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高致病性H7N9流感病毒荧光RT-PCR检测方法的建立
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作者 陈轩 黄海超 +5 位作者 杨素 邵建宏 沙才华 赵福振 罗宝正 廖秀云 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2020年第2期147-151,共5页
2017年初在中国出现的H7N9流感病毒变异株表现出对禽高致病性的特征,根据高致病性H7N9流感病毒(HP-H7N9)的HA基因序列,设计1组HP-H7N9特异性的引物和探针,在对反应体系进行优化的基础上,建立了HP-H7N9的荧光RT-PCR检测方法并进行了特异... 2017年初在中国出现的H7N9流感病毒变异株表现出对禽高致病性的特征,根据高致病性H7N9流感病毒(HP-H7N9)的HA基因序列,设计1组HP-H7N9特异性的引物和探针,在对反应体系进行优化的基础上,建立了HP-H7N9的荧光RT-PCR检测方法并进行了特异性、敏感性和重复性试验,制作了标准曲线。结果显示,本方法只对HP-H7N9特异性扩增,而对低致病性H7N9病毒(LP-H7N9)、H7N3流感病毒(H7N3)、H3N2流感病毒(H3N2)、H5N1禽流感病毒(H5N1)、H9亚型禽流感病毒(H9)、新城疫病毒(NDV)、甲型H1N1流感病毒(H1N1)、传染性法氏囊病病毒(IBDV)、鸡传染性支气管炎病毒(IBV)等病原未见扩增。该方法最低能够检测到35.45 copies的阳性质粒,具有良好的检测灵敏度。本方法的建立将为HP-H7N9的诊断、监测和防控提供快速、特异、敏感的技术手段。 展开更多
关键词 高致病性 H7N9 流感病毒 荧光RT-PCR 检测方法
新城疫病毒实时荧光RT-PCR检测方法的建立与应用 预览
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作者 王素春 孙亚伟 +6 位作者 樊擎莹 黄保续 康京丽 汪洋 刘华雷 张云香 王楷宬 《中国动物检疫》 CAS 2020年第1期74-78,共5页
为满足新城疫病毒高通量快速检测的需要,针对新城疫病毒M基因序列,通过基因比对分析保守区域,经同源性分析后,设计合成多条引物和探针并对其筛选,建立了一种能够快速检测新城疫病毒的实时荧光RTPCR检测方法,并对该方法的特异性、灵敏性... 为满足新城疫病毒高通量快速检测的需要,针对新城疫病毒M基因序列,通过基因比对分析保守区域,经同源性分析后,设计合成多条引物和探针并对其筛选,建立了一种能够快速检测新城疫病毒的实时荧光RTPCR检测方法,并对该方法的特异性、灵敏性进行了评估。结果显示,该方法检测耗时短、特异性好,检测下限达10-4 ng/μL。利用该方法,对480份临床采集的各类家禽咽拭子样品进行检测,共检测出25份阳性,与常规RT-PCR检测方法结果一致,κ值为1(P<0.001)。结果表明,该方法快速、准确,可用于新城疫病毒的快速检测。 展开更多
关键词 新城疫病毒 M基因 实时荧光RT-PCR 检测方法 建立与应用
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基于DPO引物检测猪传染性胃肠炎病毒real-time RT-PCR方法的建立及应用
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作者 王以欣 王紫微 +7 位作者 王丽 姜艳平 崔文 周晗 乔薪瑗 唐丽杰 李一经 徐义刚 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第8期1441-1447,1452共8页
为建立快速、特异性检测猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)的方法,以TGEV的N基因为靶基因,利用双启动寡核苷酸引物(dual priming oligonucleotide,DPO),建立了检测TGEV的real-time RT-PCR方法。结果显示,与常规引物相比,DPO引物的特异性强,有3... 为建立快速、特异性检测猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)的方法,以TGEV的N基因为靶基因,利用双启动寡核苷酸引物(dual priming oligonucleotide,DPO),建立了检测TGEV的real-time RT-PCR方法。结果显示,与常规引物相比,DPO引物的特异性强,有3个以上碱基与模板发生错配,将导致扩增效率极大降低或终止扩增反应,同时DPO引物有效退火温度范围较宽,在40~65℃均能高效地扩增靶基因,不需要对退火温度进行优化。本研究建立的方法灵敏度高,对TGEV核酸的最低检测限可达1.52×10~1 copies/μL,同时利用该方法对10种病毒株进行检测,仅TGEV为阳性,显示了良好的检测特异性。该方法的检测重复性好,以质粒标准品为模板的组内、组间重复性检测结果的变异系数均小于1.00%。利用建立的方法对采集的213份仔猪腹泻临床样品进行检测,共检出TGEV阳性样本31份,阳性率为14.55%,与常规RT-PCR方法检测结果的符合率为93.55%,与基于N基因测序结果的符合率为100.00%。本研究基于DPO引物建立的检测TGEV的real-time RT-PCR方法,为TGEV的准确检测和流行病学调查提供技术支持。 展开更多
关键词 猪传染性胃肠炎病毒 N基因 DPO引物 REAL-TIME RT-PCR
双扩增法和real-time RT-PCR法检测手足口病的比较
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作者 马静 马蓓蓓 +2 位作者 李清元 周攀 黄英 《中国卫生检验杂志》 CAS 2019年第16期1948-1949,1952共3页
目的开展双扩增法和real-time RT-PCR法检测手足口病的比较性研究,为基层实验室建立手足口病科学快速检测方法提供依据。方法对2016年-2017年宜昌市9县市区采集的205份手足口病患者的咽拭子样本,同时采用双扩增法和real-time RT-PCR法... 目的开展双扩增法和real-time RT-PCR法检测手足口病的比较性研究,为基层实验室建立手足口病科学快速检测方法提供依据。方法对2016年-2017年宜昌市9县市区采集的205份手足口病患者的咽拭子样本,同时采用双扩增法和real-time RT-PCR法检测手足口病通用病毒、CoxA16、EV71,比较2种方法检测结果的差异,对2种方法检测结果相异的标本进行测序。结果双扩增法同real-time RT-PCR法检测结果比较,阳性标本数差异无统计学意义(x^2=0.743,P>0.05);且2种方法与测序方法结果比较,符合数差异无统计学意义(x^2=3.32,P>0.05)。结论双扩增法适合基层实验室推广使用。 展开更多
关键词 手足口病 双扩增法 real-time RT-PCR 人肠道病毒71型 柯萨奇病毒A组16型
美国进口大豆中菜豆荚斑驳病毒和玉米褪绿斑驳病毒的检疫鉴定
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作者 柳吉芹 王立杉 +3 位作者 吴曦 钱云开 高飞 王海洋 《植物检疫》 北大核心 2019年第3期13-17,共5页
菜豆荚斑驳病毒(Bean pod mottle virus,BPMV)和玉米褪绿斑驳病毒(Maize chlorotic mottle virus,MCMV)是我国进境植物检疫性有害生物。2018年6月秦皇岛海关通过反转录PCR(RT-PCR)和双抗体夹心酶联免疫吸附(DAS-ELISA)方法,从一批美国... 菜豆荚斑驳病毒(Bean pod mottle virus,BPMV)和玉米褪绿斑驳病毒(Maize chlorotic mottle virus,MCMV)是我国进境植物检疫性有害生物。2018年6月秦皇岛海关通过反转录PCR(RT-PCR)和双抗体夹心酶联免疫吸附(DAS-ELISA)方法,从一批美国进口大豆以及杂质中检出BPMV和MCMV;同时利用实时荧光PCR(Real time RT-PCR)和序列比对分析方法进行验证。这是河北口岸首次在进境大豆中截获BPMV和MCMV。 展开更多
关键词 菜豆荚斑驳病毒 玉米褪绿斑驳病毒 ELISA RT-PCR 实时荧光PCR 序列比对分析 鉴定
一种基于N基因的麻疹病毒实时荧光RT-PCR检测技术 预览
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作者 文奇 付倩 +3 位作者 宋利军 刘琴 周郡 张艳妮 《实验与检验医学》 CAS 2019年第5期813-815,共3页
目的引进一种以检测麻疹病毒N基因为目标的荧光RT-PCR技术并运用到新余市麻疹常规监测工作。方法新荧光RT-PCR与国产的荧光RT-PCR试剂盒、IgM抗体ELISA检测试剂盒分别对新余市2014年所采集麻疹疑似病例咽拭子、血清样本进行检测和结果... 目的引进一种以检测麻疹病毒N基因为目标的荧光RT-PCR技术并运用到新余市麻疹常规监测工作。方法新荧光RT-PCR与国产的荧光RT-PCR试剂盒、IgM抗体ELISA检测试剂盒分别对新余市2014年所采集麻疹疑似病例咽拭子、血清样本进行检测和结果分析。结果新荧光RT-PCR、国产的荧光RT-PCR试剂盒、ELISA试剂盒的检测阳性率分别为25.53%、23.4%、17.02%。与ELISA相比,RT-PCR具有更好的检测灵敏度,且两种荧光RT-PCR之间的总符合率达到97.87%。结论新引进的方法很敏感,适用于麻疹实验室监测以及疑似病例的快速诊断。 展开更多
关键词 麻疹病毒 N基因 实时荧光RT-PCR
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检测纽布病毒的Real-time RT-PCR方法的建立与应用 预览
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作者 郭紫晶 何琪富 +2 位作者 汤承 张斌 岳华 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第4期893-900,共8页
纽布病毒(nebovirus,NeV)是国内新发的犊牛腹泻病原,本试验目的是建立检测NeV的real-timeRT-PCR方法。根据国内NeV流行株的聚合酶基因(RdRp)序列设计引物,通过反应条件和体系优化,成功建立基于TBGreen检测NeV的real-timeRT-PCR方法。结... 纽布病毒(nebovirus,NeV)是国内新发的犊牛腹泻病原,本试验目的是建立检测NeV的real-timeRT-PCR方法。根据国内NeV流行株的聚合酶基因(RdRp)序列设计引物,通过反应条件和体系优化,成功建立基于TBGreen检测NeV的real-timeRT-PCR方法。结果显示:该方法在2.9×10^1~2.9×10^9copies·μL^-1之间呈现良好的线性关系,线性相关系数R2=0.9994,扩增效率为98%;该方法只特异性检出NeV,不检出常见无关病原;最低检测下限为29copies·μL^-1;批内和批间的变异系数分别为0.89%~1.89%和0.83%~1.15%;该方法对临床样本的检出率高于文献报道的三种检测方法(P<0.05)。对2018年8—11月采自新疆和辽宁的135份奶犊牛腹泻样本中NeV的检出率为67.41%,场阳性率为100%(15/15)。所建方法的特异性和稳定性好、灵敏度高,为NeV的检测和流行病学调查提供了有力的手段。 展开更多
关键词 nebovirus 实时荧光定量RT-PCR 犊牛腹泻 检测
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尼帕病毒实时荧光RT-PCR检测方法的建立
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作者 梁洁怡 郑夔 +5 位作者 袁帅 戴俊 孙芳芳 林泽凯 师永霞 李小波 《中国国境卫生检疫杂志》 CAS 2019年第1期9-12,共4页
目的建立快速检测尼帕病毒的实时荧光RT-PCR方法。方法分析尼帕病毒N基因片段核苷酸序列的保守性,设计实时荧光RT-PCR引物和探针,优化引物和探针浓度,利用尼帕病毒DNA质粒作为阳性对照,确定最佳反应体系,并进行灵敏性、重复性、特异性... 目的建立快速检测尼帕病毒的实时荧光RT-PCR方法。方法分析尼帕病毒N基因片段核苷酸序列的保守性,设计实时荧光RT-PCR引物和探针,优化引物和探针浓度,利用尼帕病毒DNA质粒作为阳性对照,确定最佳反应体系,并进行灵敏性、重复性、特异性检测。结果该方法对尼帕病毒DNA的最适线性检测范围为102~108拷贝/μl,检测下限为102拷贝/μl。对2个不同浓度(102、104拷贝/μl)的尼帕病毒DNA进行4次重复检测,具有良好的重复性。与登革病毒、基孔肯雅病毒、黄热病毒、乙脑病毒和汉坦病毒等无交叉反应。结论建立的尼帕病毒实时荧光RT-PCR法能准确、快速地检测尼帕病毒。 展开更多
关键词 尼帕病毒 实时荧光RT-PCR 核蛋白
SYBR Green Ⅰ染料法荧光RT-PCR鉴别乙型两系流感病毒
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作者 徐翮飞 张瑾 +5 位作者 董梅 薛晓宁 杜辉 张娟 朱可 陈晓光 《中国国境卫生检疫杂志》 CAS 2019年第1期13-16,20共5页
目的建立SYBR GreenⅠ染料法荧光RT-PCR快速鉴别乙型流感病毒Yamagate系和Victoria系。方法比对乙型流感病毒Yamagate系和Victoria系的HA基因,设计特异性引物,采用SYBR GreenⅠ染料法荧光RT-PCR扩增两系病毒,进行熔解曲线分析,测定各系... 目的建立SYBR GreenⅠ染料法荧光RT-PCR快速鉴别乙型流感病毒Yamagate系和Victoria系。方法比对乙型流感病毒Yamagate系和Victoria系的HA基因,设计特异性引物,采用SYBR GreenⅠ染料法荧光RT-PCR扩增两系病毒,进行熔解曲线分析,测定各系扩增产物的熔解温度。优化反应体系及条件,进行特异性、灵敏性及重复性评价。结果熔解曲线分析结果显示,乙型流感病毒Yamagate系和Victoria系扩增产物的熔解温度相差较大,Yamagate系为80.40℃,Victoria系为79.04℃。特异性实验表明,该方法能检测乙型流感病毒,与甲型流感病毒、冠状病毒HCoV-229E、HCoV-0C43、HCoV-NL63、HCoV-HKU1等呼吸道病毒没有交叉反应。灵敏性实验表明,该方法对Yamagate系和Victoria系乙型流感病毒最低检测限均为102拷贝/μl。对105份乙型流感病毒阳性鼻咽拭子样本的检测结果与WHO的TaqMan探针法完全一致。结论建立的SYBR GreenⅠ染料法荧光RT-PCR方法可快速检测乙型流感病毒并对两系乙型流感病毒进行鉴别。 展开更多
关键词 乙型流感病毒 实时RT-PCR 熔解曲线
猪捷申病毒SYBR Green Ⅰ实时荧光定量RT-PCR方法的建立
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作者 杨涛涛 张凌倩 +2 位作者 谢明旺 李昕岳 钟婷 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2019年第5期639-643,共5页
为建立一种快速且灵敏的猪捷申病毒(PTV)的检测方法,本研究根据登录于GenBank数据库的所有PTV毒株基因组序列信息,在其5’端非编码区的保守区域设计引物,经过一系列的试验测试和验证建立了能够广泛用于检测PTV的SYBR Green Ⅰ荧光定量RT... 为建立一种快速且灵敏的猪捷申病毒(PTV)的检测方法,本研究根据登录于GenBank数据库的所有PTV毒株基因组序列信息,在其5’端非编码区的保守区域设计引物,经过一系列的试验测试和验证建立了能够广泛用于检测PTV的SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR方法。该方法特异性强,对除PTV外的其他常见猪病毒性病原的DNA或cDNA均无特异性的扩增。此外,该方法的敏感性高、重复性好,灵敏度能达到38.3 copiesμ/L,组内和组间变异系数均不超过2%。对临床样品的检测结果显示,本研究建立的荧光定量RT-PCR方法的PTV检出率为68.18%,远高于普通RT-PCR的PTV检出率(22.73%)。 展开更多
关键词 猪捷申病毒 荧光定量RT-PCR SYBR GreenⅠ
PEDV、TGEV、PDCoV、PRoV多重TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用 预览
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作者 施开创 王睿敏 +4 位作者 黎宗强 谢守玉 尹彦文 陆文俊 屈素洁 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第6期595-600,共6页
为建立鉴别检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)和猪轮状病毒(PRoV)的方法,本研究分别针对PEDVN基因、TGEVM基因、PDCoVM基因和PRoVVP6基因设计特异性引物和TaqMan探针,经过优化反应条件,... 为建立鉴别检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)和猪轮状病毒(PRoV)的方法,本研究分别针对PEDVN基因、TGEVM基因、PDCoVM基因和PRoVVP6基因设计特异性引物和TaqMan探针,经过优化反应条件,建立了同时检测4种病毒的多重TaqMan荧光定量RT-PCR方法。结果显示,该方法仅特异性扩增PEDV、TGEV、PDCoV和PRoV,与猪其它主要病毒无交叉反应,特异性较强;对PEDV、TGEV、PDCoV和PRoV的质粒标准品的最低检出限分别为2.06×10^2拷贝/μL、2.06×10^2拷贝/μL、2.06×10^1拷贝/μL、2.06×10^3拷贝/μL,具有较高敏感性;组内与组间变异系数均小于1.1%,具有良好的重复性。应用该方法和普通多重RT-PCR检测临床采集的243份腹泻病料样品,两者的符合率为96.71%。本研究建立的方法为临床PEDV、TGEV、PDCoV、PRoV的鉴别检测及流行病学调查提供了一种快速、特异、敏感、高效的技术手段。 展开更多
关键词 猪流行性腹泻病毒 猪传染性胃肠炎病毒 猪德尔塔冠状病毒 猪轮状病毒 荧光定量RT-PCR
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2016—2018年我国部分猪群塞尼卡病毒回顾性监测 预览 被引量:2
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作者 张志 张丽丽 +6 位作者 张峰 刘爽 董雅琴 张慧 崔进 吴发兴 李晓成 《中国动物检疫》 CAS 2019年第1期1-6,共6页
塞尼卡病毒(Senecavirus A,SVA)是最近新出现的可引起猪水泡样病变的单股小RNA病毒。为了解SVA的流行状况,采集对2016—2018年从我国辽宁等省份猪群的164份病料和2018年从我国福建等7省份35个屠宰场的458份组织混合样品和95份血清样品,... 塞尼卡病毒(Senecavirus A,SVA)是最近新出现的可引起猪水泡样病变的单股小RNA病毒。为了解SVA的流行状况,采集对2016—2018年从我国辽宁等省份猪群的164份病料和2018年从我国福建等7省份35个屠宰场的458份组织混合样品和95份血清样品,用荧光实时定量RT-PCR方法进行SVA检测和分析。结果显示:在2016年的48份样品中,从3个省份检测出7份阳性样品,阳性率为14.6%。2017年的32份病料中,从5个省份检测出7份阳性样品,占比为21.9%;2018年的84份病料中,从3个省份检测出19份阳性样品,占比为22.6%。屠宰场组织样品中,从6个省份检出55份SVA阳性样品,阳性率为12.0%;血清样品中,从1个省份检出7份阳性样品,阳性率为7.4%。结果表明,我国猪群SVA感染年份至少可追溯到2016年;SVA在我国流行面相对较广,且猪群中存在隐性带毒,因此须重视猪群的SVA监视和监测。 展开更多
关键词 猪塞尼卡病毒 监测 荧光实时定量RT-PCR 流行病学
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猪塞尼卡病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立及初步应用 被引量:2
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作者 刘健新 查云峰 +5 位作者 鲁荣 任旭皎 黎振标 李慧子 张彭涛 宁章勇 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2019年第3期274-279,共6页
本研究根据猪塞尼卡病毒(SVA)VP1基因保守序列设计引物,通过优化反应条件,建立了实时荧光定量RT-PCR检测方法,并对其进行特异性、敏感性和重复性的评价。结果显示,该检测方法特异性好,灵敏度达10 copies/uL,变异系数均小于2.0%,操作简单... 本研究根据猪塞尼卡病毒(SVA)VP1基因保守序列设计引物,通过优化反应条件,建立了实时荧光定量RT-PCR检测方法,并对其进行特异性、敏感性和重复性的评价。结果显示,该检测方法特异性好,灵敏度达10 copies/uL,变异系数均小于2.0%,操作简单,耗时短。利用建立的检测方法对124份临床样本进行检测,结果,阳性率为3.2%。上述结果表明,本研究建立的荧光定量RT-PCR方法可用于猪原发性水泡病临床样品的快速检测和流行病学调查,具有良好的应用前景。 展开更多
关键词 塞尼卡病毒 荧光定量RT-PCR 检测
H5亚型禽流感病毒实时荧光RT-PCR方法的建立与应用 预览
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作者 蒋文明 李阳 +1 位作者 程善菊 刘华雷 《中国动物检疫》 CAS 2019年第3期87-91,共5页
H5亚型禽流感病毒HA序列差异越来越大。为更准确地检测H5亚型禽流感病毒,对GenBank中发表的H5亚型禽流感病毒HA序列以及本实验室保存病毒序列进行比对,同时设计1对引物和1条探针,建立了H5亚型禽流感病毒实时RT-PCR方法,并对该方法的反... H5亚型禽流感病毒HA序列差异越来越大。为更准确地检测H5亚型禽流感病毒,对GenBank中发表的H5亚型禽流感病毒HA序列以及本实验室保存病毒序列进行比对,同时设计1对引物和1条探针,建立了H5亚型禽流感病毒实时RT-PCR方法,并对该方法的反应体系和反应参数进行了优化。以本实验室分离测序确定的30份H5亚型禽流感病毒RNA为模板,将该方法与两种商品化H5亚型禽流感病毒检测试剂盒进行比对,发现该方法与两种商品化试剂盒的检出率分别为100%、98%、98%。敏感性试验显示,该方法可以检测出0.1fg的RNA模板,灵敏度比两种商品化试剂盒均提高了10倍。结果表明,该方法具有更高的特异性和敏感性,可用于H5亚型高致病性禽流感的早期诊断。 展开更多
关键词 H5亚型 禽流感 实时RT-PCR 敏感性 特异性
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鉴别H7N9流感病毒强毒和弱毒实时荧光RT-PCR方法的建立 预览
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作者 蒋文明 李阳 +4 位作者 李金平 袁丽萍 侯广宇 程善菊 刘华雷 《中国动物检疫》 CAS 2019年第4期58-63,共6页
为建立可以区分H7N9流感病毒强毒株和弱毒株的方法,通过比对Gen Bank和GISAID中H7N9流感病毒的HA基因序列以及本实验室保存的病毒序列,设计1对特异性引物和2条探针,建立了区分H7N9流感病毒强弱毒株的实时荧光RT-PCR方法,同时对该方法的... 为建立可以区分H7N9流感病毒强毒株和弱毒株的方法,通过比对Gen Bank和GISAID中H7N9流感病毒的HA基因序列以及本实验室保存的病毒序列,设计1对特异性引物和2条探针,建立了区分H7N9流感病毒强弱毒株的实时荧光RT-PCR方法,同时对该方法的反应体系和反应参数进行优化,并开展特异性和敏感性试验以及临床应用试验。特异性试验显示,该方法具有良好的特异性,对其他常见亚型的禽流感病毒和其他禽病病毒检测均为阴性。敏感性试验显示,该方法对H7N9流感强毒和弱毒HA基因的检测下限分别为0.004 fg和0.1 fg RNA模板,高于两种商品化试剂盒的灵敏度。利用该方法对40株经实验室分离鉴定的H7N9流感病毒进行对比验证,发现检出率和符合率均为100%。结果表明,该方法具有特异、敏感、准确的优点,可用于H7N9流感病毒的快速检测,同时还可区分强弱毒株,对H7N9流感病毒,尤其是高致病性流感病毒的早期诊断和有效防控具有重要意义。 展开更多
关键词 禽流感病毒 H7N9 实时荧光RT-PCR 强毒株 弱毒株
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重庆地区小鼠诺如病毒的感染及其对免疫功能影响的初步研究
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作者 田娜 何丽雯 +3 位作者 曾莉 谭冬梅 韩志刚 谭毅 《重庆医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第12期1635-1641,共7页
目的:建立实时荧光定量RT-PCR检测方法,普查重庆市实验小鼠诺如病毒(murine Norovirus,MNV)的感染情况及其对BABL/c-nu小鼠免疫功能影响的初步研究。方法:(1)根据GenBank中收录的MNV全基因组序列,设计MNV特异性引物,检测其特异性、灵敏... 目的:建立实时荧光定量RT-PCR检测方法,普查重庆市实验小鼠诺如病毒(murine Norovirus,MNV)的感染情况及其对BABL/c-nu小鼠免疫功能影响的初步研究。方法:(1)根据GenBank中收录的MNV全基因组序列,设计MNV特异性引物,检测其特异性、灵敏度、重复性和稳定性,并和两个实验动物质量检测单位对123份小鼠临床样本开展比对检测,以最终构建荧光定量RT-PCR检测方法。(2)应用该方法比较小鼠不同肠道排泄物(盲肠内容物、新鲜粪便和排出体外24 h粪便)中MNV的检出情况。(3)应用该方法普查重庆市实验小鼠感染MNV的情况。(4)6~8周的BABL/c-nu小鼠被随机分为3组(n=3):正常对照组、MNV感染30 d组、MNV感染60 d组,收集各组小鼠血清及肝、肺、脾、结肠,HE染色观察各脏器的病理变化;酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测血清、脾和结肠肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-alpha,TNF-α)及干扰素-γ(interferon gamma,IFN-γ)的含量。结果:(1)建立的荧光定量RT-PCR方法特异性强,与同种属其他病毒均不发生交叉反应,方法的灵敏度、重复性和稳定性良好,与另外两个实验动物质检单位的检测结果吻合度高达98%。(2)新鲜粪便与盲肠内容物中MNV的检出结果完全一致;24 h的陈旧粪便也能准确反映出该笼小鼠MNV的感染情况。(3)重庆市实验小鼠存在较高的MNV感染率,且封闭群和近交系小鼠MNV感染率无品系特异性(68.3%vs.70.6%,χ^2=0.116,P=0.733),但基因修饰小鼠比普通小鼠更易感染MNV(78%vs.64%,χ^2=6.434,P=0.011)。(4)与正常对照组小鼠相比,BABL/c-nu小鼠自然感染MNV后肝、肺、脾和结肠均出现不同程度的炎症细胞浸润和明显的组织病理变化,且结肠组织的TNF-α、IFN-γ水平明显升高(F=21.682,P=0.002;F=77.223,P=0.000)。结论:本研究建立的实时荧光定量PCR方法可靠,且可通过小鼠粪便样本,日常监测MNV的感染情况等;重庆市实验小� 展开更多
关键词 小鼠诺如病毒 实时荧光定量RT-PCR BABL/c-nu小鼠 酶联免疫吸附法 肿瘤坏死因子-α 干扰素-Γ
血清miR-574-5p和miR-10b在乳腺癌中的表达及临床意义 预览
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作者 左华 陈晓军 +1 位作者 周冬 陈嘉健 《河北医药》 CAS 2019年第8期1136-1139,共4页
目的观察血清miR-574-5p和miR-10b在乳腺癌中的表达及其临床意义。方法乳腺癌患者75例为乳腺癌组。选择同期在我院行乳腺纤维腺瘤治疗的患者45例为乳腺纤维腺瘤组,健康体检者20例为对照组。3组血清采用实时荧光RT-PCR的方法检测miR-574... 目的观察血清miR-574-5p和miR-10b在乳腺癌中的表达及其临床意义。方法乳腺癌患者75例为乳腺癌组。选择同期在我院行乳腺纤维腺瘤治疗的患者45例为乳腺纤维腺瘤组,健康体检者20例为对照组。3组血清采用实时荧光RT-PCR的方法检测miR-574-5p和miR-10b。观察乳腺癌患者血清miR-574-5p和miR-10b表达与治疗后,临床指标和相互之间的相关性及诊断乳腺癌的诊断价值。结果乳腺癌组的血清miR-574-5p和miR-10b水平明显高于乳腺纤维腺瘤组和对照组(P<0.01),乳腺纤维腺瘤组明显高于对照组(P<0.01),乳腺癌根治术后血清水平较术前明显降低(P<0.01)。乳腺癌患者血清miR-574-5p和miR-10b表达水平与绝经年龄和肿瘤大小无明显相关性(P>0.05),而与淋巴结转移,ER,PR,HER-2,病理分级,病理分期和脉管癌栓是否具有明显相关性(P<0.01)。乳腺癌患者血清miR-574-5p水平与miR-10b表达水平呈正相关(r=0.762,P<0.01)。联合检测血清miR-574-5p和miR-10b表达在诊断乳腺癌的灵敏度和特异性明显高于单独检测miR-574-5p(Z=2.164,P=0.030)和miR-10b(Z=2.874,P=0.004),而单独检测miR-574-5p与miR-10b表达水平比较,差异无统计学意义(Z=0.328,P=0.978)。结论 miR-574-5p和miR-10b参与了乳腺癌发生发展,对乳腺癌的诊断和预后具有重要的临床价值。 展开更多
关键词 乳腺癌 实时RT-PCR 微小RNA 诊断 预后
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大麦条纹花叶病毒实时荧光RT-PCR检测方法的建立及应用
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作者 王佳莹 徐瑛 +3 位作者 李文 崔俊霞 张吉红 陈先锋 《植物检疫》 北大核心 2019年第1期44-47,共4页
大麦条纹花叶病毒为禾本科作物上一种重要的病原,可造成严重的经济损失。该病毒的主要传播方式为种传,因此对种子进行检疫监管是控制病害传播的一种有效途径。本文依据病毒保守序列RNA2beta C蛋白设计引物,研发了一种实时荧光RT-PCR检... 大麦条纹花叶病毒为禾本科作物上一种重要的病原,可造成严重的经济损失。该病毒的主要传播方式为种传,因此对种子进行检疫监管是控制病害传播的一种有效途径。本文依据病毒保守序列RNA2beta C蛋白设计引物,研发了一种实时荧光RT-PCR检测方法。经特异性与灵敏度评价,仅对大麦条纹花叶病毒有效,无法对小麦线条花叶病毒、甘蔗花叶病毒及玉米褪绿斑驳病毒的阳性样品进行鉴定;且扩增灵敏度与普通RT-PCR相当,处于0.02 ng/μL水平。该方法相较于已有的检测方法,操作更简便快速,不易污染,灵敏度高,特异性优。此外,本研究结合实时荧光RT-PCR与普通RT-PCR两种检测方法,对未知谷物粉进行大麦条纹花叶病毒的检测鉴定,证实了新方法的可行性。 展开更多
关键词 大麦条纹花叶病毒 实时荧光RT-PCR 灵敏度 特异性 快速筛查
实时荧光定量PCR检测布鲁菌的应用研究
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作者 杜清春 王鹏 +3 位作者 董珊珊 姜海 丁奕博 杨向东 《中华地方病学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2019年第1期72-75,共4页
目的 建立一种能快速检测布鲁菌的实时荧光定量PCR(RT-PCR)初步筛查方法。 方法 根据编码布鲁菌外膜蛋白omp10和omp31的碱基序列设计4对引物和对应探针,即omp10、omp10-1、omp31和omp31-1,应用实时荧光定量PCR技术,将设计的引物和探针... 目的 建立一种能快速检测布鲁菌的实时荧光定量PCR(RT-PCR)初步筛查方法。 方法 根据编码布鲁菌外膜蛋白omp10和omp31的碱基序列设计4对引物和对应探针,即omp10、omp10-1、omp31和omp31-1,应用实时荧光定量PCR技术,将设计的引物和探针分别用于检测6个种类的19份已知生物型的标准布鲁菌株DNA、10份云南玉溪分离的布鲁菌株DNA和224份阴性对照菌株DNA,包括35份巴尔通体菌、103份小肠结肠炎耶尔森菌(其中包括4份O∶3型和9份O∶9型)和86份杂菌,根据检测结果评价引物和探针的特异性。 结果 omp10、omp10-1可对19种标准布鲁菌株DNA进行扩增,omp10的起峰时间和扩增曲线优于omp10-1,且omp10不能扩增阴性布鲁菌株的DNA;omp31-1可对16种标准布鲁菌株DNA进行扩增;omp31不能扩增标准布鲁菌株DNA。omp10、omp10-1和omp31-1检测10份玉溪分离的布鲁菌株,DNA的平均循环(Ct)值分别为:19.87,、19.14、17.52。 结论 omp10特异性强,只对布鲁菌有特异性扩增,可用于布鲁菌的快速检测。 展开更多
关键词 布鲁杆菌属 RT-PCR 快速检测 omp10 特异性
2013-2018年浙江省衢州地区外环境禽流感病毒监测分析
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作者 黄世腾 杨瑞军 +2 位作者 吕磊 陈旭富 万圣 《疾病监测》 CAS 2019年第9期835-838,共4页
目的了解浙江省衢州地区外环境禽流感病毒流行特征,为该地区人禽流感疫情的防控和预测预警提供科学依据。方法采集2013—2018年衢州地区外环境禽流感监测标本,采用实时荧光反转录–聚合酶链式反应方法对采集的外环境标本进行禽流感病毒... 目的了解浙江省衢州地区外环境禽流感病毒流行特征,为该地区人禽流感疫情的防控和预测预警提供科学依据。方法采集2013—2018年衢州地区外环境禽流感监测标本,采用实时荧光反转录–聚合酶链式反应方法对采集的外环境标本进行禽流感病毒核酸检测,并进行统计学分析。结果 2013—2018年共采集禽流感外环境标本5 290份,检出流感病毒A型(FluA)阳性标本1 809份,阳性率为34.20%;其中以H9亚型和A型未分型为主,分别占44.50%和29.13%。开化县检出阳性率最高(54.85%),龙游县最低(17.25%)。5类场所中,城乡活禽市场检出阳性率最高(45.94%)。6种类型标本中,宰杀或摆放禽肉案板表面的擦拭标本检出阳性率最高(58.96%)。第一季度(38.06%)和第四季度(37.23%)检出阳性率较高。不同时间、地区、场所、标本类型的标本阳性检出率差异均具有统计学意义(P<0.001)。结论衢州地区外环境中存在多种亚型及混合型禽流感病毒,应加强外环境禽流感监测力度,同时采取有效的防控措施降低人群感染的风险。 展开更多
关键词 禽流感病毒 外环境 监测 实时荧光反转录–聚合酶链式反应
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