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重组人GST-TCF4βBD在大肠杆菌中的表达条件优化与活性鉴定 认领
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作者 付正豪 王慷 +2 位作者 胡克 刘晓平 陈云雨 《生命的化学》 CAS CSCD 2020年第4期614-621,共8页
在大肠杆菌中优化重组人GST-TCF4 βBD(recombinant human GST-TCF4 β-catenin binding domain,rhGST-TCF4 βBD)的表达条件及其生物学活性初探。化学合成的人TCF4βBD基因片段与pGEX-6P-1表达载体连接,构建重组质粒,再将其转化到Esche... 在大肠杆菌中优化重组人GST-TCF4 βBD(recombinant human GST-TCF4 β-catenin binding domain,rhGST-TCF4 βBD)的表达条件及其生物学活性初探。化学合成的人TCF4βBD基因片段与pGEX-6P-1表达载体连接,构建重组质粒,再将其转化到Escherichia coli Rosetta(DE3)感受态细胞中诱导目的蛋白质表达。通过优化诱导时间、诱导温度和IPTG浓度,确定rhGST-TCF4βBD可溶表达的最佳条件。以GSTrap^TM亲和柱分离纯化rhGST-TCF4 βBD后,再以GST Pull-down实验进行生物学活性鉴定。SDS-PAGE结果表明,在大肠杆菌中成功进行了rhGST-TCF4βBD的可溶表达,确定诱导温度25℃、诱导时间8 h和0.2 mmol/L IPTG作为rhGST-TCF4 βBD可溶表达的最佳表达条件,此时表达量达24%,趋于表达量峰值。GST Pull-down实验结果表明,纯化的rhGST-TCF4 βBD能与重组人β-catenin和细胞内源β-catenin特异性结合,具有良好的生物学活性。本文成功进行了rhGST-TCF4 βBD在大肠杆菌中的表达条件优化与活性鉴定,为靶向β-catenin/TCF4相互作用小分子抑制剂筛选模型的建立奠定了实验基础。 展开更多
关键词 T细胞因子4 βBD结构域 原核表达 表达优化 GST Pull-down实验
貉细小病毒的原核表达及病毒样颗粒的制备 认领
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作者 雷欢 李希辰 +2 位作者 孙博 吴丛梅 殷玉和 《黑龙江畜牧兽医》 CAS 北大核心 2020年第11期104-109,共6页
为了利用大肠杆菌系统可溶性表达貉细小病毒(Raccoon dog parvovirus,RDPV)的衣壳蛋白VP2,获得RDPV病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs),试验首先通过密码子优化并合成RDPV VP2基因,构建重组表达质粒pET30a-VP2,转化至E.coli ER2566... 为了利用大肠杆菌系统可溶性表达貉细小病毒(Raccoon dog parvovirus,RDPV)的衣壳蛋白VP2,获得RDPV病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs),试验首先通过密码子优化并合成RDPV VP2基因,构建重组表达质粒pET30a-VP2,转化至E.coli ER2566感受态细胞中;SDS-PAGE电泳检测目的蛋白RDPV VP2的表达形式;将重组表达质粒pET30a-VP2与分子伴侣质粒pTf16共同转入E.coli ER2566感受态细胞中,并优化最佳诱导表达条件;采用Western-blot技术鉴定目的蛋白的可溶性;经硫酸铵初级纯化后,电镜观察VLPs的形态,并采用血凝试验检测其免疫活性。结果表明:目的蛋白RDPV VP2得到了大量表达,并且大部分以可溶性形式表达,最佳诱导条件为30℃、0.1 mmol/L IPTG和2.0 g/L L-阿拉伯糖;犬细小单克隆抗体可以特异性识别目的蛋白RDPV VP2;30%硫酸铵沉淀初级纯化后,电镜观察可见到均一的、大小为24 nm左右的RDPV VLPs,其形态学结构与天然RDPV VLPs形态相似,血凝效价为2^23。说明分子伴侣可有效提高目的蛋白RDPV VP2的可溶性表达量,并成功制备出RDPV VLPs。 展开更多
关键词 貉细小病毒 衣壳蛋白VP2 原核表达 分子伴侣 病毒样颗粒 可溶性表达
黄颡鱼细胞因子信号传导抑制因子SOCS1的原核表达及多克隆抗体制备 认领
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作者 叶汉梅 魏晓雷 谭肖英 《水产学报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第4期523-527,共5页
细胞因子信号传导抑制因子(suppressor of cytokine signaling, SOCS)是一类由细胞产生的胞内蛋白,能够反馈性阻断细胞因子信号传导过程的负性调控因子。为深入研究黄颡鱼细胞因子信号传导的发生过程和机制,实验从黄颡鱼cDNA中克隆获得5... 细胞因子信号传导抑制因子(suppressor of cytokine signaling, SOCS)是一类由细胞产生的胞内蛋白,能够反馈性阻断细胞因子信号传导过程的负性调控因子。为深入研究黄颡鱼细胞因子信号传导的发生过程和机制,实验从黄颡鱼cDNA中克隆获得561 bp的黄颡鱼SOCS1(PfSOCS1)基因编码序列,成功构建了重组质粒pET32a(+)-PfSOCS1,并转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,在不同温度、IPTG浓度、诱导时间等条件下进行表达,确定最佳表达条件。本实验采用包涵体纯化的方法得到纯度较高的重组SOCS1蛋白;以重组PfSOCS1蛋白免疫Balb/C小鼠,制备多克隆抗体。通过Western blot鉴定了PfSOCS1抗血清可以特异性识别重组PfSOCS1蛋白。蛋白水平的组织分布显示,黄颡鱼SOCS1蛋白在肝脏中表达水平较高。 展开更多
关键词 黄颡鱼 SOCS1 原核表达 多克隆抗体制备 蛋白表达
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缢蛏2-CRD型半乳糖凝集素(Galectin)基因的克隆和表达分析 认领
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作者 徐晓荣 施鹏 +3 位作者 徐继林 廖凯 冉照收 严小军 《水产学报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第8期1264-1274,共11页
利用cDNA末端快速扩增(RACE)技术获得了缢蛏半乳糖凝集素基因(ScGL)。ScGL全长为1282 bp,5′非编码区35 bp,3′非编码区329 bp,开放阅读框(ORF)918 bp,编码305个氨基酸。氨基酸序列分析显示,ScGL无跨膜结构域,与已报道的缢蛏半乳糖凝集... 利用cDNA末端快速扩增(RACE)技术获得了缢蛏半乳糖凝集素基因(ScGL)。ScGL全长为1282 bp,5′非编码区35 bp,3′非编码区329 bp,开放阅读框(ORF)918 bp,编码305个氨基酸。氨基酸序列分析显示,ScGL无跨膜结构域,与已报道的缢蛏半乳糖凝集素含1个糖识别结构域(CRD)不同,ScGL具有2个CRD。相似性分析显示,ScGL与其他软体动物的半乳糖凝集素具有较高的相似性,与菲律宾蛤仔相似性最高,达65%;与已报道的2个缢蛏半乳糖凝集素相似性分别为39.74%和44.76%。系统进化上ScGL与菲律宾蛤仔半乳糖凝集素聚为一支。重组表达发现ScGL在包涵体表达,分子量约34.4 ku。荧光定量PCR分析显示,ScGL在缢蛏鳃、肠、唇瓣、外套膜、出水管、入水管、足和内脏团中均表达;其中肠、内脏团、唇瓣和足中表达量较高,出水管和入水管中表达量最低。消化腺ScGL表达量分别在金黄色葡萄球菌感染后3 h和48 h显著高于对照组;鳃ScGL表达量分别在鳗弧菌和金黄色葡萄球菌感染后6 h和48 h显著高于对照组,说明ScGL参与了病原体诱导的缢蛏免疫应答。本研究为深入探索ScGL在缢蛏免疫中的作用奠定基础。 展开更多
关键词 缢蛏 半乳糖凝集素 免疫 表达特征 原核表达
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Dhori病毒核蛋白基因的重组表达及其抗体制备 认领
5
作者 刘振明 沈姝 +6 位作者 阿布力米提·莫明 史深 刘希佳 丁军涛 邓菲 张渝疆 孙素荣 《生物技术》 CAS 2020年第2期140-146,共7页
[目的]表达和纯化Dhori病毒(DHOV)核蛋白(NP),并制备多克隆抗体。[方法]RT-PCR扩增NP基因,并克隆至原核表达载体pET-28a和真核表达载体peDNA3.1中。将重组质粒pET-28a-NP转化至大肠杆菌BL21中诱导表达,SDS-PAGE分析重组蛋白NP(rNP)的表... [目的]表达和纯化Dhori病毒(DHOV)核蛋白(NP),并制备多克隆抗体。[方法]RT-PCR扩增NP基因,并克隆至原核表达载体pET-28a和真核表达载体peDNA3.1中。将重组质粒pET-28a-NP转化至大肠杆菌BL21中诱导表达,SDS-PAGE分析重组蛋白NP(rNP)的表达并亲和层析纯化rNP,以抗DHOV阳性羊血清检测其抗原性,免疫新西兰免制备抗血清,以ELISA法检测其效价。将pcDNA3.1-NP转染至Vero细胞,以间接免疫荧光法评估抗体的结合活性,WesternBlotting检测抗体与重组蛋白的特异性反应能力。[结果]pET-28a-NP和peDNA3.1-NP重组质粒构建正确,原核表达的rNP约为55.3kDa,并能被阳性羊血清识别,制备的抗体效价为1:409600,能特异性识别真核及原核表达产物。[结论]成功表达和纯化rNP,并制备了多克隆抗体,可用于深入研究DHOV核蛋白的生物学特性及其检测试剂。 展开更多
关键词 Dhori virus 核蛋白 原核表达 真核表达 多克隆抗体
古尔图病毒重组截短糖蛋白基因的表达及抗体的制备 认领
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作者 阿依排日·阿布拉 沈姝 +5 位作者 张敬媛 刘希佳 李轶杰 邓菲 张渝疆 孙素荣 《中华微生物学和免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2020年第3期178-184,共7页
目的:原核表达古尔图病毒(Guertu virus,GTV)糖蛋白截短片段(Gn、Gn1、Gn2、Gn3、Gc1和Gc2),分别纯化Gn-His、Gc1-His和Gc2-His重组蛋白并制备其多克隆抗体。方法:采用RT-PCR的方法分别扩增得到GTV DXM毒株截短糖蛋白Gn、Gn1、Gn2、Gn3... 目的:原核表达古尔图病毒(Guertu virus,GTV)糖蛋白截短片段(Gn、Gn1、Gn2、Gn3、Gc1和Gc2),分别纯化Gn-His、Gc1-His和Gc2-His重组蛋白并制备其多克隆抗体。方法:采用RT-PCR的方法分别扩增得到GTV DXM毒株截短糖蛋白Gn、Gn1、Gn2、Gn3、Gc1和Gc2基因片段,并将其构建到原核表达载体pET-32a(+)中,继而转化到E.coli BL21(DE3)中进行诱导表达,SDS-PAGE分析蛋白质大小。经镍柱亲和层析纯化Gn-His、Gc1-His和Gc2-His重组蛋白,用GTV阳性羊血清通过Western blot法检测重组蛋白的抗原性。用纯化的蛋白质分别免疫新西兰白兔制备抗血清,ELISA法检测血清效价。将构建的真核表达载体pcDNA3.1-Gn和pcDNA3.1-Gc1/Gc2转染至哺乳动物Vero细胞,并用间接免疫荧光法评估前述制备的兔多克隆抗体的结合活性。最后用Western blot法检测血清与重组蛋白的特异性反应能力。结果:双酶切鉴定和测序结果表明pET-32a-Gn、pET-32a-Gn1/Gn2/Gn3、pET-32a-Gc1/Gc2、pcDNA3.1-Gn和pcDNA3.1-Gc1/Gc2重组表达载体构建正确,重组表达蛋白Gn-His、Gn1/Gn2/Gn3-His、Gc1/Gc2-His相对分子质量(Mr)大小分别约为63.4×103、37.1×103、31.9×103、30.8×103、40×103和54.4×103。重组表达蛋白能够被GTV阳性羊血清所识别;获得的抗GTV Gn、Gc1和Gc2兔多克隆抗体效价分别为1∶409600、1∶204800和1∶6400。间接免疫荧光检测和Western blot结果表明制备的多克隆抗体能够与真核表达产物或重组蛋白发生特异性反应。结论:重组GTV糖蛋白Gn-His、Gc1-His和Gc2-His得到了高效表达和纯化,具有较好的免疫性。制备的多克隆抗体效价高,特异性好。本研究结果为进一步开展GTV糖蛋白生物学功能及其检测方法和疫苗研究提供参考资料。 展开更多
关键词 古尔图病毒 糖蛋白 原核表达 真核表达 兔多克隆抗体
羽衣甘蓝类蛋白质二硫键异构酶PDIL1-2的基因克隆及蛋白表达分析 认领
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作者 李阳 施亚坤 +2 位作者 高士科 李晓屿 蓝兴国 《植物研究》 CAS CSCD 北大核心 2020年第2期293-300,共8页
以羽衣甘蓝(Brassica oleracea var.acephala)自交不亲和系(S13-bS13-b)为试材,利用RT-PCR和RACE的方法从柱头中分离类蛋白质二硫键异构酶BoPDIL1-2基因。将BoPDIL1-2编码区的序列构建到原核表达载体pET-14b上,并转化到大肠杆菌中进行... 以羽衣甘蓝(Brassica oleracea var.acephala)自交不亲和系(S13-bS13-b)为试材,利用RT-PCR和RACE的方法从柱头中分离类蛋白质二硫键异构酶BoPDIL1-2基因。将BoPDIL1-2编码区的序列构建到原核表达载体pET-14b上,并转化到大肠杆菌中进行原核表达与纯化;用纯化后的蛋白免疫小鼠,制备BoPDIL1-2多克隆抗体;通过免疫印迹法检测BoPDIL1-2在不同组织及不同发育阶段柱头的表达情况。氨基酸序列比对分析结果显示,羽衣甘蓝BoPDIL1-2与油菜BnPDIL1-2、拟南芥AtPDIL1-2的一致性分别是97.3%和85.5%。SDS-PAGE结果显示,在分子量58 kD处有BoPDIL1-2蛋白特异性地诱导表达。免疫印迹结果显示BoPDIL1-2在羽衣甘蓝柱头中特异表达,而且在柱头发育早期表达量较低,在开花期柱头表达量较高。 展开更多
关键词 羽衣甘蓝 类蛋白质二硫键异构酶 原核表达 多克隆抗体 表达分析
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重组扬州鹅IFN-α的表达与活性研究 认领
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作者 朱孟玲 王岑 +4 位作者 曹霞 徐孝宙 刘海侠 王会聪 王永娟 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第1期65-69,共5页
为获得具有抗病毒活性的鹅干扰素,本实验参考GenBank中鹅IFN-α基因序列设计引物,采用RT-PCR方法扩增扬州鹅IFN-α的全基因。将去除信号肽的IFN-α克隆至pET32a(+)以构建pET-mGoIFN-α,重组菌经IPTG诱导表达重组蛋白,纯化后的蛋白(mGoI... 为获得具有抗病毒活性的鹅干扰素,本实验参考GenBank中鹅IFN-α基因序列设计引物,采用RT-PCR方法扩增扬州鹅IFN-α的全基因。将去除信号肽的IFN-α克隆至pET32a(+)以构建pET-mGoIFN-α,重组菌经IPTG诱导表达重组蛋白,纯化后的蛋白(mGoIFN-α)免疫BALB/c小鼠,利用ELISA方法测定小鼠血清抗体效价,westernblot检测抗体特异性。同时,将IFN-α全长基因克隆至pcDNA3.1(-)以构建pcDNA-GoIFN-α,间接免疫荧光试验检测rGoIFN-α在鹅胚成纤维细胞(GEF)中的表达,细胞病变抑制法检测其抗水泡性口炎病毒(VSV)活性。结果显示:本研究扩增得到576bp的扬州鹅IFN-α全基因与486bp的成熟基因片段;原核表达的mGoIFN-α为36.3ku,免疫小鼠后可产生具有良好特异性与抗原活性的多克隆抗体,效价为1:16000;pcDNA-GoIFN-α可在GEF中表达,并具有较高的抗VSV活性。本研究为制备安全、高效的重组鹅干扰素,为研制鹅病毒性疾病的新型生物制剂奠定了基础。 展开更多
关键词 扬州鹅 IFN-Α 原核表达 真核表达 抗病毒活性
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鸡生长激素受体胞外区原核表达分析 认领
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作者 郭加丽 赖淑婷 +5 位作者 徐海冬 郑则灿 李纪桡 苏巧儿 曹子文 张丽 《中国家禽》 北大核心 2020年第1期17-20,共4页
生长激素与其靶细胞膜表面的生长激素受体(GHR)结合,可以促进动物生长发育和调节新陈代谢。为获得鸡GHR蛋白,试验通过PCR扩增获得GHR胞外区序列。经双酶切后连接入原核p ET-32a(+)表达载体,构建了鸡GHR胞外结构域的原核表达载体。将该... 生长激素与其靶细胞膜表面的生长激素受体(GHR)结合,可以促进动物生长发育和调节新陈代谢。为获得鸡GHR蛋白,试验通过PCR扩增获得GHR胞外区序列。经双酶切后连接入原核p ET-32a(+)表达载体,构建了鸡GHR胞外结构域的原核表达载体。将该重组质粒转入E. coli BL21(ED3)表达菌株。通过IPTG诱导其表达GHR重组蛋白,并探讨不同IPTG浓度、诱导时间和诱导温度等条件对鸡GHR重组蛋白表达的影响。结果表明:诱导GHR重组蛋白表达的最适条件为IPTG终浓度2.00 mmol/L、诱导时间为4 h、培养温度为37℃,在此条件下,GHR重组蛋白表达量最高。研究结果为后续GHR抗体制备奠定了基础。 展开更多
关键词 生长激素受体 原核表达 生长激素受体重组蛋白 诱导表达
红花CtGATA21基因的克隆及原核表达分析 认领
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作者 王娟 石必显 +4 位作者 胡佳蕙 侯献飞 顾元国 李强 贾东海 《植物生理学报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第3期399-405,共7页
植物在整个生命周期中会遇到各种各样的非生物胁迫,而转录因子在植物响应非生物胁迫过程中发挥重要功能。GATA是一类能够参与细胞分化、生长发育和响应胁迫的转录因子,目前还没有广泛的研究。本试验从菊科植物红花中克隆并获得了一个B类... 植物在整个生命周期中会遇到各种各样的非生物胁迫,而转录因子在植物响应非生物胁迫过程中发挥重要功能。GATA是一类能够参与细胞分化、生长发育和响应胁迫的转录因子,目前还没有广泛的研究。本试验从菊科植物红花中克隆并获得了一个B类GATA基因(命名为Ct GATA21, NCBI登录号:MN399373)。实验结果显示CtGATA21基因全长966 bp,编码321个氨基酸,理论分子量为36.02 kDa,且定位于细胞核中。进一步分析发现,红花CtGATA21的表达具有组织特异性,在叶片中表达量最高;而在盐、干旱胁迫下其表达量迅速积累,显著上调,表明红花CtGATA21能够正响应盐和干旱胁迫,这可能为进一步分析植物GATA转录因子的抗逆功能提供了新的数据。 展开更多
关键词 红花 CtGATA21 表达模式 原核表达 非生物胁迫
二点委夜蛾非典型嗅觉受体AlepOrco的基因克隆、原核表达及多克隆抗体制备 认领
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作者 田彩红 刘晓光 +2 位作者 黄建荣 王瑛 封洪强 《昆虫学报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第6期667-678,共12页
【目的】非典型嗅觉受体(olfactory receptor co-receptor,Orco)与典型嗅觉受体共同形成离子通道,在昆虫嗅觉识别中具有至关重要的作用。本研究旨在克隆和表达二点委夜蛾Athetis lepigone Orco基因,明确其分子特性,为进一步研究该基因... 【目的】非典型嗅觉受体(olfactory receptor co-receptor,Orco)与典型嗅觉受体共同形成离子通道,在昆虫嗅觉识别中具有至关重要的作用。本研究旨在克隆和表达二点委夜蛾Athetis lepigone Orco基因,明确其分子特性,为进一步研究该基因在二点委夜蛾中的功能奠定基础。【方法】将二点委夜蛾雌雄成虫触角转录组数据建立本地数据库,通过生物信息学分析获得二点委夜蛾Orco同源基因AlepOrco;利用RT-PCR方法克隆二点委夜蛾AlepOrco基因全长,并在pGEX-6P-1/BL21(DE3)系统中进行了该基因开放阅读框(ORF)的原核表达,制备多克隆抗体,用Western blot检测抗体特异性;利用qPCR技术检测该基因在二点委夜蛾雌雄成虫不同组织(喙、触角、去除触角和喙的头、胸、腹、足和翅)中的表达谱。【结果】获得了二点委夜蛾AlepOrco的cDNA(GenBank登录号:MN583125)全长序列,开放阅读框长1422 bp,编码473个氨基酸,序列中有7个跨膜结构区,预测等电点为8.59,分子量为53.40 kD。SDS-PAGE和Western blot分析结果表明AlepOrco能够在大肠杆菌Escherichia coli中高效表达。利用制备的多克隆抗体对二点委夜蛾AlepOrco进行Western blot检测,其能够特异识别成虫触角中AlepOrco蛋白。qPCR结果表明,AlepOrco在二点委夜蛾雌雄成虫不同组织间具有相似的表达模式,都是在触角中的相对表达量最大,在翅中的表达量最小。【结论】克隆并原核表达了二点委夜蛾非典型嗅觉受体基因AlepOrco,制备的多克隆抗体能够特异识别二点委夜蛾成虫触角中的AlepOrco。结果为深入了解二点委夜蛾AlepOrco基因的结构和功能奠定了基础。 展开更多
关键词 二点委夜蛾 非典型嗅觉受体 基因克隆 原核表达 多克隆抗体 组织表达
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梨DEFL基因家族的鉴定与表达分析 认领
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作者 张皓 汤超 +5 位作者 焦慧君 钱铭 刘雪莹 王鹏 张绍铃 吴巨友 《南京农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第1期33-46,共14页
[目的]本文旨在对梨的类防御素(DEFL)基因家族成员进行鉴定,分析其序列特性、进化关系、基因结构、氨基酸序列保守功能域、染色体定位和在梨中的表达特性,为PbrDEFL功能研究和应用奠定基础。[方法]基于梨的全基因组数据,采用生物信息学... [目的]本文旨在对梨的类防御素(DEFL)基因家族成员进行鉴定,分析其序列特性、进化关系、基因结构、氨基酸序列保守功能域、染色体定位和在梨中的表达特性,为PbrDEFL功能研究和应用奠定基础。[方法]基于梨的全基因组数据,采用生物信息学方法进行序列鉴定和分析;通过实时荧光定量PCR(RT-qPCR)技术和转录组数据分析PbrDEFL成员在各组织中和花粉管发育阶段的表达模式。利用亚细胞定位技术分析PbrDEFL38与PbrDEFL15在细胞中的分布情况,并且进一步分析PbrDEFL38与PbrDEFL15重组蛋白在大肠杆菌原核表达纯化过程中所需的最佳条件。[结果]梨中包含39个PbrDEFL基因(PbrDEFL 1—PbrDEFL 39),可分为2个组,均存在稳定的半胱氨酸αβ模型(CSαβmotif),且在9条染色体上呈不均匀分布,在进化过程中主要受纯化选择作用。RT-qPCR结果表明,PbrDEFL在各组织中表达且具有特异性,主要集中在花粉或叶片中;此外,在‘砀山酥梨’和‘黄花’2个梨品种花粉发育过程中,超过60%的PbrDEFL基因表达量均呈先升高后下降的趋势。PbrDEFL蛋白亚细胞定位预测均位于胞外,并通过PbrDEFL38-GFP和PbrDEFL15-GFP在烟草细胞中表达得到证实。通过不同浓度IPTG筛选,最终确定在15℃和IPTG终浓度为0.5 mmol·L-1时,PbrDEFL38和PbrDEFL15蛋白表达量最高。[结论]PbrDEFL基因家族成员高度保守,主要在胞外起重要作用,其不仅在植物免疫防御过程中发挥重要作用,还可能参与了梨花粉管生长发育和自交不亲和过程。 展开更多
关键词 类防御素 生物信息学 表达分析 原核表达
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菊芋查尔酮合成酶基因的克隆与表达分析 认领
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作者 李文静 孙艳香 +4 位作者 付亚娟 苏彦苹 王聪艳 侯晓强 张新业 《西北农业学报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第4期603-612,共10页
为揭示菊芋(Helianthus tuberosus L.)查尔酮合成酶(chalcone synthase,CHS)基因的功能,以菊芋‘廊芋8号’叶片为材料,采用同源克隆和RT-PCR技术,克隆得到菊芋CHS基因命名为HtCHS,其编码区全长为1197 bp(GenBank登录号MN124515),编码39... 为揭示菊芋(Helianthus tuberosus L.)查尔酮合成酶(chalcone synthase,CHS)基因的功能,以菊芋‘廊芋8号’叶片为材料,采用同源克隆和RT-PCR技术,克隆得到菊芋CHS基因命名为HtCHS,其编码区全长为1197 bp(GenBank登录号MN124515),编码398个氨基酸。HtCHS的基因组DNA(gDNA)全长为1567 bp,含2个外显子和1个内含子。序列比对和系统进化树分析显示,不同植物中的CHS氨基酸序列具有极高的同源性,菊芋与同属的向日葵CHS氨基酸序列一致性达到99.25%,共聚于一个分支。HtCHS蛋白相对分子质量为43.61 ku,等电点为6.33。HtCHS蛋白具有查尔酮合成酶结构域,属于查尔酮合成酶超家族成员,HtCHS不含信号肽和跨膜区,属于非分泌蛋白。实时荧光定量PCR结果显示,HtCHS在根中表达量最高。与对照相比,150 mmol·L-1 NaCl和20%PEG 6000处理6 h时HtCHS表达显著上调,处理12 h时显著下调。原核诱导表达分析结果显示,成功诱导出与预测蛋白大小一致的目的蛋白。 展开更多
关键词 菊芋 查尔酮合成酶 基因克隆 生物信息学分析 原核表达 基因表达分析
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茶树CsSNAT基因的克隆与表达分析 认领
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作者 师聪 颜小梅 韦朝领 《核农学报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第5期939-947,共9页
为明确茶树SNAT基因的序列特征和表达特点,在茶树转录组测序的基础上以茶树(Camellia sinensis)品种舒茶早为试验材料,通过SMARTTM RACE技术克隆茶树褪黑素合成途径中关键限速酶5-羟色胺-N-乙酰转移酶CsSNAT基因的cDNA全长序列,并分析... 为明确茶树SNAT基因的序列特征和表达特点,在茶树转录组测序的基础上以茶树(Camellia sinensis)品种舒茶早为试验材料,通过SMARTTM RACE技术克隆茶树褪黑素合成途径中关键限速酶5-羟色胺-N-乙酰转移酶CsSNAT基因的cDNA全长序列,并分析其基因结构和表达模式。结果表明,CsSNAT基因序列全长1 014 bp,其中包含742 bp的完整开放阅读框(ORF),编码247个氨基酸,预测等电点7.64,蛋白分子量27.36 kDa。氨基酸序列比对显示,CsSNAT蛋白与其他高等植物的SNAT蛋白具有较高同源性,与葡萄VvSNAT(CBI31163)同源性最高,为66.19%。诱导蛋白最佳条件为温度28℃,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)浓度0.5 mg·L-1,诱导时间6 h,在上清液中可获得大量分子量为66 kDa的可溶性融合蛋白。实时定量PCR分析表明,CsSNAT在褪黑素处理6 h后表达量最高,为对照的3倍;茶尺蠖取食6 h后,CsSNAT表达显著上调。不同激素处理结果显示,CsSNAT受脱落酸(ABA)、茉莉酸甲酯(MeJA)和水杨酸(SA)诱导表达。本研究结果为5-羟色胺-N-乙酰转移酶功能研究奠定了一定的基础。 展开更多
关键词 茶树 5-羟色胺-N-乙酰转移酶 基因克隆 原核表达 表达分析
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家蝇三龄幼虫Mdctl基因原核表达及生物信息学分析 认领
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作者 常振策 李忠旬 +3 位作者 贾利娜 修江帆 国果 吴建伟 《贵州医科大学学报》 CAS 2020年第2期145-150,共6页
目的:构建家蝇C型凝集素基因(Mdctl)原核表达体系,对Mdctl基因及编码蛋白进行生物信息学分析。方法:采用生物信息学方法,分析Mdctl基因及编码蛋白;将构建的pET28a(+)/Mdctl重组表达质粒转化至大肠杆菌BL21-DE3中,以异丙基硫代半乳糖苷(I... 目的:构建家蝇C型凝集素基因(Mdctl)原核表达体系,对Mdctl基因及编码蛋白进行生物信息学分析。方法:采用生物信息学方法,分析Mdctl基因及编码蛋白;将构建的pET28a(+)/Mdctl重组表达质粒转化至大肠杆菌BL21-DE3中,以异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达重组蛋白并通过SDS-PAGE对表达产物进行分析;Ni-IDA法纯化重组蛋白,Western-Blot对其鉴定。结果:生物信息学分析显示,Mdctl基因开放阅读框全长333 bp,共编码110个氨基酸,理论分子量为13.13 kDa,等电点为4.49,信号肽位于1~22位氨基酸之间;Mdctl蛋白中存在Clect结构域,属于C型凝集素超家族;Mdctl重组蛋白在大肠杆菌BL21-DE3中主要以包涵体形式表达,重组蛋白的相对分子质量与Mdctl蛋白两端融合6×His标签后的总分子量相一致。结论:成功构建Mdctl原核表达系统,并获得重组蛋白。 展开更多
关键词 家蝇 Mdctl基因 原核表达 蛋白纯化 生物信息学 基因表达
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松墨天牛漆酶基因MaLac1的克隆、原核表达及表达谱分析 认领
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作者 陈昊 罗巧玉 +9 位作者 马秋雨 初旭 袁超 刘颖 余伟 吴松青 王荣 梁光红 张飞萍 胡霞 《昆虫学报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第4期381-389,共9页
【目的】本研究旨在克隆并鉴定松墨天牛Monochamus alternatus内源漆酶基因MaLac1,分析其在松墨天牛不同发育阶段的表达水平,为进一步明确MaLac1功能提供依据。【方法】基于松墨天牛肠道转录组测序数据,通过RACE克隆松墨天牛MaLac1基因... 【目的】本研究旨在克隆并鉴定松墨天牛Monochamus alternatus内源漆酶基因MaLac1,分析其在松墨天牛不同发育阶段的表达水平,为进一步明确MaLac1功能提供依据。【方法】基于松墨天牛肠道转录组测序数据,通过RACE克隆松墨天牛MaLac1基因的全长cDNA序列,并对其进行生物信息学分析;将该基因与pET-32a载体链接构建表达载体pET-MaLac1,导入大肠杆菌Escherichia coli Rosetta (DE3)使其表达;使用qPCR检测MaLac1基因在松墨天牛不同发育阶段(低龄幼虫、老熟幼虫、蛹、雌成虫和雄成虫)肠道中的表达差异。【结果】克隆获得松墨天牛MaLac1的cDNA全长序列(GenBank登录号:KY073340)。MaLac1开放阅读框全长2 067 bp,编码一个含688个氨基酸的蛋白质,预测分子量为78.34 kD,等电点为5.30。SignalP 4.1 Server预测MaLac1在N端包含一个15个氨基酸的信号肽。序列比对分析表明,MaLac1具有典型的昆虫漆酶基因特征,与赤拟谷盗Tribolium castaneum漆酶基因的氨基酸序列一致性达93%。SDS-PAGE检测发现IPTG诱导表达了一条大约78 kD的特异蛋白条带,与推测大小一致。qPCR结果显示,MaLac1在不同发育阶段的松墨天牛肠道中均有表达,其中,在雌成虫肠道中表达量最高,在雄成虫肠道中的次之,在幼虫肠道中的最低。【结论】MaLac1在松墨天牛成虫中表达量显著高于其在幼虫中的,这一结果可能与幼虫和成虫的取食习性差异相关。MaLac1在松墨天牛体内的功能还有待进一步研究。 展开更多
关键词 松墨天牛 肠道 漆酶 全长克隆 原核表达 表达
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花椒窄吉丁气味结合蛋白基因AzanOBP3的克隆、原核表达及组织表达谱分析 认领
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作者 巩雪芳 杨平 +4 位作者 王延来 郭莉 陈迪 谢寿安 吕淑杰 《昆虫学报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第4期390-400,共11页
【目的】本研究克隆花椒窄吉丁Agrilus zanthoxylumi气味结合蛋白(odorant binding protein, OBP)基因AzanOBP3,并对其进行序列和表达分析,旨在更好地了解OBP基因在花椒窄吉丁成虫触角识别气味物质过程中的作用,为农林害虫的绿色防控提... 【目的】本研究克隆花椒窄吉丁Agrilus zanthoxylumi气味结合蛋白(odorant binding protein, OBP)基因AzanOBP3,并对其进行序列和表达分析,旨在更好地了解OBP基因在花椒窄吉丁成虫触角识别气味物质过程中的作用,为农林害虫的绿色防控提供理论依据。【方法】利用RT-PCR扩增花椒窄吉丁气味结合蛋白基因AzanOBP3的cDNA序列,采用生物信息学软件分析其核苷酸和氨基酸序列;构建重组表达载体pET-28a(+)/AzanOBP3,转化到大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)感受态细胞中进行融合蛋白的IPTG诱导表达,SDS-PAGE及Western blot鉴定重组表达蛋白;基于qPCR技术分析AzanOBP3基因在花椒窄吉丁雌雄成虫不同组织(头、胸、腹、足和翅)中的表达情况。【结果】克隆获得了花椒窄吉丁气味结合蛋白基因AzanOBP3的cDNA全长序列(GenBank登录号:MT318832),预测到其开放阅读框长414 bp,共编码137个氨基酸,等电点为4.79,蛋白分子量为16.038 kD,N末端具有29个氨基酸组成的信号肽序列,蛋白序列中具有6个保守的半胱氨酸残基,属于典型的昆虫OBP。序列分析表明,AzanOBP3的氨基酸序列分别与苹果小吉丁Agrilus mali AmalOBP2和白蜡窄吉丁Agrilus planipennis AplaGOBP的一致性最高,分别为74.45%和76.92%,在进化关系上更加同源。构建了重组表达载体pET-28a(+)/AzanOBP3。在37℃180 r/min摇床培养及1 mmol/L IPTG诱导4 h条件下,AzanOBP3在大肠杆菌中成功地表达出了与预测蛋白分子质量大小一致的AzanOBP3融合蛋白。qPCR检测结果表明,AzanOBP3基因在雌性和雄性成虫的不同组织中都有表达,其中在雄成虫足中的表达量最高。【结论】明确了AzanOBP3的核苷酸和氨基酸序列组成及编码蛋白的理化特性。组织表达谱结果提示, AzanOBP3的功能可能不仅局限于嗅觉识别,在非嗅觉器官中可能也具有重要的生理功能,特别是在其寻找寄主植物与取食的过程中可能发挥着重要作用,AzanOBP 展开更多
关键词 花椒窄吉丁 气味结合蛋白 基因克隆 序列分析 原核表达 组织表达
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文章速递薰衣草DXS基因的克隆、表达分析及原核表达 认领
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作者 龚林涛 苏秀娟 +4 位作者 尹松松 孙明辉 闫博文 阿迪莱·阿布都热依木 陈全家 《新疆农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2020年第7期1233-1242,共10页
【目的】研究拟克隆薰衣草DXS基因,并分析其表达,为揭示该基因在调控薰衣草萜类物质合成中的分子机理提供研究基础。【方法】以薰衣草杂花为试材,同源克隆薰衣草DXS基因,进行基因序列分析、表达量比较和原核表达。【结果】(1)薰衣草DXS... 【目的】研究拟克隆薰衣草DXS基因,并分析其表达,为揭示该基因在调控薰衣草萜类物质合成中的分子机理提供研究基础。【方法】以薰衣草杂花为试材,同源克隆薰衣草DXS基因,进行基因序列分析、表达量比较和原核表达。【结果】(1)薰衣草DXS基因开放阅读框长为2181 bp,编码由726个氨基酸组成的蛋白质序列;薰衣草DXS蛋白等电点为6.57,分子量约为78.39 KDa,具有高度的保守性,与狭叶薰衣草、冬凌草、毛喉鞘蕊花的DXS蛋白亲缘关系相近;(2)DXS基因在杂花花器官的衰败期表达量最高,在法国蓝花器官的盛开期表达量最高,DXS基因在杂花花器官五个不同发育时期的表达量均高于法国蓝;DXS基因在杂花花萼中表达量最高,在法国蓝雄蕊中表达量最高,DXS基因在杂花花器官5个不同组织表达量均高于法国蓝(雌蕊、雄蕊除外);(3)在37℃、IPTG 0.8 mM条件下诱导4 h后,DXS蛋白表达量最大。【结论】DXS基因表达量与薰衣草精油产量存在正相关关系。 展开更多
关键词 1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶 克隆 基因表达 原核表达
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人源酪蛋白激酶Ⅱ催化亚基的构建及表达纯化 认领
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作者 柏学 李彩虹 +2 位作者 佟红娜 胡克平 高海 《现代生物医学进展》 CAS 2020年第7期1201-1205,共5页
目的:构建人源CK2催化亚基pET-28a(+)-hcsnk2a1和pET-28a(+)-hcsnk2a2重组质粒,并进行原核表达纯化得到高纯度融合蛋白,为进一步开展CK2生理病理机制研究以及CK2作为肿瘤抑制靶点相关抑制剂的筛选和评价提供实验基础。方法:利用合成的人... 目的:构建人源CK2催化亚基pET-28a(+)-hcsnk2a1和pET-28a(+)-hcsnk2a2重组质粒,并进行原核表达纯化得到高纯度融合蛋白,为进一步开展CK2生理病理机制研究以及CK2作为肿瘤抑制靶点相关抑制剂的筛选和评价提供实验基础。方法:利用合成的人源csnk2a1和csnk2a2目的基因片段,将酶切连接得到的重组质粒经测序验证后,进行大肠杆菌感受态BL21 (DE3)/Transetta (DE3)转化。使用合适浓度IPTG诱导融合蛋白的表达以得到可溶性的融合蛋白,并应用AKTA avant蛋白纯化仪和Ni2+-NTA预装柱进行纯化,蛋白纯度最后经SDS-PAGE胶分离后考马斯亮蓝染色和Western Blot检测鉴定。结果:测序结果表明pET-28a(+)-hcsnk2a1和pET-28a(+)-hcsnk2a2质粒均成功被构建;经转化诱导表达后,成功纯化得到相对分子量为42KD的his-hcsnk2a1和38KD的his-hcsnk2a2目的融合蛋白。结论:首次成功构建得到pET-28a(+)-hcsnk2a1和pET-28a(+)-hcsnk2a2质粒;并表达纯化得到高浓度和高纯度的his-hcsnk2a1和his-hcsnk2a2融合蛋白,为后期的蛋白功能研究和抑制剂筛选评价提供了基础。 展开更多
关键词 原核表达 蛋白纯化 酪蛋白激酶Ⅱ csnk2a1 csnk2a2
塞尼卡谷病毒3ABC蛋白的表达、纯化及多克隆抗体制备 认领
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作者 连凯琪 周玲玲 +4 位作者 张明亮 张慢 王英杰 林正丹 宋玉伟 《河南农业科学》 北大核心 2020年第1期123-127,共5页
为了开发塞尼卡谷病毒(Seneca Valley virus,SVV)的检测试剂盒,克隆3 ABC基因进行原核表达和纯化,并将纯化的3ABC蛋白免疫大鼠,制备抗3ABC蛋白的多克隆抗体。通过Western blot鉴定制备的多克隆抗体与表达的3ABC蛋白的特异性识别能力,通... 为了开发塞尼卡谷病毒(Seneca Valley virus,SVV)的检测试剂盒,克隆3 ABC基因进行原核表达和纯化,并将纯化的3ABC蛋白免疫大鼠,制备抗3ABC蛋白的多克隆抗体。通过Western blot鉴定制备的多克隆抗体与表达的3ABC蛋白的特异性识别能力,通过ELISA测定多克隆抗体的效价。结果显示,3 ABC基因在大肠杆菌中大量表达,且主要以包涵体形式表达,重组蛋白分子质量约为55 ku,经纯化后得到单一条带。免疫大鼠制备的多克隆抗体效价大于1∶64000,且与表达的3ABC重组蛋白发生特异性反应。综上,在大肠杆菌中成功表达了SVV 3ABC蛋白,且表达的重组蛋白具有免疫原性。 展开更多
关键词 塞尼卡谷病毒 3ABC蛋白 原核表达 蛋白质纯化 多克隆抗体
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