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Bcl-2改善老年人骨髓间充质干细胞抗缺氧损伤能力的研究 预览
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作者 陈巍 张东旸 +3 位作者 白龙 范明 蒋树林 田海 《心肺血管病杂志》 2019年第2期194-197,205共5页
目的:通过转染Bcl-2基因增强老年人骨髓间充质干细胞(hMSCs)的Bcl-2表达,尝试改善老年hMSCs在缺氧环境下的抗凋亡、抗损伤能力,为基因联合细胞移植改善老年hMSCs自体移植治疗缺血性心脏病的提供依据。方法:分离培养老年hMSCs并进行鉴定... 目的:通过转染Bcl-2基因增强老年人骨髓间充质干细胞(hMSCs)的Bcl-2表达,尝试改善老年hMSCs在缺氧环境下的抗凋亡、抗损伤能力,为基因联合细胞移植改善老年hMSCs自体移植治疗缺血性心脏病的提供依据。方法:分离培养老年hMSCs并进行鉴定。构建Bcl-2基因质粒并对老年人hMSCs进行Bcl-2基因的转染。应用CO2和N2的混合气体建立稳定的缺氧培养环境模拟心肌梗死时的缺氧环境,分别对老年hMSCs及Bcl-2转染后老年hMSCs进行缺氧培养,比较各组细胞的细胞凋亡及损伤情况。通过冠状动脉结扎建立稳定的大鼠心肌梗死模型,分别应用老年hMSCs及Bcl-2转染后的老年hMSCs进行细胞移植,比较各组细胞在心肌梗死区域缺氧环境下的存活情况,同时应用超声心动图对比两组细胞移植后心肌梗死大鼠心脏功能的改善情况。结果:转染Bcl-2的老年hMSCs能够稳定表达Bcl-2的基因及蛋白。转染Bcl-2后的老年hMSCs在缺氧环境下较未转染的老年细胞其凋亡数量明显下降、生存率明显提高,表达的Bcl-2基因及蛋白也多于未转染的老年细胞。各组细胞移植至大鼠梗死心脏后可见转染Bcl-2的老年hMSCs组的细胞存活数量明显高于未转染组,梗死心脏的Bcl-2的基因含量和蛋白表达量也高于未转染老年细胞移植组,心肌梗死大鼠在移植了转染Bcl-2的老年hMSCs组后其心脏的射血分数和左心室短轴缩短率好于未行细胞移植组和移植未转染细胞组。结论:增加老年hMSCs中Bcl-2基因的含量能够增加其Bcl-2蛋白表达量、增强其在缺氧环境中的抗凋亡能力。应用Bcl-2转染的方法能够增强老年hMSCs移植治疗心肌梗死时的移植后细胞存活能力、提高梗死区域的Bcl-2蛋白表达量并增强了老年hMSCs移植改善心肌梗死后心脏功能的效果。 展开更多
关键词 转染 BCL-2 老年人骨髓间充质干细胞 抗缺氧损伤 细胞移植 心肌梗死
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Ndfip1对神经细胞铁超载损伤的保护作用及机制探讨 预览
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作者 陈明辉 田娟 《天津医药》 CAS 北大核心 2019年第2期118-121,共4页
目的探讨Ndfip1过表达对神经细胞SH-SY5Y铁超载损伤的保护作用及机制。方法以SH-SY5Y细胞为细胞模型,并成功构建Ndfip1质粒。应用Ndfip1质粒和空质粒分别转染SH-SY5Y细胞,建立实验组和对照组。MTT法检测不同浓度FeSO4作用下,SH-SY5Y细... 目的探讨Ndfip1过表达对神经细胞SH-SY5Y铁超载损伤的保护作用及机制。方法以SH-SY5Y细胞为细胞模型,并成功构建Ndfip1质粒。应用Ndfip1质粒和空质粒分别转染SH-SY5Y细胞,建立实验组和对照组。MTT法检测不同浓度FeSO4作用下,SH-SY5Y细胞存活率的变化,确定铁超载浓度;Ndfip1质粒转染SH-SY5Y细胞,确定转染效率;Ndfip1质粒和空质粒分别转染SH-SY5Y细胞,MTT法检测2组细胞存活率的变化;应用Calcein AM法处理细胞,荧光显微镜下观察2组细胞的荧光强度,以确定细胞内铁离子的含量;荧光分光光度计检测2组细胞的荧光强度变化,以确定细胞铁摄入能力的改变。结果随着FeSO4浓度增加,SH-SY5Y细胞存活率逐渐降低。200μmol/L FeSO4可导致SH-SY5Y细胞存活率明显下降。Ndfip1质粒转染可明显增加SH-SY5Y细胞Ndfip1蛋白表达量,提高SH-SY5Y细胞铁超载损伤后的存活率,减少细胞内铁离子含量及细胞对铁离子的摄入。结论铁超载对神经细胞造成损伤,导致其存活率降低;Ndfip1可减少铁离子进入神经细胞,减轻神经细胞内铁蓄积,降低铁超载对神经细胞的损伤作用,提高细胞存活率,从而发挥其保护作用。 展开更多
关键词 神经元 转染 Ndfip1 神经保护
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对氧磷酶3基因过表达对急性中毒小鼠肝损伤的保护作用及机制
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作者 伍洋 刘英 +1 位作者 刘济滔 尹德锋 《解剖学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第2期179-184,共6页
目的探讨对氧磷酶3(PON3)对急性中毒肝损伤的保护作用及作用机制。方法将40只Balb/c小鼠随机分为4组,正常对照(NC)组、敌敌畏(DDVT)对照组、绿色荧光蛋白慢病毒(Lv-GFP)组和重组PON3慢病毒(Lv-PON3)组,每组10只。LV-GFP组和Lv-PON3组小... 目的探讨对氧磷酶3(PON3)对急性中毒肝损伤的保护作用及作用机制。方法将40只Balb/c小鼠随机分为4组,正常对照(NC)组、敌敌畏(DDVT)对照组、绿色荧光蛋白慢病毒(Lv-GFP)组和重组PON3慢病毒(Lv-PON3)组,每组10只。LV-GFP组和Lv-PON3组小鼠经尾静脉分别注射2×107TU的Lv-GFP、Lv-PON3慢病毒,3 d后腹腔注射敌敌畏(DDVT)溶液9 mg/kg,DDVT组只需腹腔注射同等剂量DDVT,NC组注射同等剂量生理盐水。各组于DDVT染毒后12 h麻醉处死10只小鼠取肝组织,ELISA法检测各组血清乙酰胆碱酯酶(ACh E)、肝功能指标谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)和肝组织氧化应激指标丙二醛(MDA)、过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽(GSH),HE染色法观察肝组织形态学改变,Real-time PCR检测肝组织Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白-1(Keap1)、血红蛋白加氧酶(HO-1)和转录因子NF-E2相关因子2(Nrf2) mRNA的表达。结果与NC组比较,DDVT组和Lv-GFP组肝组织MDA、ALT、AST水平,HO-1和Nrf2 mRNA表达量明显升高,ACh E、CAT、SOD、GSH水平和Keap1 mRNA表达量均明显降低(P <0. 05)。与DDVT组比较,Lv-PON3组肝组织MDA、ALT、AST水平,Keap1 mRNA表达量降低,ACh E、CAT、SOD和GSH水平均明显著升高,HO-1和Nrf2 mRNA表达量显著上升(P<0. 05)。正常对照组肝细胞结构清晰,未出现肝细胞坏死和脂肪病变的情况,DDVT组和Lv-GFP组出现肝细胞坏死和脂肪变性等病理改变,Lv-PON3组肝脏病变组织肝细胞坏死和脂肪变性细胞数有一定的减少。结论PON3可通过Keap1-Nrf2/HO-1途径缓解氧化应激反应,改善肝功能,对敌敌畏急性中毒小鼠肝损伤有一定的保护作用。 展开更多
关键词 对氧磷酶3 急性中毒 肝损伤 氧化应激 转染 实时定量聚合酶链反应 小鼠
3种转染试剂对牛原代骨骼肌卫星细胞转染条件的优化 预览
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作者 陈明明 李燕 +5 位作者 张晓娟 张林林 李新 丁向彬 刘新峰 郭宏 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2019年第1期62-71,共10页
为了选择适合牛原代骨骼肌卫星细胞的转染试剂与条件,本研究以带有绿色荧光蛋白(EGFP)的质粒pcDNA3.1-EGFP和pEGFP-C1作为外源基因,分别用Lipofectamine 3000、X-tremeGENE HP和FuGENE HD转染牛原代骨骼肌卫星细胞,通过荧光显微镜观察... 为了选择适合牛原代骨骼肌卫星细胞的转染试剂与条件,本研究以带有绿色荧光蛋白(EGFP)的质粒pcDNA3.1-EGFP和pEGFP-C1作为外源基因,分别用Lipofectamine 3000、X-tremeGENE HP和FuGENE HD转染牛原代骨骼肌卫星细胞,通过荧光显微镜观察、实时荧光定量PCR及Hoechst 33342染色评价转染效率。结果表明,对于同一时期、同一转染试剂,pcDNA3.1-EGFP转染效果优于pEGFP-C1;不同转染试剂之间,Lipofectamine 3000和X-tremeGENE HP转染效果优于FuGENE HD。Lipofectamine 3000转染后分化72h肌管最明显,FuGENE HD次之,X-tremeGENE HP转染后细胞死亡较多。采用1.0μL Lipofectamine 3000、1.5μL Lipofectamine 3000和X-tremeGENE HP转染细胞后EGFP表达量极显著高于FuGENE HD (P<0.01),但这三者之间差异不显著(P>0.05)。细胞转染效率与EGFP定量结果基本一致,1.0、1.5μL Lipofectamine 3000转染效率较高,分别达26.07%和24.77%,极显著高于FuGENE HD(5.59%)和X-tremeGENE HP(10.87%)的转染效率(P<0.01),但二者之间无显著差异(P>0.05);X-tremeGENE HP的转染效率极显著高于FuGENE HD (P<0.01)。综合考虑转染试剂的用量、细胞毒性及经济效益,本试验初步认为牛原代骨骼肌卫星细胞转染宜采用Lipofectamine 3000,其与质粒DNA的比例为1∶1时转染效率最高。本试验结果可为原代细胞的转染提供重要的参考价值。 展开更多
关键词 牛原代骨骼肌卫星细胞 转染 LIPOFECTAMINE 3000 X-tremeGENE HP FuGENE HD
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过表达维A酸受体α减轻大鼠肾间质纤维化的机制
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作者 余雪云 覃远汉 +3 位作者 蒋玲 韦露明 潘竞 席志杨 《中华实用儿科临床杂志》 CSCD 北大核心 2019年第5期341-346,共6页
目的探讨过表达维A酸受体α(RARα)基因减轻大鼠肾间质纤维化(RIF)的分子机制。方法将40只6周龄雄性SD大鼠按随机数字表法分为4组:假手术组、模型组、阴性对照组、转染组,每组10只。模型组大鼠分离并双重结扎左侧输尿管;假手术组大鼠不... 目的探讨过表达维A酸受体α(RARα)基因减轻大鼠肾间质纤维化(RIF)的分子机制。方法将40只6周龄雄性SD大鼠按随机数字表法分为4组:假手术组、模型组、阴性对照组、转染组,每组10只。模型组大鼠分离并双重结扎左侧输尿管;假手术组大鼠不结扎输尿管;转染组和阴性对照组大鼠分别在建模的基础上转染携带过表达RARα基因的腺相关病毒和阴性对照病毒。2周末处死大鼠,取左肾组织进行病理学检查并计算RIF指数。采用免疫组织化学法检测肾组织Ⅳ型胶原蛋白(Col-Ⅳ)和纤维连接蛋白(FN)的表达,采用实时荧光定量PCR法和Western blot法检测肾组织RARα、抗增殖蛋白(PHB)、转化生长因子-β1(TGF-β1)的mRNA和蛋白表达。结果1.与假手术组相比,模型组大鼠RIF指数显著升高,差异有统计学意义(22.81±2.43比2.34±0.55,q=24.94,P<0.05);模型组和阴性对照组大鼠RIF指数相比,差异无统计学意义(22.81±2.43比22.26±3.43,q=0.67,P>0.05),而转染组大鼠RIF指数显著降低,差异有统计学意义(14.06±2.99比22.81±2.43,q=10.66,P<0.05)。2.与假手术组相比,模型组大鼠肾组织RARα、PHB的mRNA和蛋白表达均显著降低,而TGF-β1的mRNA及蛋白表达,Col-Ⅳ和FN的表达均显著升高,差异均有统计学意义(mRNA:0.43±0.17比1.00±0.00,0.34±0.08比1.00±0.00,2.97±0.54比1.00±0.00,均P<0.05;蛋白:0.25±0.10比0.51±0.06,0.24±0.07比0.58±0.04,0.59±0.09比0.33±0.06,16.01±0.87比8.79±0.39,14.64±0.32比9.36±0.59,均P<0.05);模型组和阴性对照组大鼠肾组织RARα、PHB、TGF-β1的mRNA及蛋白表达,Col-Ⅳ和FN的表达比较,差异均无统计学意义(均P>0.05);与模型组相比,转染组大鼠肾组织RARα、PHB的mRNA和蛋白表达均显著升高,而TGF-β1的mRNA及蛋白表达、Col-Ⅳ和FN的表达均显著降低,差异均有统计学意义(mRNA:0.86±0.07比0.43±0.17,0.89±0.11比0.34±0.08,1.65±0.28比2.97±0.54,均P<0.05;蛋白:0.40±0.07比0.25±0.10,0.45±0.10比0 展开更多
关键词 维A酸受体α 抗增殖蛋白 肾间质纤维化 转染
尼罗罗非鱼TRAF4基因的克隆、表达及功能分析
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作者 韩雪晴 高风英 +5 位作者 卢迈新 刘志刚 曹建萌 王淼 衣萌萌 张德锋 《农业生物技术学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第3期381-392,共12页
肿瘤坏死因子受体相关因子4 (tumor necrosis factor receptor associated factors 4, TRAF4)是TRAFs家族中比较特殊的一员,生物学功能较多且较复杂。为了明确TRAF4基因在尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)免疫过程中的作用,本研究首... 肿瘤坏死因子受体相关因子4 (tumor necrosis factor receptor associated factors 4, TRAF4)是TRAFs家族中比较特殊的一员,生物学功能较多且较复杂。为了明确TRAF4基因在尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)免疫过程中的作用,本研究首先通过反转录PCR和分段扩增获得尼罗罗非鱼TRAF4基因c DNA (GenBank No. MH986338)及基因组序列,并进行基因和蛋白质结构等生物信息学分析;然后利用qRT-PCR技术检测该基因在健康个体中的组织表达、受精后不同发育阶段的表达以及人工感染无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)后的表达特征;最后构建重组真核表达载体,分析TRAF4在人胚肾细胞293T中的亚细胞定位及其在Nuclear factorκB (NF-κB)通路中的作用。结果显示,TRAF4基因的cDNA序列为4 483 bp,开放阅读框为1 413 bp,可编码470个氨基酸。基因组序列分析发现,TRAF4基因含7个外显子和6个内含子。氨基酸序列分析发现,TRAF4存在1个环指(RING-finger)结构域、3个TRAF类型的锌指(zinc-finger)结构域、1个甲基多巴和TRAF同源物(meprin and TRAF-homology, MATH)结构域。组织分析表明,TRAF4基因在所检测的11个组织/器官中均有表达,脑中表达最高,脾中表达最低;该基因在受精后不同发育阶段均有表达。人工感染无乳链球菌后,尼罗罗非鱼TRAF4基因在肠、鳃、脾、肾和血液中的表达量均发生不同程度的变化,在鳃和血液中显著升高,在肠和肾中的表达量均低于对照组(0 h组)。亚细胞定位和双荧光素酶报告分析显示,TRAF4在293T细胞中主要定位于细胞质,可增强NF-κB活性。综上所述,TRAF4基因在尼罗罗非鱼的免疫应答中发挥重要作用,本研究为深入探讨TRAF4基因在罗非鱼抗感染免疫中的作用机制提供了基础资料。 展开更多
关键词 肿瘤坏死因子受体相关因子4基因(TRAF4) 尼罗罗非鱼 基因表达 转染
载BDNF基因PEG-PLGA纳米微球的制备及其转染外源性神经干细胞的研究 预览
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作者 余勇波 唐健 +3 位作者 张桂龙 朱治翰 杨芳 陈陆馗 《临床神经外科杂志》 CAS 2019年第2期109-114,共6页
目的构建转染后能表达神经修复功能蛋白的载脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)基因的聚乙二醇-聚乳酸-羟基乙酸纳米微球[poly(ethylene glycol)-poly(lactin-co-glycolic acid)-BDNF-nanoparticles,PEG-PLGA-... 目的构建转染后能表达神经修复功能蛋白的载脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)基因的聚乙二醇-聚乳酸-羟基乙酸纳米微球[poly(ethylene glycol)-poly(lactin-co-glycolic acid)-BDNF-nanoparticles,PEG-PLGA-BDNF-NPs];探讨其转染外源性神经干细胞(neural stem cells,NSCs)后对细胞生物学功能的影响。方法采用W/O/W复乳溶剂挥发法制备装载BDNF基因质粒的PEG-PLGA纳米微球转染复合体。用扫描电镜和透射电镜表征纳米微球的形貌,粒度电位分析仪测量纳米微球的粒径及Zeta电位。测定纳米微球对BDNF基因质粒的包封率和载药量;检测PEG-PLGA纳米微球转染复合体的体外缓释质粒的情况。倒置显微镜观察纳米微球转染复合体对NSCs形态的影响;并用CCK-8法检测其对NSCs增殖的影响。荧光倒置显微镜观察NSCs胞吞纳米微球转染复合体后的分泌作用;Western-blot及RT-PCR检测其BDNF的分泌能力。结果(1)制备了包载BDNF基因的PEG-PLGA纳米微球,微球的粒径约为200 nm,粒径均一;包封率及载药量均较高,具有一定的缓释效果。(2)分离培养出了具有不断增殖能力,表达神经巢蛋白的NSCs;并能经过诱导分化为神经元和神经胶质细胞。(3)载BDNF基因的PEG-PLGA纳米微球高效转染NSCs,且转染不会引起显著细胞毒性;Western-blot及RT-PCR检测显示其大量表达BDNF。结论采用W/O/W复乳溶剂挥发法制备得到安全高效的PEG-PLGA-BDNF纳米微球。并首次构建了装载PEG-PLGA-BDNF-NPs,能表达具有神经修复功能的BDNF的外源性NSCs系。 展开更多
关键词 纳米微球 神经干细胞 基因治疗 转染
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过表达Notch1的胞内段基因对人牙周膜干细胞增殖能力影响
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作者 龙晏 邱申彩 +4 位作者 李淑慧 舍玉秀 王娜 陈晓燕 吴佩玲 《口腔医学研究》 CAS 北大核心 2019年第1期28-32,共5页
目的:探讨过表达Notch1的胞内段(Notch1 intracellular domain,NICD)基因对人牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cells,PDLSCs)增殖能力的影响。方法:构建含NICD基因过表达的逆转录病毒颗粒,并将其转染至牙周膜干细胞,构建过表达N... 目的:探讨过表达Notch1的胞内段(Notch1 intracellular domain,NICD)基因对人牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cells,PDLSCs)增殖能力的影响。方法:构建含NICD基因过表达的逆转录病毒颗粒,并将其转染至牙周膜干细胞,构建过表达NICD的细胞株PDLSCs/NICD,转染48h后观察细胞一般状态。PDLSCs/NICD为实验组,以PDLSCs/wt为正常细胞组和PDLSCs/vector空病毒转染组作为对照,通过实时定量聚合酶链锁反应(quantitative Real-time-Polymerase chain reaction,qRT-PCR)和Western blot检测NICD mRNA及其蛋白的表达;细胞计数试剂盒(cell counting kit-8,CCK-8)法检测细胞的增殖情况;Transwell实验检测细胞的迁移能力。结果:Western blot和qRT-PCR结果显示,与PDLSCs/wt组和PDLSCs/vector组比较,PDLSCs/NICD组的NICD蛋白表达水平及其mRNA表达水平均明显升高(P<0.05);CCK-8结果提示,与PDLSCs/vector组比较,PDLSCs/NICD组细胞增殖速度加快,Transwell实验结果显示,PDLSCs/NICD组的细胞迁移(40.20±1.74)明显高于PDLSCs/vector组(21.20±1.18)。结论:NICD基因过表达的人PDLSCs在一定程度上增殖及迁移能力加强。 展开更多
关键词 牙周膜干细胞 Notch1的胞内段 转染 增殖 迁移
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PCV2b Cap蛋白重组杆状病毒的构建及鉴定 预览
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作者 刘喜凤 黄丹丹 张学贤 《福建畜牧兽医》 2019年第1期3-7,共5页
猪圆环病毒(PCV)能够引起多种综合征和疾病,给养猪业造成了较大的经济损失。PCV2毒株在2003年后以PCV2b取代PCV2a成为临床感染的猪群中最为流行的基因型。PCV基因组为单股负链环状DNA,其中ORF2编码病毒核衣壳蛋白Cap蛋白,Cap蛋白是主要... 猪圆环病毒(PCV)能够引起多种综合征和疾病,给养猪业造成了较大的经济损失。PCV2毒株在2003年后以PCV2b取代PCV2a成为临床感染的猪群中最为流行的基因型。PCV基因组为单股负链环状DNA,其中ORF2编码病毒核衣壳蛋白Cap蛋白,Cap蛋白是主要的免疫原性蛋白。本研究利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统将PCV2b的Cap蛋白基因克隆到杆状病毒载体中,通过制备杆粒、转染sf9细胞,获得表达PCV2bCap蛋白的重组杆状病毒毒株,从IFA、SDS-PAGE及Western-blotting分析结果可以看出,该重组杆状病毒毒株成功表达了PCV2bCap蛋白,为制备PCV2bCap蛋白亚单位疫苗打下基础。 展开更多
关键词 PCV2b CAP蛋白 BAC-TO-BAC 转染 杆状病毒
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基于超支化聚酰胺胺可生物降解阳离子基因递送系统的构建与体外评价 预览
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作者 王杨 聂锦山 +1 位作者 顾准 朱铠 《中国组织工程研究》 CAS 北大核心 2019年第6期936-944,共9页
背景:与其他聚阳离子相比,超支化聚酰胺胺的细胞毒性小、生物相容性好、溶血活性低、易于表面修饰,在基因递送中是一类具有广阔应用前景的阳离子聚合物。但目前应用于基因转染的超支化聚酰胺胺大多不可降解,易在体内聚集引起细胞毒性。... 背景:与其他聚阳离子相比,超支化聚酰胺胺的细胞毒性小、生物相容性好、溶血活性低、易于表面修饰,在基因递送中是一类具有广阔应用前景的阳离子聚合物。但目前应用于基因转染的超支化聚酰胺胺大多不可降解,易在体内聚集引起细胞毒性。目的:合成还原降解超支化聚酰胺胺(redox-degradable hyperbranched polyamidoamine,DHPAA),考察其作为基因递送载体的安全性和有效性。方法:以N,N'-双(丙烯酰)胱胺(BAC)和1-(2-氨乙基)哌嗪(AEPZ)为功能性单体,通过迈克尔加成一锅法合成DHPAA,采用核磁共振氢谱、凝胶渗透色谱和酸碱滴定法对其结构和性能进行表征。采用自组装法制备DHPAA/DNA复合物,使二者质量比分别为1∶1、5∶1、10∶1、15∶1、20∶1;采用动态光散射和透射电镜测定复合物的粒径、形貌和Zeta电势;采用琼脂糖凝胶阻滞电泳、Picogreen荧光分析和体外释放DNA实验检测DHPAA对DNA的固缩能力及DHPAA的还原降解性。以人肾上皮细胞系HEK293、人乳腺癌细胞系MCF-7、间充质干细胞和子宫颈癌细胞系Hela为细胞模型,采用MTT法检测聚合物DHPAA的细胞毒性;以间充质干细胞和子宫颈癌细胞系Hela为细胞模型,采用MTT法检测DHPAA/DNA复合物的细胞毒性。以绿色荧光蛋白报告基因为研究对象(绿色荧光蛋白报告基因与DHPAA的质量比分别为1∶1、5∶1、10∶1、15∶1、20∶1),使用流式细胞仪与共聚焦激光扫描显微镜考察DHPAA在间充质干细胞中的体外转染效率。结果与结论:①合成的聚合物DHPAA结构符合分子设计,在pH=3-10范围内具有良好的缓冲能力;聚合物DHPAA对DNA分子具有很好的固缩能力,形成的复合物在生理条件下很稳定,在还原性介质中能够快速释放出DNA;当DHPAA/DNA质量比由1∶1增加到10∶1时,复合物的包封率逐渐增加,此后质量比继续增加包封率不再增加;②在1-200mg/L范围内,聚合物DHPAA对HEK293、MCF- 展开更多
关键词 超支化聚酰胺胺 还原降解 基因递送 基因传递系统 细胞转染效率 包封率 转染 聚合物 组织工程
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一种可高效转染的青鳉肌肉细胞系的建立与应用 预览
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作者 邓羽 王乾 +3 位作者 王艺舟 薛亭 罗君志 陈天圣 《水生生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第2期322-329,共8页
在哺乳动物细胞系中转基因的效率相对较高而在鱼类细胞系中相对较低,为了获得鱼类高效转基因细胞系,我们从模式鱼类青鳉(Oryzias latipes)中分离和构建了肌肉细胞系OLM。该细胞系类似于纤维细胞,在28℃DMEM和10%的胚胎牛血清中培养了超... 在哺乳动物细胞系中转基因的效率相对较高而在鱼类细胞系中相对较低,为了获得鱼类高效转基因细胞系,我们从模式鱼类青鳉(Oryzias latipes)中分离和构建了肌肉细胞系OLM。该细胞系类似于纤维细胞,在28℃DMEM和10%的胚胎牛血清中培养了超过88代。通过染色体分析,它属于两倍体并含有48条染色体。在脂质体介导下,报告基因的转染效率可以达到40%,在测试的其他鱼类细胞中转染效率最高。此外还构建了稳定转染转基因或者非编码RNA的细胞系。OLM细胞对常见的病毒SVCV、GCRV、SGIV等不敏感。综上所述,研究在青鳉中建立了一种能高效转染的肌肉细胞系,它适用于鱼类瞬时和稳定的转基因研究。 展开更多
关键词 青鳉 肌肉 细胞系 转染 转基因
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沉默ERRα对过表达DKK1、Sost重组腺病毒载体转染的MG63细胞影响研究
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作者 刘少津 乔荣勤 +2 位作者 万雷 黄宏兴 魏合伟 《按摩与康复医学》 2019年第9期36-39,共4页
目的:探讨雌激素相关受体α(ERRα)对Wnt信号通路抑制因子Dickkopf(DKK)1、骨硬化蛋白Sclerostin(Sost)过表达腺病毒载体转染的MG63细胞和相关蛋白Lrp5、CTGF、FGF2、OPN的影响作用。方法:将培养好的MG63细胞经过表达DKK1、Sost转染后... 目的:探讨雌激素相关受体α(ERRα)对Wnt信号通路抑制因子Dickkopf(DKK)1、骨硬化蛋白Sclerostin(Sost)过表达腺病毒载体转染的MG63细胞和相关蛋白Lrp5、CTGF、FGF2、OPN的影响作用。方法:将培养好的MG63细胞经过表达DKK1、Sost转染后分为空白对照组、过表达DKK1组、过表达Sost组、过表达(DKK1+Sost)组,根据组别不同用包装好的沉默ERRα干预过表达DKK1、Sost重组腺病毒载体转染后的MG63细胞,采用四甲基偶氮唑蓝微量酶反应比色法(MTT)检测细胞增殖、考马斯亮蓝蛋白定量法测定ALP活性、流式分析法测定钙离子浓度,Western blot检测MG63细胞中Lrp5、CTGF、FGF2、OPN蛋白的表达量。结果:①与空白对照组比较,过表达DKK1、Sost、DKK1+Sost组、沉默ERRα干预空载腺病毒组的高细胞活性、ALP活性和Lrp5、CTGF、FGF2、OPN的表达量均降低,钙离子浓度均升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。②与过表达DKK1、Sost、DKK1+Sost组比较,沉默ERRα干预过表达DKK1、Sost、DKK1+Sost组的细胞活性、ALP活性和Lrp5、CTGF、FGF2、OPN的表达量均降低,钙离子浓度均升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论:沉默ERRα可降低过表达DKK1、Sost重组腺病毒转染后的MG63细胞增殖和ALP活性,升高钙离子浓度,对Lrp5、CTGF、FGF2、OPN蛋白表达有一定影响作用,尤其对DKK1、Sost同时过表达时的作用最为明显。 展开更多
关键词 雌激素受体相关受体α(ERRα) DKK1 SOST 腺病毒 MG63细胞 过表达 转染
过表达慢病毒载体介导miR-1转染L6细胞增殖分化及组蛋白去乙酰化酶的表达 预览
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作者 弓贺炜 刘承伟 +1 位作者 梁炳生 李刚 《中国组织工程研究》 CAS 北大核心 2019年第13期2075-2080,共6页
背景:有研究认为组蛋白去乙酰化酶能够影响肌肉的分化和增殖,且其与miR-1关联紧密,但其具体调控机制尚不明确。目的:分析mi R-1过表达对L6成肌细胞增殖分化及组蛋白去乙酰化酶表达水平的影响。方法:构建表达含miR-1的重组慢病毒载体,进... 背景:有研究认为组蛋白去乙酰化酶能够影响肌肉的分化和增殖,且其与miR-1关联紧密,但其具体调控机制尚不明确。目的:分析mi R-1过表达对L6成肌细胞增殖分化及组蛋白去乙酰化酶表达水平的影响。方法:构建表达含miR-1的重组慢病毒载体,进行测序和酶切鉴定,稳定转染L6成肌细胞,采用RT-PCR检测miR-1的表达水平。取稳定转染miR-1重组慢病毒载体的L6成肌细胞(miR-1组)、转染空质粒重组慢病毒载体的L6成肌细胞(空载组)及未转染的L6成肌细胞(空白组),培养24,48,72,96 h后,采用CCK-8法检测细胞增殖,荧光显微镜下观察细胞形态变化,Western blot检测培养72 h后的α肌动蛋白表达;培养24,72,120 h后,Western blot与RT-PCR检测mi R-1组、空载组组蛋白去乙酰化酶蛋白及基因的表达。结果与结论:①miR-1慢病毒载体经酶切和测序鉴定正确,转染48 h后,mi R-1组L6成肌细胞miR-1基因表达显著高于空载组、空白组(P <0.01),实现了miR-1在L6成肌细胞中过表达;②培养24,48,72,96 h后,3组细胞增殖能力比较差异无显著性意义(P > 0.05);③培养24,48 h时,miR-1组与空白组、空载组细胞形态无明显差异;72 h以后,miR-1组呈梭形的成熟肌细胞显著增多,且细胞α肌动蛋白表达明显高于空载组、空白组,证实miR-1过表达促进了L6成肌细胞的分化;④随着时间推移,miR-1组的组蛋白去乙酰化酶蛋白条带较空载组明显变淡、变细;miR-1组培养不同时间点的组蛋白去乙酰化酶基因表达均低于空载组(P <0.01);⑤结果表明,miR-1过表达可促进L6成肌细胞的分化能力,其机制与抑制组蛋白去乙酰化酶4的表达相关。 展开更多
关键词 慢病毒载体 L6细胞 MIR-1 细胞分化 细胞增殖 Α肌动蛋白 组蛋白去乙酰化酶4 成肌细胞分化 转染 成肌细胞 微RNAs 肌动蛋白类 组织工程
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多聚赖氨酸在悬浮细胞转染中的应用
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作者 王俊婷 落继先 《生物技术通讯》 CAS 2019年第1期89-92,共4页
目的:悬浮细胞的转染较贴壁细胞存在一定难度,用多聚赖氨酸包被的细胞培养板培养悬浮细胞使其贴壁,用脂质体2000按照贴壁细胞转染的方法转染悬浮细胞,提供一种高效的转染悬浮细胞的方法。方法:悬浮细胞Jurkat或CCRF-CEM培养于包被了0.1m... 目的:悬浮细胞的转染较贴壁细胞存在一定难度,用多聚赖氨酸包被的细胞培养板培养悬浮细胞使其贴壁,用脂质体2000按照贴壁细胞转染的方法转染悬浮细胞,提供一种高效的转染悬浮细胞的方法。方法:悬浮细胞Jurkat或CCRF-CEM培养于包被了0.1mg/mL多聚赖氨酸的细胞培养板,16h后洗掉未贴壁的细胞,用脂质体2000分别将pWPXLd质粒或靶向人ABL1基因的小干扰RNA(siRNA)转染细胞,24h后于荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达,鉴定质粒的转染效率,或用Western印迹鉴定siRNA的干扰效率。结果:pWPXLd成功转染2种细胞,siRNA成功抑制了ABL1的表达。结论:质粒和siRNA均能成功转染,提供了一种高效可行的转染悬浮细胞的方法。 展开更多
关键词 悬浮细胞 转染 多聚赖氨酸 小干扰RNA 白血病
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VEGF165质粒转染对骨髓内皮祖细胞增殖能力的影响
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作者 杨钰兴 肖明朝 《中华内分泌外科杂志》 CAS 2019年第1期63-66,共4页
目的探讨脂质体介导pcDNA3.1(+)/VEGF165质粒转染骨髓血管内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)对EPCs增殖的影响。方法体外分离、培养EPCs、免疫组织化学及细胞流式仪鉴定EPCs,转染VEGF165后,采用反转录聚合酶链反应(RT-PCR... 目的探讨脂质体介导pcDNA3.1(+)/VEGF165质粒转染骨髓血管内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)对EPCs增殖的影响。方法体外分离、培养EPCs、免疫组织化学及细胞流式仪鉴定EPCs,转染VEGF165后,采用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测内皮祖细胞中VEGF165mRNA的表达,酶联免疫吸附法(ELISA)检测EPCs培养上清液中VEGF蛋白水平,噻唑蓝(MTT)检测VEGF165质粒转染后对EPCs的影响。结果EPCs表达CD34、CD133及KDR细胞表面标志,PCR后凝胶电泳显示pcDNA3.1(+)/VEGF165质粒转染组在576bp处可见有明显条带,pcDNA3.1(+)空质粒转染组和未转染组可见微弱的电泳带。ELISA检测结果表明pcDNA3.1(+)/VEGF165质粒转染组VEGF165水平较其他两组高,MTT显示VEGF165质粒转染可促进EPCs增殖。结论EPCs可成功转染VEGF165基因,并促进EPCs增殖,为治疗勃起功能障碍提供实验依据。 展开更多
关键词 内皮祖细胞 血管内皮生长因子 转染
rAAV9-NGF基因转染糖尿病大鼠对心脏损伤的保护作用 预览
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作者 易剑敏 岳维 +1 位作者 高盼 张伟男 《中国药理学通报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第3期424-429,共6页
目的探讨通过心肌点注射,重组腺相关病毒9型(recombinant adeno-associated virus serotype 9,rAAV9)介导神经生长因子(nerve growth factor,NGF)基因转染糖尿病大鼠,对心脏损伤的保护作用。方法大鼠糖尿病模型建立后4周,心脏点注射携带... 目的探讨通过心肌点注射,重组腺相关病毒9型(recombinant adeno-associated virus serotype 9,rAAV9)介导神经生长因子(nerve growth factor,NGF)基因转染糖尿病大鼠,对心脏损伤的保护作用。方法大鼠糖尿病模型建立后4周,心脏点注射携带NGF基因的重组腺相关病毒(rAAV9-NGF),使心肌组织过表达NGF。5周后,免疫荧光检测NGF、降钙素基因相关肽(calcitonin gene-related peptide,CGRP)和神经纤维的分布;血流动力学参数评估心脏功能;ELISA法检测心肌组织中NGF、CGRP等蛋白表达水平。结果rAAV9介导的外源基因NGF可稳定转染,且过表达于糖尿病大鼠的心肌组织,LVSP、HR、+dp/dt max明显下降,LVEDP、-dp/dt max明显上升,心功能改善;心肌组织中的NGF、CGRP蛋白上调;免疫荧光结果显示,转染后可部分逆转心肌组织NGF、CGRP和神经纤维的减少。结论心肌点注射rAAV9-NGF基因可有效提高糖尿病大鼠心肌NGF的表达,促进神经纤维的生长,产生对心脏的保护作用。 展开更多
关键词 神经生长因子 降钙素基因相关肽 转染 重组腺相关病毒 糖尿病周围神经病变 心脏病
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Viral RNA-based transfection and expression of enhanced green fluorescent protein in the parasitic protozoan Eimeria stiedae
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作者 Caiyan Xin Jianhua Li +5 位作者 Pengtao Gong Bin Wu Nan Zhang Ju Yang Xuepeng Cai Xichen Zhang 《生物化学与生物物理学报:英文版》 SCIE CAS CSCD 2019年第2期216-218,共3页
Eimeria stiedae(E.stiedae),the most common protozoan pathogen of rabbits,causes coccidiosis.This disease is problematic for rabbit breeders [1].There is little information about the cellular and molecular biology of t... Eimeria stiedae(E.stiedae),the most common protozoan pathogen of rabbits,causes coccidiosis.This disease is problematic for rabbit breeders [1].There is little information about the cellular and molecular biology of this pathogen and a lack of genetic tools.Genetic manipulation is necessary to advance our understanding of parasite biology and ultimately develop vaccines and treat diseases.DNA-mediated and viral RNA-mediated transfection systems have successfully been established in many protozoan parasites [2,3].It was discovered that E.stiedae possesses a dsRNA virus(EsRV1),and more recently,the genome of this virus has been sequenced.To date,however,there is no report on the use of viral RNA-mediated transfection for E.stiedae.In this study,we report a transient viral RNA-mediated transfection of E.stiedae using enhanced green fluorescent protein(EGFP)as a reporter gene.Our study provides a valuable genetic tool for studying the biology of E.stiedae. 展开更多
关键词 VIRAL RNA-based TRANSFECTION enhanced green fluorescent protein dsRNA virus(EsRV1)
PRDX6过表达增强肺癌细胞系A549的迁移和侵袭 预览
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作者 郑伟荣 陈日玲 +1 位作者 赵利敏 关毅 《基础医学与临床》 CSCD 2019年第3期365-368,共4页
目的探讨PRDX6过表达对肺癌细胞系A549迁移性及侵袭性的影响。方法1)体外培养人肺癌细胞系A549,分为空白组、转染PRDX6组、转染空质粒组。2)Western blot检测细胞PRDX6蛋白表达;3)Transwell小室法检测细胞的迁移性及侵袭性。结果1)转染P... 目的探讨PRDX6过表达对肺癌细胞系A549迁移性及侵袭性的影响。方法1)体外培养人肺癌细胞系A549,分为空白组、转染PRDX6组、转染空质粒组。2)Western blot检测细胞PRDX6蛋白表达;3)Transwell小室法检测细胞的迁移性及侵袭性。结果1)转染PRDX6组PRDX6蛋白表达较空白组及转染空的质粒组明显增高(均P<0.05);2)转染PRDX6组迁移性及侵袭性较空白组及转染空质粒组显著增高(P<0.05)。结论PRDX6的高表达增强肺癌细胞系A549的迁移性及侵袭性。 展开更多
关键词 A549细胞 PRDX6 转染 侵袭性 迁移性
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微小RNA-1266对钠通道蛋白表达和分布的影响 预览
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作者 李彬 杨水祥 《中华老年心脑血管病杂志》 CAS 北大核心 2019年第1期72-76,共5页
目的探讨心房颤动(AF)相关微小RNA-1266-5p(miR-1266-5p)与AF相关钠离子通道蛋白α亚基编码基因SCNA5的靶向调控关系。方法构建含有预测结合位点3'非翻译区(3'UTR)序列的靶基因,将其与阴性对照质粒以及miRNA共转染入人胚肾HEK29... 目的探讨心房颤动(AF)相关微小RNA-1266-5p(miR-1266-5p)与AF相关钠离子通道蛋白α亚基编码基因SCNA5的靶向调控关系。方法构建含有预测结合位点3'非翻译区(3'UTR)序列的靶基因,将其与阴性对照质粒以及miRNA共转染入人胚肾HEK293细胞,实验分为空白对照组、阴性对照组、实验一组(pcDNA3.1-SCN5A 3'UTR改建质粒+miR-1266)和实验二组(pcDNA3.1-SCN5A WT质粒,不含3'UTR端+miR-1266),荧光定量PCR法和Western blot法检测各组钠通道蛋白SCN5A mRNA和Nav1.5蛋白表达变化,免疫荧光实验观察SCN5A Nav1.5蛋白表达和分布变化。结果与空白对照组和阴性对照组比较,实验一组SCN5A mRNA表达分别下调49.4%和46.0%,差异有统计学意义(0.557±0.016 vs 1.101±0.132和1.031±0.020,P<0.05),而实验二组SCN5A mRNA表达无显著变化(P >0.05);实验一组SCN5A Nav1.5蛋白表达下降,而实验二组SCN5A Nav1.5蛋白表达无显著变化;实验一组和实验二组的SCN5A Nav1.5蛋白分布都无显著变化。结论SCN5A可能是miR-1266的直接靶基因,miR-1266可能通过负性调控SCN5A表达参与AF电重构。 展开更多
关键词 心房颤动 钠通道 微RNAS 转染 基因表达
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沉默ADAM17对HT29人结肠癌细胞体外侵袭能力的影响及机制探究 预览
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作者 张琪 杨光华 +5 位作者 黄志强 葛志鹏 刘少鹏 田炜 张国志 王长友 《中国现代医学杂志》 CAS 2019年第7期24-29,共6页
目的探究沉默解聚素-金属蛋白酶17(ADAM17)对HT29人结肠癌细胞体外侵袭能力的影响及机制。方法HT29人结肠癌细胞经慢病毒转染处理后沉默ADAM17蛋白的表达,实时聚合酶链反应(real-timePCR)检测ADAM17mRNA的表达,单层细胞划痕损伤修复实... 目的探究沉默解聚素-金属蛋白酶17(ADAM17)对HT29人结肠癌细胞体外侵袭能力的影响及机制。方法HT29人结肠癌细胞经慢病毒转染处理后沉默ADAM17蛋白的表达,实时聚合酶链反应(real-timePCR)检测ADAM17mRNA的表达,单层细胞划痕损伤修复实验检测细胞迁移能力的变化,Transwell体外侵袭实验检测细胞侵袭能力的改变,westernblotting检测转染后MMP-9蛋白及ERK表达情况。结果经慢病毒转染处理后HT29细胞的ADAM17表达被抑制(P<0.05)。与空白对照组比较,沉默ADAM17的表达后,转染组细胞的迁移和侵袭能力被抑制(P<0.05);沉默ADAM17后,细胞基质金属蛋白酶9(MMP-9)表达水平下调、磷酸化细胞外调节蛋白激酶(p-ERK1/2)表达水平下降(P<0.05),但细胞外调节蛋白激酶(ERK)表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。结论ADAM17可能通过抑制ERK通路激活下调MMP-9的表达,从而影响细胞迁移、侵袭能力。 展开更多
关键词 结肠肿瘤 解聚素-金属蛋白酶17 转染 小干扰RNA 侵袭 细胞外调节蛋白激酶
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