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从一名HIV-1感染者中分离出能中和2株Tier 2病毒的单克隆抗体
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作者 鞠斌 李丹 +5 位作者 梁华 任莉 郝彦玲 王硕 魏民 邵一鸣 《中华微生物学和免疫学杂志》 CSCD 北大核心 2018年第2期81-87,共7页
目的 从中国HIV-1感染者中分离和鉴定能够中和二级难中和(Tier 2)病毒的单克隆中和抗体.方法 单个B细胞流式分选和单克隆抗体表达技术获得单克隆抗体,免疫遗传学数据库分析抗体可变区基因,酶联免疫吸附试验测定抗体的结合能力,TZM-bl... 目的 从中国HIV-1感染者中分离和鉴定能够中和二级难中和(Tier 2)病毒的单克隆中和抗体.方法 单个B细胞流式分选和单克隆抗体表达技术获得单克隆抗体,免疫遗传学数据库分析抗体可变区基因,酶联免疫吸附试验测定抗体的结合能力,TZM-bl/假病毒中和试验测定抗体的中和能力.结果 从一个HIV-1 B亚型病毒感染者中分离到了E11和H2两个能够中和2株Tier 2病毒的单克隆中和抗体;E11和 H2抗体的重链基因均来源于 IGHV4-4*08家系,突变率分别为15.79%和14.74%,轻链基因均来源于IGKV3-15*01家系,突变率分别为8.33%和7.95%;两个抗体可与B亚型、CRF01_AE和CRF07_BC病毒蛋白结合;E11和H2抗体对398-F1病毒(Tier 2)的50%抑制浓度分别为18. 78 μg/ml 和22. 43 μg/ml,中和25710病毒(Tier 2)的浓度分别为43.35 μg/ml和39.45 μg/ml.结论 本研究成功分离到了两个能够中和2株Tier 2病毒的单克隆中和抗体,能够为相关艾滋病疫苗的设计提供研究基础. 展开更多
关键词 单克隆抗体 中和活性 流式分选 二级难中和 人类免疫缺陷病毒1型
人源天然抗TNF-α ScFv抗体的筛选及性质分析 预览
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作者 乔玉玲 卢卫嘉 +5 位作者 陈继军 秦海艳 王建锋 张超 熊颖 毛晓燕 《微生物学免疫学进展》 2018年第2期20-26,共7页
目的以人肿瘤坏死因子(human tumour necrosis factor-α,humanTNF.d)为靶抗原,从构建好的人源天然单链抗体(single-chain antibody fragment,ScFv)噬菌体抗体库中筛选对应的SeFv抗体,验证其中和活性后测定动力学常数(kinetic... 目的以人肿瘤坏死因子(human tumour necrosis factor-α,humanTNF.d)为靶抗原,从构建好的人源天然单链抗体(single-chain antibody fragment,ScFv)噬菌体抗体库中筛选对应的SeFv抗体,验证其中和活性后测定动力学常数(kinetic dissociation,KD)。方法以TNF-α梯度稀释后包被免疫管,对人源天然ScFv噬菌体抗体库进行3轮吸附-洗脱-扩增的富集筛选,制备TNF-α单克隆噬菌体抗体颗粒,经ELISA试验筛选阳性克隆后测序并分析:将正确的阳性抗体序列亚克隆到pET-26b表达载体上,原核表达后用Ni Sepharose 6 Fast Flow介质进行纯化:用MTT比色法对筛选的ScFv进行中和活性验证,并测定其中和抗体的KD。结果通过3轮筛选共得到18个正确的抗体氨基酸序列,对其原核表达及纯化后得到的6株可溶性表达的抗TNF-α ScFv进行中和活性验证,并对其中有中和活性的4株ScFv抗体测定KD。结论从人源天然ScFv噬菌体抗体库中成功地筛选出4株抗人TNF-α的ScFv中和抗体,其中1株ScFv抗体的KD为4.80×10^-8,细胞毒中和率达到48.9%,达到了药用级抗人TNF-α中和抗体的研发要求.为全分子抗体药物的构建及稳定细胞株的筛选奠定了一定的基础。 展开更多
关键词 噬菌体抗体库 人肿瘤坏死因子Α 筛选 中和活性 亲和力
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H3N2亚型犬流感病毒单链抗体的制备
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作者 邱冬 赵丹 刘永杰 《中国兽医科学》 CSCD 北大核心 2018年第5期574-579,共6页
为制备犬流感病毒(CIV)单链抗体(scFv),采用纯化的CIV抗原免疫BALB/c小鼠后,取小鼠脾组织提取总RNA,采用PCR方法扩增重链、轻链可变区基因片段,利用重叠延伸PCR将重链、轻链通过弹性肽链连接物Linker连接,构建VH-Linker-VL融合片段... 为制备犬流感病毒(CIV)单链抗体(scFv),采用纯化的CIV抗原免疫BALB/c小鼠后,取小鼠脾组织提取总RNA,采用PCR方法扩增重链、轻链可变区基因片段,利用重叠延伸PCR将重链、轻链通过弹性肽链连接物Linker连接,构建VH-Linker-VL融合片段,并将其插入原核表达载体pET-32a(+)后转化大肠杆菌,重组菌经IPTG诱导表达,获得45 ku左右的目的蛋白。Western-blotting结果表明,该蛋白能被抗His标签的单抗特异性识别。间接ELISA及中和试验结果表明,scFv能够与CIV发生特异性结合反应,具有中和活性。本研究成功制备了针对H3N2亚型CIV单链抗体,为该病毒感染的诊断和治疗提供了物质基础。 展开更多
关键词 犬流感病毒 单链抗体 原核表达 中和活性
利用单个B细胞分选方法获得HIV-1单克隆抗体基因及功能鉴定
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作者 鞠斌 郝彦玲 +6 位作者 李丹 任莉 梁华 王硕 侯佳利 魏民 邵一鸣 《中华微生物学和免疫学杂志》 CSCD 北大核心 2018年第7期481-487,共7页
目的从人类免疫缺陷病毒1型(human immunodeficiency virus-1,HIV-1)感染者中获得单克隆抗体基因及功能鉴定。方法单细胞流式分选得到抗原特异性单个B细胞,基因扩增和测序得到抗体可变区序列,BioEdit软件包中Sequence Identity Mat... 目的从人类免疫缺陷病毒1型(human immunodeficiency virus-1,HIV-1)感染者中获得单克隆抗体基因及功能鉴定。方法单细胞流式分选得到抗原特异性单个B细胞,基因扩增和测序得到抗体可变区序列,BioEdit软件包中Sequence Identity Matrix程序分析基因序列一致性,免疫遗传学数据库分析抗体基因家系和突变率,酶联免疫吸附试验测定抗体结合能力,TZM-bl/假病毒试验检测抗体中和能力。结果从3个HIV-1感染者中分别获得了4个、7个和11个不同抗体的重链和轻链基因序列,其基因家系、CDR3长度和突变率广泛多样;验证了一个感染者的4个抗体基因序列,抗体A1和B3是HIV-1单克隆结合抗体,能同时与B亚型、CRF01_AE和CRF07_BC抗原蛋白结合;A1和B3也是HIV-1单克隆中和抗体,能够中和C亚型的MW965病毒,50%抑制浓度分别为0.04 μg/ml和37.34 μg/ml。结论本研究成功获得了大量的单克隆抗体基因,并对其中的部分序列进行了功能验证,为单克隆抗体的分离和鉴定等研究工作提供了基础。 展开更多
关键词 单个B细胞分选 抗体基因 序列分析 结合能力 中和活性
抗乙型肝炎病毒S抗原全人单克隆抗体的制备和表位探究 预览
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作者 佀传亚 潘少坤 +4 位作者 凌志洋 伊春艳 邓志瑞 谢幼华 孙兵 《中国免疫学杂志》 CSCD 北大核心 2018年第7期1029-1033,共5页
目的:针对乙型肝炎病毒S蛋白,制备全人单克隆抗体,对其亲和力、中和病毒活性及抗体所结合的抗原表位进行研究。所制备的全人抗体可应用于乙肝病毒的暴露后预防,为阻断母婴传播提供治疗手段。方法:通过流式分选和单细胞RT-PCR技术获得... 目的:针对乙型肝炎病毒S蛋白,制备全人单克隆抗体,对其亲和力、中和病毒活性及抗体所结合的抗原表位进行研究。所制备的全人抗体可应用于乙肝病毒的暴露后预防,为阻断母婴传播提供治疗手段。方法:通过流式分选和单细胞RT-PCR技术获得单克隆抗体;利用间接ELISA法检测抗体结合活性,进行表位分析;Hep G2-NTCP细胞用于病毒感染,KHB乙型肝炎病毒e抗原诊断试剂盒检测细胞上清中HBe Ag的指标。结果:获得三株具有中和活性,可以结合三种乙肝病毒亚型S蛋白的抗体,其中1F2、2A1两株抗体的结合依赖于抗原蛋白的天然构象,2H2抗体的结合依赖于连续的氨基酸序列;1F2、2H2抗体结合的位置位于S蛋白胞外区第一个免疫环状区域。结论:利用单细胞RT-PCR技术成功制备了针对乙肝病毒S蛋白的抗体,其具有中和作用。抗原表位位于S蛋白胞外区的第一个免疫环状区域内。 展开更多
关键词 乙型肝炎 全人单克隆抗体 单细胞RT-PCR 中和活性 抗体表位
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两株H1N1亚型猪流感病毒HA蛋白中和性单克隆抗体的制备及抗病毒活性研究 预览
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作者 梁文花 贾云慧 +5 位作者 许程志 吴运谱 陈艳 杨焕良 乔传玲 陈化兰 《畜牧兽医学报》 CSCD 北大核心 2018年第7期1460-1466,共7页
为了制备抗欧亚类禽型(Eurasian avian-like,EA)H1N1猪流感病毒(SIV)血凝素(HA)蛋白的单克隆抗体(MAb)并对其生物学活性进行检测,利用SIV A/swine/Henan/11/2005(HN11)增殖、纯化的全病毒蛋白作为免疫原,免疫BALB/c小鼠,取免... 为了制备抗欧亚类禽型(Eurasian avian-like,EA)H1N1猪流感病毒(SIV)血凝素(HA)蛋白的单克隆抗体(MAb)并对其生物学活性进行检测,利用SIV A/swine/Henan/11/2005(HN11)增殖、纯化的全病毒蛋白作为免疫原,免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞(SP2/0)融合,采用间接ELISA和HI检测方法进行筛选。结果获得了两株能稳定分泌抗HA蛋白MAb的杂交瘤细胞株,分别命名为2B6和4C7;两株MAbs的腹水ELISA和HI效价均分别高于1∶107和5log2;两株MAbs能够在IFA试验中与病毒HA蛋白发生反应,而在Western blot试验中不能检测到病毒HA蛋白;病毒中和试验结果显示这两株MAbs对EA H1N1SIV具有病毒中和活性;MAbs的抗病毒活性又进一步通过小鼠的感染试验进行了评估,结果表明接种了MAbs的小鼠获得了有效抵抗同源及异源H1N1SIV感染的保护效果。研究证实制备的两株MAbs具有较高的病毒中和活性和较强的抗病毒感染能力,可以将其进一步应用于抗EA H1N1SIV的感染及开展病毒抗原性变异的分子基础研究。 展开更多
关键词 猪流感病毒 HA蛋白 单克隆抗体 中和活性
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H9亚型禽流感病毒单克隆抗体的制备及鉴定
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作者 邢晓伟 陈惠娴 +1 位作者 李桂梅 单虎 《农业生物技术学报》 CSCD 北大核心 2018年第3期540-546,共7页
A型流感病毒(Influenza A viruses, IAVs)可以感染禽类和包括人类(Homo sapiens)在内的多种哺乳动物,造成重大经济损失,严重威胁人类健康。接种流感疫苗是预防流感发生的最有效手段,然而不同免疫策略对疫苗接种效果的影响仍未知... A型流感病毒(Influenza A viruses, IAVs)可以感染禽类和包括人类(Homo sapiens)在内的多种哺乳动物,造成重大经济损失,严重威胁人类健康。接种流感疫苗是预防流感发生的最有效手段,然而不同免疫策略对疫苗接种效果的影响仍未知。为探讨不同免疫策略对流感病毒免疫小鼠(Mus musculus)后抗体产生的影响,本研究选取两株血清学交叉反应性较弱的H9N2亚型禽流感病毒(A/chicken/Hubei/YK524/2015, A/chicken/Shandong/LX830/2014, 分别简称为YK524和LX830)作为研究对象,比较了同源免疫与异源免疫以及病毒灭活与否对抗体产生的影响。首先将病毒通过蔗糖梯度离心纯化,免疫6~7周龄雌性BALB/C小鼠,定期采集血清测定血凝抑制效价(haemagglutinin inhibition titer, HIT)。结果显示,活病毒抗原较灭活病毒抗原刺激小鼠产生的抗体水平更高,具备良好的交叉反应性。说明活病毒更易于刺激机体产生具有广泛交叉反应性的抗体。另一方面,异源免疫可刺激机体产生更多交叉反应性抗体。本研究进一步选择抗体效价较高的两只小鼠,利用杂交瘤技术制备抗流感病毒单克隆抗体。采用间接免疫荧光法筛选抗体分泌克隆。将阳性克隆经过3轮亚克隆,最终获得3株持续分泌抗体的细胞株,分别命名为H9-1、H9-2和H9-3。在对抗体进行鉴定中,发现3株抗体均对LX830及另外1株H9N2亚型禽流感病毒A/Mink/Shandong/wm/2014(Mink/SD/14)具有血凝抑制活性及中和活性,H9-1与H9-2抗体的血凝抑制效价和中和抗体活性均高于H9-3。推测这3株抗体的抗原识别表位位于血凝素(haemagglutinin, HA)球部受体结合部位。3株抗体均不可与YK524发生特异性结合,也不具备血凝抑制活性及中和活性,推测可能与YK524的血凝素基因上关键位点的差异有关。本研究探讨了可刺激机体产生更广谱抗体应答的途径,为流� 展开更多
关键词 禽流感病毒 H9N2 单克隆抗体 血凝抑制试验 中和活性
鸡新城疫病毒中和单克隆抗体的制备及鉴定 预览
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作者 李青梅 王丽 +9 位作者 冯丽丽 张雨杭 赵东 杨艳艳 邢广旭 柴书军 李赛赛 张丽萍 郭军庆 张改平 《河南农业科学》 CSCD 北大核心 2017年第1期127-131,共5页
采用差速离心法纯化鸡新城疫病毒(NDV)标准毒株F48E8,免疫Balb/c小鼠,应用杂交瘤细胞技术制备抗NDV单克隆抗体,旨在为NDV中和抗原表位分析奠定基础。将NDV感染BHK-21细胞,建立异源免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)的单克隆抗体检... 采用差速离心法纯化鸡新城疫病毒(NDV)标准毒株F48E8,免疫Balb/c小鼠,应用杂交瘤细胞技术制备抗NDV单克隆抗体,旨在为NDV中和抗原表位分析奠定基础。将NDV感染BHK-21细胞,建立异源免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)的单克隆抗体检测方法,筛选获得14株分泌抗NDV单克隆抗体杂交瘤细胞株,其单克隆抗体腹水IPMA效价均在0.50×10-2~2.56×10-5(F48E8株和La Sota株)。血凝抑制试验(HI)结果表明,单克隆抗体1G6、2C1、4D2、5F2和13A5具有血凝抑制活性,其HI效价在(6~12)log2(F48E8株)和(9~11)log2(La Sota株)。病毒中和试验结果表明,单克隆抗体5F2和13A5对F48E8株和La Sota株均有明显的病毒中和活性,中和效价分别为1∶400~1∶800和1∶25。夹心ELISA结果表明,单克隆抗体5F2识别NDV HN蛋白,13A5识别F蛋白。综上,成功制备了具有中和活性的NDV单克隆抗体(5F2和13A5)。 展开更多
关键词 鸡新城疫病毒 单克隆抗体 免疫过氧化物酶单层细胞试验 血凝抑制试验 中和试验 中和活性
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芋螺毒素GI抗血清制备及中和活性研究
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作者 唐艺菲 胡小波 +1 位作者 余硕 戴秋云 《军事医学》 CSCD 北大核心 2017年第5期338-341,共4页
目的测定芋螺毒素GI与牛血清白蛋白(BSA)偶联物免疫小鼠后产生的抗血清是否具有中和GI毒素作用。方法戊二醛法制备GI-BSA偶联物,免疫小鼠,制备GI小鼠抗血清,应用抗血清的抗体中和实验,验证其对GI的解毒作用。结果 SDS-PAGE蛋白电泳结... 目的测定芋螺毒素GI与牛血清白蛋白(BSA)偶联物免疫小鼠后产生的抗血清是否具有中和GI毒素作用。方法戊二醛法制备GI-BSA偶联物,免疫小鼠,制备GI小鼠抗血清,应用抗血清的抗体中和实验,验证其对GI的解毒作用。结果 SDS-PAGE蛋白电泳结果显示,GI与BSA成功偶联,GI-BSA在〉标志物相对分子质量(120×10^3)处有两条新蛋白带;GI-BSA(99μg/只)每隔2周免疫1次,共免疫4次,第4次免疫后第10天抗血清中和滴度效价〉1∶64 000;混合100及200μl小鼠抗血清与≥1 LD_(50)剂量GI,腹腔注射,100μl血清可使1×LD_(50)毒素(16.3μg/kg)组小鼠75%存活,200μl血清可使25.8μg/kg毒素组小鼠75%存活。结论基于GI-BSA半抗原免疫的小鼠抗血清对GI毒素具有明显的解毒作用。 展开更多
关键词 芋螺毒素类 牛血清白蛋白 偶联 免疫 中和活性
抗α干扰素双特异性抗体的制备与初步评价 预览
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作者 陈鸿斌 侯小娟 +6 位作者 袁旭东 于晓妍 徐磊 王双 郁雯科 杜鹏 孙志伟 《生物技术通讯》 CAS 2017年第6期742-749,共8页
目的:研制对α干扰素(IFN-α)中和活性有突破性提升的双特异性抗体。方法:以靶向IFN-α不同表位的中和单抗Amilimumab和Sifalimumab为基础,采用FIT-Ig(Fabs-in-tandem immunoglobulin)双特异性抗体平台技术,通过分子克隆方法构... 目的:研制对α干扰素(IFN-α)中和活性有突破性提升的双特异性抗体。方法:以靶向IFN-α不同表位的中和单抗Amilimumab和Sifalimumab为基础,采用FIT-Ig(Fabs-in-tandem immunoglobulin)双特异性抗体平台技术,通过分子克隆方法构建针对IFN-α的双特异性抗体FIT2的表达载体,并在FreeStyle293-F系统中进行瞬时转染表达;采用proteinA柱亲和纯化目标双特异性抗体,SDS-PAGE初步考察目标抗体的相对分子质量、组分及纯度;采用forteBIO系统鉴定其整体结合活性,并分别确认双特异性抗体的2个抗原结合表位的活性;通过ELISA方法评价其特异性,37℃放置实验鉴定其稳定性,Daudi细胞增殖实验定量评价双特异性抗体的中和活性。结果:构建了双特异性抗体FIT2表达载体,在FreeStyle293-F系统中实现了瞬转高效表达,表达量为127mg/L,亲和纯化获得目标双特异性抗体FIT2,纯度可达98.5%;FIT2结构稳定,具有良好的特异性,未发现与其他类型的干扰素及细胞因子存在交叉反应;FIT2对IFN-α1b-His的结合活性显著优于2个亲本抗体,特别是解离过程的改善尤为明显;同时,FIT2有效保留了2个抗原结合表位的活性;细胞增殖实验结果显示,FIT2对IFN-α1b具有优越的中和活性,其中和效能显著高于任一亲本抗体,明显优于2个亲本抗体联用。结论:获得了对IFN-α1b中和活性有突破性提升的双特异性抗体FIT2,特异性良好且结构稳定,有望成为治疗IFN-α相关疾病的良好的成药候选分子。 展开更多
关键词 双特异性抗体 FIT-Ig Α干扰素 抗原结合表位 中和活性
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中国HIV-1感染者中分离单克隆中和抗体的初步研究
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作者 鞠斌 李丹 +5 位作者 任莉 郝彦玲 张蕾 王硕 魏民 邵一鸣 《中国病毒病杂志》 CAS 2017年第5期354-359,共6页
目的从中国人类免疫缺陷病毒1型(human immunodeficiency virus-1,HIV-1)感染者中分离单克隆中和抗体,并对其生物活性进行初步鉴定。方法采用抗原特异性单个B细胞分选和单克隆抗体表达技术从感染者中分离单克隆抗体,采用免疫遗传学数... 目的从中国人类免疫缺陷病毒1型(human immunodeficiency virus-1,HIV-1)感染者中分离单克隆中和抗体,并对其生物活性进行初步鉴定。方法采用抗原特异性单个B细胞分选和单克隆抗体表达技术从感染者中分离单克隆抗体,采用免疫遗传学数据库(immunogenetics database,IMGT)分析抗体的可变区基因,采用酶联免疫吸附实验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测抗体的结合能力,采用TZM-bl/假病毒中和实验检测抗体的中和能力。结果从一个HIV-1CRF07_BC病毒感染者中分离到了两个单克隆抗体(A1和A6);两个抗体的重链来源于不同家系(IGHV5-51*01和IGHV4-59*01),轻链分别利用lambda链和kappa链,可变区基因的突变率较低;两个抗体与CRF01_AE、B亚型和CRF07_BC病毒的结合能力较强,可以中和Tier 1的SF162病毒(B亚型)和MW965病毒(C亚型),不能中和12个Tier 2的病毒(Global Panel)。结论本研究成功分离到了两个具有交叉反应性的单克隆中和抗体,丰富了HIV-1中和抗体的研究,也为艾滋病的抗原检测和治疗等应用领域提供备选的免疫制剂。 展开更多
关键词 人类免疫缺陷病毒1(HIV-1) 单个B细胞分选 单克隆抗体 中和活性
从人类免疫缺陷病毒1型感染者中筛选中和抗体的研究
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作者 刘雪 王琬玓 +3 位作者 冯霞 徐柯 余双庆 曾毅 《中国病毒病杂志》 CAS 2016年第2期99-104,共6页
目的利用B细胞培养和RT-PCR技术从我国人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)感染者中筛选出具有广谱中和活性的人单克隆抗体。方法本研究采集HIV-1感染者抗凝全血,分离出外周血单个核细胞,用磁珠分选纯化记忆性B细胞,在体外选择3T3-hCD40L作为... 目的利用B细胞培养和RT-PCR技术从我国人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)感染者中筛选出具有广谱中和活性的人单克隆抗体。方法本研究采集HIV-1感染者抗凝全血,分离出外周血单个核细胞,用磁珠分选纯化记忆性B细胞,在体外选择3T3-hCD40L作为饲养细胞,并使用细胞因子白细胞介素(IL)-2和IL-21诱导记忆性B细胞分泌IgG,用HIV假病毒微量中和的方法进行筛选。从有中和活性的孔中分别扩增出B细胞IgG的轻链和重链基因,并将其克隆到含IgG恒定区基因的载体上。然后将携带重链和轻链基因的质粒进行大量表达,得到人单克隆抗体,并进行抗体结合活性、中和活性及与抗原Gp120亲和力的鉴定。结果从我国3例HIV-1感染者记忆性B细胞中筛选出3株对HIV-1Env抗原有结合活性的单克隆抗体。其中8E7和55B3主要与Gp120结合,19GF3与Gp120和FLSC均可结合且结合活性无明显差异;基因变异大的8E7抗体对A、B、C三种亚型的假病毒均有一定的中和活性,55B3对SF162有中和活性,19GF3未检测到中和活性;这三种单抗的亲和力都很强,8E7、19GF3、55B3与抗原Gp120的KD值分别为6.45×10^(-10) mol/L、1.12×10^(-10) mol/L、2.76×10^(-10) mol/L。结论成功建立了在96孔板中高效刺激人B细胞在体外分泌IgG的方法,并利用HIV假病毒微量中和实验和RT-PCR技术筛选得到对HIV-1具有中和活性的人单克隆抗体。 展开更多
关键词 人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1) 单克隆抗体 结合活性 中和活性
抗HPV11病毒样颗粒单克隆抗体的性质鉴定及初步应用 预览
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作者 李敏 林知捷 +3 位作者 魏旻希 李少伟 夏宁邵 赵勤俭 《中国生化药物杂志》 CAS 2016年第4期9-14,共6页
目的分析和鉴定抗HPV11病毒样颗粒(virus-like particle,VLP)鼠源单克隆抗体的性质,筛选性质和生物学活性较优的抗体,并初步应用于抗原或疫苗的质量分析。方法分别利用间接ELISA法和Western blot对HPV11的22株单克隆抗体的亚类、与HPV... 目的分析和鉴定抗HPV11病毒样颗粒(virus-like particle,VLP)鼠源单克隆抗体的性质,筛选性质和生物学活性较优的抗体,并初步应用于抗原或疫苗的质量分析。方法分别利用间接ELISA法和Western blot对HPV11的22株单克隆抗体的亚类、与HPV11 VLP的结合能力和构象敏感性进行检测;采用血凝抑制实验对单克隆抗体的血凝抑制活性进行分析;运用基于假病毒的抗体中和实验对单克隆抗体的中和活性进行鉴定,选出中和活性高的单抗进行两两配对,采用双抗夹心ELISA法捕获单抗并筛选合适的配对双抗。结果对22株单抗的性质进行了详细和完整的鉴定,并根据构象敏感性进行排序,筛选出6株型别特异、结合活性强且中和活性高的单抗(2A2、4A1-3、16G7、14A6、9C12和19C7);成功建立了基于单抗的双抗夹心(14A6∶Ag∶9C12-HRP)ELISA定量分析方法。结论获得了较全面的HPV11 VLP单抗性质信息,建立了重组HPV11抗原质量分析的双抗夹心ELISA法,为HPV11抗原的生命周期管理或尖锐湿疣疫苗的研发、工艺优化、产品放行和稳定性研究等提供了技术支持。 展开更多
关键词 人乳头瘤病毒 单克隆抗体 假病毒 中和活性 质量分析
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N-糖链切除对重组抗狂犬病毒单克隆抗体中和活性的影响 预览
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作者 吕若芸 王辉 +4 位作者 陈忱 张世雄 张晓楠 曹晨华 魏敬双 《生物技术进展》 2016年第4期277-282,共6页
重组抗狂犬病毒单克隆抗体是一种全人源的抗病毒感染单抗,主要用于狂犬病毒暴露后预防。采用糖苷酶处理2种重组抗狂犬病毒单克隆抗体Mab1、Mab2水解切除N-糖链,通过糖染色和毛细管电泳检测确定N-糖链酶解程度,利用快速荧光灶抑制试验检... 重组抗狂犬病毒单克隆抗体是一种全人源的抗病毒感染单抗,主要用于狂犬病毒暴露后预防。采用糖苷酶处理2种重组抗狂犬病毒单克隆抗体Mab1、Mab2水解切除N-糖链,通过糖染色和毛细管电泳检测确定N-糖链酶解程度,利用快速荧光灶抑制试验检测其中和活性,分析N-糖链切除对该单抗中和活性的影响。结果显示,N-糖链切除后抗体中和活性无明显变化。说明N-糖链对这两株抗狂犬病毒单抗的体外中和活性不是必须的结构成分。 展开更多
关键词 重组抗狂犬病毒单克隆抗体 N-糖链切除 毛细管电泳 中和活性
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糖基工程酵母表面呈现抗体库的构建及抗真菌β甘露糖型抗体的筛选 预览 被引量:1
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作者 房泽轩 刘波 +2 位作者 巩新 唱韶红 吴军 《生物技术通讯》 CAS 2016年第3期326-330,370共6页
目的:通过构建糖基工程酵母表面呈现免疫抗体库,筛选与毕赤酵母表达的禽流感血凝素HA7结合的特异性抗体.方法:利用糖基工程毕赤酵母细胞膜锚定蛋白Sed将人IgG的Fc段锚定在酵母表面,然后用毕赤酵母表达的HA7免疫小鼠,从小鼠脾脏细胞中... 目的:通过构建糖基工程酵母表面呈现免疫抗体库,筛选与毕赤酵母表达的禽流感血凝素HA7结合的特异性抗体.方法:利用糖基工程毕赤酵母细胞膜锚定蛋白Sed将人IgG的Fc段锚定在酵母表面,然后用毕赤酵母表达的HA7免疫小鼠,从小鼠脾脏细胞中扩增抗体轻重链可变区基因构建抗体转化锚定了Fc的糖基工程酵母,构建表面展示免疫抗体库,通过免疫磁珠法筛选与毕赤酵母表达的HA7特异性结合的抗体表达酵母,分析筛选该抗体的特异性结合靶点.结果:构建了多态性良好的抗体表达质粒库,转化糖基工程酵母后筛选得到特异性结合HA7的抗体呈现酵母,Western印迹分析发现该抗体只与糖基化的HA7结合而不与切除糖链后的HA7结合,说明抗体结合区域在HA7的糖链上,进一步实验发现该抗体不与α甘露糖型和哺乳动物复杂型糖型结合,通过β甘露糖苷酶切研究发现抗体结合靶点为酵母表达HA7糖链上的β甘露糖.结论:利用糖基工程酵母构建抗体库,筛选得获得了抗真菌β甘露糖的抗体,动物实验发现抗体具有中和活性. 展开更多
关键词 糖基工程酵母抗体库 免疫磁珠筛选 β甘露糖抗体 中和活性
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人源特异性抗狂犬病毒二价Fab094-DDD抗体的制备及鉴定
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作者 耿以如 熊四平 +7 位作者 唐奇 张晓 陈雅 徐亚如 周荧 仇镇宁 冯振卿 朱进 《南京医科大学学报:自然科学版》 CAS CSCD 北大核心 2016年第6期693-699,共7页
目的 :利用蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)调节亚基(R亚基)的二聚体化功能结构域(DDD)的二聚化功能,制备具有中和活性的人源特异性抗狂犬病毒二价抗体。方法:优化合成linker-C-DDD序列,设计引物扩增抗狂犬病毒抗体Fab094的Fd... 目的 :利用蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)调节亚基(R亚基)的二聚体化功能结构域(DDD)的二聚化功能,制备具有中和活性的人源特异性抗狂犬病毒二价抗体。方法:优化合成linker-C-DDD序列,设计引物扩增抗狂犬病毒抗体Fab094的Fd段和轻链可变区序列(Vκ),通过overlap PCR将Fab094的Fd段和linker-C-DDD基因重组为Fd-DDD,将其和Vκ分别克隆到真核表达载体中,共转染293Free style细胞,表达纯化该抗体。应用SDS-PAGE、Western blot、ELISA、免疫共沉淀、亲和力测定及免疫荧光试验检测该抗体的免疫学特性,用荧光抗体病毒中和试验检测其中和活性。结果:成功构建了全人源抗狂犬病毒二价抗体Fab094-DDD的真核表达载体,获得的二价Fab094-DDD抗体与抗原保持着较好的亲和力,能特异性结合狂犬病毒,中和效价为213.2 U/mg。结论:成功制备了抗狂犬病毒二价Fab094-DDD抗体,具有较高的中和活性,为进一步研发狂犬病治疗性抗体药物奠定了基础,对于其他疾病双表位人源特异性抗体的制备也具有借鉴作用。 展开更多
关键词 狂犬病毒 二价抗体 中和活性 双表位抗体
1型鸭甲肝病毒VP3蛋白的抗血清中和活性分析及B细胞表位鉴定 预览
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作者 沈友林 汪铭书 +8 位作者 程安春 贾仁勇 朱德康 陈舜 刘马峰 刘菲 杨乔 孙昆峰 陈孝跃 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第1期141-148,共8页
旨在探究1型鸭甲肝病毒(DHAV-1)VP3蛋白抗血清的中和活性并鉴定VP3的线性B细胞表位。利用pGEX-4T-1表达载体,在BL21(DE3)宿主菌中原核表达DHAV-1 VP3基因,以切胶纯化出的蛋白质为抗原免疫兔制备多克隆抗体,通过鸡胚中和试验对多抗... 旨在探究1型鸭甲肝病毒(DHAV-1)VP3蛋白抗血清的中和活性并鉴定VP3的线性B细胞表位。利用pGEX-4T-1表达载体,在BL21(DE3)宿主菌中原核表达DHAV-1 VP3基因,以切胶纯化出的蛋白质为抗原免疫兔制备多克隆抗体,通过鸡胚中和试验对多抗的中和效价进行检测;采用Karplus&Schulz、Emini、Jameson-Wolf和Parker方法分别对柔韧性、表面可及性、抗原性及亲水性进行分析,得到了4条候选线性B细胞表位,以制备的兔抗VP3多克隆抗体为一抗,通过间接ELISA方法对人工合成的B细胞表位进行鉴定,并进一步用临床鸭血清样品对鉴定的B细胞表位的抗体检测能力进行评估。结果显示,VP3在BL21(DE3)中以包涵体形式表达,大小约54ku,Western blot分析表明重组蛋白质具有较好的反应原性。制备的兔抗VP3多克隆抗体的琼扩效价达到1∶16,并能中和DHAV-1,中和效价为1∶39;利用间接ELISA鉴定出GKRKPCRRPIHKPKNPPQEP(1—20aa)、FNTGRYQMSWYPIADGEQSL(131—150aa)和VNSSAPSNID(200—209aa)为VP3的B细胞表位,抗体检测能力试验结果显示表位肽可检测临床DHAV-1鸭血清。本研究表明DHAV-1VP3的抗血清具备一定的中和活性,1—20aa、131—150aa和200—209aa为VP3的B细胞表位且具有临床应用前景。 展开更多
关键词 1型鸭甲肝病毒 VP3蛋白 多克隆抗体 中和活性 B细胞表位
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犬细小病毒免疫球蛋白对犬细小病毒中和活性的研究报告 被引量:1
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作者 周灵 梁琳 +3 位作者 王宏伟 史利军 钱爱东 崔尚金 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2016年第8期1009-1014,共6页
犬细小病毒免疫球蛋白是治疗该病的主要药物。本研究针对静脉注射用犬细小病毒免疫球蛋白、多克隆抗体进行了血凝抑制试验比较,并在细胞上对其进行了蛋白毒性试验和中和活性试验等对比研究。结果发现,免疫球蛋白和高免血清多克隆抗体的... 犬细小病毒免疫球蛋白是治疗该病的主要药物。本研究针对静脉注射用犬细小病毒免疫球蛋白、多克隆抗体进行了血凝抑制试验比较,并在细胞上对其进行了蛋白毒性试验和中和活性试验等对比研究。结果发现,免疫球蛋白和高免血清多克隆抗体的血凝抑制价分别为1×2^11和1×2^10,它们稀释16倍以后对细胞无毒性作用,其中静脉注射用犬细小病毒免疫球蛋白的中和抗体效价为1∶873,明显优于多克隆抗体的中和效价(1∶426)。以上研究结果为静脉注射用犬细小病毒免疫球蛋白对犬细小病毒病的治疗提供了细胞学上的依据。 展开更多
关键词 静脉注射用犬细小病毒免疫球蛋白 犬细小病毒 中和活性
具有中和活性的抗狂犬病病毒单克隆抗体的制备及初步应用
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作者 曹守春 王云鹏 +4 位作者 李加 石磊泰 吴小红 唐建蓉 李玉华 《中华微生物学和免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2016年第10期762-765,共4页
目的:制备具有中和活性的抗狂犬病病毒的单克隆抗体。方法取灭活的狂犬病病毒CTN株免疫BALB/c小鼠,免疫方式采用0 d、7 d、14 d、28 d。之后取小鼠的脾细胞与SP2/0细胞融合,获得杂交瘤细胞系,通过快速荧光抑制灶试验检测具有中和活性... 目的:制备具有中和活性的抗狂犬病病毒的单克隆抗体。方法取灭活的狂犬病病毒CTN株免疫BALB/c小鼠,免疫方式采用0 d、7 d、14 d、28 d。之后取小鼠的脾细胞与SP2/0细胞融合,获得杂交瘤细胞系,通过快速荧光抑制灶试验检测具有中和活性的阳性杂交瘤细胞系。取阳性杂交瘤细胞系腹腔注射BALB/c小鼠,采集腹水,通过亲和层析纯化获得具有中和活性的抗狂犬病病毒单克隆抗体,进行抗体亚型鉴别和单克隆抗体可变区序列测序。最后,获得单克隆抗体后进行胶体金快速检测试纸条的建立。结果获得1株具有中和狂犬病病毒活性、稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞系,标记为CTN-McAb1,收获小鼠腹水,并经纯化后获得具有中和活性的抗狂犬病病毒单克隆抗体,纯度可达95%以上,抗体为IgG1亚型。成功制备人用狂犬病疫苗有效抗原检测胶体金试纸条。结论成功制备了1株具有中和狂犬病病毒活性的单克隆抗体并进行初步应用,这对人用狂犬病疫苗的质量控制具有较强的应用价值。 展开更多
关键词 狂犬病病毒 单克隆抗体 中和活性
应用小鼠肝坏死模型分析重组全人源抗肿瘤坏死因子-α单克隆抗体的体内中和活性
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作者 张雅婷 潘勇兵 +5 位作者 张银川 张坤明 任彬 宋桂芝 桂芳 闭兰 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2015年第10期1048-1052,共5页
目的建立小鼠肝坏死模型,分析重组全人源抗肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)单克隆抗体的体内中和活性。方法确定D-半乳糖胺(D-galactosamine,D-Gal N)的致敏时间及TNF-α对C57BL/6小鼠的致死剂量;采用D-Gal N致... 目的建立小鼠肝坏死模型,分析重组全人源抗肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)单克隆抗体的体内中和活性。方法确定D-半乳糖胺(D-galactosamine,D-Gal N)的致敏时间及TNF-α对C57BL/6小鼠的致死剂量;采用D-Gal N致敏小鼠,经腹腔注射TNF-α建立小鼠肝坏死模型,并测定3批供试品(抗TNF-α单抗)和3批阳性对照(阿达木单克隆抗体注射液)的体内中和活性,采用Probit回归拟合对活性测定结果进行分析。结果确定DGal N的致敏时间为10 min;TNF-α的致死剂量为100μg/kg体重;Probit回归拟合分析显示,拟合度较好,3批供试品对C57BL/6小鼠的半数有效剂量(ED50)分别为0.505、0.434和0.609 mg/kg,3批阳性对照对C57BL/6小鼠的ED50分别为0.455、0.571和0.484 mg/kg,供试品与阳性对照对C57BL/6小鼠的体内中和活性差异无统计学意义(P〉0.05)。结论联合应用D-Gal N和TNF-α可造成小鼠肝坏死,从而导致小鼠死亡,抗TNF-α单抗可阻断其效应。抗TNF-α单抗对TNF-α的抑制作用呈剂量-效应关系。 展开更多
关键词 肿瘤坏死因子-Α 单克隆抗体 中和活性
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