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趋化因子CCL28基因的克隆表达及其多抗制备 预览
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作者 陆文静 王礼学 +7 位作者 王国相 王伟康 谢泉 谢菁 邵红霞 高巍 秦爱建 叶建强 《扬州大学学报:农业与生命科学版》 CAS 北大核心 2019年第4期44-48,54共6页
将原核表达质粒pGEX-6P-1-CCL28转化至大肠埃希菌BL21中,经IPTG诱导,获得了GST-CCL28可溶性融合表达产物。利用纯化的GST-CCL28蛋白免疫BALB/c小鼠制备了抗GST-CCL28的多克隆抗体。同时将CCL28基因亚克隆进真核表达载体,经测序验证后命... 将原核表达质粒pGEX-6P-1-CCL28转化至大肠埃希菌BL21中,经IPTG诱导,获得了GST-CCL28可溶性融合表达产物。利用纯化的GST-CCL28蛋白免疫BALB/c小鼠制备了抗GST-CCL28的多克隆抗体。同时将CCL28基因亚克隆进真核表达载体,经测序验证后命名为pcDNA3.1-CCL28。间接免疫荧光及Western blot试验结果进一步证明,所获得的抗GST-CCL28多克隆抗体能特异性的识别转染pcDNA3.1-CCL28质粒的DF-1细胞内高表达的CCL28蛋白。这一研究为制备抗CCL28单克隆抗体和探究与CCL28相关的生物学功能及其机制奠定了良好的基础。 展开更多
关键词 趋化因子CCL28 克隆表达 克隆抗体
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花生脂肪酸延长酶基因AhFAE1及其启动子的克隆与功能分析 预览
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作者 石磊 黄冰艳 +7 位作者 齐飞艳 苗利娟 刘华 张忠信 高伟 董文召 汤丰收 张新友 《中国油料作物学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第2期176-185,共10页
为探讨花生脂肪酸中低芥酸含量的原因,从花生中克隆了脂肪酸延长酶FAE1及其启动子序列,并进行了功能分析。结果表明,AhFAE1全长cDNA为2 202bp,含有441bp的5′非翻译区及201bp的3′非翻译区,编码蛋白含519aa,分子量58.17Da,理论等电点9.1... 为探讨花生脂肪酸中低芥酸含量的原因,从花生中克隆了脂肪酸延长酶FAE1及其启动子序列,并进行了功能分析。结果表明,AhFAE1全长cDNA为2 202bp,含有441bp的5′非翻译区及201bp的3′非翻译区,编码蛋白含519aa,分子量58.17Da,理论等电点9.15,AhFAE1与麻疯树(Jatropha curcas ALB76796.1)、黄麻(Corchorus capsularis OMO87584.1)、拟南芥AtKCS4亲缘关系较近。亚细胞定位结果显示AhFAE1定位于内质网。qRT-PCR结果显示,AhFAE1在各个组织中均有表达,在种子中随着种子的发育成"钟"型变化,花后60d表达量最高。构建了植物表达载体,通过农杆菌介导法转化拟南芥研究启动子功能,利用GUS组织化学染色研究其表达特征,在任何组织中未发现GUS活性。推测AhFAE1可能参与了花生长链脂肪酸的合成,但是该基因启动子转录活性弱可能是造成花生中低芥酸含量的主要原因。 展开更多
关键词 花生 AhFAE1基因 克隆表达 亚细胞定位
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羊口疮病毒安徽株023基因的原核表达与生物信息学分析 预览
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作者 张高峰 杨侃侃 +7 位作者 张谦 王元红 俞赵荣 张学琪 鲁智敏 刘自敏 李永东 王勇 《浙江农业学报》 CSCD 北大核心 2019年第1期30-38,共9页
试验旨在克隆表达羊口疮病毒安徽株023基因,对该基因进行PCR扩增、亚克隆及表达,通过蛋白表达纯化后进行SDS-PAGE和Western blot鉴定,并利用生物信息学软件预测该基因编码的蛋白的理化性质、二级结构、信号肽、跨膜结构域等。结果显示,... 试验旨在克隆表达羊口疮病毒安徽株023基因,对该基因进行PCR扩增、亚克隆及表达,通过蛋白表达纯化后进行SDS-PAGE和Western blot鉴定,并利用生物信息学软件预测该基因编码的蛋白的理化性质、二级结构、信号肽、跨膜结构域等。结果显示,023基因全长819 bp,编码272个氨基酸,蛋白大小约为42 ku,主要以包涵体的形式表达且有良好的反应原性。生物信息学分析表明,该蛋白是亲水稳定蛋白,其中α-螺旋(h)占27.57%,延伸链(e)占17.28%,β-转角(t)占12.13%,无规则卷曲(c)占43.01%,无信号肽区域和跨膜结构域,可能存在30个磷酸化位点,4个B细胞抗原表位,3个CTL表位和3个Th表位。研究结果不仅有助于了解羊口疮病毒023基因的结构与功能,还能为建立快速诊断的检测方法提供参考。 展开更多
关键词 口疮病毒 023基因 克隆表达 生物信息学
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发酵乳杆菌多铜氧化酶的异源表达及酶学性质
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作者 徐洁 方芳 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第7期1286-1294,共9页
生物胺是一种存在于发酵食品中的含氮小分子有机化合物,过量摄入可能引起过敏或其他不良反应。利用酶法降解是减少发酵食品中生物胺含量从而保障食品安全的有效方法之一。文中成功克隆了来源于发酵乳杆菌的多铜氧化酶基因,在大肠杆菌中... 生物胺是一种存在于发酵食品中的含氮小分子有机化合物,过量摄入可能引起过敏或其他不良反应。利用酶法降解是减少发酵食品中生物胺含量从而保障食品安全的有效方法之一。文中成功克隆了来源于发酵乳杆菌的多铜氧化酶基因,在大肠杆菌中表达的酶活水平为484U/L。通过镍柱亲和层析方法获得了此多铜氧化酶的纯酶。该多铜氧化酶的最适反应温度为50℃,最适反应pH为3.5,其Km为1.3mmol/L,Vmax为7.67×10^–2 mmol/(L·min)。对酶的应用特性研究表明,来源于发酵乳杆菌的多铜氧化酶对18%(W/V)NaCl有一定的耐受性,并可降解包括色胺、苯乙胺、腐胺、尸胺、组胺、酪胺和亚精胺在内的7种生物胺。其中它对组胺和酪胺的降解能力最高,分别为51.6%和40.9%。此外,该酶对酱油中的生物胺也有普遍降解作用,使用较低酶量(500 U/L)时,对酱油中总胺的降解率达到10.6%。多铜氧化酶具备降解发酵食品中生物胺的潜力,为进一步实现这类食品酶的实际应用奠定基础。 展开更多
关键词 多铜氧化酶 生物胺 克隆表达 酶学性质 发酵乳杆菌
Paenibacillus puldeungensis LK18普鲁兰酶基因的克隆表达及酶学性质研究 预览
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作者 苏红玉 崔堂兵 《现代食品科技》 EI CAS 北大核心 2019年第7期107-113,35共8页
本研究根据类芽孢杆菌的普鲁兰酶基因的保守区设计兼并引物,从Paenibacillus puldeungensis LK18中扩增出普鲁兰酶基因(pulA),将其连接至pET-28a(+)载体上,构建出重组表达载体pET-28a(+)-pulA,转入到Escherichia coli BL21(DE3)中,成功... 本研究根据类芽孢杆菌的普鲁兰酶基因的保守区设计兼并引物,从Paenibacillus puldeungensis LK18中扩增出普鲁兰酶基因(pulA),将其连接至pET-28a(+)载体上,构建出重组表达载体pET-28a(+)-pulA,转入到Escherichia coli BL21(DE3)中,成功地表达了重组普鲁兰酶。结果表明:该普鲁兰酶基因全长1968 bp,编码655个氨基酸。通过Ni柱亲和层析纯化出重组蛋白,测定其比酶活为508.8 U/mg,分子量约为76.95 ku。该重组酶的最适反应温度为45℃,在35℃~40℃下保温120 min后剩余酶活达60%以上;最适作用pH为6.0,在pH 6.0~8.0条件具有较好的稳定性;10 mmol/L的K^+和Mg^2+对该重组普鲁兰酶有激活作用,而Zn^2+、Mn^2+、Ni^2+、Fe^2+、Cu^2+、Co^2+、Ca^2+等对其有不同程度的抑制作用。本研究成功地构建出一株可高效表达普鲁兰酶的重组菌株,具备一定的工业应用价值。 展开更多
关键词 PAENIBACILLUS puldeungensis 普鲁兰酶 克隆表达 酶学性质
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不同β-葡萄糖苷酶性能分析及对罗汉果苷的转化 预览
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作者 李登科 王欣驰 +4 位作者 陈雪佳 李家霖 胡小妍 路福平 李玉 《食品科学技术学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第3期48-54,共7页
以Pichia pastorisGS115为宿主,对来源于特异腐质霉Humicolainsolens、棘孢曲霉Aspergillus aculeatus和黑曲霉Aspergillus niger的β-葡萄糖苷酶基因bglHi、bglAa和bglAn进行异源表达。以对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷为底物,分析了3... 以Pichia pastorisGS115为宿主,对来源于特异腐质霉Humicolainsolens、棘孢曲霉Aspergillus aculeatus和黑曲霉Aspergillus niger的β-葡萄糖苷酶基因bglHi、bglAa和bglAn进行异源表达。以对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷为底物,分析了3种酶的酶学性质,其中BglAn的酶活力最高,为90.83U/mg。3种酶的最适反应温度和最适pH值范围分别为55~65℃和5.0~6.0。在pH值为6.0、温度50℃、酶量2U的条件下,利用3种酶水解不同浓度的罗汉果苷Ⅴ。结果表明:不同来源的酶水解底物的特异性差别较大,其中BglHi和BglAa水解罗汉果苷Ⅴ生成罗汉果苷ⅢE的转化率较低,仅为5%~7%;而BglAn在底物质量浓度1mg/mL,反应20min时转化率为96.5%;提高底物质量浓度到5mg/mL,反应1h时转化率也可达97.9%,基本实现完全转化。通过酶法转化罗汉果苷Ⅴ,获得了较高纯度的产物罗汉果苷ⅢE,为后期开发不同结构、不同功能罗汉果苷类甜剂提供了新的途径。 展开更多
关键词 Β-葡萄糖苷酶 克隆表达 酶学性质 酶法转化 罗汉果苷
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白芨(Bletilla striata)黄烷酮3-羟化酶基因的克隆和表达分析
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作者 宋祥忠 黄克江 王瑞珩 《分子植物育种》 CAS CSCD 北大核心 2019年第14期4586-4591,共6页
白芨(Bletilla striata)是中国临床常用的中药材之一,对治疗褥疮、促进创伤面愈合、抑制创面感染具有重要功效。黄烷酮3-羟化酶(flavanone 3-hydroxylase,F3H)是调控植物花青素合成的关键催化酶。利用拟南芥(Arabidopsis thaliana)、波... 白芨(Bletilla striata)是中国临床常用的中药材之一,对治疗褥疮、促进创伤面愈合、抑制创面感染具有重要功效。黄烷酮3-羟化酶(flavanone 3-hydroxylase,F3H)是调控植物花青素合成的关键催化酶。利用拟南芥(Arabidopsis thaliana)、波利亚草(Boechera stricta)、荠菜(Capsella rubella)的F3H序列设计同源引物,对白芨中的黄烷酮3-羟化酶编码基因进行了克隆,命名为BsF3H,并对BsF3H基因进行了生物信息学分析,采用荧光定量PCR技术对该基因的组织表达模式进行分析。结果表明BsF3H基因的编码序列为1017bp,编码309个氨基酸残基;该基因的基因组DNA含有2个内含子;BsF3H基因在花中的表达量最大,且在花蕾中最多。本研究为深入研究白芨中花青素的代谢途径及临床用白芨品种的培育提供了理论依据。 展开更多
关键词 白芨(Bletilla striata) 黄烷酮3-羟化酶 克隆表达 序列
海栖热袍菌耐热葡聚糖内切酶EG12B基因的克隆表达及酶学特性分析 预览
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作者 王珊珊 任艳艳 +2 位作者 张涛 路宏朝 王令 《家畜生态学报》 北大核心 2019年第4期20-26,共7页
为了促进家畜对纤维素饲料的消化吸收,提高饲料利用率,改善畜产品品质,本研究基于海栖热袍菌(Thermotoga maritima)的基因组信息,通过筛选获得一段具有潜在耐热特性的葡聚糖内切酶基因(EG12B)序列。经删除预测信号肽和优化密码子偏好性... 为了促进家畜对纤维素饲料的消化吸收,提高饲料利用率,改善畜产品品质,本研究基于海栖热袍菌(Thermotoga maritima)的基因组信息,通过筛选获得一段具有潜在耐热特性的葡聚糖内切酶基因(EG12B)序列。经删除预测信号肽和优化密码子偏好性,运用基因工程手段将成熟肽 EG12B 基因克隆至原核表达载体pET-28a中,成功构建了重组表达质粒pET28-EG12B。转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,经重组菌发酵培养及IPTG诱导表达,实现了 EG12B 在大肠杆菌系统中的胞内高效表达,表达量约占全细胞总蛋白的36%。通过细胞超声破碎、镍离子亲和层析以及热处理分离纯化,获得了电泳纯重组酶EG12B。酶学特性分析表明,该重组酶的最适反应温度为90 ℃,最适反应pH为5.2,在70 ℃下保温1 h,酶活力基本维持不变。表明葡聚糖内切酶EG12B具有优越的耐热性和良好的热稳定性,为进一步作为饲料添加剂用于纤维素饲料关键技术的开发和畜产品品质的提升奠定了理论基础。 展开更多
关键词 海栖热袍菌 葡聚糖内切酶 克隆表达 酶学特性 饲料添加剂
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副结核分枝杆菌MAP0862蛋白的重组表达及抗原性分析
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作者 李丹丹 张体银 +2 位作者 王绥家 晁哲 高慎阳 《黑龙江畜牧兽医》 CAS 北大核心 2019年第5期79-81,共3页
为了验证MAP0862蛋白在副结核分枝杆菌感染鉴别诊断中的作用,试验以从发病山羊消化道病料中提取的副结核分枝杆菌基因组DNA为模板,克隆MAP0862基因并构建重组表达载体PET28a-MAP0862,然后对其进行诱导表达及Western-blot分析。结果表明... 为了验证MAP0862蛋白在副结核分枝杆菌感染鉴别诊断中的作用,试验以从发病山羊消化道病料中提取的副结核分枝杆菌基因组DNA为模板,克隆MAP0862基因并构建重组表达载体PET28a-MAP0862,然后对其进行诱导表达及Western-blot分析。结果表明:检测到的羊副结核分枝杆菌MAP0862基因与GenBank中K10菌株基因完全相同;重组表达载体pET28a-MAP0862经IPTG诱导表达出约40ku的目标蛋白,与预期结果相符;Western-blot对比分析显示,MAP0862蛋白只与羊副结核阳性血清发生显色反应。说明MAP0862蛋白具有良好的免疫反应原性和特异性。 展开更多
关键词 副结核分枝杆菌 MAP0862基因 克隆表达 免疫反应原性 特异性
多杀性巴氏杆菌转铁结合蛋白TbpA的原核表达及免疫原性
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作者 王斐 张洪峰 +3 位作者 梁婉 彭忠 陈焕春 吴斌 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第6期1151-1156,共6页
为研究多杀性巴氏杆菌转铁结合蛋白TbpA的免疫原性,本试验利用PCR从牛源A型多杀性巴氏杆菌HB01基因组中扩增了TbpA的编码基因tbpA,并将其克隆至原核表达载体pET-30α(+)上,转化至大肠杆菌BL21中进行诱导表达。SDS-PAGE检测结果显示,rTbp... 为研究多杀性巴氏杆菌转铁结合蛋白TbpA的免疫原性,本试验利用PCR从牛源A型多杀性巴氏杆菌HB01基因组中扩增了TbpA的编码基因tbpA,并将其克隆至原核表达载体pET-30α(+)上,转化至大肠杆菌BL21中进行诱导表达。SDS-PAGE检测结果显示,rTbpA蛋白成功表达。Western blot证实该蛋白能够与抗多杀性巴氏杆菌HB01血清发生阳性反应。将rTbpA免疫小鼠后,分别于免疫后14,28 d采血,利用ELISA试验检测血清中的抗体滴度,结果显示血清中的抗rTbpA蛋白的IgG抗体显著升高(P<0.05)。感染试验结果显示,免疫rTbpA蛋白能够保护70%的小鼠抵抗多杀性巴氏杆菌的致死性攻击,并且病理切片结果表明,免疫小鼠的肺部损伤相对于对照组小鼠显著降低。本试验为筛选新型的多杀性巴氏杆菌免疫原性蛋白提供依据。 展开更多
关键词 牛源A型多杀性巴氏杆菌 转铁结合蛋白 克隆表达 小鼠
南极菌Pseudoalteromonas sp. A211-5产碱性α-淀粉酶Amy172的克隆表达及酶学性质研究 预览
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作者 潘爱红 李江 +2 位作者 谷晓倩 宋益民 宋芳琴 《化学与生物工程》 CAS 2019年第5期36-42,共7页
对具有淀粉降解活性的南极菌Pseudoalteromonas sp.A211-5进行测序分析,根据基因注释结果,获得了一条基因序列为2 139 bp的淀粉酶基因,命名为amy172;通过特异性引物克隆获得Amy172的基因序列并进行异源表达;采用Ni-NTA层析柱对重组α-... 对具有淀粉降解活性的南极菌Pseudoalteromonas sp.A211-5进行测序分析,根据基因注释结果,获得了一条基因序列为2 139 bp的淀粉酶基因,命名为amy172;通过特异性引物克隆获得Amy172的基因序列并进行异源表达;采用Ni-NTA层析柱对重组α-淀粉酶Amy172进行纯化,采用DNS法测定其酶学性质,采用薄层层析(TLC)技术对其酶解产物进行分析。结果表明:SDS-PAGE显示在分子量为79 kDa左右有一条明显的目的蛋白条带;重组α-淀粉酶Amy172最适温度为50℃,最适pH值为10.0,且在pH值5.0~10.0的范围内仍能保持80%以上的酶活,金属离子Fe^3+、Mn^2+、Mg^2+、Fe^2+、Ca^2+、K^+、Sr^2+、Ni^2+和Ba^2+对酶活性具有抑制作用;TLC分析Amy172的酶解产物为葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖和麦芽四糖。 展开更多
关键词 碱性α-淀粉酶 克隆表达 酶学性质
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乳酸片球菌AS1.2696来源的α-L-鼠李糖苷酶酶学性质分析 预览
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作者 郭双双 郑芳芳 +4 位作者 可丛雪 王子龙 韦宇拓 黄日波 杜丽琴 《食品科学》 EI CAS CSCD 北大核心 2019年第4期160-169,共10页
克隆表达乳酸片球菌AS1.2696菌株中的α-L-鼠李糖苷酶基因,研究重组酶的酶学性质。分析乳酸片球菌AS1.2696菌株的全基因组序列,聚合酶链式反应扩增目的基因,以pSE380为表达载体构建重组质粒pSE-prha2和pSEprha3,在大肠杆菌Escherichia c... 克隆表达乳酸片球菌AS1.2696菌株中的α-L-鼠李糖苷酶基因,研究重组酶的酶学性质。分析乳酸片球菌AS1.2696菌株的全基因组序列,聚合酶链式反应扩增目的基因,以pSE380为表达载体构建重组质粒pSE-prha2和pSEprha3,在大肠杆菌Escherichia coli XL-blue进行表达,使用镍亲和层析纯化重组蛋白,研究重组酶PRHA2、PRHA3的酶学性质。结果表明,重组酶PRHA2的最适pH值和温度分别为5.0和60℃,Km值为(3.039±0.581)mmol/L,Vmax值为(2.032±0.186)μm o l/(min·mg);PRHA3的最适pH值和温度分别为5.5和45℃,Km值为(2.797±0.132)mmol/L,Vmax值为(113.35±1.485)μmol/(min·mg)。PRHA2和PRHA3能够水解人工底物对硝基苯基-α-L-吡喃鼠李糖苷(p-nitrophenyl-α-L-rhamnopyranoside,pNPR)以及α-1,6键的橙皮苷、芦丁;PRHA2对4-硝基苯基-β-D-阿拉伯糖苷(4-nitrophenyl-β-L-arabinoside,pNPA)有一定的水解活性;PRHA3对淫羊藿苷、淫羊藿次苷I、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C这几种物质C-7位的葡萄糖糖苷键有较弱的水解作用。此外,PRHA3能够水解朝藿定C的C-3位以α-Rha(2→1)α-Rha连接的外侧的鼠李糖苷键,在食品及医疗方面具有一定的应用价值。 展开更多
关键词 乳酸片球菌 α-L-鼠李糖苷酶 克隆表达 酶学性质
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人LRG1基因的原核表达及生物信息学分析
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作者 陈旗 胡伟杰 +1 位作者 腾桥 夏丽洁 《基因组学与应用生物学》 CAS CSCD 北大核心 2019年第3期983-989,共7页
为了探讨LRG1基因结构与功能,对该基因进行克隆并构建到原核表达载体上,并对其进行表达及生物信息学分析。用Trizol法提取人肝癌HepG2细胞总RNA后,PCR扩增得到LRG1片段,经鉴定后将目的基因与原核表达载体pET28a连接,经诱导表达获得His-L... 为了探讨LRG1基因结构与功能,对该基因进行克隆并构建到原核表达载体上,并对其进行表达及生物信息学分析。用Trizol法提取人肝癌HepG2细胞总RNA后,PCR扩增得到LRG1片段,经鉴定后将目的基因与原核表达载体pET28a连接,经诱导表达获得His-LRG1蛋白。LRG1基因cDNA片段大小为1 044 bp,编码347个氨基酸;成功构建pET28a原核表达载体,经多次不同条件诱导后,得到大小约40 kD目的蛋白;利用软件对LRG1蛋白的一级、二级结构进行了预测,分析总结得LRG1基因编码的蛋白是一个不稳定且具有亲水性的蛋白,可与多种信号开关相互作用。LRG1属于高度保守的富亮氨酸重复家族成员,其原核表达载体不易诱导产生大量目的蛋白,克隆表达该基因有利于验证其结构与功能关系。 展开更多
关键词 肝癌 LRG1 克隆表达 生物信息学
温敏类弹性蛋白多肽的基因设计及重组克隆表达
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作者 任艳艳 庄嘉楠 +3 位作者 荣娜 孙薇 杜伟立 王珊珊 《基因组学与应用生物学》 CAS CSCD 北大核心 2019年第1期56-62,共7页
温敏类弹性蛋白多肽(elastin-like polypeptides, ELPs)作为新型的药物载体,在肿瘤治疗中具有广阔的应用前景。本研究根据大肠杆菌密码子的偏好性和简并性,将高度连续重复氨基酸的多种遗传密码引入基因序列中,利用依次插入单体基因和递... 温敏类弹性蛋白多肽(elastin-like polypeptides, ELPs)作为新型的药物载体,在肿瘤治疗中具有广阔的应用前景。本研究根据大肠杆菌密码子的偏好性和简并性,将高度连续重复氨基酸的多种遗传密码引入基因序列中,利用依次插入单体基因和递归定向连接技术,成功构建了以缬氨酸为客座氨基酸的ELPs基因的表达质粒库,即p ET28-ELP-V5~pET28-ELP-V50。将pET28-V50转化至表达宿主Escherichia coli BL21(DE3)中,经重组菌的培养和IPTG诱导,SDS-PAGE结果显示ELP-V50在大肠杆菌中成功获得了可溶性表达,与预期分子量大小一致。本研究为进一步构建不同分子量的ELPs基因库提供了新的思路,并为重组表达获得特定相变特性的多肽分子奠定了基础。 展开更多
关键词 类弹性蛋白多肽 基因设计 克隆表达
壳聚糖酶的基因克隆表达及酶学性质研究 预览
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作者 王琦 崔阳 +4 位作者 刘进宝 孙慧慧 郭娜 孙建安 毛相朝 《食品与生物技术学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第1期147-155,共9页
作者从NCBI数据库中挖掘到来源于Butyrivibrio sp.MC2013的壳聚糖酶基因,命名为BUT,该壳聚糖酶基因大小为903bp,编码301个氨基酸。通过NCBI数据库和进化树比对发现,该壳聚糖酶(BUT)属糖苷水解酶46家族(后简称GH-46),与其它壳聚糖酶相似... 作者从NCBI数据库中挖掘到来源于Butyrivibrio sp.MC2013的壳聚糖酶基因,命名为BUT,该壳聚糖酶基因大小为903bp,编码301个氨基酸。通过NCBI数据库和进化树比对发现,该壳聚糖酶(BUT)属糖苷水解酶46家族(后简称GH-46),与其它壳聚糖酶相似度为59%,是一种新型的壳聚糖酶。序列经密码子优化后进行全基因序列合成,与表达载体pET21a(+)连接构建重组质粒pET-21a-BUT,转入大肠杆菌E.coliBL21(DE3)表达宿主,进行诱导表达。所得重组壳聚糖酶通过Ni-NTA亲和层析进行纯化,SDS-PAGE确定其蛋白分子量为35kDa,DNS法测定其酶活为146.0U/mg。对BUT酶的酶学性质进行探究,结果表明BUT酶最适温度和pH分别为45℃、8.0,在中性偏碱性条件下稳定性较强。Mn^2+对其酶活力具有促进作用,SDS、Fe^3+、Cu^2+、Zn^2+等的抑制作用极强。通过TLC对其水解产物分析发现,BUT水解壳聚糖的产物是壳二糖、壳三糖和壳四糖。 展开更多
关键词 壳聚糖酶 壳聚糖 壳寡糖 克隆表达 酶学性质
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来源于Wenyingzhuangia属海洋细菌的一种β-琼胶酶的克隆表达及性质研究 预览
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作者 田雪健 申晶晶 常耀光 《食品与发酵工业》 CAS CSCD 北大核心 2019年第8期22-28,共7页
琼胶是一种重要的海洋多糖,其寡糖被证实具有丰富的生理调节功能。该研究拟从微生物基因组出发,利用生物信息学及分子生物学技术发掘新型琼胶酶。以海洋细菌Wenyingzhuangia fucanilytica CZ1127^T为实验材料,从该菌的基因组中发掘出1... 琼胶是一种重要的海洋多糖,其寡糖被证实具有丰富的生理调节功能。该研究拟从微生物基因组出发,利用生物信息学及分子生物学技术发掘新型琼胶酶。以海洋细菌Wenyingzhuangia fucanilytica CZ1127^T为实验材料,从该菌的基因组中发掘出1条潜在的GH16家族β-琼胶酶编码基因序列aga16A,通过分子克隆、异源表达及分离纯化,证实其编码的蛋白Aga16A_Wf具有琼胶酶活力。酶学性质及作用方式分析表明,Aga16A_Wf的最适反应温度(50℃)高于琼胶的凝胶温度,且该酶展现出适冷性;Aga16A_Wf的动力学常数Km为3.6g/L,Kcat为287.88s^-1;该酶为内切型水解酶,最小作用底物为四糖,最小产物为二糖。Aga16A_Wf可作为高效制备琼胶寡糖的工具酶,该酶的获取为琼胶及琼胶寡糖的进一步研究与应用提供了良好支撑。 展开更多
关键词 Β-琼胶酶 克隆表达 琼胶寡糖
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篮状菌Talaromyces leycettanus JCM12802来源的高温葡萄糖淀粉酶性质与结构
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作者 郭玉杰 涂涛 +3 位作者 邱锦 彤丽格 罗会颖 姚斌 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第4期616-625,共10页
葡萄糖淀粉酶作为淀粉糖化的关键用酶之一,广泛应用于食品、医药和发酵工业等行业。由于整个制糖过程都是在高温下完成的,因此对葡萄糖淀粉酶的反应温度和热稳定性有较高要求。本研究从嗜热篮状菌Talaromyces leycettanus JCM12802中克... 葡萄糖淀粉酶作为淀粉糖化的关键用酶之一,广泛应用于食品、医药和发酵工业等行业。由于整个制糖过程都是在高温下完成的,因此对葡萄糖淀粉酶的反应温度和热稳定性有较高要求。本研究从嗜热篮状菌Talaromyces leycettanus JCM12802中克隆到一个糖苷水解酶第15家族(GH15)葡萄糖淀粉酶基因(Tlga15A)并在毕赤酵母GS115中实现异源表达。重组葡萄糖淀粉酶TlGA的最适pH为4.5,在75℃下表现出最高酶活。TlGA热稳定性好,65℃条件下处理1 h剩余70%以上酶活力;70℃处理30min后仍有43%酶活力。TlGA有较强的离子抗性和宽泛的底物特异性,TlGA水解可溶性淀粉、支链淀粉、糖原、糊精和普鲁兰的比活力分别为(255.6±15.3) U/mg、(342.3±24.7) U/mg、(185.4±12.5) U/mg、(423.3±29.3) U/mg和(65.7±8.1) U/mg。从葡萄糖淀粉酶TlGA的一级结构、二级结构和三级结构3个层面对其进行比较分析,发现一级结构中较少的Gly组成和三级结构中较低的非极性基团溶剂可及表面积可能是维持葡萄糖淀粉酶TlGA温度稳定性的主要原因。综合其性质特点和对结构的分析,葡萄糖淀粉酶TlGA在工业葡萄糖生产中有较大应用潜力。 展开更多
关键词 篮状菌 高温葡萄糖淀粉酶 克隆表达 性质特点 结构分析
天蓝色链霉菌海藻糖合酶的异源表达、活性分析及重组菌全细胞转化合成海藻糖的条件优化
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作者 吴傲 张显 +3 位作者 徐美娟 杨套伟 李华钟 饶志明 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第7期1348-1358,共11页
从天蓝色链霉菌Streptomyces coelicolor克隆得到海藻糖合酶基因(ScTreS),在大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)中进行了异源表达,通过Ni-NTA亲和柱对表达产物进行分离纯化得到纯酶,经SDS-PAGE测定其分子量约为62.3 kDa。研究其酶学性... 从天蓝色链霉菌Streptomyces coelicolor克隆得到海藻糖合酶基因(ScTreS),在大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)中进行了异源表达,通过Ni-NTA亲和柱对表达产物进行分离纯化得到纯酶,经SDS-PAGE测定其分子量约为62.3 kDa。研究其酶学性质发现该酶最适温度35℃;最适pH7.0,对酸性条件比较敏感。通过同源建模和序列比对分析,对该基因进行定点突变。突变酶K246A比酶活比野生酶提高了1.43倍,突变酶A165T相对提高了1.39倍,海藻糖转化率分别提高了14%和10%。利用突变体重组菌K246A进行全细胞转化优化海藻糖的合成条件并放大进行5L罐发酵,结果表明:在麦芽糖浓度300g/L、初始反应温度和pH分别为35℃和7.0的条件下,转化率最高达到71.3%,产量为213.93 g/L;当底物浓度增加到700g/L时,海藻糖产量仍可达到465.98g/L。 展开更多
关键词 海藻糖合酶 克隆表达 定点突变 全细胞转化
血清8型禽腺病毒纤突蛋白基因的克隆表达及多克隆抗体的制备
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作者 路浩 张伟 +8 位作者 王伟康 梁广成 王萍 张建军 郑文铝 邵红霞 秦爱建 邹海涛 叶建强 《中国家禽》 北大核心 2018年第4期16-20,共5页
研究首先对血清8型禽腺病毒(FAdV-8)的纤突蛋白基因F进行了克隆并分别构建了原核表达载体和真核表达载体,经测序验证后分别命名为pGEX-6P-1-F和pcDNA3.1-F。将原核表达质粒pGEX-6P-1-F转化BL21,经IPTG诱导,获得了FAdV-8F蛋白的GST... 研究首先对血清8型禽腺病毒(FAdV-8)的纤突蛋白基因F进行了克隆并分别构建了原核表达载体和真核表达载体,经测序验证后分别命名为pGEX-6P-1-F和pcDNA3.1-F。将原核表达质粒pGEX-6P-1-F转化BL21,经IPTG诱导,获得了FAdV-8F蛋白的GST—F可溶性融合表达产物。将纯化的GST—F蛋白免疫BALB/c小鼠制备了抗FAdV-8F蛋白的多克隆抗体。Western blot结果证明,制备的抗FAdV-8F蛋白的多克隆抗体能特异性地识别转染pcDNA3.1一F或感染FAdV-8病毒细胞中57ku大小的蛋白条带。间接免疫荧光试验同样证明,抗FAdV-8的F蛋白的多克隆抗体具有良好的反应性及特异性。研究结果为进一步建立FAdV-8快速血清学诊断方法、亚单位疫苗研制及探究纤突蛋白F在病毒感染致病中作用奠定了基础。 展开更多
关键词 血清8型禽腺病毒 纤突蛋白 克隆表达 克隆抗体
产气肠杆菌B19中β-甘露聚糖酶基因的克隆表达及酶学性质研究 预览
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作者 宋妍 崔堂兵 《食品工业科技》 CSCD 北大核心 2018年第13期142-149,共8页
将产气肠杆菌B19中的β-甘露聚糖酶基因(ManE)进行克隆,获得全长ManE基因序列,将ManE基因与pET28a(+)表达载体连接,转入大肠杆菌BL21(DE3)中,构建重组菌株B121(DE3)-pET-28a(+)-ManE,并成功表达了重组β-甘露聚糖酶。... 将产气肠杆菌B19中的β-甘露聚糖酶基因(ManE)进行克隆,获得全长ManE基因序列,将ManE基因与pET28a(+)表达载体连接,转入大肠杆菌BL21(DE3)中,构建重组菌株B121(DE3)-pET-28a(+)-ManE,并成功表达了重组β-甘露聚糖酶。结果表明:克隆得到ManE基因序列全长为2196bp,编码731个氨基酸。通过Ni柱亲和层析法分离纯化得到纯度较高的重组β-甘露聚糖酶,其分子量大小约为82.5ku。重组β-甘露聚糖酶的酶学性质研究结果显示:最适反应温度和最适pH分别为55℃和6.5,在温度50~55℃,pH4.0-7.0的范围内都能保持较好的稳定性。1 mmol/L浓度的Co2+、Mn2+、Zn2+、Ba2+和Ca2+对重组β-甘露聚糖酶的酶活有不同程度的激活作用。而K+、Mg2+和Cu2+对该重组酶有不同程度的阻碍作用,其中cu2+对该重组酶催化活性的抑制作用最强,酶活降低到最大酶活力的65.3%。本研究实现了β-甘露聚糖酶的异源表达,这些结果为该酶的进一步工业化应用提供了重要的理论依据。 展开更多
关键词 产气肠杆菌B19 Β-甘露聚糖酶 克隆表达 酶学性质
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