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猪流行性腹泻病毒猪传染性胃肠炎病毒猪Delta冠状病毒和猪轮状病毒多重RT-PCR检测方法的建立 被引量:1
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作者 王睿敏 施开创 +5 位作者 黎宗强 尹彦文 谢守玉 莫胜兰 陆文俊 屈素洁 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2019年第2期190-198,共9页
针对猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪Delta冠状病毒(PDCoV)和猪轮状病毒(PRoV)基因序列,分别设计特异性引物,扩增PEDV N基因(750 bp)、TGEV M基因(544 bp)、PDCoV N基因(183 bp)和PRoV VP6基因(329 bp)。经过对... 针对猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪Delta冠状病毒(PDCoV)和猪轮状病毒(PRoV)基因序列,分别设计特异性引物,扩增PEDV N基因(750 bp)、TGEV M基因(544 bp)、PDCoV N基因(183 bp)和PRoV VP6基因(329 bp)。经过对引物浓度、退火温度等反应条件的优化及特异性、敏感性、重复性试验,成功建立了快速鉴别检测PEDV、TGEV、PDCoV、PRoV的多重RT-PCR方法。该方法仅对PEDV、TGEV、PDCoV、PRoV检测为阳性,对口蹄疫病毒(FMDV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪圆环病毒2型(PCV2)和猪细小病毒(PPV)等主要病毒的扩增均为阴性。PEDV、TGEV、PDCoV、PRoV重组质粒标准品的检出下限分别为1.57×10^2、1.57×10^3、1.57×10^2、1.57×10^2 copies/L。相同条件下的重复性试验获得均匀一致的结果。应用所建立的方法检测2017-2018年采集自广西各地的270份腹泻病料,结果显示,PEDV、TGEV、PDCoV、PRoV的阳性率分别为15.56%、11.48%、10.74%、1.85%,并且存在混合感染现象。上述结果表明,所建立的多重RT-PCR方法可用于PEDV、TGEV、PDCoV、PRoV的快速鉴别检测及流行病学调查。 展开更多
关键词 猪流行性腹泻病毒 猪传染性胃肠炎病毒 猪Delta冠状病毒 猪轮状病毒 多重RT-PCR 检测方法
小反刍兽疫病毒、A型口蹄疫病毒和O型口蹄疫病毒多重RT-PCR检测方法的建立 预览
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作者 黄元 袁淑英 +4 位作者 黄武 廖任如 王晓虎 陈晶 向华 《广东畜牧兽医科技》 2019年第3期44-47,共4页
小反刍兽疫病毒(PPRV)是一种感染小反刍动物的急性接触性传染病,近年来在我国多个省份流行,对我国养羊业造成了巨大危害。口蹄疫病毒(FMDV)A型和O型疫情曾在我国多地暴发,今年仍零星发生。小反刍兽疫和口蹄疫均为A类传染病,也都是水疱... 小反刍兽疫病毒(PPRV)是一种感染小反刍动物的急性接触性传染病,近年来在我国多个省份流行,对我国养羊业造成了巨大危害。口蹄疫病毒(FMDV)A型和O型疫情曾在我国多地暴发,今年仍零星发生。小反刍兽疫和口蹄疫均为A类传染病,也都是水疱性疾病,其临床症状极其相似。为建立一种检测并鉴别小反刍兽疫病毒和口蹄疫病毒的方法,针对小反刍兽疫病毒的F基因和口蹄疫的VP1基因,合成相应的引物,优化反应体系和扩增条件,建立一种同时检测小反刍兽疫病毒和A,O型口蹄疫病毒的方法。对建立的多重RT-PCR方法进行特异性和敏感性试验,结果表明,建立的多重RT-PCR检测方法敏感性强,特异性良好,对小反刍兽疫病毒和A,O型口蹄疫病毒最低检出量分别为PPRV102copies/μL、A型FMDV102copies/μL、O型FMDV10copies/μL。本方法的建立对临床感染口蹄疫和小反刍兽疫病毒的家畜进行快速检测具有十分重要的意义。 展开更多
关键词 小反刍兽疫 口蹄疫 多重RT-PCR
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多重RT-PCR方法对人肺炎链球菌菌种、血清型及耐药性的鉴别检测 预览 被引量:1
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作者 程弘夏 付敏 +3 位作者 周立 秦文英 周策凡 唐景峰 《信阳师范学院学报:自然科学版》 北大核心 2018年第1期32-39,共8页
首先,选择肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae,SP)基因LytA、肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae,MP)基因P1、肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae,CP)基因ompA作为目标检测靶点设计引物探针,建立鉴别肺炎链球菌菌种的多重RT-PCR方... 首先,选择肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae,SP)基因LytA、肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae,MP)基因P1、肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae,CP)基因ompA作为目标检测靶点设计引物探针,建立鉴别肺炎链球菌菌种的多重RT-PCR方法.其次,针对肺炎链球菌cps基因座序列,利用MGB-TaqMan探针的多重RT-PCR方法对肺炎链球菌的血清型进行鉴别检测.最后,针对肺炎链球菌耐药基因ermB、mefA为靶标设计引物探针,采用多重RT-PCR方法对其临床阳性样本的耐药性进行鉴别检测.肺炎链球菌鉴别检测多重RT-PCR方法,线性范围为102-107 copies/mL,R2分别为0.999、0.996和0.995,灵敏度可达102copies/mL,与其他病原体无交叉反应.512例临床样本经多重RT-PCR方法鉴别检测,肺炎链球菌189例(189/304,62.17%),肺炎支原体83例(83/304,27.30%),肺炎衣原体32例(32/304,10.53%),与单重FQ-PCR及基因测序法比较无统计学差异(P〉0.05).189例肺炎链球菌临床样本,经多重RT-PCR检测,血清分型为:19(19.58%,37/189)、23(15.87%,30/189)、6(13.23%,25/189)、14(6.3%,12/189),其他血清型(22.75%,43/189),其他血清型(22.22%,42/189).肺炎链球菌抗药菌株突变检测为:ermB突变115例(115/189,60.85%),mefA突变56例(56/189,29.63%),两基因共突变15例(15/189,7.94%). 展开更多
关键词 多重RT-PCR 肺炎链球菌 血清分型 耐药性 鉴别检测
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蓝舌病病毒10型和20型及23型多重RT-PCR检测方法的建立
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作者 黄秋华 聂福平 +8 位作者 周庆 杨俊 王昱 艾军 唐昌杰 陈冉越 李应国 王国民 胡世君 《中国兽医科学》 CSCD 北大核心 2018年第5期552-558,共7页
为建立可同时鉴别检测蓝舌病病毒(BTV)10型、20型及23型的方法,本研究针对这三型病毒VP2基因保守区,设计合成了3对特异性引物,经过条件优化,建立了单管同时鉴别BTV 10型、20型、23型的多重RT-PCR方法。结果显示,该方法可同时扩增出BTV... 为建立可同时鉴别检测蓝舌病病毒(BTV)10型、20型及23型的方法,本研究针对这三型病毒VP2基因保守区,设计合成了3对特异性引物,经过条件优化,建立了单管同时鉴别BTV 10型、20型、23型的多重RT-PCR方法。结果显示,该方法可同时扩增出BTV 10型696 bp、BTV20型293 bp和BTV 23型356 bp三条特异性的片段,对BTV其他基因型以及小反刍兽疫病毒(PPRV)、口蹄疫病毒(FMDV)的核酸均无扩增;该方法最低可检测1.696×103copies/L的BTV10、1.375×103copies/L的BTV20和1.317×103copies/L的BTV23。利用建立的多重RT-PCR方法对67份临床样品进行检测,结果与OIE推荐的BTV套式RTPCR方法符合率为100%。本研究建立的多重RT-PCR检测方法特异性好,具有较强的检测敏感性,可用于蓝舌病病毒血清型的鉴别。 展开更多
关键词 蓝舌病病毒 多重RT-PCR 血清型鉴别
牛副流感病毒3型3种基因型多重RT-PCR检测方法的建立 预览 被引量:1
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作者 杨帆 石顺利 +4 位作者 徐娜 雷宇 常塔娜 李平安 关平原 《中国畜牧兽医》 北大核心 2018年第1期32-38,共7页
为建立检测牛副流感病毒3型(bovine parainfluenza virus type 3,BPIV3)3种基因型的多重RT-PCR方法,根据GenBank上发表的BPIV3 3种基因型病毒株的HN基因序列设计特异性引物,优化反应体系建立多重RT-PCR方法。结果显示,方法可同时扩增... 为建立检测牛副流感病毒3型(bovine parainfluenza virus type 3,BPIV3)3种基因型的多重RT-PCR方法,根据GenBank上发表的BPIV3 3种基因型病毒株的HN基因序列设计特异性引物,优化反应体系建立多重RT-PCR方法。结果显示,方法可同时扩增出BPIV3A型150bp、B型253bp和C型342bp的特异性片段,与牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)、牛呼吸道合胞体病毒(BRSV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、小反刍兽疫病毒(PPRV)、牛支原体、牛布鲁氏菌、羊布鲁氏菌、牛源多杀性巴氏杆菌A型和B型均无交叉反应,A、B、C基因型BPIV3最低阳性质粒检测量分别为0.89×104、0.92×104和1.53×104拷贝/μL。本试验建立的多重RT-PCR检测方法操作方便、特异性强,应用于临床样本的检测,可快速检测BPIV3 3种基因型。 展开更多
关键词 牛副流感病毒3型(BPIV3) 基因型 多重RT-PCR 检测
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副猪嗜血杆菌、PCV2及PRRSV多联RT-PCR检测方法的建立及其应用 被引量:1
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作者 罗尚星 范京惠 +5 位作者 刘宝京 邸晶美 代飞 常彦嫣 孔园园 左玉柱 《中国兽医学报》 CSCD 北大核心 2018年第8期1513-1518,共6页
副猪嗜血杆菌(H.parasuis)、猪圆环病毒2型(PCV2)及猪呼吸与繁殖障碍综合征病毒(PRRSV)是引起猪呼吸系统疫病的3种重要病原,根据GenBank中这3种病原的基因组序列,选择基因序列的高保守区,分别设计合成了3对特异性引物进行3种... 副猪嗜血杆菌(H.parasuis)、猪圆环病毒2型(PCV2)及猪呼吸与繁殖障碍综合征病毒(PRRSV)是引起猪呼吸系统疫病的3种重要病原,根据GenBank中这3种病原的基因组序列,选择基因序列的高保守区,分别设计合成了3对特异性引物进行3种病原的多重PCR,并对反应条件进行优化。利用建立的多重PCR方法,对河北省2012-2013年发生呼吸系统疾病的412份猪病料进行检测,并随机选择其中的57份,同时进行单一PCR检测,以确定2种方法检测结果的符合程度。结果表明,3对引物能特异扩增出大小分别为469,829,219bp的目的条带。灵敏度检测试验表明,H.parasuis,PCV2和PRRSV的最低检测量分别为52.7,335.0,137.0Pg。412份临床样品检测结果显示,H.parasuis在2012年的阳性率为44.2%,2013年为45.1%,提示这2年引起猪呼吸道疫病的主要病原是H.parasuis。 展开更多
关键词 副猪嗜血杆菌 猪圆环病毒2型 猪呼吸与繁殖障碍综合征病毒 多重RT-PCR
樱桃病毒PNRSV、CGRMV、PDV多重RT-PCR检测方法的建立与应用 预览
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作者 周登攀 郝小军 向本春 《江苏农业科学》 2018年第11期40-43,共4页
采用多重RT-PCR方法,建立可同时检测李属坏死环斑病毒(Prunus necrotic ring spot virus,简称PNRSV)、李矮缩病毒(Prune dwarf virus,简称PDV)、樱桃绿环斑驳病毒(Cherry green ring mottle virus,简称CGRMV)的方法。根据GenBank... 采用多重RT-PCR方法,建立可同时检测李属坏死环斑病毒(Prunus necrotic ring spot virus,简称PNRSV)、李矮缩病毒(Prune dwarf virus,简称PDV)、樱桃绿环斑驳病毒(Cherry green ring mottle virus,简称CGRMV)的方法。根据GenBank中PNRSV、PDV、CGRMV的保守基因序列设计特异性引物,并对多重RT-PCR的退火温度、循环数、灵敏度、特异性、dNTPs浓度等因素进行优化,建立能同时检测3种樱桃病毒的多重RT-PCR方法。该方法能同时扩增出PNRSV(675 bp)、CGRMV(363 bp)、PDV(304 bp)特异片段,扩增产物大小与预期相符。测序结果表明,3种病毒的序列与相应参考序列相似性达90%以上。多重RT-PCR反应条件优化结果显示,在退火温度为58℃、35个循环条件下,效果均较为理想;dNTP的浓度对试验结果影响不大,最适的浓度为0.6 mmol/L;灵敏度分析结果显示,最低检测浓度为59.7 ng/μL。应用该方法对新疆石河子地区的樱桃样本进行检测,结果显示,该方法可以准确、快速、灵敏地同时检测单一或复合侵染的3种樱桃病毒。 展开更多
关键词 樱桃绿环斑驳病毒 李属坏死环斑病毒 李矮缩病毒 多重RT-PCR 病原检测 大样品快速检测
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3种核果类果树病毒多重PCR检测方法的建立与初步应用 预览
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作者 赵世恒 王吉腾 +2 位作者 李雪娇 高润蕾 云晓鹏 《北方农业学报》 2018年第3期37-41,共5页
根据李痘病毒(PPV)、李坏死环斑病毒(PNRSV)和李矮缩病毒(PDV)3种检疫性病毒的外壳蛋白基因保守序列设计特异性引物,在建立各种病毒单个RT-PCR技术的基础上,通过优化多重RT-PCR反应条件,初步建立了同步检测这3种病毒的多重RT-PCR... 根据李痘病毒(PPV)、李坏死环斑病毒(PNRSV)和李矮缩病毒(PDV)3种检疫性病毒的外壳蛋白基因保守序列设计特异性引物,在建立各种病毒单个RT-PCR技术的基础上,通过优化多重RT-PCR反应条件,初步建立了同步检测这3种病毒的多重RT-PCR检测体系。结果表明:3对引物特异性较强,分别可以扩增出172,675,945 bp的目的片段,该方法快速、灵敏、准确,为同时检测多种检疫性病毒提供了参考。 展开更多
关键词 病毒检测 李痘病毒 李坏死环斑病毒 李矮缩病毒 多重RT-PCR
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猪7种腹泻相关病毒的临床检测及猪嵴病毒的遗传进化分析 被引量:6
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作者 孟丽 陶洁 +4 位作者 李本强 马玉飞 程靖华 张春玲 刘惠莉 《生物工程学报》 CSCD 北大核心 2017年第8期1292-1303,共12页
为了解引起猪腹泻疫病的病毒性病原种类及感染现状,本研究首先针对7种报道较少但可引起猪腹泻的病毒性病原建立了多重RT-PCR检测方法,包括猪捷申病毒(PTV)、猪萨佩罗病毒(PSV)、猪丁型冠状病毒(PDCo V)、猪嵴病毒(PKV)、猪札幌... 为了解引起猪腹泻疫病的病毒性病原种类及感染现状,本研究首先针对7种报道较少但可引起猪腹泻的病毒性病原建立了多重RT-PCR检测方法,包括猪捷申病毒(PTV)、猪萨佩罗病毒(PSV)、猪丁型冠状病毒(PDCo V)、猪嵴病毒(PKV)、猪札幌病毒(PSa V)、猪星状病毒(PAst V)和猪环曲病毒(PTo V)。利用该方法对419份临床腹泻粪便样品进行筛检,结果显示PKV检出率最高,阳性率达26.98%–45.79%;PKV和其他病原混合感染率达9.52%–18.54%。基于PKV的高检出率及其可能在猪腹泻疾病中发挥的作用,本试验进一步选取3个PKV阳性样品进行全基因组序列测定及遗传进化分析。结果表明,这3个阳性样品PKV均归属于猪嵴病毒属,且与其他动物嵴病毒遗传距离较远,分别标记为CM-PKV、JS-PKV和PD-PKV;它们的全基因组同源性为88.1%–89.1%;CM-PKV与2013年报道的中国株JS-02a-CHN/2013同源性最高,而JS-PKV和PD-PKV则与2008年报道的匈牙利株K-30-HUN/2008/HUN同源性最高。表明上海不同地区猪群中存在的PKV有明显的遗传差异,但毒株遗传特性的差异与其致病力的相关性需进一步研究。本研究为深入了解PKV的流行现状及探讨其在猪腹泻疫情中的作用提供了参考。 展开更多
关键词 多重RT-PCR 猪嵴病毒 全基因组序列 遗传进化分析
酿酒葡萄4种病毒多重RT-PCR检测体系的建立 预览 被引量:2
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作者 苏静 陈佰鸿 +3 位作者 毛娟 左存武 胡紫璟 王凯 《果树学报》 CSCD 北大核心 2017年第5期632-638,共7页
【目的】建立快速、灵敏的葡萄病毒多重RT-PCR检测体系。【方法】通过设计6对不同引物,在退火温度分别为48.0、49.0、50.0、51.0、52.0、53,0、54.0、55.0、56.0、57.0、58.0、59.0和60.0℃,采用单-RT-PCR技术检测酿酒葡... 【目的】建立快速、灵敏的葡萄病毒多重RT-PCR检测体系。【方法】通过设计6对不同引物,在退火温度分别为48.0、49.0、50.0、51.0、52.0、53,0、54.0、55.0、56.0、57.0、58.0、59.0和60.0℃,采用单-RT-PCR技术检测酿酒葡萄6种常见的葡萄病毒,即葡萄病毒A(Grapevine virus A,GVA)、葡萄斑点病毒(Grapevine fleck virus,GFKV)、葡萄扇叶病毒(Grapevine fanleaf virus,GFLV)、葡萄卷叶病毒1(Grapevine leafroll associated virus-1,GLRaV-1)、葡萄卷叶病毒2(Grapevine leafroll associated virus-1,GLRaV-2)和葡萄卷叶病毒4(Grapevine leafroll associated virus-4,GLRaV-4)。在此基础上,对退火温度相似、扩增片段长度不同的引物进行组合,建立能同时检测2种或2种以上病毒的多重RT-PCR检测体系。【结果】单一RT-PCR结果显示,退火温度为49℃、55℃和60℃时,可分别检测GVA和GLRaV、GLRaV和GFKV以及GFLV和GLRaV。多重RT-PCR结果显示,退火温度分别为49℃和55℃时,引物GVA和GLRaV-2以及引物GLRaV-1和GFKV组合所建立的2个多重RT-PCR检测体系可同时检测葡萄叶片中GVA和GLRaV以及GLRaV和GFKV。所检测的河西地区16份样品普遍携带葡萄病毒,部分葡萄样品同时携带两种病毒。其中,5份样品为GVA阳性,8份为GLRaV-1阳性,3份为GLRaV-2阳性,5份为GFKV阳性,所有样品均未检测到GFLV和GLRaV-4。退火温度分别为49℃和55℃时所建立的GVA和GLRaV以及GLRaV和GFKV两个多重PCR扩增体系检测结果与各样品单一PCR检测结果均一致。【结论】建立2套多重PCR检测体系,可同时有效地检测GVA和GLRaV-2或GLRaV-1和GFKV,可用于田间葡萄样品的快速检测。 展开更多
关键词 酿酒葡萄 病毒 检测 多重RT-PCR
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多重RT-PCR快速检测东南沿海城市生食水产品中致病菌污染状况 预览 被引量:2
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作者 谢庆超 李想 +4 位作者 赵勇 黄新新 潘迎捷 郭德华 刘海泉 《检验检疫学刊》 2017年第4期1-5,共5页
为实现生食水产品中致病菌的快速、定量检测,构建了副溶血性弧菌及单增李斯特菌的多重RT-PCR体系。对东南沿海地区的92份生食水产品样品进行检测,并同国标方法进行比对,同时对检测结果的变化趋势进行分析。快速检测结果在36 h后得到,国... 为实现生食水产品中致病菌的快速、定量检测,构建了副溶血性弧菌及单增李斯特菌的多重RT-PCR体系。对东南沿海地区的92份生食水产品样品进行检测,并同国标方法进行比对,同时对检测结果的变化趋势进行分析。快速检测结果在36 h后得到,国标方法的结果在3-5 d后得到;经过比对,二者检出率相同,致病菌总体检出率为41.30%:其中副溶血性弧菌检出率为39.13%,单增李斯特菌检出率为20.65%。比对结果表明多重RT-PCR方法具有快速、灵敏、特异性强的优点;对检出率的分析表明东南沿海地区生食水产品中致病菌污染情况较为严重,相关部门应加强管理及控制。 展开更多
关键词 多重RT-PCR 快速检测 生食水产品 致病菌
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FMDV、BTV、PPRV多重RT-PCR检测方法的建立 预览
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作者 何亚鹏 张琪 +3 位作者 徐丽美 庞文静 付明哲 许信刚 《西北农业学报》 CSCD 北大核心 2017年第11期1584-1589,共6页
为建立能够同时检测并鉴别口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)、蓝舌病病毒(Bluetongue virus,BTV)和小反刍兽疫病毒(Peste des petits ruminants virus,PPRV)感染的多重RT-PCR(反转录-聚合酶链式反应,Reverse trans... 为建立能够同时检测并鉴别口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)、蓝舌病病毒(Bluetongue virus,BTV)和小反刍兽疫病毒(Peste des petits ruminants virus,PPRV)感染的多重RT-PCR(反转录-聚合酶链式反应,Reverse transcription-polymerase chain reaction)方法,根据3种病毒的基因组全序列和保守区序列设计3对特异性引物,优化反应体系和扩增条件,建立能够同时检测3种病毒的多重RT-PCR方法。结果表明,建立的多重RT-PCR检测方法敏感性强,对FMDV、BTV和PPRV的核酸最低检测量分别为15.42、6.29、16.50ng/μL;特异性试验结果表明所建立方法的特异性良好。建立的多重RT-PCR方法具有敏感性高、特异性强、重复性好、快速简便等特点,可以用于临床上3种病毒感染的诊断和鉴别。 展开更多
关键词 口蹄疫病毒 蓝舌病病毒 小反刍兽疫病毒 多重RT-PCR
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鸡传染性支气管炎病毒强毒株和弱毒疫苗株的免疫磁珠-多重RT-PCR鉴别方法的建立 被引量:3
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作者 高文倩 韩潇潇 王红宁 《中国家禽》 北大核心 2017年第10期14-17,共4页
利用鸡传染性支气管炎病毒(IBV)多克隆抗体构建的免疫磁珠富集IBV,对GenBank中896株IBVS1基因序列及其多变区进行分析,根据IBV强毒株和弱毒疫苗株序列差异设计引物,建立了一种基于免疫磁珠富集IBV后检测S1基因多变区的多重RT—PCR... 利用鸡传染性支气管炎病毒(IBV)多克隆抗体构建的免疫磁珠富集IBV,对GenBank中896株IBVS1基因序列及其多变区进行分析,根据IBV强毒株和弱毒疫苗株序列差异设计引物,建立了一种基于免疫磁珠富集IBV后检测S1基因多变区的多重RT—PCR方法。结果表明:该方法能扩增出强毒株约710bp的通用片段和约350bp的特异片段,弱毒疫苗株能扩增出约710bp的通用片段和约210bp的特异片段,能鉴别出强毒株和弱毒疫苗株。免疫磁珠富集IBV后比不富集病毒用RT—PCR方法检测敏感性提高100倍。该方法为IBV检测提供了新的技术支持。 展开更多
关键词 鸡传染性支气管炎病毒(IBV) 免疫磁珠 多重RT-PCR 鉴别
辣椒三种病毒的多重RT-PCR同步检测 被引量:1
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作者 丁超 李欲轲 +3 位作者 刘倩 万晴姣 乙引 洪鲲 《分子植物育种》 CSCD 北大核心 2017年第10期4054-4059,共6页
本研究根据辣椒轻斑驳病毒(PMMo V)、烟草花叶病毒(TMV)和黄瓜花叶病毒(CMV)的外壳蛋白(CP)编码序列设计了3对PCR检测引物,并初步建立了同步检测以上3种辣椒病毒的多重RT-PCR方法。以被感染了3种病毒的叶片的总RNA作为模板,可... 本研究根据辣椒轻斑驳病毒(PMMo V)、烟草花叶病毒(TMV)和黄瓜花叶病毒(CMV)的外壳蛋白(CP)编码序列设计了3对PCR检测引物,并初步建立了同步检测以上3种辣椒病毒的多重RT-PCR方法。以被感染了3种病毒的叶片的总RNA作为模板,可同时扩增到324 bp(TMV)、220 bp(PMMo V)和112 bp(CMV)的3个目标条带,在电泳图上清晰可辨。测序结果表明所扩增产物确为待检病毒靶序列。除阳性对照外,该多重RT-PCR体系不对ORSV、PVX和PVY等同属或不同属的其它病毒发生反应;该体系可检测到104倍稀释的病毒c DNA模板。同时,以建立的三重RT-PCR法对10份田间辣椒病样进行检测,其结果与单重RT-PCR结果一致,说明该法检测结果可靠,可用于PMMo V、TMV和CMV 3种辣椒病毒的同步检测。 展开更多
关键词 辣椒 病毒检测 多重RT-PCR
PRRSV美洲型经典株、变异株和疫苗株多重RT-PCR鉴别检测方法的建立及应用 预览 被引量:3
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作者 施开创 许心婷 +3 位作者 胡杰 粟艳琼 陆文俊 陈汉忠 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2017年第3期879-887,共9页
为建立猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)的快速鉴别检测方法,本研究针对PRRSV美洲型经典株、高致病性变异株以及TJM-F92疫苗株的Nsp2基因序列特点,设计2对特异性引物。经优化反应... 为建立猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)的快速鉴别检测方法,本研究针对PRRSV美洲型经典株、高致病性变异株以及TJM-F92疫苗株的Nsp2基因序列特点,设计2对特异性引物。经优化反应条件后,建立了能同时检测并区分PRRSV美洲型经典株、变异株及疫苗株的多重RT-PCR方法。该方法特异性强,与猪其他病毒间不存在交叉反应;敏感性高,对重组质粒标准品的检出下限为1.13×10^3拷贝/μL。应用所建立的方法对349份临床疑似病料进行检测,结果检出PRRSV阳性119份,其中美洲型经典株5份、变异株107份、TJM-F92疫苗株7份,且有变异株和TJM-F92疫苗株混合阳性7份。表明本研究成功建立了PRRSV美洲型经典株、变异株及TJM-F92疫苗株的多重RT-PCR鉴别检测方法,可用于PRRSV的临床检测及流行病学调查。 展开更多
关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒 美洲型 多重RT-PCR 野毒株 疫苗株
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三种甘薯病毒多重RT-PCR检测技术的建立 预览 被引量:1
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作者 蒋素华 程喜梅 +3 位作者 宋彩霞 许申平 梁芳 崔波 《植物保护》 CAS CSCD 北大核心 2017年第1期126-130,共5页
本文根据GenBank中甘薯G病毒(SPVG)、甘薯卷叶病毒(SPLCV)和甘薯羽状斑驳病毒(SPFMV)外壳蛋白(CP)基因序列设计特异引物,对多重RT-PCR退火温度、延伸温度、模板浓度、引物浓度进行改良优化,建立能同时检测3种甘薯病毒的多重RT-... 本文根据GenBank中甘薯G病毒(SPVG)、甘薯卷叶病毒(SPLCV)和甘薯羽状斑驳病毒(SPFMV)外壳蛋白(CP)基因序列设计特异引物,对多重RT-PCR退火温度、延伸温度、模板浓度、引物浓度进行改良优化,建立能同时检测3种甘薯病毒的多重RT-PCR方法。该方法能同时扩增出SPVG、SPLCV和SPFMV特异片段,其大小分别是800、276和570bp。测序结果表明,扩增出的3种病毒序列与相应参考序列相似性达到98%以上。灵敏度分析结果表明,多重RT-PCR方法能够检测cDNA的量为0.1ng。应用建立的多重RT-PCR检测方法对田间样品进行检测,结果显示该方法可以特异、快速、灵敏地同时检测3种甘薯病毒。这些研究结果可为甘薯病毒检测提供参考。 展开更多
关键词 甘薯 病毒 多重RT-PCR
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多重RT-PCR检测蝴蝶兰3种病毒CymMV、ORSV和CMV 预览
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作者 涂小云 董小艳 +2 位作者 郭春梅 何俊平 鲍恩亚 《江苏农业科学》 北大核心 2017年第5期91-93,共3页
根据建兰花叶病毒(Cymbidium mosaic virus,CymMV)、齿兰轮斑病毒(Odontoglossum ringspot virus,ORSV)和黄瓜花叶病毒(cucumber mosaic virus,CMV)3种病毒外壳蛋白基因序列保守序列设计特异性引物,以病毒侵染的蝴蝶兰总RNA... 根据建兰花叶病毒(Cymbidium mosaic virus,CymMV)、齿兰轮斑病毒(Odontoglossum ringspot virus,ORSV)和黄瓜花叶病毒(cucumber mosaic virus,CMV)3种病毒外壳蛋白基因序列保守序列设计特异性引物,以病毒侵染的蝴蝶兰总RNA反转录的cDNA为模板进行扩增,建立了三重RT-PCR同时检测该3种病毒的方法。CymMV、ORSV和CMV 3种病毒特异扩增的片段分别为561、433、306 bp。用该方法对17个疑似病毒感染的蝴蝶兰样品进行检测,结果13个材料检测出CymMV特异带,2个材料检测出ORSV病毒特异带,1个材料检测出CMV病毒特异带,1个材料同时检测出CymMV和ORSV病毒2条特异带,所检测的17个蝴蝶兰材料未发现3种病毒复合侵染的情况。 展开更多
关键词 蝴蝶兰 多重RT-PCR 建兰花叶病毒 齿兰轮斑病毒 黄瓜花叶病毒 检测方法
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辽宁省发热伴呼吸道症候群病原谱及流行特征 被引量:2
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作者 孙海波 于伟 +3 位作者 王璐璐 宋亦春 毛玲玲 姚文清 《中国公共卫生》 CSCD 北大核心 2017年第6期997-1000,共4页
目的 建立并完善辽宁省呼吸道传染病病原检测平台,了解辽宁省发热伴呼吸道症候群流行特征和病原谱构成。方法 于2012—2014年在辽宁省内8个地市10家哨点医院收集就诊的发热伴呼吸道病例流行病学资料及标本,使用多重逆转录聚合酶链反应... 目的 建立并完善辽宁省呼吸道传染病病原检测平台,了解辽宁省发热伴呼吸道症候群流行特征和病原谱构成。方法 于2012—2014年在辽宁省内8个地市10家哨点医院收集就诊的发热伴呼吸道病例流行病学资料及标本,使用多重逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测流感病毒A、B型(Flu A、B型)、副流感病毒Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ型(PIVⅠ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ型)、呼吸道腺病毒(Adv)、呼吸道合胞病毒A、B型(RSV A、B型)、人类冠状病毒(HCov)、人鼻病毒(HRV)和偏肺病毒(hMPV)。结果 共收集发热伴呼吸道症状标本670份,病毒检测阳性率为19.70%(132/670)。其中Flu阳性率为39.26%、HRV 14.81%、RSV 15.56%、Adv 14.81%、PIV 9.63%、HCov 5.19%、hMPV 0.74%。以0~4岁幼儿组和5~9岁少年组为主,发病主要集中在冬春季节。结论 辽宁省发热伴呼吸道病毒感染人群主要以〈10岁儿童为主,发病时间集中在冬春季节,主要病原为流感病毒,偏肺病毒比较少见。 展开更多
关键词 发热伴呼吸道症候群 多重RT-PCR 流行特征 病原谱
进境大豆种子上菜豆荚斑驳病毒和大豆花叶病毒的多重RT-PCR检测 预览 被引量:9
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作者 沈建国 高芳銮 +3 位作者 蔡伟 金晶 廖富荣 吴祖建 《中国农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2016年第4期667-676,共10页
【目的】针对进境大豆种子上症状相似的菜豆荚斑驳病毒(Bean pod mottle virus,BPMV)和大豆花叶病毒(Soybean mosaic virus,SMV),建立同时快速检测2种病毒的多重RT-PCR技术。【方法】根据GenBank公布的BPMV、SMV外壳蛋白基因序列,设... 【目的】针对进境大豆种子上症状相似的菜豆荚斑驳病毒(Bean pod mottle virus,BPMV)和大豆花叶病毒(Soybean mosaic virus,SMV),建立同时快速检测2种病毒的多重RT-PCR技术。【方法】根据GenBank公布的BPMV、SMV外壳蛋白基因序列,设计2对特异性引物,以复合感染BPMV、SMV的大豆种子为材料,提取dsRNA作为模板进行多重RT-PCR的引物浓度、退火温度和循环数的优化。利用优化建立的多重RT-PCR方法分别对健康大豆种子、BPMV、SMV及2种病毒复合感染的大豆种子进行检测,测定该方法的特异性。利用健康大豆种子提取的dsRNA,将从复合侵染BPMV、SMV大豆种子中提取的dsRNA按10倍梯度稀释,依次稀释为原液的10~(-1)、10~(-2)、10~(-3)、10~(-4).10~(-5)和10~(-6)倍作为模板,分别进行多重RT-PCR和单一RT-PCR扩增,测定灵敏度。多重RT-PCR扩增产物回收纯化后,连接于pMD18-T载体,进行克隆测序和序列比对,进一步验证该方法的可靠性。应用建立的多重RT-PCR方法对来自于美国、阿根廷、中国和巴西的疑似带病大豆种子进行检测,同时以单一RT-PCR检测进行验证。以BPMV、SMV抗体等体积混合液包被PCR管后再加入样品提取液或直接以样品提取液包被PCR管,将免疫捕获、试管捕捉和多重RT-PCR相结合,建立同时检测BPMV、SMV的多重一步IC-RT-PCR、多重一步TC-RT-PCR方法。【结果】多重RT-PCR的优化结果显示,最佳引物浓度为BPMV 0.4μmol·L~(-1)、SMV 0.4μmol·L~(-1),最佳退火温度为52℃,最佳循环数为35。特异性测定结果表明,多重RT-PCR能够从复合感染BPMV、SMV的大豆种子上同时扩增到大小约542、221 by特异性目的条带,从单一感染BPMV的大豆种子上扩增到大小约542 by特异性目的条带,从单一感染SMV的大豆种子上扩增到大小约221 by特异性目的条带,而从健康大豆种子材料上未扩增出任何特异性条带。灵敏度测定结果� 展开更多
关键词 菜豆荚斑驳病毒 大豆花叶病毒 多重RT-PCR 双链RNA
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PEDV、TGEV和PRoV多重RT-PCR检测方法的建立及应用 预览 被引量:6
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作者 龙飞翔 施开创 +3 位作者 张珍 尹彦文 陈汉忠 莫胜兰 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2016年第10期2518-2526,共9页
为建立猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)及猪轮状病毒(PRoV)的快速鉴别检测方法,本试验针对PEDV、TGEV、PRoV的基因组序列设计3对特异性引物PEDV-N、TGEV-M和PRoV-VP6,分别扩增PEDV N基因、TGEV M基因和PRoV VP... 为建立猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)及猪轮状病毒(PRoV)的快速鉴别检测方法,本试验针对PEDV、TGEV、PRoV的基因组序列设计3对特异性引物PEDV-N、TGEV-M和PRoV-VP6,分别扩增PEDV N基因、TGEV M基因和PRoV VP6基因。经优化反应条件,成功建立了能同时检测并区分PEDV、TGEV、PRoV的多重RT-PCR方法。该方法可特异扩增PEDV、TGEV、PRoV相应的基因片段,而与猪瘟病毒(CSFV)、猪口蹄疫病毒(FMDV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)、猪圆环病毒2型(PCV2)均无交叉反应;对PEDV、TGEV、PRoV基因重组质粒标准品的检出限分别为1.41×103、1.41×102和1.41×103拷贝/μL;在相同条件下重复试验可获得一致的结果。应用该方法对临床采集的190份腹泻病料进行检测,结果PEDV阳性42份,阳性率22.11%;TGEV阳性58份,阳性率30.53%;PRoV阳性34份,阳性率17.89%,且存在不同病毒混合感染的现象。结果表明,所建立的多重RT-PCR方法具有特异性强、敏感性高、重复性好的优点,可用于PEDV、TGEV和PRoV的临床检测和流行病学调查。 展开更多
关键词 猪流行性腹泻病毒 猪传染性胃肠炎病毒 猪轮状病毒 多重RT-PCR 检测方法
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