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含禽流感病毒血凝素蛋白VSV假病毒制备
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作者 赖天莹 李永刚 单颖 《中国公共卫生》 CAS CSCD 北大核心 2019年第8期1036-1037,共2页
目的构建含有H6N2型禽流感病毒血凝素蛋白(HA)的疱疹口炎病毒(VSV)。方法以H6N2亚型禽流感病毒互补脱氧核糖核酸(cDNA)为模板,扩增HA基因,并与pcDNA3.1+载体连接;使用VSVΔG*-G病毒感染制备VSVΔG*-HA假病毒,并对其血凝活性进行测定。... 目的构建含有H6N2型禽流感病毒血凝素蛋白(HA)的疱疹口炎病毒(VSV)。方法以H6N2亚型禽流感病毒互补脱氧核糖核酸(cDNA)为模板,扩增HA基因,并与pcDNA3.1+载体连接;使用VSVΔG*-G病毒感染制备VSVΔG*-HA假病毒,并对其血凝活性进行测定。结果成功构建重组表达载体pcDNA3.1HA;HA蛋白表达于293T细胞;荧光显微镜证实VSVΔG*-HA假病毒包装成功;活性试验显示VSVΔG*-HA假病毒具有与禽流感病毒相似的血凝活性。结论含有H6N2型禽流感病毒HA蛋白的VSV假病毒安全、可靠,为进一步对禽流感病毒受体等研究及筛选抗流感病毒的药物提供了技术支持和思路。 展开更多
关键词 H6N2型禽流感病毒 重组基因 包膜蛋白 假病毒 血凝实验
基于In-fusion技术的高通量HIV表型耐药检测系统的建立及应用研究 预览
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作者 吴守丽 刘峰 +3 位作者 颜苹苹 王征桦 谢美榕 严延生 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第4期285-291,共7页
目的构建基于In-fusion技术的高通量新型HIV表型耐药检测系统,用于临床表型耐药检测。方法扩增LacZ基因,插入并替换原骨架质粒pLWJ-SV40-Luc中耐药检测片段构建新的骨架质粒pLWJ-SV40-Luc-LacZ,利用In-fusion定向克隆技术,将耐药检测片... 目的构建基于In-fusion技术的高通量新型HIV表型耐药检测系统,用于临床表型耐药检测。方法扩增LacZ基因,插入并替换原骨架质粒pLWJ-SV40-Luc中耐药检测片段构建新的骨架质粒pLWJ-SV40-Luc-LacZ,利用In-fusion定向克隆技术,将耐药检测片段插入到改造后的骨架质粒中构建耐药检测载体(RTV),并与膜蛋白表达质粒VSV-G共转染293T细胞产生HIV假病毒,在药物干预下,通过检测感染细胞中Luc+表达量来反应其对药物的敏感性。结果成功引入蓝白斑筛选改造出新的骨架质粒pLWJ-SV40-Luc-LacZ。36例临床检测样本成功扩增出30例,利用In-fusion无缝连接技术成功构建26例RTV,其中21株产生的假病毒具有活性。药物敏感性实验结果显示所得的假病毒表型耐药检测结果与基因型耐药解释结果完全一致。结论成功构建出基于In-fusion技术的高通量新型HIV表型耐药检测系统,可应用于临床耐药检测,以指导临床抗病毒治疗。 展开更多
关键词 人类免疫缺陷病毒 假病毒 表型耐药性检测 基因型耐药性检测
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两种高危型HPV假病毒的构建及其在血清中和抗体测定中的应用 预览
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作者 李雄雄 董占柱 +2 位作者 吴元元 安静 马超 《微生物学免疫学进展》 2019年第5期1-9,共9页
目的 构建人乳头瘤病毒(human papillomavirus, HPV)16型(HPV16)和18型(HPV18)假病毒,探索优化假病毒制备的条件,并利用制备的假病毒评价HPV疫苗血清抗体的中和活性。方法 将优化后的HPV16和HPV18 L1、L2和EGFP基因片段分别插入pcDNA3.1... 目的 构建人乳头瘤病毒(human papillomavirus, HPV)16型(HPV16)和18型(HPV18)假病毒,探索优化假病毒制备的条件,并利用制备的假病毒评价HPV疫苗血清抗体的中和活性。方法 将优化后的HPV16和HPV18 L1、L2和EGFP基因片段分别插入pcDNA3.1+载体中,通过多质粒共转染293FT细胞制备假病毒。对转染试剂、多质粒共转染比例、转染时间和细胞裂解时间进行摸索优化,通过测定假病毒的滴度,确定假病毒制备的最佳条件。收获的假病毒用30%的碘克沙醇作为介质进行超速离心纯化,纯化后的假病毒用于电镜观察。利用假病毒中和试验对制备的原核表达复性蛋白HPV16 L1免疫血清以及HPV16和HPV18病毒样颗粒(virus-like particles, VLP)免疫血清进行中和活性评价。结果 成功构建了假病毒,并确定了假病毒制备的最佳条件:pL1∶pL2∶pEGFP等3种质粒共转染比例为1∶0.1∶0.5,总量为4μg;转染时间为72 h,细胞裂解时间为24 h时获得的假病毒滴度最高。透射电镜观察结果显示,HPV16和HPV18假病毒颗粒基本呈规则圆形,形态上与天然病毒颗粒相似。中和试验结果显示,当用原核表达复性蛋白HPV16 L1免疫血清中和HPV16假病毒时,并不能抑制假病毒的感染活性;但HPV16和18 VLP免疫血清能明显的抑制HPV16和HPV18假病毒的感染活性。结论 成功构建并制备了2种高危型HPV假病毒,并可用于中和试验评价HPV疫苗血清抗体的中和活性。 展开更多
关键词 高危型人乳头瘤病毒 假病毒 中和试验 感染活性
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SARS和MERS中和抗体假病毒检测方法的建立
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作者 马建 贺鹏飞 +5 位作者 赵晨燕 陈瑞峰 刘强 王佑春 黄维金 杨晓明 《病毒学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第2期189-195,共7页
严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV)和中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)均属冠状病毒科(Coronaviridae),能够引起人类严重疾病,特别是SARS-CoV可以导致严重急性呼吸综合征,而且容易造成暴发式流行,引起社会恐慌。本研究利用含有SARS... 严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV)和中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)均属冠状病毒科(Coronaviridae),能够引起人类严重疾病,特别是SARS-CoV可以导致严重急性呼吸综合征,而且容易造成暴发式流行,引起社会恐慌。本研究利用含有SARS-CoV和MERS-CoV棘突蛋白(Spike protein, S)基因的表达质粒pcD-NA3.1-SS、pcDNA3.1-MS,成功构建了高滴度假病毒,在此基础上通过对病毒接种量进行优化,建立了稳定可靠的假病毒中和抗体检测方法,并通过检测SARS恢复期病人血清以及免疫后小鼠血清对方法的特异性、稳定性以及重复性进行分析,充分证明了该方法是有效的血清中和抗体的检测手段。本研究成功构建了不依赖于BSL-3级生物安全条件的SARS和MERS假病毒,不仅可应用于血清中和抗体检测,还为后续单克隆抗体及抗病毒药物筛选和评价、疫苗研发及病毒感染机制研究等奠定了基础。 展开更多
关键词 严重急性呼吸综合征(SARS) 中东呼吸综合征(MERS) 假病毒 中和抗体
HIV-1衣壳蛋白抑制剂体外筛选方法研究进展 预览
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作者 张大为 许晓双 常珊 《中国药理学通报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第4期473-477,共5页
HIV-1的感染高度依赖其圆锥形的“富勒烯”型衣壳。衣壳由大约1500个衣壳蛋白组装而成。近年来,衣壳蛋白已成为设计和筛选抗HIV-1药物的理想靶点。目前,文献已报道了多种基于不同原理的HIV-1衣壳蛋白抑制剂的筛选方法,该文将对这些体外... HIV-1的感染高度依赖其圆锥形的“富勒烯”型衣壳。衣壳由大约1500个衣壳蛋白组装而成。近年来,衣壳蛋白已成为设计和筛选抗HIV-1药物的理想靶点。目前,文献已报道了多种基于不同原理的HIV-1衣壳蛋白抑制剂的筛选方法,该文将对这些体外筛选方法进行综述。 展开更多
关键词 HIV-1 衣壳蛋白抑制剂 邻近闪烁分析 均相时间分辨荧光 放大化学发光临近均相检测 噬菌体展示 双分子荧光互补 假病毒 虚拟筛选
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用于MERS-CoV核酸检测的假病毒阳性对照品制备及鉴定
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作者 周冬根 李云鹏 +3 位作者 罗洁 李军花 余军平 危宏平 《中国国境卫生检疫杂志》 CAS 2019年第4期233-238,共6页
目的制备安全、稳定的含有中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)靶基因片段的假病毒颗粒阳性对照品。方法人工合成含up E、ORF1b以及N基因片段的MERS-CoV核苷酸序列,连入慢病毒表达载体,将重组慢病毒表达载体与包装质粒同时转染HEK293T-17... 目的制备安全、稳定的含有中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)靶基因片段的假病毒颗粒阳性对照品。方法人工合成含up E、ORF1b以及N基因片段的MERS-CoV核苷酸序列,连入慢病毒表达载体,将重组慢病毒表达载体与包装质粒同时转染HEK293T-17细胞,利用透射电镜观察重组假病毒颗粒形态,用荧光定量RT-PCR方法检测假病毒包装情况,并进行稳定性、均一性以及线性试验。结果测序分析显示,3个基因片段正确克隆至载体pCMVMCS-GFP-PURO,经大肠杆菌表达可形成直径约为100 nm的均一、球形重组假病毒颗粒。不同浓度样品在不同温度条件下存放数日仍保持稳定,不同浓度样品、不同组别的Ct值的变异系数均小于0.1%。结论成功构建了含有upE、ORF1b以及N基因片段的MERS-CoV假病毒颗粒,可作为阳性对照品实现对核酸提取与检测过程全程监控。 展开更多
关键词 中东呼吸综合征冠状病毒 假病毒 病毒样颗粒 阳性对照
沙粒病毒进入抑制剂体外药效学评价模型的建立
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作者 张晓雨 唐克 +2 位作者 郭家梅 陈勍 郭颖 《药学学报》 CSCD 北大核心 2018年第5期735-742,共8页
沙粒病毒是一类有囊膜的RNA病毒。以哺乳动物为宿主的沙粒病毒(mammarenavirus)中,有9种可致人疾病,其中8种可致人出血热。拉沙病毒(Lassa virus,LASV)感染人所致拉沙出血热(Lassa hemorrhagic fever)流行范围广,有引发疾病大流... 沙粒病毒是一类有囊膜的RNA病毒。以哺乳动物为宿主的沙粒病毒(mammarenavirus)中,有9种可致人疾病,其中8种可致人出血热。拉沙病毒(Lassa virus,LASV)感染人所致拉沙出血热(Lassa hemorrhagic fever)流行范围广,有引发疾病大流行的可能,因此拉沙病毒被列为第一类病原微生物。目前针对沙粒病毒的疫苗和药物极为有限。本研究应用重组病毒技术,以HIV-1为核心,共构建了以9种沙粒病毒外壳蛋白包裹的重组病毒(arenavirus-GP/HIV-luc),在考察了它们对17株人、猴、鼠及蝙蝠的不同组织来源细胞进入水平的基础上,建立了沙粒病毒进入抑制剂药理活性评价模型,并用工具药验证。本研究建立的重组沙粒病毒进入抑制剂体外药效学评价模型特异性好,安全性高,可在生物安全二级(BSL-2)实验室进行实验,可为抗沙粒病毒药物和疫苗的活性评价提供技术平台,促进针对沙粒病毒出血热的药物及疫苗的研发。 展开更多
关键词 沙粒病毒 病毒性出血热 假病毒 进入抑制剂
具有广谱中和活性的HIV感染者血浆病毒膜蛋白基因及中和特征分析 被引量:1
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作者 张岱 邹森 +5 位作者 郝金娟 侯佳利 胡园园 任莉 邵一鸣 洪坤学 《中国热带医学》 CAS 2018年第5期418-422,共5页
目的分析一例具有广谱中和活性的慢性HIV感染者病毒膜蛋白(Env)基因序列特征及中和特征。方法使用单拷贝基因组扩增(SGA)方法从患者两个随访时间点血浆样本扩增env基因,测序后进行序列比对和进化树构建,分析env基因特征;将env基因... 目的分析一例具有广谱中和活性的慢性HIV感染者病毒膜蛋白(Env)基因序列特征及中和特征。方法使用单拷贝基因组扩增(SGA)方法从患者两个随访时间点血浆样本扩增env基因,测序后进行序列比对和进化树构建,分析env基因特征;将env基因克隆至pcDNATM3.1载体上,env质粒和骨架质粒pSG3△env共转染293T细胞制备假病毒,使用假病毒分别和两个时间点的自体血浆及6种不同的广谱中和抗体进行中和试验,分析Env蛋白的中和特征。结果从两个时间点血浆样本中共获得50个全长env基因,进化分析显示两个时间点序列各自聚集成簇,第1个时间点膜蛋白序列有较短的V1区和较少的V1区糖基化位点数目,第2个时间点膜蛋白序列有更高的基因多样性。自体血浆不能中和同时期的假病毒,但能中和前期的假病毒;两个时间点的假病毒对PGT121、PGT135、2G12和10E8抗体均高度敏感,但对VRC01及12A21抗体呈现中和抗性。结论该具有广谱中和活性的慢性HIV感染者病毒膜蛋白基因持续进化;感染者体内存在CD4bs类中和抗体的免疫压力。 展开更多
关键词 HIV-1 膜蛋白 中和抗体 假病毒 逃逸
柯萨奇病毒A组6型报告基因假病毒可视化感染模型的建立
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作者 吴星 苏瑶 +8 位作者 董方玉 陈盼 李克雷 高帆 卞莲莲 孙世洋 胡亚林 毛群颖 梁争论 《中国病毒病杂志》 CAS 2018年第6期515-520,共6页
目的以含报告基因的柯萨奇病毒A组6型(CV-A6)假病毒(pCV-A6-Luc),建立CV-A6可视化感染模型,用于疫苗的有效性评价.方法比较BALB/c、C57BL/6、ICR、NIH、KM小鼠对pCV-A6-Luc的敏感性,确定模型动物;进行小鼠周龄选择、检测时间摸索以及假... 目的以含报告基因的柯萨奇病毒A组6型(CV-A6)假病毒(pCV-A6-Luc),建立CV-A6可视化感染模型,用于疫苗的有效性评价.方法比较BALB/c、C57BL/6、ICR、NIH、KM小鼠对pCV-A6-Luc的敏感性,确定模型动物;进行小鼠周龄选择、检测时间摸索以及假病毒感染剂量优化等研究,确定模型体系;通过给小鼠接种灭活CV-A6病毒或被动免疫抗血清观察保护效果.结果通过不同品系小鼠对假病毒的敏感性比对,确定将BALB/c小鼠作为模型动物,并确定了使用4周龄小鼠作为假病毒攻毒时间,攻毒后16h为检测时间.半数动物感染剂量(AID50)研究结果表明,活体成像发光值与pCV-A6-Luc攻毒剂量呈现良好的剂量效应关系(r^2=0.996),Reed-Muench法计算pCV-A6-Luc感染BALB/c小鼠的AID50攻毒剂量为2.86×10^8拷贝.主动免疫和被动免疫研究结果表明,抗体及灭活疫苗均可抑制pCV-A6-Luc对小鼠的感染.主动免疫实验组小鼠活体成像发光强度和中和抗体检测结果均明显低于对照组.结论本研究建立了安全、敏感、可视化的CV-A6报告基因假病毒可视化感染模型,该模型可应用于CV-A6疫苗评价及药物筛选研究. 展开更多
关键词 柯萨奇病毒A组6型 可视化 动物模型 报告基因 假病毒
人乳头瘤病毒58型L1/E7“假病毒”疫苗的制备及免疫效果评价 预览 被引量:1
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作者 王亚婷 李文生 +2 位作者 闫小飞 齐宗利 郭华 《现代检验医学杂志》 CAS 2018年第3期35-37,43共4页
目的 构建人乳头瘤病毒58型L1/E7“假病毒”疫苗,并研究其免疫学特性。方法 采用sf9昆虫-杆状病毒表达系统表达HPV58L1蛋白,体外解离重组病毒颗粒,向已经解离的衣壳中加入mE7-pcDNA3.1+质粒,CaCl2室温透析促使病毒样颗粒(VLP)重新聚... 目的 构建人乳头瘤病毒58型L1/E7“假病毒”疫苗,并研究其免疫学特性。方法 采用sf9昆虫-杆状病毒表达系统表达HPV58L1蛋白,体外解离重组病毒颗粒,向已经解离的衣壳中加入mE7-pcDNA3.1+质粒,CaCl2室温透析促使病毒样颗粒(VLP)重新聚合,用“假病毒”颗粒滴鼻免疫小鼠,检测小鼠血清IgG,IgA中和抗体以及脾淋巴细胞IFN-γ的分泌水平和细胞毒性T淋巴细胞(CTL)反应。结果 SDS-PAGE,Western blot和红细胞凝集实验证实sf9昆虫-杆状病毒表达系统有效表达有功能活性的HPV58L1蛋白,HPV58L1蛋白能够有效的折叠、解聚以及再折叠为VLP。小鼠免疫保护实验发现,用包含有mE7-pcDNA3.1~+质粒的HPV58L1“假病毒”免疫小鼠,抗HPV58L1特异性IgG,IgA明显升高(P〈0.001),“假病毒”免疫组产生的IFN-γ明显高于VLP免疫组(P〈0.001);“假病毒”免疫过的小鼠脾淋巴细胞可以特异性杀伤Tc-1细胞,引起CTL反应。结论 成功制备了人乳头瘤病毒58型L1/E7“假病毒”疫苗,能诱发免疫动物较强的体液免疫反应,激发保护性抗体的产生。 展开更多
关键词 人乳头瘤病毒58型 病毒样颗粒 假病毒 细胞毒性T淋巴细胞
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诱导表达人IFITM3的293细胞株的建立及其对H1N1型流感病毒侵染作用 预览
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作者 侯志飞 蒋栋 +1 位作者 赵学森 曾辉 《中华实验和临床感染病杂志(电子版)》 CAS 2018年第2期198-203,共6页
目的建立诱导表达IFITM3蛋白的293细胞株,为进一步研究人IFITM3对H1N1型流感病毒侵染的作用及其分子机制提供细胞模型。方法构建IFITM3/pc DNA5/FRT/TO expression vector质粒及诱导表达细胞株,建立H1N1型流感病毒假病毒评价系统,利用... 目的建立诱导表达IFITM3蛋白的293细胞株,为进一步研究人IFITM3对H1N1型流感病毒侵染的作用及其分子机制提供细胞模型。方法构建IFITM3/pc DNA5/FRT/TO expression vector质粒及诱导表达细胞株,建立H1N1型流感病毒假病毒评价系统,利用蛋白印迹(Western blot)和荧光素酶报告基因对筛选的诱导表达细胞株功能进行检测。结果建立的293诱导表达细胞株能够很好表达目的蛋白,且诱导表达出来的IFITM3蛋白使H1N1型流感假病毒感染率下降97%(t=38.08、P〈0.001),使水泡性口炎假病毒(VSVpp)感染率下降68%(t=54.56、P〈0.001),而阴性对照组小鼠白血病假病毒(MLVpp)感染率(t=1.282、P=0.2208)和拉沙假病毒(LASVpp)感染率(t=0.4814、P=0.6377)无显著影响。结论 IFITM3蛋白诱导表达细胞株可以显著抑制H1N1型流感病毒感染,为进一步深入研究IFITM3抑制流感病毒感染的作用机制和分子机理提供了细胞模型和实验基础。 展开更多
关键词 干扰素诱导跨膜蛋白3 H1N1型流感病毒 假病毒 诱导表达 防御分子
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人乳头瘤病毒假病毒中和试验血清起始稀释倍数的研究 预览
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作者 赵慧 李娟 +2 位作者 马新兴 周凌云 李长贵 《微生物学免疫学进展》 2018年第2期1-4,共4页
目的对人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)假病毒中和试验起始稀释倍数进行研究,确定该系统中合适的起始稀释倍数。方法为了排除血清中HPV抗体以及母传抗体的干扰,选取50份15-18月龄的儿童血清作为验证样本。血清以不同的稀... 目的对人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)假病毒中和试验起始稀释倍数进行研究,确定该系统中合适的起始稀释倍数。方法为了排除血清中HPV抗体以及母传抗体的干扰,选取50份15-18月龄的儿童血清作为验证样本。血清以不同的稀释倍数,与适量的假病毒中和。以光学显微镜观察接种细胞的形态,来判定不同稀释度的血清对细胞生长状况的影响;观察感染细胞表达的绿色荧光蛋白的强度及数量,以此考察血清对假病毒感染过程的影响。结果血清稀释度1:40对细胞生长状况影响较小;该稀释倍数的病毒进入细胞表达的荧光强度与不加血清的阳性对照类似;假病毒感染细胞导致的荧光斑点数与真实病毒对照相比减少了10%,远低于中和试验判定阈值(相对抑制率50%)。结论在该实验系统中,HPV假病毒中和试验的血清起始稀释度以1:40较为合适. 展开更多
关键词 人乳头瘤病毒 中和试验 假病毒 方法 验证
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马传染性贫血病弱毒疫苗免疫马血清对同源和异源病毒株中和活性的研究 预览
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作者 刘影 王雪峰 +4 位作者 王美月 陈杰 孙君帅 马建 王晓钧 《中国预防兽医学报》 CSCD 北大核心 2018年第2期142-146,共5页
为评价马传染性贫血病毒(EIAV)弱毒疫苗免疫马血清对同源和异源病毒株的中和活性差异,本研究构建了不同EIAV株(EIAVFDDV2.8。EIAVILN、EIAVUK和EIAVYN)Env的重组表达质粒,并将这些质粒与包装质粒(pUK-Gag-pol)YL表达荧光素酶的... 为评价马传染性贫血病毒(EIAV)弱毒疫苗免疫马血清对同源和异源病毒株的中和活性差异,本研究构建了不同EIAV株(EIAVFDDV2.8。EIAVILN、EIAVUK和EIAVYN)Env的重组表达质粒,并将这些质粒与包装质粒(pUK-Gag-pol)YL表达荧光素酶的转移质粒(pONY8.1)共转染293T细胞;将假病毒与疫苗免疫马(5#、8#)血清共孵育后接种于ELR1-293T细胞单层;通过检测细胞中荧光素酶活性,计算疫苗免疫马血清中和50%假病毒感染的血清稀释倍数,评价血清对病毒的中和活性。结果显示,疫苗免疫马血清对表达不同Env假病毒的中和滴度存在差异,从高到低依次是:pVR1012-FDDV-3-8-Env、pVR1012-LN-Env、pVR1012-UK-Env、pVR1012-YN-Env,而且免疫血清对不同病毒株的中和能力与不同病毒株Env的变异呈负相关(5#,R^2=-0.99;8#},R2=-0.96).虽然免疫马血清中和异源病毒株的能力显著低于同源病毒株,但其对异源病毒株仍具有良好的中和作用,本研究结果表明中国EIAV弱毒疲苗可以激发抗不同病喜株的广谱中和抗体。 展开更多
关键词 马传染性贫血病毒 囊膜蛋白 假病毒 中和抗体
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广西HIV-1 B亚型假病毒的构建 预览
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作者 黄春湲 王洪 +8 位作者 梁浩 叶力 梁冰玉 蒋俊俊 陈荣凤 宁传艺 廖艳研 余军 黄颉刚 《实用医学杂志》 北大核心 2018年第12期1942-1946,共5页
目的针对广西HIV-1 B亚型毒株构建一种优化的假病毒耐药检测模型,为表型耐药检测提供成本较低、简便易行的研究工具。方法从质粒pSV-EGFP中扩增出EGFP基因,采用双酶切法将EGFP基因克隆至骨架质粒pNL4-3.Luc.E-R-,以此构建假病毒重组骨... 目的针对广西HIV-1 B亚型毒株构建一种优化的假病毒耐药检测模型,为表型耐药检测提供成本较低、简便易行的研究工具。方法从质粒pSV-EGFP中扩增出EGFP基因,采用双酶切法将EGFP基因克隆至骨架质粒pNL4-3.Luc.E-R-,以此构建假病毒重组骨架质粒;采用RT-PCR方法从HIV-1 B亚型慢性感染者RNA中获得包膜蛋白基因,采用双酶切法将env基因克隆至真核表达质粒pc DNATM3.1(+),以此构建重组包膜质粒;单转染重组包膜质粒至293t细胞验证表达;共转染重组质粒至293t细胞获得假病毒;采用与TZM-b1细胞共培养法,通过荧光表达检测验证假病毒感染性。结果两种质粒以质量比2:1(pc DNA3.1-env:p NL4-3.EGFP.E-R-)共转染至293t细胞,48 h后收集细胞上清获得假病毒。将假病毒加入到TZM-bl细胞共培养48 h后,可以观察到荧光表达。结论带有EGFP基因重组假病毒的系统构建成功。 展开更多
关键词 HIV-1 假病毒 耐药检测
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汉坦病毒76-118株假病毒的构建及其在中和试验中的应用
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作者 李燕 邱野 +4 位作者 孙宏亮 郝建丽 安继新 姜崴 李玉华 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2018年第7期701-707,共7页
目的构建含有汉坦病毒76-118株包膜蛋白的假病毒,并初步探讨双价肾综合征出血热(hemorrhagic fever wiht renal syndrome,HFRS)灭活疫苗效价检测的新方法。方法提取汉坦病毒76-118株病毒RNA,PCR扩增获得M基因,将其插入真核表达质粒,... 目的构建含有汉坦病毒76-118株包膜蛋白的假病毒,并初步探讨双价肾综合征出血热(hemorrhagic fever wiht renal syndrome,HFRS)灭活疫苗效价检测的新方法。方法提取汉坦病毒76-118株病毒RNA,PCR扩增获得M基因,将其插入真核表达质粒,获得重组表达质粒Pc DNA3.1-M。将质粒Pc DNA3.1-M与HIV假病毒构建体系DMEM 1、Lenti-HG和HG transgene reagent瞬时共转染Vero-E6细胞,48 h后,收集假病毒上清,对其滴度、单轮感染性、蛋白量及中和活性进行检测,并应用于双价HFRS灭活疫苗抗血清的检测。结果质粒Pc DNA3.1-M经酶切及测序鉴定证明构建正确。假病毒对Vero-E6细胞的感染性滴度为8×10^7 TU/mL,能被76-118株抗血清中和,从而失去感染性,其中和活性与野生型病毒一致。基于假病毒的效价检测方法对效价合格血清进行再检测时结果均达到了预期要求。结论构建了含有汉坦病毒76-118株包膜蛋白的假病毒,构建的假病毒可以应用于中和试验,并与野生病毒的检测结果具有高度相关性,为下一步检测双价HFRS灭活疫苗的效价提供了可能。 展开更多
关键词 汉坦病毒 假病毒 质粒 效价 中和试验
手足口病假病毒中和抗体检测平台的建立和初步应用
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作者 吴星 董方玉 +2 位作者 苏瑶 陈盼 梁争论 《中国病毒病杂志》 CAS 2018年第6期439-444,共6页
手足口病(hand,foot and mouth disease,HFMD)是婴幼儿常见的传染病,可并发重症及死亡.疫苗为防控HFMD的最有效措施.中和抗体是疫苗质控和评价的重要指标.为对疫苗研发提供工具,本课题组构建了HFMD主要病原肠道病毒A组71型(enterovirus ... 手足口病(hand,foot and mouth disease,HFMD)是婴幼儿常见的传染病,可并发重症及死亡.疫苗为防控HFMD的最有效措施.中和抗体是疫苗质控和评价的重要指标.为对疫苗研发提供工具,本课题组构建了HFMD主要病原肠道病毒A组71型(enterovirus A71,EV-A71)、柯萨奇病毒A组6型(cox-sackievirus A6,CV-A6)、柯萨奇病毒A组16型(coxsackievirus A16,CV-A16)、柯萨奇病毒B组3型(coxsackievirus B3,CV-B3)和柯萨奇病毒B组5型(coxsackievirus B5,CV-B5)的假病毒,在此基础之上建立了肠道病毒假病毒中和抗体检测平台.本文简要概述了该平台的建立和初步应用结果. 展开更多
关键词 手足口病 肠道病毒 EV-A71 柯萨奇病毒 假病毒 中和抗体
六株不同地区分离的H7N9流感病毒假病毒制备与生物学特性研究
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作者 黄保英 李善琴 +5 位作者 齐香荣 任皎 宋敬东 谭文杰 田厚文 阮力 《中华实验和临床病毒学杂志》 CAS CSCD 2017年第4期281-286,共6页
目的 选择不同地区分离的H7N9亚型流感病毒代表株,制备各代表株的假病毒,为H7N9疫苗对不同地区毒株的免疫保护效果评价奠定基础.方法 通过对29株H7N9流感病毒血凝素(Hemagglutinin,HA)的氨基酸序列分析,获得6株不同地区H7N9亚型流感... 目的 选择不同地区分离的H7N9亚型流感病毒代表株,制备各代表株的假病毒,为H7N9疫苗对不同地区毒株的免疫保护效果评价奠定基础.方法 通过对29株H7N9流感病毒血凝素(Hemagglutinin,HA)的氨基酸序列分析,获得6株不同地区H7N9亚型流感病毒代表株病毒;采用基于慢病毒载体的假病毒包装系统,以HA与神经氨酸酶(Neuraminidase,NA)作为包膜质粒,包装获得6株带有荧光素酶报告基因的假病毒;通过电镜负染、Western blot检测、感染MDCK后的荧光素酶读值和血凝试验等了解6株假病毒的生物学特性,通过血清交叉中和试验了解其在中和抗体检测中的应用情况.结果 筛选获得6株不同地区分离的H7N9流感病毒代表株并制备了相应的假病毒颗粒,电镜下可观察到典型的流感病毒形态,Western blot可检测到HA、NA和P24的表达;滴度测定结果显示6株假病毒对MDCK细胞的感染力为104- 105TCID50/50μl,血凝活性可达64- 512;SH1上海株H7N9 HA疫苗免疫血清针对6株流感假病毒100TCID50剂量的中和效力不同,提示6株假病毒可用于疫苗的交叉免疫效果评价.结论 成功获得6株H7N9不同地区代表株流感假病毒,为疫苗的免疫效果评价奠定了基础. 展开更多
关键词 H7N9流感病毒 假病毒 血凝素 抗原特性 中和试验
携带圣路易斯脑炎病毒特异基因片段的重组假病毒颗粒的构建与鉴定 被引量:1
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作者 张娜娜 邓永强 +3 位作者 年庆功 康晓平 杨银辉 秦成峰 《军事医学》 CAS CSCD 北大核心 2017年第3期194-198,共5页
目的制备含有圣路易斯脑炎病毒(SLEV)pr M基因片段的假病毒颗粒,旨在提供安全、可靠、稳定的核酸阳性质控品。方法根据armored RNA技术原理,构建携带含有SLEV prM基因片段的重组质粒pSE380-MS2-SLEV,转化大肠杆菌后利用IPTG进行诱导表... 目的制备含有圣路易斯脑炎病毒(SLEV)pr M基因片段的假病毒颗粒,旨在提供安全、可靠、稳定的核酸阳性质控品。方法根据armored RNA技术原理,构建携带含有SLEV prM基因片段的重组质粒pSE380-MS2-SLEV,转化大肠杆菌后利用IPTG进行诱导表达,三氯甲烷法纯化后利用透射电镜观察重组假病毒颗粒形态。通过DNaseⅠ和RNase A双酶消化实验评价重组假病毒颗粒的核酸酶耐受性,并结合温度敏感性实验分析假病毒颗粒中核酸片段的稳定性。利用荧光定量RT-PCR法对该假病毒颗粒进行验证。结果 PCR扩增和测序分析显示,pr M基因片段正确克隆至载体p SE380-MS2。经大肠杆菌表达可形成直径约为25 nm的均一、球形重组假病毒颗粒。核酸酶消化和温度敏感性实验表明假病毒样颗粒包装的病毒核酸能耐受核酶的降解,37℃条件下存放20 d仍保持稳定。荧光定量RT-PCR检测该假病毒颗粒检测限可达1.8×103拷贝/ml,且与同属的其他病毒无交叉反应。结论成功构建了含有SLEV prM基因片段的假病毒颗粒,具有良好的核酸酶耐受性和稳定性,可作为核酸阳性质控品对核酸提取与检测过程进行全程监控。 展开更多
关键词 圣路易斯脑炎病毒 假病毒 阳性质控品
HIV-1假病毒包装及感染条件优化 预览
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作者 陈丹瑛 李蕊 +3 位作者 张玥 宋川 韩俊燕 张媛媛 《检验医学与临床》 CAS 2017年第15期2172-2174,共3页
目的对人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)假病毒包装及感染条件进行优化,获得高重复性、高稳定性和高滴度的假病毒包装方法和较高的感染效率。方法采用pSG3△env质粒与pcDNA3.1-SF162rev/env质粒共转染293T细胞包装病毒,对HIV假病毒骨架质粒... 目的对人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)假病毒包装及感染条件进行优化,获得高重复性、高稳定性和高滴度的假病毒包装方法和较高的感染效率。方法采用pSG3△env质粒与pcDNA3.1-SF162rev/env质粒共转染293T细胞包装病毒,对HIV假病毒骨架质粒与env真核表达质粒转染比例、转染试剂与质粒比例、假病毒收获时间对HIV假病毒包装滴度的影响进行实验,同时对感染过程中假病毒接种剂量与二乙氨乙基葡聚糖(DEAE-Dextran)使用浓度进行了优化。结果在包装过程中当HIV假病毒骨架质粒与env真核表达质粒转染比例为4∶1、转染试剂与质粒比例为3∶1,转染后培养48hHIV-1假病毒的滴度最高;在假病毒感染过程中,15μg/mL的DEAE-Dextran可有效增加假病毒的感染效率且不会对细胞造成较大毒性。结论通过对包装和感染过程中关键条件的优化,可以有效提高HIV-1假病毒的包装和感染效率,增加实验技术稳定性,为新型抗艾滋病药物筛选和艾滋病疫苗评价等研究奠定了基础。 展开更多
关键词 人类免疫缺陷病毒 假病毒 包装方法 二乙氨乙基葡聚糖
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HIV-1广谱中和活性感染者假病毒的中和表型分析 被引量:1
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作者 邹森 张岱 +5 位作者 胡园园 齐中伟 侯佳利 任莉 邵一鸣 洪坤学 《中国热带医学》 CAS 2017年第7期646-649,674共5页
目的分析HIV-1广谱中和活性感染者基于膜蛋白基因(env)的假病毒对自体血浆和代表性广谱单克隆中和抗体(bm NAbs)的中和表型。方法单基因组扩增(SGA)广谱中和活性感染者第0月血浆的env基因并克隆至pc D-NA~(TM)3.1 Directional T... 目的分析HIV-1广谱中和活性感染者基于膜蛋白基因(env)的假病毒对自体血浆和代表性广谱单克隆中和抗体(bm NAbs)的中和表型。方法单基因组扩增(SGA)广谱中和活性感染者第0月血浆的env基因并克隆至pc D-NA~(TM)3.1 Directional TOPO表达载体,将env表达质粒与HIV-1骨架质粒p SG3△env共转染293T/17细胞制备假病毒,用假病毒分别与自体连续时间点血浆和代表性bm NAbs进行中和实验分析中和表型。结果共获得11株功能性假病毒,假病毒对8个连续时间点自体血浆的中和敏感性呈现先升高(第0~15月),后下降(第16~32月),之后再上升(第33~45月)的波动。所有假病毒对10E8、PGT121和VRC01中和敏感(IC_(50)〈6μg/m L);各有18.2%(2株)的假病毒对12A21和2G12高度敏感(IC_(50)〈1μg/m L);所有病毒均对PGT135呈中和抗性。结论假病毒对当前时间点血浆的中和敏感性低,对之后时间点血浆中和敏感性增强,提示感染者体内病毒与中和抗体的动态进化过程。同一时间点假病毒对特定bm-NAbs的敏感性差异明显,提示感染者准种毒株间中和表型的复杂性。 展开更多
关键词 HIV-1 膜蛋白 假病毒 中和表型
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