P<0.05)。结论:成功构建了表达CUEDC1的慢病毒载体,CUEDC1可以促进MOLT-4细胞的增殖和集落形成能力。 展开更多
关键词 CUEDC1 慢病毒载体 白血病 载体构建 MOLT-4细胞
组蛋白赖氨酸转移酶KAT6B基因shRNA慢病毒载体的构建与鉴定 预览
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作者 靳俊杰 安静 +3 位作者 曹涤非 宋爱利 赵丽丽 刘兆良 《实用肿瘤学杂志》 CAS 2018年第1期1-6,共6页
目的在乳腺癌细胞T47D中利用构建的短发卡RNA(shRNA)慢病毒载体对赖氨酸乙酰转移酶6B(KAT6B/MORF)基因进行RNA干扰,通过下调该基因的表达来研究其对乳腺癌细胞的抑制功能。方法针对KAT6B基因的CDS区合成2对单链的短发卡RNA(shRNA5... 目的在乳腺癌细胞T47D中利用构建的短发卡RNA(shRNA)慢病毒载体对赖氨酸乙酰转移酶6B(KAT6B/MORF)基因进行RNA干扰,通过下调该基因的表达来研究其对乳腺癌细胞的抑制功能。方法针对KAT6B基因的CDS区合成2对单链的短发卡RNA(shRNA5、shRNA8)及相应的对照组序列(Scramble5、Scramble8),通过聚合酶链式反应(PCR)扩增后,与双酶切(EcoRl、Xhol)线性化处理的入门载体(pENTR/p SM2(CMV)GFP)同源重组,获得含有目的片段的入门克隆。再通过Gateway系统的LR克隆反应,将目的片段重组到目的载体(pLenti x1 puroDEST)上。利用慢病毒包装系统,将慢病毒包装质粒分别与构建好的两对目的质粒共转染到HEK-293T细胞中,收集病毒上清,转导乳腺癌细胞T47D。最后,通过免疫印迹法(Western blot)检测KAT6B的表达。结果对转化获得的单菌落进行测序鉴定,与目标序列完全一致,表明已经成功构建慢病毒载体。Western blot结果显示KAT6B基因的蛋白表达量在每组shRNA中都比相应的对照组显著降低,表明构建的基因沉默载体在乳腺癌细胞T47D中对KAT6B基因具有基因沉默作用。结论本研究通过构建KAT6B基因的shRNA慢病毒基因沉默载体,在乳腺癌细胞T47D中对KAT6B基因进行RNA干扰的研究,为进一步研究KAT6B基因在乳腺癌中发挥肿瘤抑制作用奠定了基础。 展开更多
关键词 载体构建 基因沉默 RNA干扰 KAT6B 慢病毒载体
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卵巢癌细胞系OVCAR3过表达SND1稳定株的构建 预览 被引量:1
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作者 杨扬 白虹 辛灵彪 《天津医科大学学报》 2018年第1期7-9,13共4页
目的:通过慢病毒载体构建过表达SND1的OVCAR3稳定的表达株。方法:重组的pLVX-FLAG-SND1表达载体与包装质粒共同转染293T细胞,获得携带FLAG-SND1的重组慢病毒。病毒感染的OVCAR3细胞经Hygromycin B筛选出稳定表达株。用Western blot方... 目的:通过慢病毒载体构建过表达SND1的OVCAR3稳定的表达株。方法:重组的pLVX-FLAG-SND1表达载体与包装质粒共同转染293T细胞,获得携带FLAG-SND1的重组慢病毒。病毒感染的OVCAR3细胞经Hygromycin B筛选出稳定表达株。用Western blot方法检测SND1蛋白表达。结果:用病毒感染OVCAR3细胞,药物筛选后获得的过表达稳定株中SND1蛋白表达水平明显增高。结论:利用慢病毒表达载体pLVX-FLAG-SND1成功感染并筛选出稳定表达SND1的OVCAR3细胞株,为进一步研究SND1在卵巢癌中的作用提供了体外细胞系模型。 展开更多
关键词 SND1 慢病毒载体 OVCAR3细胞 卵巢癌
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miR-1268重组慢病毒质粒构建及其在人前体脂肪细胞中的表达验证 预览
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作者 周雨森 徐广峰 +1 位作者 赵亚萍 汪春晖 《山东医药》 2018年第34期26-28,共3页
目的 构建miR-1268重组慢病毒质粒,观察其在人前体脂肪细胞HPA中的表达情况。方法 从NCBI Gen Bank数据库查找miR-1268的DNA序列,用Primer 5.0软件设计PCR引物,以HPA细胞的DNA为模板进行PCR扩增;克隆慢病毒表达载体,进而包装成空载慢病... 目的 构建miR-1268重组慢病毒质粒,观察其在人前体脂肪细胞HPA中的表达情况。方法 从NCBI Gen Bank数据库查找miR-1268的DNA序列,用Primer 5.0软件设计PCR引物,以HPA细胞的DNA为模板进行PCR扩增;克隆慢病毒表达载体,进而包装成空载慢病毒和miR-1268过表达慢病毒;HPA细胞分别感染空载慢病毒和miR-1268过表达慢病毒,荧光定量PCR检测miR-1268表达水平。结果 测序结果表明,miR-1268前体序列与Gen Bank上的序列完全相同。与空载慢病毒感染的HPA细胞比较,miR-1268过表达慢病毒感染的HPA细胞miR-1268上调2.5倍。结论 成功构建miR-1268重组慢病毒质粒,感染的HPA细胞高表达miR-1268。 展开更多
关键词 微小核糖核酸1268 慢病毒载体 肥胖症 人前体脂肪细胞
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SOX9慢病毒表达载体的构建及其在LNcap细胞中的稳定表达 预览
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作者 王江 段君君 +3 位作者 张小玉 贾霄 汪小波 何颖红 《昆明医科大学学报》 CAS 2018年第2期5-9,共5页
目的构建SOX9基因慢病毒表达载体,建立稳定表达SOX9的LNCaP细胞株.方法PCR扩增SOX9基因,将其克隆到慢病毒表达载体pLVX-IRES-Puro中,双酶切和测序鉴定重组质粒.用HEK293细胞包装重组病毒颗粒并感染LNcap细胞,经puromycin筛选获得稳定转... 目的构建SOX9基因慢病毒表达载体,建立稳定表达SOX9的LNCaP细胞株.方法PCR扩增SOX9基因,将其克隆到慢病毒表达载体pLVX-IRES-Puro中,双酶切和测序鉴定重组质粒.用HEK293细胞包装重组病毒颗粒并感染LNcap细胞,经puromycin筛选获得稳定转染细胞株.qRT-PCR和Western Blot分别检测SOX9 mRNA水平及蛋白表达.结果经双酶切和测序鉴定证实目的片段已插入到慢病毒表达载体上.重组质粒转入LNCaP细胞后经puromycin抗性筛获得稳定表达的细胞株,qRT-PCR检测到SOX9基因在转录水平的表达,Western blot分析显示SOX9蛋白高表达.结论慢病毒表达载体pLVX-IRES-FLAG-SOX9构建成功,实现了SOX9在LNcap细胞中的外源性表达. 展开更多
关键词 SOX9 慢病毒表达载体 LNCAP细胞 脂质体转染
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P130CAS对食管癌细胞ECA109中Angiopoietin-2表达及其生物学行为的影响 预览
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作者 唐绪容 黄伟 +2 位作者 屈虹 马洪飚 罗锋 《临床与实验病理学杂志》 CSCD 北大核心 2018年第8期840-844,共5页
目的探讨抑制P130CAS(P130 Crk-associated substrate)基因对食管癌细胞ECA109中Angiopoietin-2表达和生物学行为的影响。方法构建P130CAS基因siRNA慢病毒载体,感染ECA109细胞,荧光显微镜观察感染效率,应用RT-PCR和Western blot法检测... 目的探讨抑制P130CAS(P130 Crk-associated substrate)基因对食管癌细胞ECA109中Angiopoietin-2表达和生物学行为的影响。方法构建P130CAS基因siRNA慢病毒载体,感染ECA109细胞,荧光显微镜观察感染效率,应用RT-PCR和Western blot法检测其干扰效率。应用CCK-8法、划痕实验、Transwell实验、Western blot法检测抑制P130CAS基因表达对ECA109细胞增殖、迁移、侵袭能力和对Angiopoietin-2蛋白表达的影响。结果成功构建PLVT716 siRNA慢病毒载体,ECA109细胞P130CAS mRNA和蛋白表达明显下调(P<0.05),并建立稳定细胞株;抑制P130CAS基因表达导致ECA109细胞增殖、迁移和侵袭能力显著减弱(P<0.05),同时Angiopoietin-2表达明显下调(P<0.05)。结论抑制P130CAS基因表达可抑制食管癌ECA109细胞的增殖、迁移和侵袭,同时可下调Angiopoietin-2表达。 展开更多
关键词 食管肿瘤 P130CAS ANGIOPOIETIN-2 慢病毒
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关于嵌合抗原受体修饰T细胞产品药学评价的思考
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作者 刘伯宁 曹越 +1 位作者 卢加琪 罗建辉 《药学学报》 CSCD 北大核心 2018年第10期1637-1644,共8页
CAR-T细胞作为一种活的个体化治疗药物,其药学研究与评价显著区别于小分子化学药和大分子重组蛋白。CAR-T产品的药学研究表现出原材料的"多样性"、制备工艺的"差异化"和质控策略的"互补性"等特点。申报临床阶段的药学评价重在识... CAR-T细胞作为一种活的个体化治疗药物,其药学研究与评价显著区别于小分子化学药和大分子重组蛋白。CAR-T产品的药学研究表现出原材料的"多样性"、制备工艺的"差异化"和质控策略的"互补性"等特点。申报临床阶段的药学评价重在识别重大风险点,在保证临床用药安全性的前提下,兼顾细胞制品的产品特殊性。本文结合近期国内CAR-T产品药学审评实践,提出此类产品药学评价的一般考虑与评价要点,并就行业共性问题与发补原因展开讨论,以期促进此类产品尽快进入临床,在临床实践中不断改进完善,最终转化成可实际应用的药品。 展开更多
关键词 嵌合抗原受体修饰T细胞 基因修饰T细胞 逆转录病毒载体 慢病毒载体 生产工艺 质量控制
Differential Effects of Strategies to Improve the Transduction Efficiency of Lentiviral Vector that Conveys an Anti-HIV Protein,Nullbasic,in Human T Cells
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作者 Lina Rustanti Hongping Jin +3 位作者 Dongsheng Li Mary Lor Haran Sivakumaran David Harrich 《中国病毒学:英文版》 CAS CSCD 2018年第2期142-152,共11页
关键词 蛋白质 房间 向量 传送 HIV-1 微分 数据显示 RNA
异戊二烯基二磷酸合酶亚基2对肝癌细胞HepG2基因表达谱的影响
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作者 童婷 李康 +6 位作者 陈埏芳 李劲 杨敬源 刘雄秀 林琳 薛增福 黄卫 《中华肝脏病杂志》 CSCD 北大核心 2018年第9期694-697,共4页
肝癌是当今世界主要的恶性肿瘤之一,其进展快、预后不良,发生率逐年升高,且有年轻化趋势。肝癌是多基因、多因素、多环节共同作用的结果,探索影响肝癌生物学行为的相关基因和机制一直是研究的热点。
关键词 肝肿瘤 基因表达谱 异戊二烯基二磷酸合酶亚基2 基因本体论功能分析 慢病毒载体 基因组百科全书通路富集分析
IFN-β基因修饰的人脐带源性间充质干细胞抑制A549和H226肺癌细胞的克隆、迁移和增殖能力 预览
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作者 陈诗军 陈晓 +3 位作者 赵成岭 王效静 李昶 陈余清 《中国组织化学与细胞化学杂志》 CAS CSCD 2018年第2期107-115,共9页
目的探讨干扰素-β(interferon-β,IFN-β)基因修饰的人脐带源性间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,huc MSCs)对非小细胞肺癌细胞株A549和H226克隆形成、迁移和增殖能力的影响。方法按照慢病毒IFN-β感染hu... 目的探讨干扰素-β(interferon-β,IFN-β)基因修饰的人脐带源性间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,huc MSCs)对非小细胞肺癌细胞株A549和H226克隆形成、迁移和增殖能力的影响。方法按照慢病毒IFN-β感染huc MSCs条件分为以下5组:慢病毒组、阴性对照病毒组、间充质干细胞组、干扰素组、空白对照组。将IFN-β慢病毒感染huc MSC,荧光显微镜观察荧光表达,确定最佳感染复数(multiplicities of infection,MOI)值,以最佳MOI值感染huc MSCs细胞。达到稳定感染后收集慢病毒组、阴性对照病毒组和间充质干细胞组的上清,ELISA法和Western blot检测以上3组的IFN-β表达的水平。克隆形成实验、Transwell小室迁移实验、细胞增殖-毒性检测法(CKK-8)检测A549、H226细胞克隆形成、迁移和增殖能力。结果慢病毒组和阴性对照病毒组的慢病毒感染效率均在85%以上,慢病毒组的IFN-β表达水平明显高于阴性对照病毒组和间充质干细胞组,慢病毒组A549细胞和H226细胞的克隆形成、迁移能力和增值能力明显降低。结论 IFN-β修饰的huc MSCs能显著抑制非小细胞肺癌细胞株A549和H226的克隆形成、迁移及增值能力,有望成为治疗非小细胞肺癌的一种新途径。 展开更多
关键词 IFN-Β 人脐带源性间充质干细胞 慢病毒 基因感染 肺癌 迁移 细胞增殖
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慢病毒介导NEP1-40及NT-3双基因转染神经干细胞的实验研究
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作者 王林楠 汪雷 +4 位作者 宋跃明 刘立岷 杨曦 丰干均 周春光 《中国修复重建外科杂志》 CSCD 北大核心 2018年第4期420-427,共8页
目的 通过慢病毒载体将NEP1-40(Nogo extracellular peptide residues 1-40)及神经营养因子_3(neurotrophin 3,NT-3)双基因转染入神经干细胞(neural stem cells,NSC_s)内进行表达,探讨NEP1-40及NT-3双基因转染NSC_s的可行性,为NS... 目的 通过慢病毒载体将NEP1-40(Nogo extracellular peptide residues 1-40)及神经营养因子_3(neurotrophin 3,NT-3)双基因转染入神经干细胞(neural stem cells,NSC_s)内进行表达,探讨NEP1-40及NT-3双基因转染NSC_s的可行性,为NSC_s体内实验奠定基础。方法 将SD大鼠胚胎室管膜区NSC_s采用空载慢病毒载体(A组)、NEP1-40慢病毒载体(B组)、NT-3慢病毒载体(C组)及NEP1-40和NT-3慢病毒载体(D组)进行转染,以未转染病毒的细胞作为对照组(E组)。用感染复数(multiplicity of infection,MOI)为5、10、15的慢病毒载体分别转染24、48、72 h,荧光显微镜观察转染后细胞内荧光表达情况,确定慢病毒载体的最佳MOI和收样时间。再分别通过实时荧光定量PCR及Western blot,检测转染后细胞中NEP1-40及NT-3基因的表达,以及细胞和培养基中NEP1-40及NT-3蛋白的表达。结果 荧光显微镜观察示,MOI为10时NEP1-40和NT-3基因慢病毒载体在NSC_s内转染率最高,最佳时间为转染48 h时。实时荧光定量PCR及Western blot检测示,B、D组NEP1-40 m RNA相对表达量和蛋白相对表达量均显著高于A、C组,差异有统计学意义(P〈0.05)。C、D组NT-3 m RNA相对表达量和蛋白相对表达量均显著高于A、B组,差异有统计学意义(P〈0.05)。结论 通过慢病毒载体可将NEP1-40及NT-3双基因成功转染入NSC_s内,在NSC_s内稳定表达,且两种目的基因在表达过程中无相互拮抗或促进作用。 展开更多
关键词 神经干细胞 NEP1-40 神经营养因子3 慢病毒载体 转染
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