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人TNF-α重组慢病毒载体构建及其脐血间质干细胞表达 预览 被引量:9
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作者 马贵亮 毛伟征 +2 位作者 杨堃 安岗 岱震波 《青岛大学医学院学报》 CAS 2010年第3期 189-192,195,共5页
目的构建带有人TNF-α基因的慢病毒载体,并且观察该基因在体外人脐血间质干细胞中的表达。方法通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)从PCD DNA-TNF-α质粒中获得人TNF-α基因,利用Infusion技术重组构建慢病毒载体穿梭质粒pGC-FU-TNF-α,在... 目的构建带有人TNF-α基因的慢病毒载体,并且观察该基因在体外人脐血间质干细胞中的表达。方法通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)从PCD DNA-TNF-α质粒中获得人TNF-α基因,利用Infusion技术重组构建慢病毒载体穿梭质粒pGC-FU-TNF-α,在脂质体Lipofectamine 2000介导下与结构质粒pHelper 1.0和包膜质粒pHelper 2.0共转染293T细胞包装生产慢病毒。将人脐血间质干细胞分为实验组(pGC-FU-TNF-α)、空载体对照组(pGC-FU-EGFP)及空白组(脐血间质干细胞),分别用重组慢病毒、空载慢病毒、PBS感染后,采用RT-PCR以及ELISA方法检测TNF-α表达。结果所获TNF-α基因测序证明与GenBank中序列一致;重组慢病毒载体质粒pGC-FU-TNF-α经鉴定正确;三质粒共转染293T细胞成功,收集、浓缩病毒后测定其滴度为2×107TU/L,感染脐血间质干细胞后RT-PCR、ELISA检测3组细胞均有TNF-α表达,其中实验组大量表达TNF-α,与其余两组比较差异有显著性(F=11.677、21.321,P〈0.01)。结论成功构建带有TNF-α基因的慢病毒载体并实现在脐血间质干细胞中的表达,为脐血间质干细胞转基因治疗胃癌的应用奠定基础。 展开更多
关键词 慢病毒感染 遗传载体 肿瘤坏死因子α 基因 脐血 间质干细胞
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慢病毒介导的Aurora A基因沉默对人胃癌细胞迁移及侵袭的影响 预览
2
作者 袁春秀 刘新兰 吴媛媛 《宁夏医科大学学报》 2018年第8期895-898,共4页
目的探讨Aurora A基因在人胃癌侵袭、转移中的作用。方法采用慢病毒感染的方法沉默胃癌SGC-7901细胞Aurora A基因,以细胞划痕实验、迁移实验(Transwell小室)及侵袭实验检测基因沉默后对细胞胃癌细胞迁移和侵袭转移能力的影响。结果 Au... 目的探讨Aurora A基因在人胃癌侵袭、转移中的作用。方法采用慢病毒感染的方法沉默胃癌SGC-7901细胞Aurora A基因,以细胞划痕实验、迁移实验(Transwell小室)及侵袭实验检测基因沉默后对细胞胃癌细胞迁移和侵袭转移能力的影响。结果 Aurora A基因沉默后的胃癌SGC-7901细胞组24h迁移率和转移细胞及48h侵袭转移细胞数[(0.40±0.03)%、(143.00±4.21)个、(89.00±6.13)个]均低于感染了空载体的胃癌SGC-7901组[(0.51±0.05)%、(171.00±2.11)个、(108.00±4.39)个](P均〈0.05)。结论下调胃癌细胞Aurora A基因表达可降低细胞迁移、侵袭转移能力。 展开更多
关键词 胃癌 AURORA A基因 细胞迁移及侵袭 慢病毒转染
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稳定表达人巨噬细胞集落刺激因子的L929细胞株的建立 预览
3
作者 陆琤 周晨辰 +2 位作者 张鹏飞 张硌 张鹏 《中国医学装备》 2018年第11期155-157,共3页
目的:建立稳定表达人巨噬细胞集落刺激因子(hMCSF)的L929细胞株,用于体外培养人源巨噬细胞。方法:采用慢病毒感染的方法将载体质粒pCDH-hMCSF-HA导入L929细胞中,通过荧光显微镜观察病毒感染情况,利用免疫印迹实验检测细胞及培养上清... 目的:建立稳定表达人巨噬细胞集落刺激因子(hMCSF)的L929细胞株,用于体外培养人源巨噬细胞。方法:采用慢病毒感染的方法将载体质粒pCDH-hMCSF-HA导入L929细胞中,通过荧光显微镜观察病毒感染情况,利用免疫印迹实验检测细胞及培养上清中hMCSF的表达。结果:慢病毒感染的方法使L929细胞株能够稳定表达hMCSF,并已稳定传代。结论:采用慢病毒重组系统能够成功建立稳定表达hMCSF的L929细胞株,并高效表达hMCSF,为体外培养人源的巨噬细胞提供高效途径。 展开更多
关键词 L929细胞株 巨噬细胞集落刺激因子 慢病毒感染
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UHRF1基因沉默可促进人肺腺癌A549细胞的凋亡 被引量:4
4
作者 杨从容 赵学涛 +5 位作者 王军 吴凤鹏 刘青 程云杰 景绍武 边晨峰 《肿瘤》 CAS CSCD 北大核心 2015年第11期1222-1229,共8页
目的:探讨慢病毒介导的shRNA干扰泛素样含PHD和环指域1[ubiquitin—like with plant homeodomain(PHD)and ringfinger domain 1,UHRF1]基因表达对人肺腺癌A549细胞凋亡的影响及其可能的作用机制。方法:应用蛋白质印迹法从4条针对UH... 目的:探讨慢病毒介导的shRNA干扰泛素样含PHD和环指域1[ubiquitin—like with plant homeodomain(PHD)and ringfinger domain 1,UHRF1]基因表达对人肺腺癌A549细胞凋亡的影响及其可能的作用机制。方法:应用蛋白质印迹法从4条针对UHRF1基因的RNA干扰慢病毒载体中筛选出1条敲减效率最高的pGC—UHRF1-shRNA—LV-GFP#1包装成慢病毒。实验设未进行感染的空白对照组、感染非特异性shRNA的阴性对照组和感染pGC—UHRF1-shRNA—LV-GFP#1的UHRF1 shRNA组。慢病毒感染A549细胞后,应用RT—PCR法检测各组细胞中UHRF1 mRNA的表达水平,蛋白质印迹法检测各组细胞中UHRF1、Bax、caspase9和Bcl-2蛋白的表达水平;FCM法检测各组细胞的凋亡情况。结果:慢病毒pGC—UHRF1-shRNA—LV-GFP#1感染A549细胞后明显下调UHRF1 mRNA和蛋白表达水平(P值均〈0.01)。UHRF1 shRNA组A549细胞的凋亡率显著高于空白对照组和阴性对照组(P〈0.01),抗凋亡蛋白Bcl-2的表达水平显著下调(P〈0.01),而促凋亡蛋白Bax和caspase9的表达水平显著上调(P值均〈0.01)。结论:慢病毒介导的shRNA沉默UHRF1基因表达可促进人肺腺癌A549细胞的凋亡,其作用可能与上调Bax、caspase9蛋白表达和下调Bcl-2蛋白表达有关。 展开更多
关键词 肺肿瘤 慢病毒感染 RNA干扰 细胞凋亡 UHRF1基因
胃泌素调控ERK信号通路在促进大肠癌CACO2细胞增殖中的作用 被引量:2
5
作者 茆家定 胡迪 吴佩 《中国临床药理学与治疗学》 CAS CSCD 2017年第4期401-405,共5页
目的:利用RNA干扰技术探讨ERK1/2基因在胃泌素促进大肠癌细胞株CACO2增殖中的作用及分子机制。方法:通过慢病毒感染细胞构建胃泌素受体(CCK-BR)阳性的细胞稳转株CACO2,应用qRT-PCR检测大肠癌细胞株CACO2中CCK-BR的表达情况。应用RN... 目的:利用RNA干扰技术探讨ERK1/2基因在胃泌素促进大肠癌细胞株CACO2增殖中的作用及分子机制。方法:通过慢病毒感染细胞构建胃泌素受体(CCK-BR)阳性的细胞稳转株CACO2,应用qRT-PCR检测大肠癌细胞株CACO2中CCK-BR的表达情况。应用RNA干扰技术沉默ERK1/2基因后,分析其总的ERK基因的蛋白表达及其磷酸化水平变化。实验共分4组:对照组、阴性干扰组、胃泌素组及质粒干扰组。使用流式细胞仪Annexin V-FITC法检测各组细胞增殖指数及Western blot检测各组细胞ERK1/2蛋白的表达和磷酸化水平。结果:慢病毒感染后,在CACO2细胞中均检测到目的条带膜蛋白,CACO2细胞存在着一定量的CCK-BR mRNA表达,扩增产物为185 bp。筛选出干扰质粒,质粒与脂质体比例在1∶2,转染效率达到40%-50%,转染干扰质粒的细胞中ERK蛋白表达水平降低,从蛋白水平说明构建的质粒沉默有效。胃泌素组细胞增殖指数明显高于质粒干扰组,也高于阴性干扰组和空白对照组,差异有统计学意义(P〈0.01)。4组细胞间ERK1/2的蛋白表达及磷酸化水平比较,差异有统计学意义(P〈0.01)。胃泌素组ERK1/2的蛋白表达及磷酸化水平明显高于质粒干扰组,也高于阴性干扰组和空白对照组,差异有统计学意义(P〈0.01)。结论:胃泌素能够通过ERK信号通路促进体外大肠癌CACO2细胞增殖。通过RNA干扰技术有效地阻断ERK信号通路下调ERK蛋白磷酸化水平,有望为胃泌素依赖型大肠癌综合治疗寻找到一条新的切入途径。 展开更多
关键词 胃泌素 ERK1/2 大肠癌 RNA干扰 慢病毒感染
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STIM1基因在人下咽癌细胞系FaDu中的表达及对细胞凋亡的影响 预览 被引量:2
6
作者 武帅 崔晓波 +2 位作者 孙源昊 王军 王博谦 《局解手术学杂志》 2016年第3期167-170,共4页
目的探索STIM1基因在人下咽癌细胞系Fa Du中的表达情况及其表达沉默后对细胞凋亡的影响。方法培养人下咽癌Fa Du细胞,根据不同慢病毒感染分2组。STIM1-siRNA组为经STIM1-siRNA慢病毒感染的下咽癌细胞;对照组为经阴性对照慢病毒感染的下... 目的探索STIM1基因在人下咽癌细胞系Fa Du中的表达情况及其表达沉默后对细胞凋亡的影响。方法培养人下咽癌Fa Du细胞,根据不同慢病毒感染分2组。STIM1-siRNA组为经STIM1-siRNA慢病毒感染的下咽癌细胞;对照组为经阴性对照慢病毒感染的下咽癌细胞。Real-Time PCR法检测STIM1在人下咽癌Fa Du细胞中的表达以及siRNA慢病毒感染后STIM1mRNA水平的表达;Western blot检测siRNA慢病毒感染后STIM1在蛋白水平的表达;流式细胞仪检测STIM1基因沉默后的人下咽癌Fa Du细胞的凋亡情况。采用SPSS 17.0软件对数据进行统计学分析。结果以GAPDH为内参(Ct=12.08±0.05),STIM1在下咽癌细胞系Fa Du中表达显著(Ct=22.21±0.05,P〈0.01);Real-time PCR结果显示对照组和STIM1-siRNA组人下咽癌Fa Du细胞的表达值分别为(1.00±0.08)和(0.12±0.01),2组差异具有统计学意义(P〈0.01);Western blot的结果显示,STIM1-siRNA组Fa Du细胞中STIM1蛋白明显受抑制,与Real-time PCR结果一致,慢病毒感染成功;流式细胞仪检测结果显示对照组凋亡率为(4.36±1.32)%;实验组凋亡率为(9.81±0.56)%,差异具有统计学意义(P〈0.05)。结论 STIM1基因与人下咽癌Fa Du细胞凋亡显著相关,人下咽癌Fa Du细胞中,STIM1可能抑制凋亡,可能成为下咽癌诊治的全新切入点。 展开更多
关键词 STIM1 下咽癌 FaDu细胞 SIRNA 慢病毒感染 凋亡
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神经干细胞静脉移植对大鼠脊髓损伤的修复作用 预览 被引量:2
7
作者 杜宁 陈志 +2 位作者 申才良 张峰 宋旆文 《安徽医科大学学报》 CAS 北大核心 2016年第11期1688-1692,共5页
制备阴性对照病毒转染的传代神经干细胞(NSCs),同期制作大鼠脊髓损伤模型,随机分为实验组、假手术组、空白组,并对其进行术后行为学评分。3d后取实验组再次手术,尾静脉输注已用阴性对照病毒标记的大鼠NSCs浓缩液。于1周和6周时对假手... 制备阴性对照病毒转染的传代神经干细胞(NSCs),同期制作大鼠脊髓损伤模型,随机分为实验组、假手术组、空白组,并对其进行术后行为学评分。3d后取实验组再次手术,尾静脉输注已用阴性对照病毒标记的大鼠NSCs浓缩液。于1周和6周时对假手术组、实验组大鼠10%福尔马林灌注,以固定的大鼠脊髓段落,福尔马林浸泡存放去除的脊髓段1d,石蜡包埋后切片。获得大量尚未分化、悬浮生长的NSCs球。完成NSCs的传代。移植组的行为学评分结果比假手术组高。实验组大鼠脊髓损伤区脊髓空洞体积较假手术组小。初步证明注射NSCs液的大鼠恢复速度高于对照组,NSCs移植能够减小脊髓损伤处的空洞体积和促进血管生长,从而促进脊髓损伤后神经功能的恢复。 展开更多
关键词 脊髓损伤 移植 慢病毒转染 行为学评分
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慢病毒感染稳定敲减eIF4E基因的鼻咽癌CNE2细胞系的建立 预览 被引量:2
8
作者 赵毅 王燕 胡新荣 《检验医学与临床》 CAS 2015年第7期888-890,894共4页
目的构建稳定干扰真核起始因子4E(eIF4E)基因的鼻咽癌CNE2细胞系。方法设计针对eIF4E基因mRNA序列的RNA干扰序列,以慢病毒载体pGC-LV为基础构建感染体系。慢病毒感染CNE2细胞后,经嘌呤霉素压力筛选稳定敲减eIF4E基因的CNE2细胞株。采... 目的构建稳定干扰真核起始因子4E(eIF4E)基因的鼻咽癌CNE2细胞系。方法设计针对eIF4E基因mRNA序列的RNA干扰序列,以慢病毒载体pGC-LV为基础构建感染体系。慢病毒感染CNE2细胞后,经嘌呤霉素压力筛选稳定敲减eIF4E基因的CNE2细胞株。采用定量聚合酶链反应和免疫印迹法检测eIF4EmRNA和蛋白的表达水平;采用细胞增殖和迁徙实验验证eIF4E敲减对CNE2细胞的影响。结果成功构建并筛选获得带有eIF4E特异性短发夹RNA的慢病毒颗粒;将慢病毒颗粒转入CNE2细胞,经抗菌药物压力筛选获得稳定敲减eIF4E基因的CNE2细胞(CNE2siEp)及阴性对照细胞(CNE2siNC)。与CNE2siNC细胞相比,CNE2siEp细胞eIF4EmRNA表达水平下调76.0%,蛋白表达水平下调50.0%,细胞增殖活性下调85.0%,运动活性下调59.0%。结论成功构建稳定敲减eIF4E的CNE2细胞系,其eIF4E基因表达水平与功能明显受抑。 展开更多
关键词 真核起始因子4E 敲减 慢病毒感染 RNA干扰
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抑制NFBD1基因的表达对鼻咽癌CNE-1细胞放射敏感性的影响 被引量:2
9
作者 王志海 曾泉 +4 位作者 陈弢 廖奎 卜友泉 洪苏玲 胡国华 《肿瘤》 CAS CSCD 北大核心 2014年第2期101-107,共7页
目的:通过短发夹RNA(shorthairpinRNA,shRNA)干扰NFBDl(nuclearfactorwithBRCTdomainsprotein1)基因的表达,并探讨其对鼻咽癌CNE-1细胞放射敏感性的影响。方法:以慢病毒感染的方法将特异性针对NFBDl基因的shRNA转入CNE-1细胞,... 目的:通过短发夹RNA(shorthairpinRNA,shRNA)干扰NFBDl(nuclearfactorwithBRCTdomainsprotein1)基因的表达,并探讨其对鼻咽癌CNE-1细胞放射敏感性的影响。方法:以慢病毒感染的方法将特异性针对NFBDl基因的shRNA转入CNE-1细胞,并用嘌呤霉素筛选稳定表达的细胞;分别采用实时荧光定量-PCR(real-timefluorogenicquantitative-PCR,RFQzPCR)及蛋白质印迹法检测NFBDlmRNA和蛋白的表达;以克隆形成和FCM法检测沉默NFBDl基因对CNE-1细胞放射敏感性的影响。结果:NFBDl-shRNA慢病毒载体感染后,CNE-1细胞中NFBDlmRNA和蛋白表达水平明显降低。各组细胞经6MeV电子线照射后,NFBD1-shRNA组细胞的凋亡率和G:/M期细胞所占的比例均较阴性对照组[negativecontro1-shRNA(NC-shRNA)]明显增加(P〈0.05),细胞存活分数较NC-shRNA组明显降低(P〈0.05)。结论:采用慢病毒感染的方法靶向NFBDl基因的RNA干扰可稳定沉默NFBDl的表达,从而增加鼻咽癌细胞对放射治疗的敏感性。 展开更多
关键词 鼻咽肿瘤 RNA 小分子干扰 慢病毒感染 放射肿瘤学
4种全能性基因转入人胚胎成纤维细胞诱导多能性干细胞系的建立及其鉴定 预览 被引量:2
10
作者 杜丽丽 林戈 卢光琇 《中南大学学报:医学版》 CAS CSCD 北大核心 2009年第12期 1157-1165,共9页
目的:利用人类胚胎成纤维细胞(human embryonic fibroblast cells,hEFs)获得诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)系并对其全能性进行鉴定。方法:本研究采用慢病毒感染的方法将含有Oct4,Sox2,Nanog和Lin28全... 目的:利用人类胚胎成纤维细胞(human embryonic fibroblast cells,hEFs)获得诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)系并对其全能性进行鉴定。方法:本研究采用慢病毒感染的方法将含有Oct4,Sox2,Nanog和Lin28全能性基因的慢病毒颗粒转导hEFs,获得iPSCs,并对其进行碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,AKP)染色,以及检测表面标记,端粒酶活性,EB分化和畸胎瘤形成等,同时进行核型分析以及短串联重复序列(short tandem repeat,STR)分析。结果:所获得的iPSCs表达多能性细胞的表面标记,具有高的端粒酶活性,可在体内体外向内中外三胚层分化,与hESCs相似。经STR分析证实,iPSCs确实来源于hEFs而非胚胎干细胞的污染。结论:4种全能性基因转入hEFs可诱导获得与胚胎干细胞相似的iPSCs,有助于进一步的表观遗传学重编程以及干细胞多能性维持的研究。 展开更多
关键词 诱导性多能干细胞 慢病毒感染 胚胎干细胞 胚胎成纤维细胞
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慢病毒介导RNAi下调LMP2A基因表达抑制EB病毒相关胃癌细胞的体外生长 预览
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作者 王芳军 高昳 +2 位作者 刘兵团 王文平 刘鹏飞 《胃肠病学》 2017年第12期711-716,共6页
EB病毒(EBV)与多种人类肿瘤,如Burkitt淋巴瘤以及鼻咽癌、胃癌等上皮性肿瘤相关。病毒编码的潜伏膜蛋白2A(LMP2A)存在于部分EBV相关胃癌(EBVaGC)中,与肿瘤发生、发展密切相关。目的:应用慢病毒介导的RNA干扰(RNAi)技术抑制LMP2A基因表达... EB病毒(EBV)与多种人类肿瘤,如Burkitt淋巴瘤以及鼻咽癌、胃癌等上皮性肿瘤相关。病毒编码的潜伏膜蛋白2A(LMP2A)存在于部分EBV相关胃癌(EBVaGC)中,与肿瘤发生、发展密切相关。目的:应用慢病毒介导的RNA干扰(RNAi)技术抑制LMP2A基因表达,探讨下调LMP2A对EBVaGC细胞体外生长的影响。方法:构建慢病毒载体pGCSIL-LMP2A-shRNA-LV和阴性对照载体并转染EBVaGC细胞株GT38,以real-timePCR和蛋白质印迹法检测慢病毒载体的抑制效率,CCK-8实验、克隆形成实验和流式细胞术检测GT38细胞的细胞生长、细胞周期和细胞凋亡。结果:GT38细胞转染LMP2A-shRNA-LV后,LMP2AmRNA和蛋白表达分别下调65.4%和50.8%,进而导致细胞体外增殖受抑,克隆形成能力降低,G0/G1期细胞比例增加,细胞凋亡率增高,与转染阴性对照慢病毒载体和未予转染慢病毒的GT38细胞相比,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论:慢病毒介导的RNAi技术能高效抑制LMP2A基因表达,进而抑制EBVaGC细胞的体外生长,诱导G0/G1期阻滞,促进细胞凋亡。LMP2A可作为EBVaGC基因治疗的潜在靶点。 展开更多
关键词 潜伏膜蛋白2A EB病毒感染 胃肿瘤 RNA干扰 慢病毒感染 细胞增殖 细胞凋亡
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慢病毒介导高表达OTUD7B对乳腺癌MCF-7细胞生物学行为影响
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作者 刘静 史建红 +1 位作者 段菲 陈保平 《中华肿瘤防治杂志》 北大核心 2017年第9期596-601,共6页
目的去泛素化酶OTUD7B与肿瘤的发生、发展密切相关。为了明确OTUD7B在乳腺癌中所发挥的作用,实验利用慢病毒构建高表达OTUD7B载体感染MCF-7乳腺癌细胞后对其生物学行为的影响。方法构建带有绿色荧光蛋白标签的人OTUD7B表达质粒的慢病毒... 目的去泛素化酶OTUD7B与肿瘤的发生、发展密切相关。为了明确OTUD7B在乳腺癌中所发挥的作用,实验利用慢病毒构建高表达OTUD7B载体感染MCF-7乳腺癌细胞后对其生物学行为的影响。方法构建带有绿色荧光蛋白标签的人OTUD7B表达质粒的慢病毒(pEGFP-hOTUD7B)及对照(pEGFP-CI)感染MCF-7乳腺癌细胞;于荧光倒置显微镜下观察病毒转染效果及应用蛋白质印迹法及免疫组化法检测OTUD7B的表达水平;MTS法检测实验组(pEGFP-hOTUD7B)、阴性对照组(pEGFP-CI)和正常对照组对MCF-7乳腺癌细胞增殖能力的影响;应用细胞划痕实验检测细胞迁移能力;流式细胞仪检测细胞凋亡。结果感染病毒后于荧光倒置显微镜下观察病毒感染效率,可见病毒感染成功。应用蛋白质印迹法检测病毒感染率并找出最适病毒感染复数(multiplicity of infection,MOI),当MOI=30时,实验组、阴性对照组和正常对照组灰度值分别为3.81±0.08、2.12±0.078和2.05±0.15,差异有统计学意义,F=402.03,P〈0.001。应用免疫组化法可见感染OTUD7B表达水平。MTS法结果显示,实验组、阴性对照组和正常对照组细胞24hA值分别为0.36±0.08、0.56±0.25和0.69±0.17,F=11.819,P〈0.001;48hA值分别为0.65±0.17、1.45±0.48和1.82±0.63,F=23.752,P〈0.001;在72hA值分别为0.73±0.21、1.58±0.63和1.99±0.27,F=35.563,P〈0.001。细胞划痕试验显示,24h后实验组组迁移率为(7.7±0.91)%,阴性对照组和正常对照组迁移率分别为(13.4±1.52)%和(12.1±1.32)%,F=49.36,P〈0.001,48h后实验组迁移率为(12.4±1.29)%,阴性对照组及正常对照组迁移率分别为(32.9±1.71)%和(31.8±1.59)%,F=504.50,P〈0.001。流式细胞仪检测细胞凋亡结果提示,实验组与阴性对照组及正常对照组相比明显使细胞阻滞在G0/G1期,促进其凋亡,F(G0/G1)期=425.102,FS期=135.063,均P〈0.001。结论成功构建了能够高表达OTUD7B的慢病毒载体,明显抑制� 展开更多
关键词 MCF-7乳腺癌细胞 OTUD7B 慢病毒感染 增殖 迁移
慢病毒介导的p21/Waf1基因沉默增强膀胱癌特异性溶瘤腺病毒的复制及对EJ细胞增殖的抑制作用 被引量:1
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作者 石洁 王志平 +5 位作者 李晓娟 杨兰 秦晓东 王莉 付生军 陶燕 《肿瘤》 CAS CSCD 北大核心 2015年第10期1083-1091,共9页
目的:沉默人膀胱癌EJ细胞中p21/Waf1基因的表达,并探讨p21/Wa~1表达下调对膀胱癌特异性溶瘤腺病毒复制及对EJ细胞增殖的影响。方法:设计并合成特异性针对p21/Waf1基因的shRNA,插入含绿色荧光蛋白(greenfluorescentprotein,GFP... 目的:沉默人膀胱癌EJ细胞中p21/Waf1基因的表达,并探讨p21/Wa~1表达下调对膀胱癌特异性溶瘤腺病毒复制及对EJ细胞增殖的影响。方法:设计并合成特异性针对p21/Waf1基因的shRNA,插入含绿色荧光蛋白(greenfluorescentprotein,GFP)编码基因的pMagic7.1载体,构建p21/Waf1-shRNA重组慢病毒质粒pLVTl051,并进行PCR和测序鉴定。将pLVTl051、pCMV—VSV—G和pCMV—dR8.91三种质粒共转染293T细胞,包装产生慢病毒。将携带有p21/Waf1-shRNA的慢病毒感染ET细胞,采用嘌呤霉素筛选p21/Waf1—shRNA稳定转入的EI细胞,采用实时荧光定量PCR和蛋白质印迹法分别检测p21/V%n—shRNA稳定感染后ET细胞中p21/wafltuRNA和蛋白的表达水平。将膀胱癌特异性溶瘤腺病毒Ad/PSCAE/UPII/ElA感染p21/wafl基因沉默的ET细胞,采用蛋白质印迹法检测病毒复制相关指标E1A和Hexon蛋白的表达水平,MTT法检测腺病毒Ad/PSCAE/UPII/E1A对ET细胞增殖的影响。结果:成功构建了携带有p21/Waf1—shRNA的重组慢病毒表达载体并获得相应的慢病毒;经嘌呤霉素筛选2周后成功获得稳定感染的ET细胞。p21/Waf1—shRNA能明显降低EJ细胞中p21/Waf1mRNA及蛋白的表达水平,差异均有统计学意义(P值均〈0.05)。膀胱癌特异性溶瘤腺病毒(Ad/PSCAE/UPII/E1A)作用于p211waFl基因沉默的EJ细胞后,其病毒复制相关指标E1A和Hexon的表达水平明显上调,对EJ细胞的增殖抑制作用明显增强(P〈0.01)。结论:成功建立了p21/Waf1基因沉默表达的EJ细胞,沉默p211WaFl基因的表达能增强膀胱癌特异性溶瘤腺病毒的复制能力,并对EJ细胞的增殖有明显的抑制作用。 展开更多
关键词 膀胱肿瘤 RNA 小分子干扰 慢病毒感染 p21/Waf1基因 病毒复制 EJ细胞
无镁诱导神经元惊厥样放电后Lingo-1对轴突的影响
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作者 刘丽鸣 蒋莉 +3 位作者 王玥 何蓉 陈恒胜 程莉 《重庆医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第8期774-780,共7页
目的:研究惊厥样神经元模型中含亮氨酸重复序列和免疫球蛋白结构域的Nogo受体作用蛋白(LRR and Ig domain containing,Nogo receptor interacting protein,Lingo-1)对神经元轴突的作用。方法:(1)培养10 d的皮层神经元,经正常细胞... 目的:研究惊厥样神经元模型中含亮氨酸重复序列和免疫球蛋白结构域的Nogo受体作用蛋白(LRR and Ig domain containing,Nogo receptor interacting protein,Lingo-1)对神经元轴突的作用。方法:(1)培养10 d的皮层神经元,经正常细胞外液处理(正常组)或无镁细胞外液处理(无镁组)后用免疫荧光技术检测神经元轴突变化。(2)以上两种不同处理后6、12、24、48、72 h 5个时间点,用q RT-PCR及Western blot检测神经元中Lingo-1表达情况。(3)设计sh RNA慢病毒抑制Lingo-1表达,分为正常组、无镁组、无镁+对照sh RNA组和无镁+Lingo-1sh RNA组4组,用免疫荧光技术检测神经元轴突长度。结果:(1)正常组神经元轴突粗壮、轴突间网络连接较致密,神经丝蛋白200(neurofilament proteins 200,NF200)只在突起表达;无镁组神经元轴突纤细、轴突间网络连接稀疏,NF200在胞体内高表达。(2)各观察时间点上,无镁组Lingo-1的表达量均高于正常组(P〈0.05)。(3)在神经元轴突长度上:无镁组小于正常组(P=0.000),无镁+对照sh RNA组与无镁组无统计学差异,无镁+Lingo-1sh RNA组大于无镁组+对照sh RNA(P=0.000)。结论:无镁处理后神经元轴突损伤、Lingo-1表达升高,抑制Lingo-1表达后神经元轴突损伤减轻,说明Lingo-1可能参与神经元放电后神经元轴突损伤。 展开更多
关键词 LINGO-1 皮层神经元 惊厥 轴突损伤 慢病毒感染
外源表达持续活化型Gli2对小鼠星形胶质细胞生物学特性的影响 预览
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作者 吴文涛 葛瑞民 +3 位作者 董林 刘秀秀 张小燕 沈丽 《中国药理学通报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第1期98-101,共4页
目的探讨外源表达持续活化型Gli2对小鼠星形胶质细胞生物学特性的影响。方法构建可表达持续活化型Gli2的慢病毒载体,包装慢病毒颗粒,继而感染小鼠星形胶质细胞,对其生物学特性的改变进行鉴定。结果研究发现,含有外源表达的持续活化型Gli... 目的探讨外源表达持续活化型Gli2对小鼠星形胶质细胞生物学特性的影响。方法构建可表达持续活化型Gli2的慢病毒载体,包装慢病毒颗粒,继而感染小鼠星形胶质细胞,对其生物学特性的改变进行鉴定。结果研究发现,含有外源表达的持续活化型Gli2的小鼠星形胶质细胞在神经干细胞培养基中连续培养13 d后可获得形成细胞球的能力,且形成的细胞球与正常的小鼠神经球在形态上相近;对所形成的细胞球做免疫荧光染色,结果显示神经干细胞的特异性标志物Nestin呈阳性。结论在小鼠星形胶质细胞中外源表达持续活化型Gli2后可使其获得形成神经球样细胞球的能力。 展开更多
关键词 神经干细胞 中枢神经系统损伤 持续活化型 GLI2 神经球 慢病毒转染法 星形胶质细胞 NESTIN
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弓形虫棒状体ROP16基因转染RAW264.7的实验研究 预览
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作者 谢园园 徐元宏 +4 位作者 闻慧琴 王书书 李源玲 储德勇 沈继龙 《安徽医科大学学报》 CAS 北大核心 2015年第10期1367-1372,共6页
目的 比较目前常用的5种基因导入技术将弓形虫棒状体ROP16基因导入RAW264. 7,选择合适的方法提高转染效率. 方法 以绿色荧光蛋白pEGFP-ROP16融合表达构建质粒,采用 Lipofectamine(R)3000 、Attractene 、Fugene(R) HD转染试剂以及... 目的 比较目前常用的5种基因导入技术将弓形虫棒状体ROP16基因导入RAW264. 7,选择合适的方法提高转染效率. 方法 以绿色荧光蛋白pEGFP-ROP16融合表达构建质粒,采用 Lipofectamine(R)3000 、Attractene 、Fugene(R) HD转染试剂以及电穿孔转染和慢病毒载体感染RAW264. 7,利用荧光显微镜和流式细胞仪观察目的基因的表达、细胞生长状态并分析转染效率,从而确定最佳的基因导入途径. 结果上述质粒载体对RAW264. 7的转染效率依次为电转法〈Fugene(R) HD〈Lipofectamine (R)3000〈Attractene. 但是电转法转染后细胞死亡率较高,细胞贴壁不牢或死亡;而慢病毒感染效率可达61. 2%,细胞生长状态佳,显著优于质粒载体( P〈0. 05). 慢病毒组显著优于4个质粒组(P〈0. 05). 结论慢病毒感染可将弓形虫棒状体 ROP16 成功转入RAW264. 7,具有较高的转染效率,效果显著优于质粒载体,目的基因在细胞内获得高效表达. 为弓形虫ROP16的功能研究提供了重要基础. 展开更多
关键词 ROP16基因 RAW264.7 慢病毒感染
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增殖抑制基因(HSG)RNAi慢病毒载体的构建与鉴定 预览
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作者 楼煜清 李榕 +5 位作者 刘洁琳 张岩巍 刘雅 王佐广 温绍君 韩宝惠 《北京生物医学工程》 2015年第4期389-393,共5页
目的为研究HSG基因不同表达程度对肺癌细胞的影响,构建并鉴定HSG基因RNA干扰慢病毒表达载体,以建立HSG基因沉默的人肺癌细胞株。方法针对HSG mRNA设计了4条siRNA,并构建p GCSIL-GFP-HSG慢病毒质粒,通过测序鉴定。采用构建的p GCSIL-GFP-... 目的为研究HSG基因不同表达程度对肺癌细胞的影响,构建并鉴定HSG基因RNA干扰慢病毒表达载体,以建立HSG基因沉默的人肺癌细胞株。方法针对HSG mRNA设计了4条siRNA,并构建p GCSIL-GFP-HSG慢病毒质粒,通过测序鉴定。采用构建的p GCSIL-GFP-HSG,p Helper1.0和p Helper2.0共感染293T细胞,包装产生慢病毒,测定其滴度。将慢病毒转染人肺腺癌细胞株A549,通过real-time PCR分析HSG基因表达。结果测序结果显示,DNA序列与实验要求序列一致,提示插入人HSG基因RNAi序列正确。荧光显微镜观察转染慢病毒包装质粒后的细胞,见细胞生长良好,荧光强度强烈。测定病毒滴度为3×108TU/ml。real-time PCR分析提示RNA干扰病毒感染A549细胞株后,HSG基因表达显著下调。结论人HSG基因RNAi慢病毒载体构建成功,可用于肿瘤学的进一步应用。 展开更多
关键词 RNA干扰 慢病毒干扰 增值抑制基因 肺肿瘤
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北疆绵羊慢病毒感染的血清学调查 预览 被引量:5
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作者 邓普辉 孟庆文 《新疆农业大学学报》 CAS 1996年第2期 6-9,共4页
北疆某羊场的5群成年新疆美利奴母羊,用琼脂凝胶免疫扩散试验检查其对绵羊慢病毒(ovinelentivirusOvLV)的血清抗体。1075只受试母羊中,8只为血清学阳性,6只为血清学可疑,平均血清学阳性率为0.85%... 北疆某羊场的5群成年新疆美利奴母羊,用琼脂凝胶免疫扩散试验检查其对绵羊慢病毒(ovinelentivirusOvLV)的血清抗体。1075只受试母羊中,8只为血清学阳性,6只为血清学可疑,平均血清学阳性率为0.85%(0.7%~1.0%)。在8只血清学阳性母羊中,7只来自第3群而另1只来自第5群。6只母羊有对OvLV核心蛋白p26的血清抗体,1只有对OvLV包膜蛋白gp135的抗体,1只有对p26与gp135二者的抗体。由156只老母羊组成的第3群的血清学阳性率为4.5%,与2岁的第2群、4岁的第1,4群的血清学阳性率0和3岁的第5群的0.4%相比,结果证明血清学阳性率随年龄增长而增加。此外,还讨论了OvLV感染的控制、新疆美利奴羊对OvLV的品种敏感性等问题 展开更多
关键词 绵羊 病毒感染 血清学 品种敏感性
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生长分化因子15过表达对心肌缺血再灌注的保护作用及与其自噬的关系 被引量:2
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作者 曹蕾 郭谦 +4 位作者 王彰昭 张新然 焦建杰 何景华 强兆艳 《中国临床药理学杂志》 CSCD 北大核心 2017年第10期909-912,共4页
目的通过构建生长分化因子15(GDF15)稳定过表达的心肌细胞株,探讨其对H9c2心肌细胞缺血/再灌注(I/R)损伤凋亡和自噬的影响。方法建立H9c2 I/R损伤模型,用靶向GDF15过表达慢病毒和阴性空载体病毒转染H9c2细胞,筛选出GDF15稳定过表达... 目的通过构建生长分化因子15(GDF15)稳定过表达的心肌细胞株,探讨其对H9c2心肌细胞缺血/再灌注(I/R)损伤凋亡和自噬的影响。方法建立H9c2 I/R损伤模型,用靶向GDF15过表达慢病毒和阴性空载体病毒转染H9c2细胞,筛选出GDF15稳定过表达细胞株。分为3组:对照组、空载体组和GDF15过表达组。用MTT法检测I/R后细胞存活率,以LDH试剂盒检测细胞培养上清液中乳酸脱氢酶活力,以免疫印迹法检测凋亡相关蛋白Caspase-3、Bcl-2、Bax和自噬相关蛋白Beclin-1、LC3-B的表达。结果 I/R 2 h,对照组、空载体组和过表达组的细胞存活率分别为(60.47±5.03)%,(63.21±17.13)%,(74.93±10.03)%,过表达组细胞活性较对照组与空载体组均增高,差异有统计学意义(P〈0.01)。对照组和过表达组LDH活力值分别为108.72±7.20,50.29±10.05,与对照组比较差异有统计学意义(P〈0.01)。在I/R干预下,凋亡相关蛋白Caspase-3在对照组和过表达组的灰度值分别为99.73±0.61,67.68±0.47,过表达组低于对照组,差异有统计学意义(P〈0.01)。Bcl-2/Bax在对照组、空载体组和过表达组的灰度值分别为72.52±2.05,39.55±0.46,82.52±1.39,过表达组明显高于对照组和空载体组,差异有统计学意义(P〈0.01)。在I/R后,自噬相关蛋白Beclin-1在对照组、空载体组和GDF15过表达组的灰度值分别为58.93±0.64,36.71±0.35,88.39±0.72,过表达组明显高于对照组和空载体组,差异有统计学意义(P〈0.01)。LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ在空载体组和GDF15过表达组的灰度值分别为2.11±0.02,3.32±0.04,过表达组明显高于空载体组,差异有统计学意义(P〈0.01)。结论上调H9c2细胞的GDF15水平可保护H9c2大鼠心肌细胞,其作用机制可能通过促进细胞的自噬作用得以实现。 展开更多
关键词 生长分化因子15 慢病毒感染 心肌细胞 缺氧/复氧
小鼠Islet-1基因RNAi慢病毒载体的构建 被引量:3
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作者 智深深 朱静 +4 位作者 田杰 刘官信 鲁荣 林建萍 刘建平 《解放军医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2011年第2期170-173,共4页
目的构建高效沉默小鼠Islet-1基因的慢病毒载体。方法针对小鼠Islet-1基因设计3个RNAi靶序列,合成相应的短发卡RNA(shRNA)寡核苷酸序列(oligo):Sh1、Sh2、Sh3,分别插入经酶切后的PLVTHM载体。经PCR和测序方法筛选阳性克隆,抽提阳... 目的构建高效沉默小鼠Islet-1基因的慢病毒载体。方法针对小鼠Islet-1基因设计3个RNAi靶序列,合成相应的短发卡RNA(shRNA)寡核苷酸序列(oligo):Sh1、Sh2、Sh3,分别插入经酶切后的PLVTHM载体。经PCR和测序方法筛选阳性克隆,抽提阳性克隆质粒经大肠埃希菌扩增后,与其辅助包装质粒共同感染293T细胞制备慢病毒载体,利用斑形成试验测定病毒滴度。感染C3H10T1/2细胞株,以流式细胞仪检测其感染效率、荧光定量PCR检测其干扰效率。结果与正常C3H10T1/2细胞比较,测序及PCR结果显示目的片段插入正确;病毒滴度值为3.87×108TU/ml;慢病毒载体对C3H10T1/2细胞感染效率达90.36%;3个靶点(抑制效率分别为76.8%5、5.1%和11.7%)均有干扰效果,与正常细胞比较,Sh1靶点干扰效果最为显著(76.8%,P〈0.05)。结论成功构建高效沉默Islet-1基因慢病毒载体。 展开更多
关键词 慢病毒感染 RNA干扰 基因 Islet-1 细胞分化
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