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pcDNA3-HBsAg-p30-ROP2真核表达载体的构建与鉴定 被引量:4
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作者 魏庆宽 王英婷 +10 位作者 闫运琴 肖婷 李瑾 徐超 刘功振 刘娟美 仲维霞 尹昆 付斌 闫歌 黄炳成 《中国血吸虫病防治杂志》 CAS CSCD 2014年第1期46-50,共5页
目的构建pcDNA3-HBsAg-p30-ROP2多基因重组表达载体,并对其进行初步鉴定。方法根据重组体pcDNA3-p30-ROP2酶切位点和乙型肝炎表面抗原(HBsAg)基因序列等因素设计合成引物,扩增HBsAg目的基因片段,再应用酶切、连接等分子生物学技术... 目的构建pcDNA3-HBsAg-p30-ROP2多基因重组表达载体,并对其进行初步鉴定。方法根据重组体pcDNA3-p30-ROP2酶切位点和乙型肝炎表面抗原(HBsAg)基因序列等因素设计合成引物,扩增HBsAg目的基因片段,再应用酶切、连接等分子生物学技术将HBsAg目的基因克隆至pcDNA3-p30-ROP2表达载体中。应用聚合酶链反应(PCR)初筛,冉采用酶切、测序等技术对构建的重组表达载体pcDNA3-HBsAg-p30-ROP2进行鉴定。结果PCR扩增出HBsAg基因片段,构建了pcDNA3-HBsAg-p30-ROP2多基因真核表达载体。PCR与酶切结果显示,该基因片段大小均与理论值相符;测序结果湿示该重组表达载体包含了p30-ROP2和HBsAg目的基因的完整序列。结论成功构建了多基因重组表达载体pcDNA3-HBsAg-p30-ROP2,为进一步研究多基因核酸疫苗奠定了基础。 展开更多
关键词 弓形虫 表面抗原1(p30) 棒状体分泌抗原2(ROP2) 乙肝表面抗原 基因重组
乙肝表面抗原和弓形虫棒状体分泌抗原多功能真核表达载体的构建与鉴定 预览 被引量:1
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作者 魏庆宽 肖婷 +12 位作者 李瑾 马丽萍 王林 王英婷 闫运琴 高建丽 朱嵩 仲维霞 尹昆 付斌 张佃波 闫歌 黄炳成 《中国临床新医学》 2013年第3期191-195,共5页
目的探讨通过体外扩增乙肝表面抗原(HBsAg)基因,构建真核表达载体pcDNA3-HBsAg-ROP2的可行性。方法根据乙肝S基因序列及pcDNA3-p30-ROP2酶切位点等情况设计、合成引物,应用聚合酶链反应(PCR)技术,扩增HBsAg基因片段;应用回收、纯化... 目的探讨通过体外扩增乙肝表面抗原(HBsAg)基因,构建真核表达载体pcDNA3-HBsAg-ROP2的可行性。方法根据乙肝S基因序列及pcDNA3-p30-ROP2酶切位点等情况设计、合成引物,应用聚合酶链反应(PCR)技术,扩增HBsAg基因片段;应用回收、纯化、酶切、连接等技术,将HBsAg基因替换pcD-NA3-p30-ROP2中的p30基因,并进行酶切、PCR扩增及测序鉴定。结果 PCR扩增出约0.7 kb的目的基因HBsAg,成功构建pcDNA3-HBsAg-ROP2重组载体。PCR、酶切结果与理论相符,重组体包含了HBsAg和ROP2基因的完整序列。结论利用体外扩增乙肝表面抗原,可成功构建乙肝和弓形虫多功能重组载体pcDNA3-HBsAg-ROP2。 展开更多
关键词 乙肝表面抗原(HBsAg) 弓形虫 棒状体分泌抗原2(ROP2) 真核表达载体pcDNA3 基因重组
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弓形虫多基因核酸疫苗构建及其免疫保护性研究 被引量:7
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作者 魏庆宽 《中国血吸虫病防治杂志》 CAS CSCD 2012年第2期 173-177,182,共6页
目的构建弓形虫多基因核酸疫苗,评价其免疫保护性。方法 PCR扩增热休克蛋白(HSP70)基因片段,克隆到pcDNA3 ROP2 p30重组质粒中,构建pcDNA3 ROP2 p30 HSP70多基因核酸疫苗。采用该疫苗免疫BALB/c小鼠,检测小鼠脾淋巴细胞及全血CD4+、... 目的构建弓形虫多基因核酸疫苗,评价其免疫保护性。方法 PCR扩增热休克蛋白(HSP70)基因片段,克隆到pcDNA3 ROP2 p30重组质粒中,构建pcDNA3 ROP2 p30 HSP70多基因核酸疫苗。采用该疫苗免疫BALB/c小鼠,检测小鼠脾淋巴细胞及全血CD4+、CD8+,血清、脾淋巴细胞培养液中IgG、IgM、IgA和IFNγ、TNF、IL 2、IL 4、IL 12等,并进行弓形虫攻击感染实验。结果应用PCR扩增出916 bp HSP70基因片段,成功构建pcDNA3 ROP2 p30 HSP70重组体,其中包含HSP70蛋白基因读码框内的完整序列。该弓形虫多基因核酸疫苗能诱发小鼠产生细胞免疫和体液免疫,实验组小鼠血清抗体滴度高,CD4+和CD8+均增殖明显,组间差异有统计学意义(FCD4+=45.00,FCD8+=15.01,P均〈0.01);其血清及脾细胞培养液中IFNγ、IL 2和IL 12含量均明显升高,尤以血清中升高显著。攻击实验结果显示,实验组小鼠存活时间明显延长。结论 pcDNA3 ROP2 p30 HSP70多基因核酸疫苗具有较强的免疫原性,能产生较好的免疫保护作用。 展开更多
关键词 刚地弓形虫 棒状体蛋白2 表面抗原P30 热休克蛋白70 核酸疫苗
弓形虫自然弱毒株棒状蛋白2基因克隆及序列分析 预览 被引量:3
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作者 祁光宇 孙晓林 +3 位作者 付宝权 王艳华 苟惠天 张德林 《甘肃农业大学学报》 CAS CSCD 2007年第2期 13-16,共4页
应用PCR法从弓形虫QHO株速殖子基因组DNA中扩增ROP2的基因片断,连接到pMD18-T载体中,转化大肠杆菌JM109,经酶切及PCR鉴定后进行测序,并进行序列分析.结果表明,自然弱毒株的开放阅读框架(ORF)与ROP2基因已知序列(Z36906)的ORF具有97... 应用PCR法从弓形虫QHO株速殖子基因组DNA中扩增ROP2的基因片断,连接到pMD18-T载体中,转化大肠杆菌JM109,经酶切及PCR鉴定后进行测序,并进行序列分析.结果表明,自然弱毒株的开放阅读框架(ORF)与ROP2基因已知序列(Z36906)的ORF具有97%的同源性,氨基酸序列具有95%的同源性. 展开更多
关键词 刚地弓形虫 棒状体蛋白2基因 克隆 PCR 同源性
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弓形虫复合抗原基因P30-ROP2体外扩增、克隆及真核表达重组质粒的构建 预览 被引量:4
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作者 蒋华 何深一 +4 位作者 周怀瑜 丛华 古钦民 李瑛 赵群力 《中国寄生虫病防治杂志》 CSCD 2005年第1期 1-4,共4页
目的构建弓形虫RH株pcDNA3.1-P30-ROP2真核表达重组质粒,为进一步表达及DNA疫苗的研制作准备. 方法用PCR技术从弓形虫RH分离株的基因组DNA中扩增编码 P30基因片段和棒状体蛋白(ROP2)的基因片段,重组入pUC18克隆载体,然后将pUC18-P30-ROP... 目的构建弓形虫RH株pcDNA3.1-P30-ROP2真核表达重组质粒,为进一步表达及DNA疫苗的研制作准备. 方法用PCR技术从弓形虫RH分离株的基因组DNA中扩增编码 P30基因片段和棒状体蛋白(ROP2)的基因片段,重组入pUC18克隆载体,然后将pUC18-P30-ROP2中的P30-ROP2外源基因片段经酶切、连接等反应,亚克隆入pcDNA3.1真核表达载体,再经含氨苄青霉素的LB培养基筛选、酶切及PCR鉴定. 结果从弓形虫RH株基因组中扩增出特异的P30、ROP2片段,克隆成功pUC18-P30-ROP2重组质粒;经亚克隆、筛选鉴定获得了pcDNA3.1-P30-ROP2重组表达质粒. 结论成功构建了弓形虫pUC18-P30-ROP2重组克隆质粒,亚克隆成功pcDNA3.1-P30-ROP2真核表达重组质粒,为下一步DNA疫苗的研究奠定了基础. 展开更多
关键词 弓形虫 P30 棒状体蛋白2 克隆 基因重组
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弓形虫棒状体蛋白的免疫原性及其DNA疫苗的研制
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作者 魏庆宽 肖婷 +7 位作者 崔勇 胡颖新 史世俊 李桂玲 傅婷霞 李瑾 黄炳成 韩广东 《中国热带医学》 CAS 2009年第1期1-5,共5页
目的研制抗弓形虫DNA疫苗,评价其免疫原性及免疫保护作用,进而推广应用。方法首先用RH株弓形虫速殖子提取基因组DNA,应用PCR、酶切、连接、测序等技术,扩增棒状体蛋白2(ROP2)基因片段,将其克隆于真核表达载体pc-DNA3质粒中,制... 目的研制抗弓形虫DNA疫苗,评价其免疫原性及免疫保护作用,进而推广应用。方法首先用RH株弓形虫速殖子提取基因组DNA,应用PCR、酶切、连接、测序等技术,扩增棒状体蛋白2(ROP2)基因片段,将其克隆于真核表达载体pc-DNA3质粒中,制备抗弓形虫棒状体蛋白2DNA疫苗。再应用该疫苗免疫小鼠,取其血清、脾和淋巴结培养液检测免疫学指标评价其免疫原性,最后应用弓形虫攻击感染实验评价其免疫保护作用。结果PCR扩增出1.7kb ROP2基因片段,克隆、构建出pc-DNA3-ROP2重组DNA疫苗能诱发小鼠产生强烈的细胞免疫和体液免疫反应,小鼠血清抗体滴度高且能正确识别由基因重组体外诱导表达的ROP2蛋白抗原;实验组小鼠CD4^+T细胞增殖明显,体液中各细胞因子含量均有不同程度的升高,尤其是血清中升高最为显著。弓形虫攻击感染180h后,疫苗免疫保护率为88.9%,小鼠存活时间明显延长。结论pc-DNA3-ROP2重组DNA疫苗具有较强的免疫原性,安全可靠,能产生良好的免疫保护作用。 展开更多
关键词 刚地弓形虫 棒状体蛋白2(ROP2) 基因重组 DNA疫苗 免疫保护作用
弓形虫pc-DNA3-ROP2核酸疫苗的研制 预览 被引量:4
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作者 李瑾 魏庆宽 +9 位作者 徐秀来 傅婷霞 崔勇 肖婷 王洪法 张佃波 王用斌 黄炳成 闫歌 韩广东 《中国病原生物学杂志》 CSCD 2008年第5期 374-378,共5页
目的 研究廉价有效的抗弓形虫核酸疫苗,以用于人类和畜类弓形虫病的防治。方法 收集、纯化RH株弓形虫速殖子,提取基因组DNA;根据ROP2基因序列,设计合成ROP2基因引物,应用PCR、酶切、连接、测序等技术,扩增ROP2基因片段,克隆于真核表达载... 目的 研究廉价有效的抗弓形虫核酸疫苗,以用于人类和畜类弓形虫病的防治。方法 收集、纯化RH株弓形虫速殖子,提取基因组DNA;根据ROP2基因序列,设计合成ROP2基因引物,应用PCR、酶切、连接、测序等技术,扩增ROP2基因片段,克隆于真核表达载体pc-DNA3质粒中,制备抗弓形虫pc-DNA3-ROP2核酸疫苗。应用该疫苗免疫小鼠,通过ELISA检测血清抗体,Western blot鉴定该疫苗的免疫原性;应用RH株弓形虫进行动物攻击实验,评价其安全性及免疫保护性。结果 以弓形虫基因组DNA为模板,PCR扩增出1.7 kb ROP2基因片段,克隆于pc-DNA3质粒中,成功构建了pc-DNA3-ROP2重组质粒。测序结果显示,重组质粒包含了ROP2蛋白基因读码框内的完整序列,能完整表达ROP2的抗原蛋白。应用该疫苗免疫小鼠,能诱导产生强烈的细胞、体液免疫反应,使实验组小鼠攻虫感染后的存活时间明显延长,攻虫感染192 h后的存活率为77.8%,空质粒及PBS对照组存活率为0,差异有统计学意义(P〈0.001);实验全程免疫小鼠未发生毒性及异常反应。结论 该核酸疫苗具有很强的免疫原性,安全可靠,能诱导小鼠产生良好的免疫保护作用,具有很好的开发应用价值。 展开更多
关键词 刚地弓形虫 棒状体蛋白2(ROP2) 基因重组 核酸疫苗 免疫保护作用
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