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单链抗体对Cry1A类毒素的检测方法建立及识别差异初步研究
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作者 曲婷婷 张霄 +5 位作者 董飒 刘贝贝 李盼 王耘 张存政 刘贤金 《农业生物技术学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第3期516-525,共10页
为建立一种针对Cry1类毒素的经济高效的检测方法,本研究以杂交瘤细胞株2D10 cDNA为模板,通过重叠延伸PCR(gene splicing by overlap extension PCR, SOE-PCR)技术构建单链抗体(single-chain variable fragment, scFv)基因,转入大肠杆菌(... 为建立一种针对Cry1类毒素的经济高效的检测方法,本研究以杂交瘤细胞株2D10 cDNA为模板,通过重叠延伸PCR(gene splicing by overlap extension PCR, SOE-PCR)技术构建单链抗体(single-chain variable fragment, scFv)基因,转入大肠杆菌(Escherichia coli) BL21 (DE3)表达并建立双抗体夹心酶联免疫吸附测定(double antibody sandwich ELISA, DAS-ELISA)检测方法,通过分子对接模拟分析影响scFv与Cry1A类毒素结合的关键因素。结果成功构建了scFv基因,表达纯化出具有较高识别活性的scFv抗体(约28 kD),所建立的DAS-ELISA方法对Cry1Ab/Cry1Ac毒素的最低检测限(limits of determination, LOD)为20 ng/mL,分子对接结果显示,毒素的三维结构决定了其结合活性,氢键和疏水作用力在scFv与毒素结合过程中起重要作用。本研究利用基因工程抗体技术构建并表达获得了scFv抗体,建立了针对Cry1Ab/Cry1Ac毒素的双抗夹心ELISA检测方法,初步分析研究了scFv与Cry1Ac/Cry1Ab和Cry1Aa的识别差异机制,为进一步改造、研究开发新型广谱scFv提供了理论依据。 展开更多
关键词 CRY1AB CRY1AC SCFV DAS-ELISA 分子对接
抗甲硝唑单链抗体融合蛋白的表达及其ELISA检测方法建立 预览
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作者 何扩 张秀媛 +2 位作者 王云峰 赵瑞平 李育峰 《食品研究与开发》 CAS 北大核心 2019年第9期46-50,共5页
为实现甲硝唑单链抗体(single-chain variable fragment,scFv)在大肠杆菌中的可溶性表达,以甲硝唑抗体可变区基因(VH、VL)为模板,扩增甲硝唑的scFv基因,scFv双酶切后与PLIP6/GN载体重组,构建重组质粒PLIP6/GN-scFv,转化大肠杆菌JM109,... 为实现甲硝唑单链抗体(single-chain variable fragment,scFv)在大肠杆菌中的可溶性表达,以甲硝唑抗体可变区基因(VH、VL)为模板,扩增甲硝唑的scFv基因,scFv双酶切后与PLIP6/GN载体重组,构建重组质粒PLIP6/GN-scFv,转化大肠杆菌JM109,阳性克隆转大肠杆菌BL21经温度诱导表达重组单链抗体,并通过聚丙酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)对其鉴定。采用竞争酶联免疫(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测重组单链抗体的抗原结合活性。结果表明诱导表达的scFv分子量接近33kDa,能够特异性识别兽药甲硝唑,半抑制率(IC50)为(0.72±0.04)ng/mL。选择虾样品进行添加回收试验,建立的方法检测其回收率在88.54%到113.27%之间。这说明成功构建重组质粒PLIP6/GN-scFv并实现可溶性表达并可用于实际样品检测。 展开更多
关键词 甲硝唑 单链抗体 融合蛋白 诱导表达 酶联免疫吸附
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Establishment of an in vitro reporter system for screening HBx-targeting molecules
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作者 Chenjian Gu Shuai Tao +6 位作者 Kongying Hu Lijun Ming Mengjun Luo Huimin Guo Yu Su Jing Liu Youhua Xie 《生物化学与生物物理学报:英文版》 SCIE CAS CSCD 2019年第4期431-440,共10页
Chronic hepatitis B virus (HBV) infection remains a global public health problem. HBV-encoded X protein (HBx) is a multifunctional regulator that is required to initiate and maintain productive HBV infection, and is i... Chronic hepatitis B virus (HBV) infection remains a global public health problem. HBV-encoded X protein (HBx) is a multifunctional regulator that is required to initiate and maintain productive HBV infection, and is involved in HBV-related hepatocellular carci noma (HCC). Inhibitors that in terfere with the functions of HBx could be useful not only for the inhibition of HBV replication but also for the prevention or treatment of HBV-related HCC. To screen molecules that target HBx on a large scale remains a tech nical challenge due to a lack of sensitive and high-throughput system .In this work, we established an in vitro bioluminescent reporter system for screening HBx-targeting molecules. The system is based on a secretory fusion protein that combines HBx and NanoLuc (HBx-Nluc). The measured activity of NanoLuc in the culture supernatant of HBx-Nluc-expressing cells directly reflects the level of secreted HBx-Nluc. HBx protein-targeting intracellular anti-HBx single-chain variable fragment and RNA-targeting shRNA significantly reduced the secreted NanoLuc activity in HBx-Nluc-expressing cells. This system is simple and sensitive, and compatible with continuous non-disruptive screening, suggesting its potential usefulness for highthroughput screening and evaluating HBx-targeting molecules. 展开更多
关键词 HBX NanoLuc SCFV REPORTER system HBx-targeting MOLECULES
靶向EGFR二聚化界面单链抗体的构建及表达
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作者 李泽民 赵林 +5 位作者 邓栩文 祝贺 邱创楠 温碧燕 刘梦苗 李黄金 《生物技术》 CAS 2019年第2期122-126,198共6页
[目的]构建靶向EGFR二聚化界面的单链抗体。[方法]构建单链抗体的基因并进行密码子优化,克隆于表达载体p GAPZα-A和毕赤酵母X-33。镍柱纯化目的蛋白,并对EGFR高表达细胞A431和EGFR正常表达细胞NIH-3T3进行体外抑制分析和抗磷酸化分析。... [目的]构建靶向EGFR二聚化界面的单链抗体。[方法]构建单链抗体的基因并进行密码子优化,克隆于表达载体p GAPZα-A和毕赤酵母X-33。镍柱纯化目的蛋白,并对EGFR高表达细胞A431和EGFR正常表达细胞NIH-3T3进行体外抑制分析和抗磷酸化分析。[结果]纯化获得了分子量大小约29. 0 k Da的EGFR dimer Sc Fv蛋白。在48h体外抑制实验中,534 nmol/L EGFR dimer Sc Fv对A431和NIH-3T3的抑制率分别为34. 92±1. 30%和5. 89±0.46%,抑制作用与母本抗体相似。Western Blotting分析表明,EGFR dimer Sc Fv能显著抑制A431细胞EGFR磷酸化,而对NIH-3T3细胞显著无抑制作用。[结论]初步验证了靶向EGFR二聚化界面的单链抗体作为新型抗体药物的可行性,为后续研究奠定了基础。 展开更多
关键词 表皮生长因子受体 二聚化界面 单链抗体 肿瘤
牛源金黄色葡萄球菌单链抗体治疗小鼠乳腺炎效果评价
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作者 王婷婷 黄慧华 +4 位作者 王曼 张凡庆 王凤青 张波 朱建国 《畜牧与兽医》 北大核心 2018年第4期111-115,共5页
引起奶牛乳腺炎的原因复杂多样,金黄色葡萄球菌是其中重要的病原之一。为探寻治疗奶牛乳腺炎的抗生素替代性生物制剂,本研究利用建立的小鼠金黄色葡萄球菌感染乳腺炎模型,将针对金黄色葡萄球菌牛源性单链抗体(scFv)的真核表达质粒pcDN... 引起奶牛乳腺炎的原因复杂多样,金黄色葡萄球菌是其中重要的病原之一。为探寻治疗奶牛乳腺炎的抗生素替代性生物制剂,本研究利用建立的小鼠金黄色葡萄球菌感染乳腺炎模型,将针对金黄色葡萄球菌牛源性单链抗体(scFv)的真核表达质粒pcDNA3.1-scFv33和pcDNA3.1-scFv73经第4对乳腺导管注入到处于泌乳期的乳腺炎模型小鼠的乳腺中,以通过scFv在小鼠乳腺内的表达来抑制细菌对乳腺上皮细胞的黏附从而达到防治乳腺炎的目的。结果显示,两个scFv治疗组乳腺内的细菌数量分别为4.52±0.37、4.38±0.32(lgcfu·mg-1),TNF-α的含量分别为29.55和42.29 pg/mg,IL-6的含量分别为48.38和21.74 pg/mg。与阴性对照组相比,scFvs治疗组乳腺内的细菌数量显著减少(P〈0.05),乳腺组织较完整,减少了炎性细胞的浸润,且TNF-α和IL-6的含量均显著降低(P〈0.05)。表明pcDNA3.1-scFvs对小鼠乳腺炎可能具有一定程度的保护作用,为进一步研究防治奶牛乳腺炎的抗生素替代性生物制剂探索了新途径。 展开更多
关键词 乳腺炎 SCFV 金黄色葡萄球菌 TNF-α IL-6
靶向人c-Met蛋白单链抗体的制备及其对肺腺癌A549细胞的杀伤作用
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作者 刘传苗 刘明珠 +3 位作者 黄艳平 储菲 李永海 李正红 《细胞与分子免疫学杂志》 CSCD 北大核心 2018年第5期401-407,共7页
目的制备并纯化出靶向细胞间质上皮转化因子(c-Met)蛋白的人源单链抗体(scFv),鉴定其靶向c-Met蛋白的特性及其对肺腺癌细胞的作用。方法将scFv基因插入至p Fuse载体构建真核表达载体,表达融合鼠源Fc段的融合蛋白Met-scFv,经AKTA蛋... 目的制备并纯化出靶向细胞间质上皮转化因子(c-Met)蛋白的人源单链抗体(scFv),鉴定其靶向c-Met蛋白的特性及其对肺腺癌细胞的作用。方法将scFv基因插入至p Fuse载体构建真核表达载体,表达融合鼠源Fc段的融合蛋白Met-scFv,经AKTA蛋白纯化系统纯化;将纯化的Met-scFv进行功能性检测:ELISA检测Met-scFv亲和力;流式细胞术和免疫荧光细胞化学染色检测Met-scFv识别并结合肺腺癌细胞的特性;CCK-8法检测Met-scFv对细胞增殖的影响;通过补体依赖的细胞毒性(CDC)、抗体依赖细胞介导的细胞毒作用(ADCC),用乳酸脱氢酶(LDH)释放试剂盒检测Met-scFv对靶细胞A549细胞的毒性影响。结果 ELISA结果提示,Met-scFv与c-Met呈量效关系;流式细胞术和免疫荧光细胞化学染色实验结果提示,与对照组相比,Met-scFv组信号呈阳性,提示Met-scFv与A549细胞特异性结合;Met-scFv抑制A549细胞增殖并产生细胞毒性,且毒性大小与Met-scFv剂量呈正相关。结论制备出靶向c-Met蛋白的Met-scFv,并可在体外识别并介导杀伤A549细胞。 展开更多
关键词 c-Met 单链抗体(scFv) A549细胞 靶向性 补体依赖的细胞毒性(CDC) 抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)
人源抗ICAM-1单链抗体的制备及其生物学活性鉴定
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作者 陈云雨 孙红 +4 位作者 刘刚 胡华波 张国利 刘晓平 岳玉环 《生物工程学报》 CSCD 北大核心 2018年第12期2016-2024,共9页
利用噬菌体展示技术筛选特异性人源抗ICAM-1单链抗体(Anti-humanICAM-1scFv)并进行生物学活性鉴定。应用TomlinsonI+J噬菌体抗体库,以P1抗原肽为包被抗原,经过4轮“吸附-洗脱-扩增”进行亲和富集筛选。以PCR反应、ELISA抗原交叉反应和Do... 利用噬菌体展示技术筛选特异性人源抗ICAM-1单链抗体(Anti-humanICAM-1scFv)并进行生物学活性鉴定。应用TomlinsonI+J噬菌体抗体库,以P1抗原肽为包被抗原,经过4轮“吸附-洗脱-扩增”进行亲和富集筛选。以PCR反应、ELISA抗原交叉反应和Dotblotting实验进行阳性克隆的鉴定。scFv经原核表达和分离纯化后,以Westernblotting实验、竞争ELISA实验和细胞黏附抑制实验对其生物学活性进行初步鉴定。TomlinsonI+J噬菌体抗体库经4轮亲和富集筛选,利用ELISA方法成功筛出4株阳性克隆。通过PCR鉴定反应、ELISA抗原交叉反应和Dotblotting实验,最终获得了1株既能与P1抗原肽特异结合又能与人ICAM-1抗原特异结合的阳性克隆J-A1。对scFv进行原核表达和亲和层析后获得了高纯度的目的蛋白。竞争ELISA实验和细胞黏附抑制实验证实纯化的scFv具有良好的亲和活性和抗细胞黏附活性。文中成功利用噬菌体展示技术筛选到特异性人源抗ICAM-1scFv,为进一步探索该抗体在炎症相关性疾病治疗中的应用奠定了基础。 展开更多
关键词 噬菌体展示技术 细胞间黏附分子 ICAM-1 单链抗体 人源化抗体
抗胰岛素样生长因子1受体单链抗体复性研究
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作者 宋永红 张跃栋 +3 位作者 苏县辉 许岩丽 孙雪文 张红艳 《生物技术》 2018年第5期478-483,466共7页
[目的]建立抗人胰岛素样生长因子1受体单链抗体包涵体复性方法。[方法]首先,在96孔板上进行稀释复性,从72种复性液中筛选最佳条件。每孔复性液2 mL,滴入起始浓度1. 5 mg/mL的包涵体溶解液100μL过夜复性。然后,选择最佳复性液与变性液... [目的]建立抗人胰岛素样生长因子1受体单链抗体包涵体复性方法。[方法]首先,在96孔板上进行稀释复性,从72种复性液中筛选最佳条件。每孔复性液2 mL,滴入起始浓度1. 5 mg/mL的包涵体溶解液100μL过夜复性。然后,选择最佳复性液与变性液混合在Superdex 75柱上形成1 cm柱长下降5%的变性液梯度,样品按5%柱体积上样进行柱上复性。[结果]最适稀释复性液为C8(50 mmol/L Tris-Cl,GSH/GSSG=5/0. 5 mmol/L,0. 4 mol/L精氨酸,pH 9.0),对应复性率约为78%;以该复性液为基础通过柱上复性,目标蛋白复性率提高到95%,复性样品抗原结合活性良好。[结论]建立了目标蛋白包涵体柱上复性方法,复性率达到95%,产量达到384 mg/L。 展开更多
关键词 胰岛素样生长因子1受体 单链抗体 包涵体 高通量 柱上复性
抗CD147人源单链抗体的筛选及生物特性初步鉴定 被引量:1
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作者 刘妍 陈秀秀 +3 位作者 王欲晓 丁立 付凯飞 周丽君 《免疫学杂志》 CSCD 北大核心 2018年第1期59-64,共6页
目的 利用噬菌体展示技术筛选特异性抗CD147人源单链抗体(human anti-CD147 sc Fvs)并进行生物特性鉴定。方法以真核表达的CD147蛋白为抗原,采用“酸洗脱法”对库进行4轮富集性筛选、以ELISA法对筛选克隆的结合活性进行测定,以竞争EL... 目的 利用噬菌体展示技术筛选特异性抗CD147人源单链抗体(human anti-CD147 sc Fvs)并进行生物特性鉴定。方法以真核表达的CD147蛋白为抗原,采用“酸洗脱法”对库进行4轮富集性筛选、以ELISA法对筛选克隆的结合活性进行测定,以竞争ELISA和Western blot实验对获得的噬菌体抗体和可溶性sc Fv的特异性进行鉴定,通过DNA测序核实特异性sc Fvs的人源性及其亚群,以硫氰酸盐洗脱法对获得的抗体进行相对亲和力分析。结果 经过4轮的富集性筛选,共筛出4个与CD147特异性结合的阳性克隆,其中3个获得可溶性表达,竞争抑制及Western blot实验证实其能与CD147特异性结合。DNA序列分析证实3个阳性克隆具有不同的基因型,三者的轻链可变区分别属于V_λⅠ、V_κⅡ、V_λⅢ亚群,重链可变区分别属于V_HⅠ、V_HⅢ、V_HⅢ亚群。硫氰酸盐洗脱法测出13号、15号和168号3个human anti-CD147 sc Fvs的亲和力分别为0.20 mol/L、0.35 mol/L和0.6 mol/L。结论 成功从大容量噬菌体抗体库中筛选到特异性human anti-CD147 sc Fvs,为进一步研究该抗体的功能及应用前景奠定了基础。 展开更多
关键词 噬菌体展示技术 CD147 单链噬菌体抗体
抗EGFRvⅢ单链抗体的原核表达条件的优化及纯化 被引量:1
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作者 杨友辉 刘香香 +4 位作者 吴琼 刘亭 何彬 李勇军 兰燕宇 《基因组学与应用生物学》 CSCD 北大核心 2018年第7期3207-3213,共7页
为了构建抗EGFRvⅢ单链抗体大肠杆菌表达体系,优化抗EGFRvⅢ单链抗体在大肠杆菌中的表达条件,并建立纯化方法。构建抗EGFRvⅢ单链抗体的pET-22b(+)重组质粒,将其转化到大肠杆菌BL21中,研究不同温度、不同浓度诱导剂对目的蛋白表达效... 为了构建抗EGFRvⅢ单链抗体大肠杆菌表达体系,优化抗EGFRvⅢ单链抗体在大肠杆菌中的表达条件,并建立纯化方法。构建抗EGFRvⅢ单链抗体的pET-22b(+)重组质粒,将其转化到大肠杆菌BL21中,研究不同温度、不同浓度诱导剂对目的蛋白表达效率的影响。用Ni^2+亲和层析纯化蛋白,并通过免疫印迹对其进行鉴定。抗EGFRvⅢ单链抗体重组质粒经NdeⅠ和XhoⅠ双酶切,菌落PCR和测序验证,结果显示重组质粒构建成功。SDS-PAGE结果表明BL21表达的目的蛋白相对分子量为29kD左右,与理论分子量一致,免疫印迹结果表明在29kD左右出现一条特异性条带,与SDS-PAGE结果一致。15℃和0.6μmol/L的诱导剂为抗EGFRvⅢ单链抗体的最佳诱导条件。本研究成功构建了抗EGFRvⅢ单链抗体大肠杆菌表达体系,并获得了大肠杆菌表达单链抗体的最佳诱导条件。 展开更多
关键词 条件优化 单链抗体 免疫印迹 亲和层析 原核表达
牛源金黄色葡萄球菌单链抗体对奶牛乳腺炎的治疗效果评价 被引量:1
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作者 金耀忠 王曼 +6 位作者 王婷婷 何随彬 林赛峰 张蕾 金盈宇 叶承荣 朱建国 《畜牧与兽医》 北大核心 2018年第7期127-131,共5页
本文首先对患隐性乳腺炎的50头奶牛采取奶样,并对奶样进行了细菌分离鉴定及PCR检测,共检出金黄色葡萄球菌21株;随后对分离到的金黄色葡萄球菌进行了药敏试验,结果显示70%的金黄色葡萄球菌对青霉素产生了耐药性。为了研究针对金黄色葡萄... 本文首先对患隐性乳腺炎的50头奶牛采取奶样,并对奶样进行了细菌分离鉴定及PCR检测,共检出金黄色葡萄球菌21株;随后对分离到的金黄色葡萄球菌进行了药敏试验,结果显示70%的金黄色葡萄球菌对青霉素产生了耐药性。为了研究针对金黄色葡萄球菌全菌抗原的单链抗体对奶牛乳腺炎的治疗效果,将表达单链抗体的重组质粒通过无针注射器注射到患病奶牛的乳腺(600μg/乳区),48 h后再以相同的剂量注射一次。14 d后,奶样的加利福尼亚乳腺炎试验(California Mastitis Test,CMT)结果显示,治疗奶牛乳腺炎的有效率为83.33%,其中2例完全治愈。定期采集试验奶牛的乳样,并用PCR方法进行检测,发现第二次注射后的14 d内,奶样中未检测到重组质粒,说明重组质粒不能在奶牛体内长期残留。本研究为奶牛乳腺炎治疗抗体的研发提供了理论依据。 展开更多
关键词 奶牛乳腺炎 金黄色葡萄球菌 单链抗体
抗氯霉素单链抗体基因表达及免疫学活性检测
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作者 郑义 陈晓兰 +1 位作者 丁宁 陆辉 《畜牧与兽医》 北大核心 2018年第5期77-79,共3页
旨在构建和原核表达抗氯霉素的单链抗体(Sc Fv)基因,并进行免疫学活性的初步测定。将前期克隆的氯霉素Sc Fv全长基因克隆到p ET-24a载体后转化入大肠杆菌BL21,IPTG诱导后进行SDS-PAGE检测目的蛋白的表达,间接ELISA分析纯化的表达产物... 旨在构建和原核表达抗氯霉素的单链抗体(Sc Fv)基因,并进行免疫学活性的初步测定。将前期克隆的氯霉素Sc Fv全长基因克隆到p ET-24a载体后转化入大肠杆菌BL21,IPTG诱导后进行SDS-PAGE检测目的蛋白的表达,间接ELISA分析纯化的表达产物的免疫活性。结果:经酶切鉴定及DNA序列测定证明原核表达载体构建正确,SDS-PAGE分析显示表达蛋白为27.5 ku,间接ELISA表明纯化后的蛋白免疫学活性良好。本试验成功表达了具有免疫学活性的氯霉素Sc Fv,为氯霉素的药物残留检测方法建立奠定了基础。 展开更多
关键词 氯霉素 单链抗体 表达 免疫学活性
抗IL-4R单链抗体与蜂毒肽融合蛋白的构建、表达与纯化 预览
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作者 杨光勇 刘茜明 +2 位作者 刘莉莉 王文佳 何光志 《华中科技大学学报:医学版》 CSCD 北大核心 2018年第2期193-197,共5页
目的 制备重组抗白细胞介素4受体(recombinant anti-interleukin-4 receptor,anti-IL-4R)单链抗体(single-chain variable fragment,scFv)与蜂毒肽(melitin,MLT)的融合蛋白。方法 设计并合成抗IL-4R单链抗体基因与蜂毒肽基因,再用1.5%... 目的 制备重组抗白细胞介素4受体(recombinant anti-interleukin-4 receptor,anti-IL-4R)单链抗体(single-chain variable fragment,scFv)与蜂毒肽(melitin,MLT)的融合蛋白。方法 设计并合成抗IL-4R单链抗体基因与蜂毒肽基因,再用1.5%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定;通过重叠延伸PCR(gene splicing by over lap extension polymerase chain reaction,SOE-PCR)技术将抗IL-4R单链抗体基因与蜂毒肽基因连接成scFv-MLT融合基因,并以1%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定;scFv-MLT融合基因连接pET-32a原核表达载体以构建重组质粒,并用Eco RⅠ和XhoⅠ内切酶进行酶切鉴定;将重组质粒转入BL21(DE3)原核表达菌感受态细胞,37℃环境下培养于含有羧苄青霉素(100μg/mL)的平板TB固体培养基表面,分离出单菌落;挑取单菌落接种于含有羧苄青霉素(200μg/mL)TB液体培养基中,于通气良好的37℃环境下培养,使其A 600 nm值达到0.4~0.6,用浓度为1 mmol/L的诱导剂IPTG诱导表达scFv-MLT融合蛋白;3 h后达到表达高峰,离心沉淀菌体并将其裂解,提取所有蛋白并进行scFv-MLT融合蛋白纯化和复性;通过SDS-PAGE分析scFv-MLT融合蛋白的分子量,运用Western blot检测表达蛋白的特异性。结果 scFv-MLT基因序列大小约1 000 bp,IL-4R单链抗体与蜂毒肽重组蛋白的分子量在48~63 kD之间,与预期分子量52 kD相符,scFv-MLT融合蛋白具有较高的特异性。结论 成功制备了scFv-MLT重组蛋白,为进一步研究抗IL-4R单链抗体与蜂毒肽的融合蛋白的靶向生物治疗奠定了工作基础。 展开更多
关键词 白细胞介素4受体 单链抗体 蜂毒肽 融合蛋白构建 原核表达
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创伤弧菌溶细胞素特定氨基酸序列分析及其人源化单链抗体筛选
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作者 潘振 吕鹏 +6 位作者 邵淑丽 毕艳梅 孙梅 曲业敏 陈英剑 王明义 胡成进 《现代免疫学》 CSCD 北大核心 2018年第5期360-365,共6页
本研究利用生物信息学方法分析创伤弧菌(vibrio vulnificus, V.vulnificus)溶细胞素的蓖麻毒素结构域内氨基酸序列并合成多肽,筛选人工合成的单链抗体噬菌体文库Tomlinson I+J,为创伤弧菌感染的抗体阻断治疗研究奠定基础。通过对未... 本研究利用生物信息学方法分析创伤弧菌(vibrio vulnificus, V.vulnificus)溶细胞素的蓖麻毒素结构域内氨基酸序列并合成多肽,筛选人工合成的单链抗体噬菌体文库Tomlinson I+J,为创伤弧菌感染的抗体阻断治疗研究奠定基础。通过对未经处理的大容量Tomlinson I+J噬菌体文库进行3轮特异性亲和筛选,从中筛到特异性结合溶细胞素多肽的克隆,命名为scFv-D2,经氨基酸序列分析验证其含有完整的人源化抗体重链和轻链可变区。将scFv-D2克隆转化E.coli HB2151并诱导表达,用ELISA方法检测其可溶性scFv片段与溶细胞素毒性多肽的结合活性。结果显示从Tomlinson I+J文库成功筛选出一株具有结合活性的人源化噬菌体单链抗体,可用于创伤弧菌感染抗体阻断治疗策略的研究。 展开更多
关键词 创伤弧菌 溶细胞素 噬菌体展示 单链抗体
抗四环素单链抗体基因表达及免疫学活性检测
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作者 孟婷 郑志明 +2 位作者 王永娟 郭长明 左伟勇 《畜牧与兽医》 北大核心 2018年第7期57-59,共3页
为原核表达抗四环素的单链抗体(Sc Fv),并进行免疫学活性的初步测定,将前期克隆的四环素Sc Fv全长基因克隆到p ET-24a载体后转化入大肠杆菌BL21工程菌;IPTG诱导后进行SDS-PAGE检测目的蛋白的表达,间接ELISA分析纯化的表达产物的免疫... 为原核表达抗四环素的单链抗体(Sc Fv),并进行免疫学活性的初步测定,将前期克隆的四环素Sc Fv全长基因克隆到p ET-24a载体后转化入大肠杆菌BL21工程菌;IPTG诱导后进行SDS-PAGE检测目的蛋白的表达,间接ELISA分析纯化的表达产物的免疫活性。通过酶切鉴定法、DNA序列测定,证明目的基因构建正确,SDS-PAGE和间接ELISA分析显示表达蛋白为27.8 ku,纯化后的蛋白免疫学活性良好。表明成功表达了具有免疫学活性的四环素Sc Fv,为四环素的药物残留检测方法建立奠定了基础。 展开更多
关键词 四环素 单链抗体 药物残留 表达 免疫学活性
天然鼠源噬菌体抗体库的构建及抗鸡堆型艾美耳球虫裂殖子单链抗体的筛选
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作者 康茜 任志军 +5 位作者 唐欣浩 王雪伟 陈颖彬 刘立元 秦建华 赵月兰 《中国兽医学报》 CSCD 北大核心 2018年第11期2114-2124,共11页
从未经主动免疫的BALB/c小鼠脾脏淋巴细胞中提取总RNA,用RT-PCR扩增鼠抗体重链(VH)和轻链(VL)可变区基因,将轻链和重链可变区基因经重叠延伸拼接PCR反应,构建成单链抗体(ScFv)基因。将ScFv基因克隆到噬菌体载体PCANTAB-5E,转化入... 从未经主动免疫的BALB/c小鼠脾脏淋巴细胞中提取总RNA,用RT-PCR扩增鼠抗体重链(VH)和轻链(VL)可变区基因,将轻链和重链可变区基因经重叠延伸拼接PCR反应,构建成单链抗体(ScFv)基因。将ScFv基因克隆到噬菌体载体PCANTAB-5E,转化入大肠杆菌TG1中,筛选出阳性克隆,接种于LB培养基,经辅助噬菌体M13KO7拯救,构建天然鼠源噬菌体抗体库,并进行抗体库滴度测定,通过DNA finger printing技术及单链抗体基因序列分析鉴定抗体库的多样性。以堆型艾美耳球虫裂殖子为靶抗原,对构建的噬菌体抗体库进行亲和筛选,将强阳性重组噬菌体克隆感染大肠杆菌HB2151,经IPTG诱导表达可溶性ScFv抗体,并对表达产物进行SDS-PAGE和Western blot鉴定,用ELISA法鉴定其对堆型艾美耳球虫裂殖子抗原的结合活性。结果表明,天然鼠源噬菌体抗体库成功构建,库容量约为2.50×10~(11) CFU/mol,单链抗体库具有一定的多样性。经过4轮亲和筛选,携带抗鸡堆型艾美耳球虫裂殖子表面抗原的特异性噬菌体抗体得到了富集。特异性ScFv抗体在E.coli中分泌表达,表达产物具有免疫活性。筛选出5个与鸡堆型艾美耳球虫裂殖子抗原结合活性较高的克隆,构建的单链噬菌体抗体库的有效表位具有多样性。本研究为进一步认识鸡球虫的各个发育阶段奠定理论基础,为鸡球虫病免疫控制研究提供参考。 展开更多
关键词 堆型艾美耳球虫 裂殖子 噬菌体抗体库 单链抗体
scFv-RBP4融合蛋白的构建 预览
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作者 李红侠 刘崇东 +2 位作者 曹广明 娄彤 张震宇 《中国实验诊断学》 2017年第6期1082-1085,共4页
目的构建scFv-RBP4融合蛋白。方法采用德泰生物最新开发的密码子优化软件MaxCodonTM Optimization Program(V13)对提供的scFv-RBP4蛋白氨基酸序列进行优化,设计全长拼接引物,通过双酶切法将scFvRBP4基因插入到表达载体proEM中,并通过... 目的构建scFv-RBP4融合蛋白。方法采用德泰生物最新开发的密码子优化软件MaxCodonTM Optimization Program(V13)对提供的scFv-RBP4蛋白氨基酸序列进行优化,设计全长拼接引物,通过双酶切法将scFvRBP4基因插入到表达载体proEM中,并通过酶切法和测序确认最终表达载体的准确性,最终转到DH5a克隆菌株中,通过质粒大抽试剂盒提取转染级质粒,之后将质粒通过转染试剂转染到哺乳动物细胞HEK293T中进行瞬时表达,再通过Ni-IDA亲和层析纯化scFv-RBP4蛋白。结果酶切和测序结果显示,scFv-RBP4蛋白构建正确,目标蛋白纯度〉90%。结论构建的scFv-RBP4融合蛋白可以在HEK293T细胞内获得稳定表达,为后期融合蛋白的提取及功能研究打下基础。 展开更多
关键词 RBP4 融合蛋白 SCFV HEK293T 构建
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抗IL-4R单链抗体原核表达载体的构建与表达 预览 被引量:1
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作者 杨光勇 刘茜明 +2 位作者 刘莉莉 王文佳 何光志 《天津医药》 CAS 2017年第9期897-901,共5页
目的 通过BL21(DE3)原核表达系统制备抗白细胞介素-4受体(IL-4R)鼠抗人单链抗体(scFv).方法在前期研究结果的基础上优化抗IL-4R scFv序列,优化后分析scFv序列,构建重组质粒pET-32a-scFv,将该重组质粒酶切鉴定,将其转入BL21(DE3... 目的 通过BL21(DE3)原核表达系统制备抗白细胞介素-4受体(IL-4R)鼠抗人单链抗体(scFv).方法在前期研究结果的基础上优化抗IL-4R scFv序列,优化后分析scFv序列,构建重组质粒pET-32a-scFv,将该重组质粒酶切鉴定,将其转入BL21(DE3)原核表达菌进行诱导表达,并进行SDS-PAGE分析检测,对表达蛋白进行纯化和复性,通过SDS-PAGE分析抗IL-4R单链抗体的分子质量,运用Western blot检测融合蛋白的特异性.结果插入pET-32a载体的scFv序列长度761 bp,抗IL-4R单链抗体的分子质量在45 ku左右,重组蛋白具有较高的特异性.结论本实验成功构建pET32a-scFv原核表达系统,重组蛋白具有较高的免疫反应性,为进一步研究抗IL-4R单链抗体作为药物靶点提供了工作基础. 展开更多
关键词 受体 白细胞介素4 重组蛋白质类 电泳 聚丙烯酰氨凝胶 单链抗体 原核表达 INTERLEUKIN-4
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抗木瓜凝乳蛋白酶单链抗体的筛选、可溶性表达及鉴定 预览
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作者 王舰平 赵树进 +2 位作者 李脉 许锋 朱庆玲 《广东药科大学学报》 CAS 2017年第4期531-535,共5页
目的 筛选具有较好结合能力的抗木瓜凝乳蛋白酶单链抗体(scFv),并进行可溶性表达和鉴定.方法 前期实验室构建了抗木瓜凝乳蛋白酶全套鼠源scFv噬菌体抗体文库,对抗体文库进行4轮富集后,采用ELISA筛选抗木瓜凝乳蛋白酶阳性scFv;将ELISA... 目的 筛选具有较好结合能力的抗木瓜凝乳蛋白酶单链抗体(scFv),并进行可溶性表达和鉴定.方法 前期实验室构建了抗木瓜凝乳蛋白酶全套鼠源scFv噬菌体抗体文库,对抗体文库进行4轮富集后,采用ELISA筛选抗木瓜凝乳蛋白酶阳性scFv;将ELISA最强阳性克隆pFAB5C-scFv的重组噬粒切除gene 3 singal后进行表达,SDS-PAGE分析、双抗体夹心ELISA分析、鉴定表达产物,并将阳性克隆可变区序列与Gene Bank数据库进行同源性比较.结果 经4轮噬菌体展示富集,筛选到3株亲和力相对较高的阳性克隆;去除gene 3 singal后的重组scFv在宿主菌E.coli XL1-blue中主要以可溶性的形式进行了表达,且对木瓜凝乳蛋白酶有较好的亲和力.基因序列分析表明阳性克隆所包含的重链可变区基因(VH)与小鼠免疫球蛋白γ重链基因同源性达96%,轻链可变区基因(VL)和小鼠免疫球蛋白轻链κ基因同源性达98%.结论 成功筛选出结合能力较好的抗木瓜凝乳蛋白酶scFv并进行了可溶性表达,所克隆的scFv基因符合小鼠抗体序列的特征. 展开更多
关键词 木瓜凝乳蛋白酶 单链抗体 噬菌体抗体库 可溶性表达
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抗黄曲霉毒素单链抗体在毕赤酵母X-33中的表达 预览 被引量:3
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作者 王婷 雷佳文 +3 位作者 李培武 张奇 张文 何婷 《中国油料作物学报》 CAS CSCD 北大核心 2017年第1期113-116,共4页
为降低黄曲霉毒素单链抗体制备成本,提高单链抗体表达活性,利用获得的含抗黄曲霉毒素scFv基因的重组质粒pCANTAB 5E-scFv1A7,克隆出了scFv基因片段,并构建了酵母表达载体pPICZαA-scFv1A7,利用SacⅠ酶将重组载体线性化后插入到毕赤酵母X... 为降低黄曲霉毒素单链抗体制备成本,提高单链抗体表达活性,利用获得的含抗黄曲霉毒素scFv基因的重组质粒pCANTAB 5E-scFv1A7,克隆出了scFv基因片段,并构建了酵母表达载体pPICZαA-scFv1A7,利用SacⅠ酶将重组载体线性化后插入到毕赤酵母X-33染色体基因组中,构建了pPICZαA-scFv1A7 X-33重组酵母,用0.8%甲醇诱导其分泌表达成功。间接竞争ELISA方法检测到该scFv对黄曲霉毒素B1的抑制率(IC50)值为4.5ng/m L,表明重组酵母表达产物scFv具有很好的抗原结合活性,可用于黄曲霉毒素的检测。 展开更多
关键词 黄曲霉毒素 单链抗体 毕赤酵母 表达
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