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从一名HIV-1感染者中分离出能中和2株Tier 2病毒的单克隆抗体
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作者 鞠斌 李丹 +5 位作者 梁华 任莉 郝彦玲 王硕 魏民 邵一鸣 《中华微生物学和免疫学杂志》 CSCD 北大核心 2018年第2期81-87,共7页
目的 从中国HIV-1感染者中分离和鉴定能够中和二级难中和(Tier 2)病毒的单克隆中和抗体.方法 单个B细胞流式分选和单克隆抗体表达技术获得单克隆抗体,免疫遗传学数据库分析抗体可变区基因,酶联免疫吸附试验测定抗体的结合能力,TZM-bl... 目的 从中国HIV-1感染者中分离和鉴定能够中和二级难中和(Tier 2)病毒的单克隆中和抗体.方法 单个B细胞流式分选和单克隆抗体表达技术获得单克隆抗体,免疫遗传学数据库分析抗体可变区基因,酶联免疫吸附试验测定抗体的结合能力,TZM-bl/假病毒中和试验测定抗体的中和能力.结果 从一个HIV-1 B亚型病毒感染者中分离到了E11和H2两个能够中和2株Tier 2病毒的单克隆中和抗体;E11和 H2抗体的重链基因均来源于 IGHV4-4*08家系,突变率分别为15.79%和14.74%,轻链基因均来源于IGKV3-15*01家系,突变率分别为8.33%和7.95%;两个抗体可与B亚型、CRF01_AE和CRF07_BC病毒蛋白结合;E11和H2抗体对398-F1病毒(Tier 2)的50%抑制浓度分别为18. 78 μg/ml 和22. 43 μg/ml,中和25710病毒(Tier 2)的浓度分别为43.35 μg/ml和39.45 μg/ml.结论 本研究成功分离到了两个能够中和2株Tier 2病毒的单克隆中和抗体,能够为相关艾滋病疫苗的设计提供研究基础. 展开更多
关键词 单克隆抗体 中和活性 流式分选 二级难中和 人类免疫缺陷病毒1型
H3N2亚型犬流感病毒单链抗体的制备
2
作者 邱冬 赵丹 刘永杰 《中国兽医科学》 CSCD 北大核心 2018年第5期574-579,共6页
为制备犬流感病毒(CIV)单链抗体(scFv),采用纯化的CIV抗原免疫BALB/c小鼠后,取小鼠脾组织提取总RNA,采用PCR方法扩增重链、轻链可变区基因片段,利用重叠延伸PCR将重链、轻链通过弹性肽链连接物Linker连接,构建VH-Linker-VL融合片段... 为制备犬流感病毒(CIV)单链抗体(scFv),采用纯化的CIV抗原免疫BALB/c小鼠后,取小鼠脾组织提取总RNA,采用PCR方法扩增重链、轻链可变区基因片段,利用重叠延伸PCR将重链、轻链通过弹性肽链连接物Linker连接,构建VH-Linker-VL融合片段,并将其插入原核表达载体pET-32a(+)后转化大肠杆菌,重组菌经IPTG诱导表达,获得45 ku左右的目的蛋白。Western-blotting结果表明,该蛋白能被抗His标签的单抗特异性识别。间接ELISA及中和试验结果表明,scFv能够与CIV发生特异性结合反应,具有中和活性。本研究成功制备了针对H3N2亚型CIV单链抗体,为该病毒感染的诊断和治疗提供了物质基础。 展开更多
关键词 犬流感病毒 单链抗体 原核表达 中和活性
利用单个B细胞分选方法获得HIV-1单克隆抗体基因及功能鉴定
3
作者 鞠斌 郝彦玲 +6 位作者 李丹 任莉 梁华 王硕 侯佳利 魏民 邵一鸣 《中华微生物学和免疫学杂志》 CSCD 北大核心 2018年第7期481-487,共7页
目的从人类免疫缺陷病毒1型(human immunodeficiency virus-1,HIV-1)感染者中获得单克隆抗体基因及功能鉴定。方法单细胞流式分选得到抗原特异性单个B细胞,基因扩增和测序得到抗体可变区序列,BioEdit软件包中Sequence Identity Mat... 目的从人类免疫缺陷病毒1型(human immunodeficiency virus-1,HIV-1)感染者中获得单克隆抗体基因及功能鉴定。方法单细胞流式分选得到抗原特异性单个B细胞,基因扩增和测序得到抗体可变区序列,BioEdit软件包中Sequence Identity Matrix程序分析基因序列一致性,免疫遗传学数据库分析抗体基因家系和突变率,酶联免疫吸附试验测定抗体结合能力,TZM-bl/假病毒试验检测抗体中和能力。结果从3个HIV-1感染者中分别获得了4个、7个和11个不同抗体的重链和轻链基因序列,其基因家系、CDR3长度和突变率广泛多样;验证了一个感染者的4个抗体基因序列,抗体A1和B3是HIV-1单克隆结合抗体,能同时与B亚型、CRF01_AE和CRF07_BC抗原蛋白结合;A1和B3也是HIV-1单克隆中和抗体,能够中和C亚型的MW965病毒,50%抑制浓度分别为0.04 μg/ml和37.34 μg/ml。结论本研究成功获得了大量的单克隆抗体基因,并对其中的部分序列进行了功能验证,为单克隆抗体的分离和鉴定等研究工作提供了基础。 展开更多
关键词 单个B细胞分选 抗体基因 序列分析 结合能力 中和活性
重组人源化抗TNF-α单抗WLB303猴重复给药毒性试验血清中和抗体确证方法的建立 被引量:1
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作者 陈红霞 李雪 +4 位作者 罗涛 李乐 于玉根 蒙志超 刘思思 《中国新药杂志》 CSCD 北大核心 2017年第20期2386-2395,共10页
目的:建立一种快速、灵敏、高效和易操作的方法,用于检测重组人源化抗TNF-α单抗WLB303猴重复给药毒性试验血清中产生的中和抗体。方法:对食蟹猴静脉输注WLB303,连续给药4周。采取给药期和恢复期不同时间的血清,随后采用桥式酶联免疫... 目的:建立一种快速、灵敏、高效和易操作的方法,用于检测重组人源化抗TNF-α单抗WLB303猴重复给药毒性试验血清中产生的中和抗体。方法:对食蟹猴静脉输注WLB303,连续给药4周。采取给药期和恢复期不同时间的血清,随后采用桥式酶联免疫吸附法对血清中的抗药抗体进行定性筛选,对筛选为阳性的血清样本进行预处理,然后以WLB303生物学活性测定法为基础的中和反应法对中和抗体进行确证。结果:建立了WLB303中和抗体的确证方法,确定了检测的临界点。确证方法的检出率为100%,在血清中检测到具有中和活性的抗体,中和抗体的中和作用强度总体与给药时间、给药剂量呈正相关。结论:建立的检测方法能够直接体现出剂量差异性和个体差异性,也能反映中和抗体的滴度差别。该方法的特异性、灵敏度和有效性能够满足试验要求,可以用于单抗药物重复给药动物毒性试验血清中和抗体的检测。 展开更多
关键词 桥式酶联免疫吸附法 中和抗体 生物学活性 重复给药毒性试验
中国HIV-1感染者中分离单克隆中和抗体的初步研究
5
作者 鞠斌 李丹 +5 位作者 任莉 郝彦玲 张蕾 王硕 魏民 邵一鸣 《中国病毒病杂志》 CAS 2017年第5期354-359,共6页
目的从中国人类免疫缺陷病毒1型(human immunodeficiency virus-1,HIV-1)感染者中分离单克隆中和抗体,并对其生物活性进行初步鉴定。方法采用抗原特异性单个B细胞分选和单克隆抗体表达技术从感染者中分离单克隆抗体,采用免疫遗传学数... 目的从中国人类免疫缺陷病毒1型(human immunodeficiency virus-1,HIV-1)感染者中分离单克隆中和抗体,并对其生物活性进行初步鉴定。方法采用抗原特异性单个B细胞分选和单克隆抗体表达技术从感染者中分离单克隆抗体,采用免疫遗传学数据库(immunogenetics database,IMGT)分析抗体的可变区基因,采用酶联免疫吸附实验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测抗体的结合能力,采用TZM-bl/假病毒中和实验检测抗体的中和能力。结果从一个HIV-1CRF07_BC病毒感染者中分离到了两个单克隆抗体(A1和A6);两个抗体的重链来源于不同家系(IGHV5-51*01和IGHV4-59*01),轻链分别利用lambda链和kappa链,可变区基因的突变率较低;两个抗体与CRF01_AE、B亚型和CRF07_BC病毒的结合能力较强,可以中和Tier 1的SF162病毒(B亚型)和MW965病毒(C亚型),不能中和12个Tier 2的病毒(Global Panel)。结论本研究成功分离到了两个具有交叉反应性的单克隆中和抗体,丰富了HIV-1中和抗体的研究,也为艾滋病的抗原检测和治疗等应用领域提供备选的免疫制剂。 展开更多
关键词 人类免疫缺陷病毒1(HIV-1) 单个B细胞分选 单克隆抗体 中和活性
抗α干扰素双特异性抗体的制备与初步评价 预览
6
作者 陈鸿斌 侯小娟 +6 位作者 袁旭东 于晓妍 徐磊 王双 郁雯科 杜鹏 孙志伟 《生物技术通讯》 CAS 2017年第6期742-749,共8页
目的:研制对α干扰素(IFN-α)中和活性有突破性提升的双特异性抗体。方法:以靶向IFN-α不同表位的中和单抗Amilimumab和Sifalimumab为基础,采用FIT-Ig(Fabs-in-tandem immunoglobulin)双特异性抗体平台技术,通过分子克隆方法构... 目的:研制对α干扰素(IFN-α)中和活性有突破性提升的双特异性抗体。方法:以靶向IFN-α不同表位的中和单抗Amilimumab和Sifalimumab为基础,采用FIT-Ig(Fabs-in-tandem immunoglobulin)双特异性抗体平台技术,通过分子克隆方法构建针对IFN-α的双特异性抗体FIT2的表达载体,并在FreeStyle293-F系统中进行瞬时转染表达;采用proteinA柱亲和纯化目标双特异性抗体,SDS-PAGE初步考察目标抗体的相对分子质量、组分及纯度;采用forteBIO系统鉴定其整体结合活性,并分别确认双特异性抗体的2个抗原结合表位的活性;通过ELISA方法评价其特异性,37℃放置实验鉴定其稳定性,Daudi细胞增殖实验定量评价双特异性抗体的中和活性。结果:构建了双特异性抗体FIT2表达载体,在FreeStyle293-F系统中实现了瞬转高效表达,表达量为127mg/L,亲和纯化获得目标双特异性抗体FIT2,纯度可达98.5%;FIT2结构稳定,具有良好的特异性,未发现与其他类型的干扰素及细胞因子存在交叉反应;FIT2对IFN-α1b-His的结合活性显著优于2个亲本抗体,特别是解离过程的改善尤为明显;同时,FIT2有效保留了2个抗原结合表位的活性;细胞增殖实验结果显示,FIT2对IFN-α1b具有优越的中和活性,其中和效能显著高于任一亲本抗体,明显优于2个亲本抗体联用。结论:获得了对IFN-α1b中和活性有突破性提升的双特异性抗体FIT2,特异性良好且结构稳定,有望成为治疗IFN-α相关疾病的良好的成药候选分子。 展开更多
关键词 双特异性抗体 FIT-Ig Α干扰素 抗原结合表位 中和活性
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从人类免疫缺陷病毒1型感染者中筛选中和抗体的研究
7
作者 刘雪 王琬玓 +3 位作者 冯霞 徐柯 余双庆 曾毅 《中国病毒病杂志》 CAS 2016年第2期99-104,共6页
目的利用B细胞培养和RT-PCR技术从我国人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)感染者中筛选出具有广谱中和活性的人单克隆抗体。方法本研究采集HIV-1感染者抗凝全血,分离出外周血单个核细胞,用磁珠分选纯化记忆性B细胞,在体外选择3T3-hCD40L作为... 目的利用B细胞培养和RT-PCR技术从我国人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)感染者中筛选出具有广谱中和活性的人单克隆抗体。方法本研究采集HIV-1感染者抗凝全血,分离出外周血单个核细胞,用磁珠分选纯化记忆性B细胞,在体外选择3T3-hCD40L作为饲养细胞,并使用细胞因子白细胞介素(IL)-2和IL-21诱导记忆性B细胞分泌IgG,用HIV假病毒微量中和的方法进行筛选。从有中和活性的孔中分别扩增出B细胞IgG的轻链和重链基因,并将其克隆到含IgG恒定区基因的载体上。然后将携带重链和轻链基因的质粒进行大量表达,得到人单克隆抗体,并进行抗体结合活性、中和活性及与抗原Gp120亲和力的鉴定。结果从我国3例HIV-1感染者记忆性B细胞中筛选出3株对HIV-1Env抗原有结合活性的单克隆抗体。其中8E7和55B3主要与Gp120结合,19GF3与Gp120和FLSC均可结合且结合活性无明显差异;基因变异大的8E7抗体对A、B、C三种亚型的假病毒均有一定的中和活性,55B3对SF162有中和活性,19GF3未检测到中和活性;这三种单抗的亲和力都很强,8E7、19GF3、55B3与抗原Gp120的KD值分别为6.45×10^(-10) mol/L、1.12×10^(-10) mol/L、2.76×10^(-10) mol/L。结论成功建立了在96孔板中高效刺激人B细胞在体外分泌IgG的方法,并利用HIV假病毒微量中和实验和RT-PCR技术筛选得到对HIV-1具有中和活性的人单克隆抗体。 展开更多
关键词 人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1) 单克隆抗体 结合活性 中和活性
人源特异性抗狂犬病毒二价Fab094-DDD抗体的制备及鉴定
8
作者 耿以如 熊四平 +7 位作者 唐奇 张晓 陈雅 徐亚如 周荧 仇镇宁 冯振卿 朱进 《南京医科大学学报:自然科学版》 CAS CSCD 北大核心 2016年第6期693-699,共7页
目的 :利用蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)调节亚基(R亚基)的二聚体化功能结构域(DDD)的二聚化功能,制备具有中和活性的人源特异性抗狂犬病毒二价抗体。方法:优化合成linker-C-DDD序列,设计引物扩增抗狂犬病毒抗体Fab094的Fd... 目的 :利用蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)调节亚基(R亚基)的二聚体化功能结构域(DDD)的二聚化功能,制备具有中和活性的人源特异性抗狂犬病毒二价抗体。方法:优化合成linker-C-DDD序列,设计引物扩增抗狂犬病毒抗体Fab094的Fd段和轻链可变区序列(Vκ),通过overlap PCR将Fab094的Fd段和linker-C-DDD基因重组为Fd-DDD,将其和Vκ分别克隆到真核表达载体中,共转染293Free style细胞,表达纯化该抗体。应用SDS-PAGE、Western blot、ELISA、免疫共沉淀、亲和力测定及免疫荧光试验检测该抗体的免疫学特性,用荧光抗体病毒中和试验检测其中和活性。结果:成功构建了全人源抗狂犬病毒二价抗体Fab094-DDD的真核表达载体,获得的二价Fab094-DDD抗体与抗原保持着较好的亲和力,能特异性结合狂犬病毒,中和效价为213.2 U/mg。结论:成功制备了抗狂犬病毒二价Fab094-DDD抗体,具有较高的中和活性,为进一步研发狂犬病治疗性抗体药物奠定了基础,对于其他疾病双表位人源特异性抗体的制备也具有借鉴作用。 展开更多
关键词 狂犬病毒 二价抗体 中和活性 双表位抗体
1型鸭甲肝病毒VP3蛋白的抗血清中和活性分析及B细胞表位鉴定 预览
9
作者 沈友林 汪铭书 +8 位作者 程安春 贾仁勇 朱德康 陈舜 刘马峰 刘菲 杨乔 孙昆峰 陈孝跃 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第1期141-148,共8页
旨在探究1型鸭甲肝病毒(DHAV-1)VP3蛋白抗血清的中和活性并鉴定VP3的线性B细胞表位。利用pGEX-4T-1表达载体,在BL21(DE3)宿主菌中原核表达DHAV-1 VP3基因,以切胶纯化出的蛋白质为抗原免疫兔制备多克隆抗体,通过鸡胚中和试验对多抗... 旨在探究1型鸭甲肝病毒(DHAV-1)VP3蛋白抗血清的中和活性并鉴定VP3的线性B细胞表位。利用pGEX-4T-1表达载体,在BL21(DE3)宿主菌中原核表达DHAV-1 VP3基因,以切胶纯化出的蛋白质为抗原免疫兔制备多克隆抗体,通过鸡胚中和试验对多抗的中和效价进行检测;采用Karplus&Schulz、Emini、Jameson-Wolf和Parker方法分别对柔韧性、表面可及性、抗原性及亲水性进行分析,得到了4条候选线性B细胞表位,以制备的兔抗VP3多克隆抗体为一抗,通过间接ELISA方法对人工合成的B细胞表位进行鉴定,并进一步用临床鸭血清样品对鉴定的B细胞表位的抗体检测能力进行评估。结果显示,VP3在BL21(DE3)中以包涵体形式表达,大小约54ku,Western blot分析表明重组蛋白质具有较好的反应原性。制备的兔抗VP3多克隆抗体的琼扩效价达到1∶16,并能中和DHAV-1,中和效价为1∶39;利用间接ELISA鉴定出GKRKPCRRPIHKPKNPPQEP(1—20aa)、FNTGRYQMSWYPIADGEQSL(131—150aa)和VNSSAPSNID(200—209aa)为VP3的B细胞表位,抗体检测能力试验结果显示表位肽可检测临床DHAV-1鸭血清。本研究表明DHAV-1VP3的抗血清具备一定的中和活性,1—20aa、131—150aa和200—209aa为VP3的B细胞表位且具有临床应用前景。 展开更多
关键词 1型鸭甲肝病毒 VP3蛋白 多克隆抗体 中和活性 B细胞表位
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具有中和活性的抗狂犬病病毒单克隆抗体的制备及初步应用
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作者 曹守春 王云鹏 +4 位作者 李加 石磊泰 吴小红 唐建蓉 李玉华 《中华微生物学和免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2016年第10期762-765,共4页
目的:制备具有中和活性的抗狂犬病病毒的单克隆抗体。方法取灭活的狂犬病病毒CTN株免疫BALB/c小鼠,免疫方式采用0 d、7 d、14 d、28 d。之后取小鼠的脾细胞与SP2/0细胞融合,获得杂交瘤细胞系,通过快速荧光抑制灶试验检测具有中和活性... 目的:制备具有中和活性的抗狂犬病病毒的单克隆抗体。方法取灭活的狂犬病病毒CTN株免疫BALB/c小鼠,免疫方式采用0 d、7 d、14 d、28 d。之后取小鼠的脾细胞与SP2/0细胞融合,获得杂交瘤细胞系,通过快速荧光抑制灶试验检测具有中和活性的阳性杂交瘤细胞系。取阳性杂交瘤细胞系腹腔注射BALB/c小鼠,采集腹水,通过亲和层析纯化获得具有中和活性的抗狂犬病病毒单克隆抗体,进行抗体亚型鉴别和单克隆抗体可变区序列测序。最后,获得单克隆抗体后进行胶体金快速检测试纸条的建立。结果获得1株具有中和狂犬病病毒活性、稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞系,标记为CTN-McAb1,收获小鼠腹水,并经纯化后获得具有中和活性的抗狂犬病病毒单克隆抗体,纯度可达95%以上,抗体为IgG1亚型。成功制备人用狂犬病疫苗有效抗原检测胶体金试纸条。结论成功制备了1株具有中和狂犬病病毒活性的单克隆抗体并进行初步应用,这对人用狂犬病疫苗的质量控制具有较强的应用价值。 展开更多
关键词 狂犬病病毒 单克隆抗体 中和活性
应用小鼠肝坏死模型分析重组全人源抗肿瘤坏死因子-α单克隆抗体的体内中和活性
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作者 张雅婷 潘勇兵 +5 位作者 张银川 张坤明 任彬 宋桂芝 桂芳 闭兰 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2015年第10期1048-1052,共5页
目的建立小鼠肝坏死模型,分析重组全人源抗肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)单克隆抗体的体内中和活性。方法确定D-半乳糖胺(D-galactosamine,D-Gal N)的致敏时间及TNF-α对C57BL/6小鼠的致死剂量;采用D-Gal N致... 目的建立小鼠肝坏死模型,分析重组全人源抗肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)单克隆抗体的体内中和活性。方法确定D-半乳糖胺(D-galactosamine,D-Gal N)的致敏时间及TNF-α对C57BL/6小鼠的致死剂量;采用D-Gal N致敏小鼠,经腹腔注射TNF-α建立小鼠肝坏死模型,并测定3批供试品(抗TNF-α单抗)和3批阳性对照(阿达木单克隆抗体注射液)的体内中和活性,采用Probit回归拟合对活性测定结果进行分析。结果确定DGal N的致敏时间为10 min;TNF-α的致死剂量为100μg/kg体重;Probit回归拟合分析显示,拟合度较好,3批供试品对C57BL/6小鼠的半数有效剂量(ED50)分别为0.505、0.434和0.609 mg/kg,3批阳性对照对C57BL/6小鼠的ED50分别为0.455、0.571和0.484 mg/kg,供试品与阳性对照对C57BL/6小鼠的体内中和活性差异无统计学意义(P〉0.05)。结论联合应用D-Gal N和TNF-α可造成小鼠肝坏死,从而导致小鼠死亡,抗TNF-α单抗可阻断其效应。抗TNF-α单抗对TNF-α的抑制作用呈剂量-效应关系。 展开更多
关键词 肿瘤坏死因子-Α 单克隆抗体 中和活性
HIV-1特异性单抗2G12单价抗体的构建及活性分析
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作者 冯一帆 刘雪 +3 位作者 徐柯 冯霞 曾毅 余双庆 《中国病毒病杂志》 2015年第3期171-175,共5页
目的构建单价抗体并与IgG比较结合活性及中和活性的差异。方法对IgG1抗体重链恒定区基因进行改造,分别构建N端截短型的IgG1重链恒定区基因IgG1-tH和去除绞链区二硫键及CH2、CH3区的稳定非共价键的2G12重链基因2G12-HM。将IgG1-tH与2G12... 目的构建单价抗体并与IgG比较结合活性及中和活性的差异。方法对IgG1抗体重链恒定区基因进行改造,分别构建N端截短型的IgG1重链恒定区基因IgG1-tH和去除绞链区二硫键及CH2、CH3区的稳定非共价键的2G12重链基因2G12-HM。将IgG1-tH与2G12抗体重链和轻链基因表达质粒共转染293T细胞,表达含有完整Fc的单价抗体;将2G12-HM和轻链基因表达质粒共转染293T细胞,表达半分子型的单价抗体。通过非还原SDS-PAGE对表达抗体的大小进行鉴定,并用ELISA和微量中和实验比较原型2G12抗体和单价抗体的结合活性及中和活性。结果以HIV-1中和抗体2G12为模型通过基因改造成功表达了两种单价抗体,一种为完整的重链、轻链以及N端截短型的重链分子组成的包含1个Fab和1个Fc的单价抗体2G12-tH;另一种为1条重链和1条轻链组成的半分子型单价抗体2G12-HM。两种抗体均可与抗原有效结合,且与IgG分子相比差异无统计学意义。中和实验结果发现IgG抗体能中和的,病毒两种单价抗体也均能中和。结论成功构建了两种单价抗体,与IgG相比其结合活性和中和活性无明显变化。 展开更多
关键词 人类免疫缺陷病毒 单价抗体 中和活性
抗鸡传染性法氏囊病病毒抗体Fab的表达及其中和活性的测定 预览
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作者 张瑛杰 尹杰超 +5 位作者 李天鹤 周兵 徐鹏飞 荆燕 任桂萍 李德山 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第11期866-870,共5页
为表达抗鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)抗体Fab并检测其中和活性,本研究将抗IBDV抗体的轻链(L)和重链片段(Fd)基因分别克隆于pET-27b(+)载体中,并转化于大肠杆菌Rosetta(DE3)进行诱导表达。将L和Fd片段包涵体蛋白变性后等量... 为表达抗鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)抗体Fab并检测其中和活性,本研究将抗IBDV抗体的轻链(L)和重链片段(Fd)基因分别克隆于pET-27b(+)载体中,并转化于大肠杆菌Rosetta(DE3)进行诱导表达。将L和Fd片段包涵体蛋白变性后等量混合于复性液中,制备Fab并对其进行活性鉴定。结果显示L和Fd蛋白相对分子质量大小分别为25ku和28ku。Westemblot和ELISA检测结果表明,获得的抗体Fab大小约为50ku,并且与VP2蛋白和不同病毒株均具有特异性结合能力。体外中和试验结果表明,获得的IBDV抗体Fab具有中和活性,可以有效阻断IBDV(B87株)对鸡胚成纤维细胞(DF1)的感染。本实验获得的IBDV抗体Fab有望成为治疗IBD的候选生物制剂,为研制治疗IBD抗体制剂奠定了基础。 展开更多
关键词 鸡传染性法氏囊病病毒 FAB抗体 共复性 中和活性 治疗性抗体
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7型腺病毒中和多肽的筛选及其活性研究
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作者 许元生 田新贵 +2 位作者 刘铭龙 李晨阳 周荣 《免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2014年第6期560-561,565共3页
目的筛选7型腺病毒的结合多肽,并研究其对7型腺病毒的结合和中和活性。方法利用噬菌体肽库,筛选7型腺病毒的结合多肽,非竞争ELISA法测亲和常数测定与7型腺病毒的亲和常数,微量中和试验测定对7型腺病毒的中和活性。结果筛选到了GTS0... 目的筛选7型腺病毒的结合多肽,并研究其对7型腺病毒的结合和中和活性。方法利用噬菌体肽库,筛选7型腺病毒的结合多肽,非竞争ELISA法测亲和常数测定与7型腺病毒的亲和常数,微量中和试验测定对7型腺病毒的中和活性。结果筛选到了GTS09多肽,其与噬菌体的复合物(GTS09-phage)能特异的结合7型腺病毒,并且能够高效的中和7型腺病毒,GTS09与BSA的复合物也有中和作用,但GTS09本身却没有中和活性。结论大分子蛋白可能会改变GTS09的空间构象,从而使其具有中和7型腺病毒的能力。 展开更多
关键词 7型腺病毒 噬菌体肽库 中和活性
猪圆环病毒2型Cap蛋白单克隆抗体的制备与应用 被引量:3
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作者 翟淑燕 陈兴慧 +2 位作者 白娟 王先炜 姜平 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2014年第10期1022-1028,共7页
利用纯化的猪圆环病毒2型(PCV2)免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤细胞技术,筛选获得3株能稳定分泌抗PCV2蛋白抗体的杂交瘤细胞株,分别被命名为3E5、3E6和5A6。经ELISA测定,它们的培养上清的效价分别为1∶12 800、1∶1 600和1∶6 400,腹水效价... 利用纯化的猪圆环病毒2型(PCV2)免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤细胞技术,筛选获得3株能稳定分泌抗PCV2蛋白抗体的杂交瘤细胞株,分别被命名为3E5、3E6和5A6。经ELISA测定,它们的培养上清的效价分别为1∶12 800、1∶1 600和1∶6 400,腹水效价分别为1∶6 400 000、1∶640 000和1∶800 000;亚类鉴定结果显示,3株单克隆抗体为IgG2a亚类,轻链为κ型;Western-blot结果显示,3株单克隆抗体均能与PCV2Cap蛋白发生特异性反应;间接免疫荧光试验(IFA)结果显示,3株单克隆抗体均能与感染PCV2的PK-15细胞产生特异性荧光反应;病毒中和试验显示,3E5和3E6具有中和活性。利用单克隆抗体3E5建立了检测PCV2抗原的夹心ELISA;它可被用于检测经β-丙内酯灭活的PCV2和杆状病毒表达系统表达的PCV2Cap蛋白。上述研究成果为PCV2感染的诊断和PCV2蛋白功能的研究提供了重要工具和手段。 展开更多
关键词 猪圆环病毒2型 CAP蛋白 中和活性 单克隆抗体 夹心ELISA
抗鸡传染性法氏囊病病毒单链抗体库的构建及其中和抗体的筛选 预览 被引量:3
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作者 周兵 李天鹤 +10 位作者 李宁 徐黎明 郭茉 马蕾 张瑛杰 叶贤龙 赵景壮 衣春霖 韩晓辉 丁良君 李德山 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第3期227-231,共5页
为构建抗鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)的细菌展示单链抗体(scFv)库并筛选出具有高亲和力和中和活性的scFv。本研究从IBDV免疫鸡的法氏囊提取总RNA,采用RT-PCR的方法分别扩增鸡抗体的VH和VL编码序列,插入含有(Gly4Ser)3 linker的p... 为构建抗鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)的细菌展示单链抗体(scFv)库并筛选出具有高亲和力和中和活性的scFv。本研究从IBDV免疫鸡的法氏囊提取总RNA,采用RT-PCR的方法分别扩增鸡抗体的VH和VL编码序列,插入含有(Gly4Ser)3 linker的pTlinker载体中,再将VH-linker-VL片段亚克隆到细菌展示载体pBSD中。以FITC标记的VP2 蛋白为诱饵,通过流式细胞术筛选出5株阳性scFv,其氨基酸同源性为82.16 %~87.27 %。将5株scFv基因分别插入原核表达载体pET-27b(+)中,构建重组表达质粒pET-IBDV-scFv。将其转化大肠杆菌Rosetta进行诱导和表达,该5株scFv相对分子质量均约为28 ku。此外,利用纯化的scFv包被于ELISA检测板中作为扑捉抗体,检测结果显示scFv对VP2蛋白和不同IBDV株均具有特异性结合能力。而且通过体外中和试验结果表明,仅有一株scFv具有病毒中和活性,可以有效阻断IBDV(B87 株)对鸡胚成纤维细胞(DF1)的感染。该研究结果为进一步研制IBDV治疗性抗体奠定了基础。 展开更多
关键词 IBDV 细菌展示 单链抗体 中和活性
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猪流行性腹泻病毒COE基因在毕赤酵母中的表达及生物活性分析 预览 被引量:2
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作者 胡青松 李吕木 +4 位作者 张小飞 许发芝 丁小玲 徐延伟 丁维民 《畜牧兽医学报》 CSCD 北大核心 2014年第8期1342-1347,共6页
旨在利用毕赤酵母表达系统表达猪流行性腹泻病毒(PEDV)COE蛋白,及研究COE蛋白免疫小鼠后产生抗体的中和病毒的能力。根据PEDV S糖蛋白基因设计引物,取患猪流行性腹泻病(PED)的仔猪肠道组织,抽提PEDV的总mRNA,进行RT-PCR扩增,获得PED... 旨在利用毕赤酵母表达系统表达猪流行性腹泻病毒(PEDV)COE蛋白,及研究COE蛋白免疫小鼠后产生抗体的中和病毒的能力。根据PEDV S糖蛋白基因设计引物,取患猪流行性腹泻病(PED)的仔猪肠道组织,抽提PEDV的总mRNA,进行RT-PCR扩增,获得PEDV部分保护性抗原基因(COE基因)片段。进一步将COE基因导入毕赤酵母表达载体,构建毕赤酵母表达质粒pPIC9K—COE重组质粒,并电转化入酵母感受态细胞GS1 15中,筛选高拷贝阳性重组菌进行诱导表达。利用SDS-PAGE和Western blot分析重组蛋白及其免疫原性,病毒中和试验评价重组蛋白免疫小鼠后血清抗体的病毒中和能力。RT-PCR扩增获得大小为530 bp的PEDV COE基因,该基因在毕赤酵母表达载体中能够正确表达,SDS—PAGE结果显示毕赤酵母表达的COE蛋白大小在27 ku左右,分泌表达量约30 mg·L<sup>-1</sup>。Western blot表明PEDV COE重组蛋白具有反应原性。中和试验结果表明,PEDV COE重组蛋白免疫小鼠后血清中特异性抗体具有中和活性,中和效价为1:36,而对照则小于1:2。PEDV COE基因可在毕赤酵母中获得分泌表达,且表达的蛋白具有很好的生物学活性。 展开更多
关键词 猪流行性腹泻病毒 COE基因 毕赤酵母表达 中和活性
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具备中和中东呼吸综合征冠状病毒活性的单克隆抗体的制备 预览
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作者 于虹 邱洪杰 +7 位作者 潘婷 李琳 唐健 郭彦 孙世惠 寇志华 赵光宇 周育森 《解放军预防医学杂志》 CAS 2014年第5期388-390,共3页
目的制备并鉴定对中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)具有中和活性的单克隆抗体,为进一步开展MERS-CoV感染与免疫保护机制研究,以及发展诊断与治疗手段奠定基础。方法 MERS-CoV S蛋白受体结合区与人IgG Fc片段融合表达的重组蛋白免疫BA... 目的制备并鉴定对中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)具有中和活性的单克隆抗体,为进一步开展MERS-CoV感染与免疫保护机制研究,以及发展诊断与治疗手段奠定基础。方法 MERS-CoV S蛋白受体结合区与人IgG Fc片段融合表达的重组蛋白免疫BALB/c小鼠,将免疫后小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,通过ELISA筛选出阳性克隆,随后通过多次亚克隆筛选出稳定分泌特异性抗体的杂交瘤细胞株,制备单抗腹水并进行抗体效价测定及亚类鉴定;通过MERS-CoV假病毒及活病毒中和试验筛选出中和单抗。结果获得了10株能够稳定分泌抗原特异性单抗的杂交瘤细胞株。制备的腹水单抗亚类均为IgG1;其中7株单抗抗体ELISA效价达到10 000以上,并有1株单抗对MERS-CoV具有良好的中和活性。结论本研究获得了1株对MERSCoV具有良好中和活性的单克隆抗体。 展开更多
关键词 中东呼吸综合征冠状病毒 单克隆抗体 中和活性 受体结合区
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登革病毒2型prM蛋白的表达及其抗体的ADE作用研究 被引量:2
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作者 冯俊杰 罗雅艳 +4 位作者 周俊梅 方丹云 曾谷城 晏辉钧 江丽芳 《热带医学杂志》 CAS 2013年第4期377-381,411共6页
目的建立登革病毒2型(DENV-2)前膜蛋白(prM)的原核稳定表达系统,并制备prM多克隆抗体,研究登革病毒特异性prM抗体的中和作用及抗体依赖性感染增强作用(ADE)。方法应用大肠杆菌表达系统表达全长DENV-2prM蛋白,经电洗脱法纯化重... 目的建立登革病毒2型(DENV-2)前膜蛋白(prM)的原核稳定表达系统,并制备prM多克隆抗体,研究登革病毒特异性prM抗体的中和作用及抗体依赖性感染增强作用(ADE)。方法应用大肠杆菌表达系统表达全长DENV-2prM蛋白,经电洗脱法纯化重组蛋白,免疫家兔,制备兔抗prM蛋白多抗;应用空斑减数中和试验(PRNT)和流式细胞术(FCM)分别检测prM兔多克隆抗体的中和作用和ADE效应。结果重组prM蛋白在原核系统可获得高效表达,prM蛋白的表达量占大肠杆菌全菌蛋白的15%左右;其免疫血清经Westernblotting法证实为登革病毒特异性prM多克隆抗体,用ELISA法检测效价为1:800000。PRNT表明,prM抗体对成熟和不成熟DENV.2感染C6/36细胞中和作用有限,最大中和程度分别为49.84%和50.22%;FCM结果表明,prM抗体能在较大的抗体稀释度范围(10-2~10-6)增强成熟和不成熟DENV-2感染,且在10。稀释度时达到最高峰。结论重组DENV-2prM蛋白有很强的免疫原性.其诱生的prM抗体对登革病毒仅有较弱的中和活性,但却呈现出较强的ADE作用,揭示prM抗体是一种感染增强性抗体。 展开更多
关键词 登革病毒2型 prM蛋白 prM多克隆抗体 中和作用 抗体依赖性感染增强作用(ADE)
全人源抗狂犬病病毒G蛋白单链抗体制备及中和活性鉴定 被引量:4
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作者 张倩倩 赵茜 +7 位作者 张晓 丁贵鹏 金秋 高畅 熊四平 陈玉平 朱进 冯振卿 《南京医科大学学报:自然科学版》 CAS CSCD 北大核心 2013年第7期927-931,共5页
目的:构建全人源抗狂犬病病毒scFv噬菌体抗体库,筛选针对狂犬病病毒G蛋白不同表位的单链抗体(scFv)并鉴定其中和活性。方法:分离130例经狂犬病疫苗免疫接种志愿者的外周血淋巴细胞,提取总RNA,逆转录制备cDNA,构建全人源抗狂犬病病毒... 目的:构建全人源抗狂犬病病毒scFv噬菌体抗体库,筛选针对狂犬病病毒G蛋白不同表位的单链抗体(scFv)并鉴定其中和活性。方法:分离130例经狂犬病疫苗免疫接种志愿者的外周血淋巴细胞,提取总RNA,逆转录制备cDNA,构建全人源抗狂犬病病毒scFv噬菌体抗体库。以纯化的狂犬病病毒G蛋白包板筛选,对阳性克隆进行可溶性表达,并鉴定中和活性。结果:构建全人源抗狂犬病病毒scFv噬菌体抗体库,库容为5.0×107,经核酸序列分析,证实插入片段为scFv。经过5轮筛选,从富集的次级抗体库中随机挑出140个克隆,通过phage-ELISA鉴定得到4株核酸序列不同的scFv抗体。经His-Trap纯化后进行中和活性鉴定,获得1株有中和活性的scFv,其中和效价为0.13 IU/mg。结论:构建全人源抗狂犬病病毒scFv噬菌体抗体库,获得1株具有中和活性的抗狂犬病病毒G蛋白scFv抗体,为进一步研发狂犬病治疗性抗体药物奠定了基础。 展开更多
关键词 狂犬病病毒G蛋白 噬菌体抗体库 单链抗体(scFv) 中和活性
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