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蓖麻延伸因子基因的克隆与表达分析
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作者 王芳 董美玲 +5 位作者 董乐 王云 朱国立 许珊珊 吕冬雪 王建颖 《核农学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第3期464-472,共9页
为探讨蓖麻延伸因子基因(RcEF-1α)作为参考基因进行相关研究的可行性,以蓖麻雌性花为试验材料,扩增RcEF-1α(GenBank登录号:XM002518027. 3)的编码序列(CDS),并将其亚克隆至原核表达载体pET32a(+)构建成重组载体p ET32a(+)-RcEF-1α;将... 为探讨蓖麻延伸因子基因(RcEF-1α)作为参考基因进行相关研究的可行性,以蓖麻雌性花为试验材料,扩增RcEF-1α(GenBank登录号:XM002518027. 3)的编码序列(CDS),并将其亚克隆至原核表达载体pET32a(+)构建成重组载体p ET32a(+)-RcEF-1α;将p ET32a(+)-RcEF-1α转化至大肠杆菌表达菌株BL21 (DE3)中进行优化表达,表达蛋白经纯化后进行Western blot验证。结果表明,异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)可诱导一个分子量约66 kD的特异蛋白;采用纯化的表达蛋白免疫新西兰白兔制备抗RcEF-1α的多克隆抗血清,用多克隆抗血清进行Western blot验证,发现多克隆抗血清具有针对RcEF-1α的特异性,经ELISA检测,其效价为1∶51 200;以抗血清为一抗,通过Western blot分析RcEF-1α在时空条件一致且正常生长的根、茎、叶、雌花、雄花和果实中的表达量,结果显示,蓖麻各组织中RcEF-1α蛋白质的含量存在显著差异,其中雌花和雄花中的含量显著高于其他组织。RT-qPCR分析结果表明,蓖麻各组织中RcEF-1αmRNA差异不显著。本研究结果为蓖麻功能基因表达分析参考基因的筛选提供了一定的理论依据。 展开更多
关键词 蓖麻 转录延伸因子-1α 基因克隆 原核表达 组织表达
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飞蝗发育相关基因Omb的克隆、原核表达及时空表达分析 预览
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作者 张晓红 冯莉 +2 位作者 刘亚超 乔宁 印红 《昆虫学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第1期33-40,共8页
【目的】本研究克隆飞蝗Locusta migratoria发育相关的optomotor-blind(Omb)基因,并对其进行序列和表达分析,旨在更好地了解Omb基因在飞蝗翅发育中的作用及为进一步蝗灾的治理和防治提供新的理论依据。【方法】利用RT-RCR扩增飞蝗Omb基... 【目的】本研究克隆飞蝗Locusta migratoria发育相关的optomotor-blind(Omb)基因,并对其进行序列和表达分析,旨在更好地了解Omb基因在飞蝗翅发育中的作用及为进一步蝗灾的治理和防治提供新的理论依据。【方法】利用RT-RCR扩增飞蝗Omb基因cDNA序列,采用生物信息学软件分析该基因的核苷酸和氨基酸序列,利用MEGA 6.0构建昆虫纲分子系统进化树;构建重组表达载体pET-30a/LmOmb,转化到大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)中,SDS-PAGE及Western blot鉴定重组表达蛋白;基于qPCR技术分析Omb基因在飞蝗不同发育时期及成虫不同组织中的表达谱。【结果】克隆获得飞蝗Omb基因部分cDNA序列,命名为LmOmb(GenBank登录号:MG867658),其长792 bp,编码264个氨基酸,在第37-219位氨基酸之间存在一个T-box superfamily保守结构域。同源序列比对分析表明LmOmb与褐飞虱Nilaparvata lugens NlOmb氨基酸序列一致性为93%。在IPTG诱导下目标蛋白以6×His标签融合蛋白的形式在宿主菌中得到稳定表达。荧光定量PCR结果显示LmOmb基因在飞蝗不同发育时期均有表达,其中胚胎期的表达量最高,进入若虫期后表达量下降,且各龄若虫之间表达量相对平稳。LmOmb基因在雌性和雄性成虫的胸部、足、腹部和翅中都有表达,且雌性和雄性之间表达量明显不同。【结论】LmOmb基因可能参与了飞蝗的胚胎发育。研究结果为进一步研究飞蝗LmOmb的功能提供了依据。 展开更多
关键词 飞蝗 Omb 基因克隆 原核表达 表达
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肝片吸虫CatB4蛋白分子特征及其免疫原性分析 预览
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作者 王熙凤 孟庆玲 +5 位作者 乔军 张凯 张国武 贡莎莎 黄运福 才学鹏 《南方农业学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第1期158-164,共7页
【目的】明确肝片吸虫组织蛋白酶B4(CatB4)的分子特征及其免疫原性,为研究肝片吸虫CatB4蛋白的生物学特性及揭示其致病机理提供科学依据。【方法】通过RT-PCR扩增肝片吸虫CatB4基因,利用在线分子生物信息学软件对CatB4基因及其编码蛋白... 【目的】明确肝片吸虫组织蛋白酶B4(CatB4)的分子特征及其免疫原性,为研究肝片吸虫CatB4蛋白的生物学特性及揭示其致病机理提供科学依据。【方法】通过RT-PCR扩增肝片吸虫CatB4基因,利用在线分子生物信息学软件对CatB4基因及其编码蛋白进行分子特征分析;构建原核表达载体pET-CatB4,经IPTG诱导获得融合蛋白后进行SDS-PAGE和Western blotting检测分析;并以融合蛋白CatB4免疫小鼠制备多克隆抗体,利用免疫组化对融合蛋白在肝片吸虫体内的表达进行定位分析。【结果】肝片吸虫CatB4基因片段为699 bp,其编码蛋白等电点(pI)7.95,理论分子质量25.89 kD,无信号肽和跨膜区,属于非分泌性蛋白;CatB4蛋白存在10个潜在的磷酸化位点、2个N-糖基化位点和7个N-肉豆蔻酰化位点,有9个抗原决定簇,具有高度保守的CatB结构域,是由无规则卷曲连接9个α-螺旋和8个β-折叠构成其空间结构。基于CatB4基因核苷酸序列同源性构建的系统发育进化树显示,肝片吸虫和大片吸虫聚为一支,二者的同源性为83.98%。SDS-PAGE检测和Western blotting分析结果均显示在41.80 kD处能检测到目的条带。以纯化融合蛋白CatB4与弗氏佐剂乳化后免疫的小鼠均可产生特异性抗体,证实融合蛋白CatB4具有较强的免疫原性;免疫组化定位分析结果显示,在肝片吸虫的卵黄腺腺体细胞、排泄管上皮细胞、肠道上皮细胞和卵黄腺管上皮细胞均发生特异性的抗原抗体反应,呈深棕色。【结论】诱导表达获得的融合蛋白CatB4可特异性识别绵羊肝片吸虫阳性血清,具有较强的免疫原性,且主要在肝片吸虫分泌排泄组织器官中表达,说明CatB4蛋白具有作为肝片吸虫候选抗原的潜力。 展开更多
关键词 肝片吸虫 组织蛋白酶B4(CatB4) 原核表达 免疫原性
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小麦选择性自噬关键基因NBR1的原核表达 预览
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作者 刘彦妮 杨文文 王华忠 《天津农业科学》 CAS 2019年第4期1-4,共4页
自噬参与了动植物的生长、发育、衰老和逆境胁迫响应等过程。NBR1是选择性自噬的底物受体之一,其识别泛素化的特定蛋白底物并通过与自噬膜上的ATG8互作引导底物进入自噬降解过程。在前期克隆了两个小麦NBR1基因的基础上,本研究通过常规... 自噬参与了动植物的生长、发育、衰老和逆境胁迫响应等过程。NBR1是选择性自噬的底物受体之一,其识别泛素化的特定蛋白底物并通过与自噬膜上的ATG8互作引导底物进入自噬降解过程。在前期克隆了两个小麦NBR1基因的基础上,本研究通过常规的分子克隆技术构建了两个基因的原核表达载体并将其转化到大肠杆菌中,利用SDS-PAGE方法鉴定了两个NBR1基因在大肠杆菌中的表达情况。结果表明,导入大肠杆菌的两个小麦NBR1均能够被IPTG诱导表达;表达重组蛋白两端含有His(6)标签,其表观分子量与理论分子量基本一致;重组蛋白在诱导后2h即表现较高的表达量,并在诱导后4h达到最高的表达量。研究结果为后续小麦NBR1蛋白的纯化、抗体的制备以及该蛋白的互作性质、表达特征等功能研究工作奠定了基础。 展开更多
关键词 选择性自噬 小麦 NBR1基因 原核表达
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重组人白血病抑制因子的原核表达及优化 预览
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作者 曹顺 杨玉露 +2 位作者 徐光华 陈思佳 王天云 《新乡医学院学报》 CAS 2019年第3期228-233,共6页
目的在大肠杆菌中表达重组人白血病抑制因子(HLIF)蛋白,并探索其高效表达的条件。方法将HLIF重组质粒转化至大肠杆菌BL21,分别给予不同诱导时间(4、8、12、16、20、24 h)、不同浓度大肠杆菌(吸光度值分别为0. 5、0. 6、0. 8、1. 0)、不... 目的在大肠杆菌中表达重组人白血病抑制因子(HLIF)蛋白,并探索其高效表达的条件。方法将HLIF重组质粒转化至大肠杆菌BL21,分别给予不同诱导时间(4、8、12、16、20、24 h)、不同浓度大肠杆菌(吸光度值分别为0. 5、0. 6、0. 8、1. 0)、不同诱导温度(20、25、30、37、42℃)、不同浓度诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)(0. 1、0. 2、0. 3、0. 4、0. 5 mmol·L-1)、不同浓度乙酸(0. 0、0. 1、0. 2、0. 3、0. 4 mmol·L-1)进行培养,蛋白电泳考马斯亮蓝染色后,采用Image J软件分析HLIF蛋白的相对表达量,观察不同干预条件对HLIF表达的影响。结果不同诱导时间下HLIF蛋白相对表达量比较差异有统计学意义(F=22. 088,P <0. 05),诱导16 h时的HLIF蛋白相对表达量显著高于诱导4、8、12、20、24 h(P <0. 05)。不同浓度(以吸光度值表示)大肠杆菌诱导时HLIF蛋白相对表达量比较差异有统计学意义(F=17. 153,P <0. 05);吸光度值为0. 8时HLIF蛋白相对表达量显著高于吸光度值为0. 5、0. 6时(P <0. 05),吸光度值为1. 0时与吸光度值为0. 8时HLIF蛋白相对表达量比较差异无统计学意义(P> 0. 05)。不同温度诱导时HLIF蛋白相对表达量比较差异有统计学意义(F=18. 053,P <0. 05),25℃时HLIF蛋白相对表达量显著高于20、30、37、42℃时(P <0. 05)。不同浓度诱导剂诱导时HLIF蛋白相对表达量比较差异无统计学意义(F=1. 181,P> 0. 05)。不同浓度乙酸诱导时HLIF蛋白相对表达量比较差异有统计学意义(F=27. 181,P <0. 05),乙酸浓度为0. 00 mmol·L-1时HLIF蛋白相对表达量显著高于乙酸浓度为0. 1、0. 2、0. 3、0. 4 mmol·L-1时(P <0. 05)。结论成功在大肠杆菌表达了HLIF,并探索出了适合最佳表达的诱导时间、大肠杆菌浓度、诱导温度、诱导剂浓度、乙酸浓度等条件。 展开更多
关键词 人白血病抑制因子 原核表达 优化
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H3N2犬流感病毒M1蛋白的原核表达及鉴定 预览
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作者 余晓颖 田园 +4 位作者 张国利 吴广谋 刘雨玲 李泽鸿 岳玉环 《中国兽药杂志》 2019年第1期1-8,共8页
为制备犬流感病毒(H3N2) M1蛋白纯品,针对M1基因序列设计引物,用聚合酶链式反应(PCR)扩增目的基因片段,扩增产物克隆至表达载体pET-SUMO中并转化至宿主菌BL21(DE3),诱导表达目的蛋白,探索纯化工艺,制备目的蛋白,并用Western blot检测纯... 为制备犬流感病毒(H3N2) M1蛋白纯品,针对M1基因序列设计引物,用聚合酶链式反应(PCR)扩增目的基因片段,扩增产物克隆至表达载体pET-SUMO中并转化至宿主菌BL21(DE3),诱导表达目的蛋白,探索纯化工艺,制备目的蛋白,并用Western blot检测纯化的M1目的蛋白。通过PCR成功扩增出大小为771 bp的M1基因,成功构建p ET-SUMO-M1表达载体,表达的融合蛋白相对分子量为41 kD,主要以可溶形式表达,纯化后获得蛋白纯品,Western blot检测显示用M1蛋白(28 k D)免疫小鼠制备的多抗能与制备的蛋白纯品发生特异性反应,从而证明蛋白纯品为M1目的蛋白。试验制备出的M1蛋白纯品可为进一步制备通用型抗犬流感病毒抗体提供纯品抗原。 展开更多
关键词 H3N2犬流感病毒 M1蛋白 原核表达 蛋白纯化
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鸡柔嫩艾美尔球虫HAP2基因的克隆与原核表达 预览
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作者 梁爽 王蓓蕾 +5 位作者 项钰 佟季航 于鹦月 马闯 谭忠亮 寇叙 《现代畜牧兽医》 2019年第2期1-4,共4页
为研究鸡柔嫩艾美尔球虫(E.tenella)HAP2(hapless2/generative cell-specific)蛋白的抗原性,根据Gen?Bank发表的HAP2基因的cDNA序列(Gene ID:25252561)ORF设计1对引物,用RT-PCR方法从柔嫩艾美耳球虫配子体总RNA中扩增HAP2基因,将扩增产... 为研究鸡柔嫩艾美尔球虫(E.tenella)HAP2(hapless2/generative cell-specific)蛋白的抗原性,根据Gen?Bank发表的HAP2基因的cDNA序列(Gene ID:25252561)ORF设计1对引物,用RT-PCR方法从柔嫩艾美耳球虫配子体总RNA中扩增HAP2基因,将扩增产物与pMD18-T载体连接后进行测序和序列分析,将测序正确的HAP2基因亚克隆入原核表达载体pET32a,转化宿主菌E.coli RGB,在IPTG诱导下进行原核表达。结果在20℃诱导12 h条件下成功表达了HAP2融合蛋白大小为41 ku,并应用磁珠纯化的方法纯化了重组蛋白,获得了HAP2融合蛋白,为进一步研究HAP2的抗原性奠定基础。 展开更多
关键词 柔嫩艾美尔球虫 HAP2基因 原核表达
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盐藻钙依赖蛋白激酶基因DsCDPK的表达分析 预览
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作者 丛玉婷 邢震宇 +3 位作者 岳金荣 高相楠 张晓琳 柴晓杰 《水产科学》 CAS CSCD 北大核心 2019年第2期248-253,共6页
以盐藻总RNA为模板,利用RT-PCR技术扩增了盐藻DsCDPK基因的cDNA序列,将其克隆到pMD TM 19-T simple载体上,经测序获得的克隆片段全长1650 bp,与已发表的盐藻DsCDPK(GenBank: JQ964113)的编码区序列同源性达100%。将DsCDPK基因的开放阅... 以盐藻总RNA为模板,利用RT-PCR技术扩增了盐藻DsCDPK基因的cDNA序列,将其克隆到pMD TM 19-T simple载体上,经测序获得的克隆片段全长1650 bp,与已发表的盐藻DsCDPK(GenBank: JQ964113)的编码区序列同源性达100%。将DsCDPK基因的开放阅读框与质粒pET-32a(+)连接,构建原核表达载体pET-32a-DsCDPK。将该重组质粒转化到大肠杆菌BL21中,经IPTG诱导融合,蛋白在大肠杆菌BL21中得到成功表达。通过SDS-PAGE检测发现,融合蛋白为部分可溶性表达,将上清蛋白经过His柱纯化后获得了纯度较高的可溶性融合蛋白,Western杂交检测显示,融合蛋白能被抗His单克隆抗体特异性识别,初步证明该融合蛋白就是带有His标签的DsCDPK蛋白。采用实时荧光定量PCR方法分析了高盐胁迫下DsCDPK基因的表达模式。试验结果表明,盐藻DsCDPK基因为盐胁迫上调基因,在高盐(3.0 mol/L NaCl)胁迫下,DsCDPK基因表达量显著增加,盐胁迫1 h时表达量达到最高,为正常生长状况(1.0 mol/L NaCl)下的3倍,差异达到极显著水平( P < 0.01 )。该研究成果为进一步阐明盐藻钙依赖蛋白激酶基因的功能及作用机制奠定了基础。 展开更多
关键词 杜氏盐藻 DsCDPK 原核表达 实时荧光定量PCR 盐胁迫
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牛支原体EF-Tu基因的克隆表达、亚细胞定位及间接ELISA方法建立
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作者 王艳芳 周雅坪 +4 位作者 郭婷 张新竹 吴倩 陈昕迪 郝永清 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第1期134-142,共9页
旨在获得牛支原体延伸因子EF-Tu蛋白,分析其在牛支原体菌体内的分布情况,建立EF-Tu间接ELISA法,为进一步研究牛支原体EF-Tu的生物学功能提供理论依据,也为建立牛支原体有效的血清学诊断方法和亚单位疫苗的研制奠定基础。参照Uniprot数... 旨在获得牛支原体延伸因子EF-Tu蛋白,分析其在牛支原体菌体内的分布情况,建立EF-Tu间接ELISA法,为进一步研究牛支原体EF-Tu的生物学功能提供理论依据,也为建立牛支原体有效的血清学诊断方法和亚单位疫苗的研制奠定基础。参照Uniprot数据库中M.bovisPG45株EF-Tu基因序列,应用OverlapPCR扩增获得EF-Tu基因并将其克隆至pMD19-T载体,测序正确后,构建pET32a-EF-Tu原核表达载体,转化大肠杆菌BL21表达菌,IPTG诱导表达,纯化后的表达产物免疫新西兰兔(New Zealand rabbit)制备多克隆抗体,利用间接ELISA测定高免血清抗体效价,用Western blot和间接ELISA法初步定位EF-Tu在菌体内的分布,通过优化反应条件,建立间接ELISA检测法。结果表明:重组蛋白EF-Tu约为66ku,主要以可溶性形式表达;采用间接ELISA测定的多克隆抗体效价为1∶6400;Western blot和ELISA表明该蛋白在牛支原体细胞质和细胞膜中均有表达,且含量相当。利用EF-Tu建立的ELISA法具有很好的特异性和敏感性。通过原核表达系统成功得到牛支原体延伸因子的重组蛋白,该蛋白分布于菌体细胞质和膜表面,且含量基本相当。本研究所建立的EF-TuELISA法适合大规模的血清学诊断检测。 展开更多
关键词 牛支原体 原核表达 多克隆抗体 亚细胞定位 ELISA
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坏死梭杆菌亚单位疫苗候选抗原蛋白的筛选、表达及免疫原性分析 预览
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作者 肖璐 谢晶 +10 位作者 康润敏 叶勇刚 于吉锋 曹冶 李兴玉 魏勇 林毅 廖党金 潘梦 叶健强 戴卓建 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2019年第1期215-222,共8页
试验旨在筛选坏死梭杆菌(Fusobacterium necrophorum,Fn)外膜蛋白(outer membrane protein,Omp)中的候选抗原蛋白,为Fn的亚单位疫苗研究奠定基础。采用Uniprot对Fn Omp序列进行预测,基于预测结果筛选拟表达蛋白,并根据GenBank中登录的Fn... 试验旨在筛选坏死梭杆菌(Fusobacterium necrophorum,Fn)外膜蛋白(outer membrane protein,Omp)中的候选抗原蛋白,为Fn的亚单位疫苗研究奠定基础。采用Uniprot对Fn Omp序列进行预测,基于预测结果筛选拟表达蛋白,并根据GenBank中登录的Fn Omp相应基因序列设计特异性引物,以QL03株为模板进行PCR扩增、原核表达,以及SDS-PAGE和Western blotting分析,并通过血清杀菌试验和小鼠免疫攻毒保护试验,鉴定重组蛋白的免疫原性,筛选最佳候选蛋白。结果显示,预测得到121个蛋白,顺次命名为1-Fn~121-Fn,根据预测结果筛选出8-Fn、11-Fn、41-Fn、95-Fn和102-Fn 5个候选蛋白,其PCR扩增产物大小分别为672、1 164、570、1 059、729bp。SDS-PAGE和Western blotting分析显示,除8-Fn未表达外,其余4个蛋白均成功表达,大小分别为60、39、59、44ku,命名为P11-Fn、P41-Fn、P95-Fn和P102-Fn,均能与Fn阳性血清反应。血清杀菌试验结果显示,4个重组蛋白均有一定杀菌效果,其中抗P102-Fn血清的杀菌效果最佳,杀菌率可达40.49%。小鼠免疫保护试验结果显示,P11-Fn、P41-Fn、P95-Fn和P102-Fn对小鼠均具有一定的保护效果,其中P102-Fn保护效率最高,达60%。结果表明,P11-Fn、P41-Fn、P95-Fn和P102-Fn均具有良好的免疫原性,其中P102-Fn的免疫原性及诱导机体产生保护免疫反应能力最佳,最有望成为Fn亚单位疫苗的候选蛋白。 展开更多
关键词 坏死梭杆菌 原核表达 外膜蛋白 免疫原性 杀菌试验
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乳酸菌细菌素Avicin A的高效表达及抑菌活性研究
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作者 宋前进 张静 +2 位作者 贾燕 关平原 温永俊 《食品科技》 CAS 北大核心 2019年第1期26-31,共6页
乳酸菌细菌素是一种广谱抑菌素,已成为天然食品防腐剂研究与开发的热点。文章进行了该类细菌素在大肠杆菌中的异源表达,并应用Western-blot鉴定。利用组氨酸标签纯化及Trx-Tag标签的切除,对重组蛋白的抑菌活性进行检测。根据GenBank数... 乳酸菌细菌素是一种广谱抑菌素,已成为天然食品防腐剂研究与开发的热点。文章进行了该类细菌素在大肠杆菌中的异源表达,并应用Western-blot鉴定。利用组氨酸标签纯化及Trx-Tag标签的切除,对重组蛋白的抑菌活性进行检测。根据GenBank数据库中公布的细菌素Avicin A基因设计引物,以本实验室分离自酸马乳中的乳酸菌XM-38株为模板,采用PCR方法扩增了细菌素Avicin A片段,利用原核表达载体pET-32a(+)构建重组质粒HIS-Trx-Avicin A,将重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)中表达,获得了可溶性表达的融合蛋白(HIS-Trx-Avicin A)。SDS-PAGE分析HISTrx-Avicin A蛋白大小约为42 ku,表达量约占菌体总蛋白的19%。经亲和柱层析纯化后,得到纯化的HIS-Trx-Avicin A蛋白,含量180μg/mL。用肠激酶对融合蛋白HIS-Trx-Avicin A进行解离,获得浓度为20μg/mL的目的蛋白Avicin A。对HIS-Trx-Avicin A进行Western-blot鉴定,表明该细菌素蛋白得到了重组表达,对多种菌的抑菌实验表明,该重组蛋白具有良好的抑菌活性,研究的Avicin A为食品添加防腐剂提供了一个切实可行的来源。 展开更多
关键词 细菌素 Avicin A基因 原核表达 抑菌活性
柑橘黄龙病病原CLIBASIA_03230基因的克隆及其编码蛋白的原核表达
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作者 赵国欢 张小兵 +1 位作者 李凡 李为民 《云南农业大学学报:自然科学版》 CSCD 北大核心 2019年第1期9-14,共6页
【目的】柑橘黄龙病(Citrus Huanglongbing,HLB)是由韧皮部杆菌(Candidatus Liberibacter spp.)引发的重要柑橘病害。本试验利用生物信息学方法分析韧皮部杆菌全基因组,推测CLIBASIA_03230基因(命名为Clsp11)编码分泌蛋白,克隆该基因并... 【目的】柑橘黄龙病(Citrus Huanglongbing,HLB)是由韧皮部杆菌(Candidatus Liberibacter spp.)引发的重要柑橘病害。本试验利用生物信息学方法分析韧皮部杆菌全基因组,推测CLIBASIA_03230基因(命名为Clsp11)编码分泌蛋白,克隆该基因并构建其原核表达载体,表达、纯化Clsp11蛋白,以用于制备特异抗体。【方法】利用CTAB法从感染柑橘黄龙病病原的长春花中提取总DNA,以此为模板经PCR扩增Clsp11,并克隆至pMD18-T载体,挑取阳性克隆测序验证;利用无缝克隆技术将Clsp11克隆至原核表达载体pET30a,通过PCR和酶切鉴定筛选阳性克隆,命名为pET30a-Clsp11;转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导,表达N-端融合6×His标签的Clsp11重组蛋白,SDS-PAGE电泳检测,分析目的蛋白的表达水平,并利用镍柱进行纯化。【结果】Clsp11蛋白成功表达,IPTG诱导5h表达量显著提高,主要以包涵体形式存在于宿主菌中。【结论】本研究克隆了柑橘黄龙病病原Clsp11基因,构建了原核表达载体pET30a-Clsp11,并成功表达、纯化了Clsp11重组蛋白,为进一步制备特异性抗体和研究Clsp11生物学功能奠定了基础。 展开更多
关键词 柑橘黄龙病 Clsp11 基因克隆 原核表达
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多杀性巴氏杆菌中recN基因的克隆、原核表达及生物信息学分析 预览
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作者 章泸尹 郑义盈 +11 位作者 王成强 安琪 张萌萌 黄海峰 张振兴 李宝宝 朱姝 杨小健 曹瑞勇 聂鑫 杜丽 王凤阳 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2019年第3期661-668,共8页
试验旨在对多杀性巴氏杆菌recN基因进行克隆和原核表达,并对其表达蛋白进行生物信息学分析。参照GenBank中recN基因序列(登录号:CP003313.1)设计1对引物,通过PCR扩增获得目的基因片段,构建pET-28a(+)-recN重组质粒并转化E.coli DH5α感... 试验旨在对多杀性巴氏杆菌recN基因进行克隆和原核表达,并对其表达蛋白进行生物信息学分析。参照GenBank中recN基因序列(登录号:CP003313.1)设计1对引物,通过PCR扩增获得目的基因片段,构建pET-28a(+)-recN重组质粒并转化E.coli DH5α感受态细胞,提取质粒进行酶切鉴定,将鉴定正确的重组质粒转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达,对融合蛋白进行SDS-PAGE及Western blotting鉴定。结果表明,试验成功克隆了大小约为1677bp的recN基因序列,通过诱导表达的His-Tag融合蛋白大小约为66.94ku,主要以包涵体形式存在。经生物信息学分析,recN蛋白的分子式为C2735H4428N786O855S16,消光系数为24785,不稳定系数为43.99,属于不稳定蛋白;理论等电点(pI)为5.62,为酸性蛋白;总平均亲水性为-0.316,与试验表达的包涵体蛋白性质相同,即同为疏水性蛋白;recN蛋白在哺乳动物网织红细胞的半衰期为30h,在酵母(体内)中的半衰期>20h,在大肠杆菌(体内)中的半衰期>10h;二级结构主要以α-螺旋(64.87%)及无规则卷曲(21.00%)为主;经疏水性分析,预测该蛋白有3个高疏水性区域和9个高亲水性区域。本试验结果为进一步探究多杀性巴氏杆菌recN基因的功能提供了参考依据。 展开更多
关键词 多杀性巴氏杆菌 recN基因 克隆 原核表达 生物信息学分析
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树鼩干细胞生长因子的原核表达、纯化及免疫原性
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作者 龙琼 郝嘉茂 +8 位作者 徐盟 毕研伟 肖红剑 李智华 闫玲梅 丁晨 李育中 姚月婷 寸韡 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2019年第1期20-24,28共6页
目的原核表达、纯化树鼩干细胞生长因子(stem cell factor,SCF),并检测其免疫原性。方法根据GenBank预测的树鼩SCF基因序列设计引物,PCR扩增SCF基因,克隆至原核表达载体p ET-30a(+)中,构建重组表达质粒pET-30a(+)-SCF,转化大肠埃希菌BL2... 目的原核表达、纯化树鼩干细胞生长因子(stem cell factor,SCF),并检测其免疫原性。方法根据GenBank预测的树鼩SCF基因序列设计引物,PCR扩增SCF基因,克隆至原核表达载体p ET-30a(+)中,构建重组表达质粒pET-30a(+)-SCF,转化大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达的融合蛋白经Ni柱纯化后,免疫家兔,Western blot和ELISA法检测其免疫原性,并检测SCF在树鼩不同组织中的分布情况。结果重组表达质粒pET-30a(+)-SCF经酶切及测序证实构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约为34 500,表达量约占菌体总蛋白的35.6%,以包涵体形式存在;纯化后的重组蛋白纯度达90%以上,可与兔抗人SCF多克隆抗体特异性结合,且免疫原性良好,抗血清效价为1∶256 000。在鼻、气管、肺、脾、肾、食管中能检测到SCF的分布。结论在大肠埃希菌中高效表达了重组SCF蛋白,纯化复性后具有良好的免疫原性。 展开更多
关键词 树鼩 干细胞生长因子 原核表达 纯化 免疫原性
拟南芥细胞周期基因AtCDC5的功能研究及抗体制备 预览
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作者 徐金龙 梁爽 郁飞 《江苏农业学报》 CSCD 北大核心 2019年第1期26-32,共7页
MYB相关CDC5(Cell division cycle 5)蛋白对于细胞周期G2期的正常进行是必须的,但是在植物中对这种蛋白质的研究还较少涉及。本试验测量比较野生型拟南芥(Col-0生态型)和AtCDC5T-DNA插入缺失突变体(GK_278B09)的主根生长速度和长度,利... MYB相关CDC5(Cell division cycle 5)蛋白对于细胞周期G2期的正常进行是必须的,但是在植物中对这种蛋白质的研究还较少涉及。本试验测量比较野生型拟南芥(Col-0生态型)和AtCDC5T-DNA插入缺失突变体(GK_278B09)的主根生长速度和长度,利用瞬时表达AtCDC5-GFP研究AtCDC5在拟南芥叶片叶肉细胞中的定位,同时利用AtCDC5N端144个氨基酸在大肠杆菌中进行原核表达和纯化,免疫家兔获得针对AtCDC5的多克隆特异性抗体,从表型、细胞和蛋白质水平研究AtCDC5基因的功能。结果表明,GK_278B09的主根因发育受到抑制而生长速度缓慢;AtCDC5-GFP融合蛋白主要定位于细胞核中;经过分离得到的AtCDC5蛋白抗血清能够有效地检测出10ng原核表达的AtCDC51-144抗原,并在原生质体AtCDC5过表达体系中检测出1条分子量约为120000的条带,此条带与AtCDC5-GFP大小相近。本研究成功制备出AtCDC5蛋白的多克隆抗体,为进一步研究AtCDC5蛋白影响细胞周期从而影响植物生长发育提供了研究基础。 展开更多
关键词 细胞周期基因CDC5 亚细胞定位 原核表达 抗体制备
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嗜水气单胞菌气溶素的表达纯化和活性实验 预览
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作者 董靖 刘永涛 +3 位作者 胥宁 杨秋红 杨移斌 艾晓辉 《中国渔业质量与标准》 2019年第1期27-33,共7页
气溶素(AerA)是嗜水气单胞菌分泌的重要毒力因子之一。为开展抗气溶素药物的筛选,本实验设计得到高纯度的气溶素重组蛋白并研究其生物学活性。本实验依据嗜水气单胞菌气溶素基因(aerA)序列设计特异性引物,采用PCR扩增、酶切、连接构建ae... 气溶素(AerA)是嗜水气单胞菌分泌的重要毒力因子之一。为开展抗气溶素药物的筛选,本实验设计得到高纯度的气溶素重组蛋白并研究其生物学活性。本实验依据嗜水气单胞菌气溶素基因(aerA)序列设计特异性引物,采用PCR扩增、酶切、连接构建aerA-pGEX-6p-1原核表达载体,经测序验证后将其转化至BL21(DE3)菌株,经IPTG诱导、亲和层析、离子交换层析纯化,然后进行溶血试验测定其生物学活性。结果表明,当表达温度为16℃,经0.2mmol/LIPTG诱导表达16h后可得到可溶性蛋白,纯化后其纯度大于95%,该蛋白对绵羊红细胞的溶血单位为54.17HU/μg。本实验通过原核表达、纯化得到的可溶性重组气溶素蛋白,具有良好的溶血活性,为进一步探究气溶素功能及其应用铺垫基础。[中国渔业质量与标准,2019,9(1):27-33]. 展开更多
关键词 嗜水气单胞菌 气溶素 原核表达 纯化 溶血活性 PCR扩增 分子克隆
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铜绿假单胞菌RhlR抗血清制备
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作者 訾静 王军 +3 位作者 高磊 张琨 张绪 万一 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2019年第1期72-75,共4页
目的在原核系统中表达铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PA)PAO1的调控蛋白RhlR,制备兔抗RhlR抗血清。方法构建重组表达载体pGEX-4T-1-rhlR和pET-22b-rhlR并转化至大肠埃希菌BL21感受态细胞中,IPTG诱导表达GST-RhlR和His-RhlR蛋白,... 目的在原核系统中表达铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PA)PAO1的调控蛋白RhlR,制备兔抗RhlR抗血清。方法构建重组表达载体pGEX-4T-1-rhlR和pET-22b-rhlR并转化至大肠埃希菌BL21感受态细胞中,IPTG诱导表达GST-RhlR和His-RhlR蛋白,经GST或Ni2+亲和层析纯化重组蛋白。将His-RhlR蛋白免疫新西兰大白兔,制备RhlR抗血清,GST-RhlR蛋白包被ELISA板,检测效价。结果构建的表达载体pGEX-4T-1-rhlR和pET-22b-rhlR经双酶切及测序鉴定证明构建正确;构建的工程菌表达的目的蛋白His-RhlR和GST-RhlR相对分子质量分别为29 000和54 000,表达量均约占菌体总蛋白的85%,纯度大于90%。制备的RhlR抗血清效价可达1∶80 000。结论获得高效价的RhlR抗血清,为PA中rhl调控系统的研究奠定基础。 展开更多
关键词 铜绿假单胞菌 原核表达 RhlR 抗血清
家蚕整合素β2的表达、纯化及其免疫功能 预览
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作者 张奎 李重阳 +3 位作者 苏晶晶 谈娟 徐曼 崔红娟 《中国农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2019年第1期181-190,共10页
【目的】分析家蚕(Bombyx mori)整合素β2的序列和结构特征及其在家蚕感染病原菌后血细胞中的表达变化,检测其重组蛋白对不同病原相关模式分子识别和病原菌的凝聚作用,为进一步探究家蚕整合素β2的蛋白功能打下基础。【方法】利用生物... 【目的】分析家蚕(Bombyx mori)整合素β2的序列和结构特征及其在家蚕感染病原菌后血细胞中的表达变化,检测其重组蛋白对不同病原相关模式分子识别和病原菌的凝聚作用,为进一步探究家蚕整合素β2的蛋白功能打下基础。【方法】利用生物信息学对整合素β2的序列和结构特征进行分析,利用实时荧光定量PCR检测家蚕分别注射大肠杆菌(Escherichia coli)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)后整合素β2在血细胞中的表达变化。通过PCR技术扩增获得整合素β2完整的胞外域片段,构建至pET22b原核表达载体后转化至E.coli Rosetta(DE3)表达菌株。经IPTG诱导获得重组蛋白,利用Ni-NTA亲和层析得到纯化的体外重组蛋白,利用SDS-PAGE和Western blot对纯化获得的体外重组蛋白的纯度和质量进行检测。利用ELISA检测重组蛋白与两种不同病原相关分子模式LPS和PGN的结合情况,运用Western blot检测重组蛋白与不同病原微生物的结合情况,通过凝集试验检测重组蛋白对金黄色葡萄球菌的凝集能力,最后在个体水平探索重组蛋白在体内细菌清理中的作用。【结果】家蚕整合素β2具有典型的β整合素亚基保守结构特征,即由一个较长的胞外域、一个单次跨膜结构域和一个较短的胞内域构成。家蚕整合素β2具有金属离子结合位点MIDAS、EGF结构域、半胱氨酸重复基序和NPxY等整合素典型的结构特征。实时荧光定量PCR检测结果表明家蚕在受到细菌感染后,整合素β2的表达发生显著变化。通过原核表达和蛋白纯化获得纯度较高的重组蛋白,SDS-PAGE和Western blot检测结果表明纯化的重组蛋白纯度较高,可以用于后续试验。ELISA试验表明重组蛋白对LPS和PGN等病原相关分子模式具有较强的结合能力。细菌结合试验结果显示重组蛋白能够结合多种细菌,但与革兰氏阳性菌的结合能力要高于革兰氏阴性菌。细菌凝聚试验 展开更多
关键词 家蚕 整合素β2 细菌感染 原核表达 细菌凝聚
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朱砂叶螨几丁质酶TecCht1基因的原核表达与纯化
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作者 李博 洪鹏 +2 位作者 沈宏亮 杨金 卜春亚 《北京农学院学报》 2019年第1期8-13,共6页
【目的】朱砂叶螨是世界范围广泛分布的重要经济害螨,害螨防治十分困难.而几丁质酶是昆虫体内几丁质代谢中分解几丁质的关键酶,在更替新旧表皮和降解围食膜中起着重要的作用,几丁质酶是潜在的螨害生物防治靶标.本研究对朱砂叶螨几丁质酶... 【目的】朱砂叶螨是世界范围广泛分布的重要经济害螨,害螨防治十分困难.而几丁质酶是昆虫体内几丁质代谢中分解几丁质的关键酶,在更替新旧表皮和降解围食膜中起着重要的作用,几丁质酶是潜在的螨害生物防治靶标.本研究对朱砂叶螨几丁质酶TecCht1进行原核表达和纯化.【方法】克隆朱砂叶螨TecCht1基因的催化结构域,连接到pColdⅡ载体上,构建pColdⅡ/TecCht1重组表达载体,在大肠杆菌中进行高效表达,采用镍柱纯化目的蛋白,并进行Western Blot检测.【结果】TecCht1在pColdⅡ载体上成功高水平表达,确定最佳诱导表达时间为24h.对TecCht1进行大量表达和纯化,经Western Blot验证,获得纯度较高的目的蛋白.【结论】实现TecCht1体外高效原核表达,获得大量的TecCht1重组蛋白. 展开更多
关键词 朱砂叶螨 几丁质酶 pColdⅡ 原核表达 纯化
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艰难梭菌谷氨酸脱氢酶的原核表达及其胶体金免疫层析检测方法的建立
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作者 任永鑫 孙斌 徐广贤 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2019年第3期303-310,共8页
目的原核表达艰难梭菌(Clostridium difficile,CD)谷氨酸脱氢酶(glutamate dehydrogenase,GDH),并建立GDH胶体金免疫层析检测方法。方法以艰难梭菌(ATCC BAA-1382)全基因组为模板,PCR法扩增GDH基因,并克隆至载体pET-30a(+),将重组质粒... 目的原核表达艰难梭菌(Clostridium difficile,CD)谷氨酸脱氢酶(glutamate dehydrogenase,GDH),并建立GDH胶体金免疫层析检测方法。方法以艰难梭菌(ATCC BAA-1382)全基因组为模板,PCR法扩增GDH基因,并克隆至载体pET-30a(+),将重组质粒转染至E. coli BL21(DE3),诱导表达重组GDH,并优化IPTG终浓度(0、0. 2、0. 4、0. 6、0. 8、1. 0 mmol/L)、诱导时间(0、2、4、6 h)及诱导温度(31、34、37℃),表达产物采用Ni-NTA purificationSystem进行纯化。用纯化蛋白免疫家兔,以获得的多克隆抗体作为金标抗体,制备胶体金试纸条,并验证其灵敏性、特异性、精密性及稳定性。结果经双酶切及测序鉴定,重组质粒p ET-30a-GDH构建正确。最适诱导表达条件为:于37℃,IPTG终浓度为0. 8 mmol/L诱导4 h。获得的免疫血清效价达1∶51 200,制备的胶体金试纸条灵敏性为60 ng/mL,与其他肠道菌无交叉反应,批内、批间结果无差异,且具有良好的稳定性。结论原核表达了重组GDH,成功建立了GDH胶体金试纸条检测方法,且灵敏性、特异性、精密性及稳定性均良好,具有临床应用价值。 展开更多
关键词 艰难梭菌 谷氨酸脱氢酶 原核表达 胶体金试纸条
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