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朊粒病 预览 被引量:10
1
作者 廖延雄 《畜牧与兽医》 北大核心 1999年第3期 1-4,共4页
由朊粒所致的疾病称朊粒病。朊粒(prion)是一种蛋白质,存在于许多脊椎动物的胞浆膜上,当结构异常时,就成为致病性朊粒,能引起反刍动物、人及猫科动物的神经系统疾病,统称为朊粒病(priondiseases)。有的是传... 由朊粒所致的疾病称朊粒病。朊粒(prion)是一种蛋白质,存在于许多脊椎动物的胞浆膜上,当结构异常时,就成为致病性朊粒,能引起反刍动物、人及猫科动物的神经系统疾病,统称为朊粒病(priondiseases)。有的是传染性,有的是遗传病,潜伏期很长,从... 展开更多
关键词 野生动物 朊粒病 病毒感染 致病性朊粒
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人TNF-α重组慢病毒载体构建及其脐血间质干细胞表达 预览 被引量:9
2
作者 马贵亮 毛伟征 +2 位作者 杨堃 安岗 岱震波 《青岛大学医学院学报》 CAS 2010年第3期 189-192,195,共5页
目的构建带有人TNF-α基因的慢病毒载体,并且观察该基因在体外人脐血间质干细胞中的表达。方法通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)从PCD DNA-TNF-α质粒中获得人TNF-α基因,利用Infusion技术重组构建慢病毒载体穿梭质粒pGC-FU-TNF-α,在... 目的构建带有人TNF-α基因的慢病毒载体,并且观察该基因在体外人脐血间质干细胞中的表达。方法通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)从PCD DNA-TNF-α质粒中获得人TNF-α基因,利用Infusion技术重组构建慢病毒载体穿梭质粒pGC-FU-TNF-α,在脂质体Lipofectamine 2000介导下与结构质粒pHelper 1.0和包膜质粒pHelper 2.0共转染293T细胞包装生产慢病毒。将人脐血间质干细胞分为实验组(pGC-FU-TNF-α)、空载体对照组(pGC-FU-EGFP)及空白组(脐血间质干细胞),分别用重组慢病毒、空载慢病毒、PBS感染后,采用RT-PCR以及ELISA方法检测TNF-α表达。结果所获TNF-α基因测序证明与GenBank中序列一致;重组慢病毒载体质粒pGC-FU-TNF-α经鉴定正确;三质粒共转染293T细胞成功,收集、浓缩病毒后测定其滴度为2×107TU/L,感染脐血间质干细胞后RT-PCR、ELISA检测3组细胞均有TNF-α表达,其中实验组大量表达TNF-α,与其余两组比较差异有显著性(F=11.677、21.321,P〈0.01)。结论成功构建带有TNF-α基因的慢病毒载体并实现在脐血间质干细胞中的表达,为脐血间质干细胞转基因治疗胃癌的应用奠定基础。 展开更多
关键词 病毒感染 遗传载体 肿瘤坏死因子α 基因 脐血 间质干细胞
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沉默RNF181基因表达可促进结肠癌SW480细胞的生长 被引量:5
3
作者 牛文博 王穗海 +6 位作者 李鹏 王明清 高彦君 董宁宁 何沛嵘 石相宜 李纪良 《肿瘤》 CAS CSCD 北大核心 2016年第6期621-627,共7页
目的 :研究沉默环指蛋白181(ring finger protein 181,RNF181)基因表达对结肠癌细胞SW480生长的影响,并探讨其可能的作用机制。方法 :采用慢病毒感染的方法将靶向沉默RNF181基因表达的重组慢病毒颗粒LV3-RNF181-KD转入人结肠癌SW48... 目的 :研究沉默环指蛋白181(ring finger protein 181,RNF181)基因表达对结肠癌细胞SW480生长的影响,并探讨其可能的作用机制。方法 :采用慢病毒感染的方法将靶向沉默RNF181基因表达的重组慢病毒颗粒LV3-RNF181-KD转入人结肠癌SW480细胞中[以感染重组慢病毒颗粒LV3-negative control(NC)为阴性对照)]。病毒感染48 h后,分别采用实时荧光定量PCR和蛋白质印迹法检测SW480细胞中RNF181m RNA及蛋白的表达水平;CCK-8法和平板克隆法检测RNF 181基因沉默对SW480细胞增殖的影响;蛋白质印迹法检测对细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)及其磷酸化ERK(phospho-ERK,p-ERK)表达的影响。结果 :实时荧光定量PCR和蛋白质印迹法检测结果显示,重组慢病毒颗粒LV3-RNF181-KD转入SW480细胞后,细胞中RNF181 m RNA和蛋白的表达水平均较阴性对照组(感染重组慢病毒颗粒LV3-NC的SW480细胞)明显下调,差异均有统计学意义(P值均〈0.01)。CCK-8及平板克隆实验证实,沉默RNF181基因表达后SW480细胞的增殖能力明显增强(P值均〈0.01)。细胞中ERK蛋白的表达水平无明显变化(P〉0.05),而p-ERK蛋白的表达水平明显升高(P〈0.01)。结论 :沉默RNF181基因的表达可增强人结肠癌细胞SW480的增殖能力,其机制可能与丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activate protein kinase,MAPK)/ERK信号转导通路的活化有关。 展开更多
关键词 结肠肿瘤 病毒感染 RNF181基因 细胞增殖
过表达基质细胞衍生因子1基因促进骨髓间充质干细胞增殖和迁移 预览 被引量:1
4
作者 陈少强 吴碧莲 +1 位作者 王姗姗 黄海辉 《中国组织工程研究》 北大核心 2018年第1期32-39,共8页
背景:基质细胞衍生因子1(stromal cell derived factor,SDF-1)/CXCR4轴不仅能够促进骨髓间充质干细胞向损伤组织迁移,而且具有抑制骨髓间充质干细胞凋亡、增加骨髓间充质干细胞存活率及增殖活性等作用。目的:建立慢病毒介导的稳定... 背景:基质细胞衍生因子1(stromal cell derived factor,SDF-1)/CXCR4轴不仅能够促进骨髓间充质干细胞向损伤组织迁移,而且具有抑制骨髓间充质干细胞凋亡、增加骨髓间充质干细胞存活率及增殖活性等作用。目的:建立慢病毒介导的稳定过表达SDF-1α的骨髓间充质干细胞系,在体外观察其对骨髓间充质干细胞增殖和迁移的影响。方法:构建过表达SDF-1α重组慢病毒载体(pNL-SDF-1α-IRES2-EGFP),并以空载体质粒pNL-IRES2-EGFP、基因沉默质粒GV-118-SDF-1α-siRNA作为实验对照,分别转染293T细胞和骨髓间充质干细胞,建立稳定过表达SDF-1α的骨髓间充质干细胞系:SDF-1α-BMSCs组、null-BMSCs组和siRNA-BMSCs组;采用RT-PCR、Western Blot方法检测SDF-1αmRNA和蛋白的表达水平;MTT法检测骨髓间充质干细胞的增殖能力;Transwell迁移实验检测SDF-1α对骨髓间充质干细胞迁移能力的影响。结果与结论:①成功构建pNL-SDF-1α-IRES2-EGFP质粒,经测序结果表明pNL-SDF-1α-IRES2-EGFP重组质粒构建成功;②慢病毒转染48h后可见293T细胞和各组骨髓间充质干细胞强烈表达EGFP;③SDF-1α-BMSCs组高效表达SDF-1α,siRNA-BMSCs组SDF-1α表达明显被抑制;④SDF-1α-BMSCs组的细胞增殖能力增强,SDF-1α可明显促进骨髓间充质干细胞的跨膜迁移。在抗SDF-1α多抗作用后各组细胞迁移指数明显下降;⑤结果可见,慢病毒载体可介导外源性基因SDF-1α在大鼠骨髓间充质干细胞中高效表达,并促进骨髓间充质干细胞的增殖和迁移。 展开更多
关键词 趋化因子CXCL12 骨髓 间质干细胞 病毒感染 细胞增殖 细胞运动 组织工程
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经尿道灌注慢病毒转染豚鼠膀胱的研究 预览 被引量:5
5
作者 魏艳青 王江平 +2 位作者 王勤章 钱彪 丁国富 《天津医药》 CAS 2015年第11期1275-1277,共3页
目的:观察慢病毒介导绿色荧光蛋白(GFP)转染膀胱的效果,并确定取得较好转染效果的病毒量。方法豚鼠经尿道灌注及静脉注射不同量的携带GFP基因的慢病毒,饲养7 d后取膀胱、肝、肺、肾等组织冰冻切片,激光共聚焦显微镜下观察各组织GF... 目的:观察慢病毒介导绿色荧光蛋白(GFP)转染膀胱的效果,并确定取得较好转染效果的病毒量。方法豚鼠经尿道灌注及静脉注射不同量的携带GFP基因的慢病毒,饲养7 d后取膀胱、肝、肺、肾等组织冰冻切片,激光共聚焦显微镜下观察各组织GFP分布。结果滴度为4×108的慢病毒,经尿道膀胱灌注30μL时可见组织黏膜下有绿色荧光,40μL时组织肌层有广泛绿色荧光分布,50μL时组织肌层有更强绿色荧光分布,静脉注射25μL时组织肌层可见有广泛绿色荧光分布;经尿道灌注各病毒量下未在膀胱外组织见有明显绿色荧光分布,静脉注射下在肝、肺等组织见有较膀胱更强绿色荧光。结论慢病毒可以成功介导GFP转染豚鼠膀胱,并且经尿道灌注可以避免静脉注射带来的病毒在膀胱外组织广泛分布,能够为膀胱疾病的临床治疗带来新的研究方向和手段。 展开更多
关键词 病毒感染 膀胱 转染 绿色荧光蛋白质类 豚鼠
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慢病毒介导人白细胞介素12转染鼠骨髓间充质干细胞可抑制CT26瘤体的生长 预览
6
作者 何杨 林晨 +2 位作者 高琴 宋京翔 涂小煌 《中国组织工程研究》 北大核心 2018年第25期3944-3949,共6页
背景:白细胞介素12作为最具潜力的抑瘤因子一直是研究的热点,但其在结直肠癌方面的研究相对较少。目的:构建稳定表达人白细胞介素12的大鼠骨髓间充质干细胞株(hIL-12-BMSCs),观察其对大鼠结肠癌模型的影响。方法:设计并合成引物,PCR扩... 背景:白细胞介素12作为最具潜力的抑瘤因子一直是研究的热点,但其在结直肠癌方面的研究相对较少。目的:构建稳定表达人白细胞介素12的大鼠骨髓间充质干细胞株(hIL-12-BMSCs),观察其对大鼠结肠癌模型的影响。方法:设计并合成引物,PCR扩增并回收纯化后的p40和p35基因片段,行Overlap-ping PCR连接获得hIL-12的单链双亚基表达融合基因,与慢病毒包装系统共转染293T细胞,构建慢病毒过表达重组体,再转染大鼠骨髓间充质干细胞,药物筛选培育出稳转株。32只裸鼠皮下注射CT26细胞悬液造模成功后,随机分为4组:瘤周分别注射0.2 mL hIL-12-BMSCs(hIL-12-BMSCs组)、0.2 mL PBS溶液(PBS组)、0.2 mL骨髓间充质干细胞(骨髓间充质干细胞组)、0.2 mL表达IL-12的慢病毒液(LV-IL-12组),统计并分析各组瘤体生长情况。结果与结论:①观察期内PBS组与骨髓间充质干细胞组肿瘤体积差异无显著性意义(P>0.05),表明骨髓间充质干细胞本身对CT26瘤体生长无明显促进或抑制作用;②注射7 d后hIL-12-BMSCs组与PBS组、PBS组与LV-IL-12组间肿瘤体积差异均有显著性意义(P<0.01),表明白细胞介素12对CT26瘤体生长有明显抑制作用;③注射10 d后hIL-12-BMSCs组与LV-IL-12组间肿瘤体积差异有显著性意义(P<0.05),表明hIL-12-BMSCs抑制CT26生长优于LV-IL-12;④结果表明,hIL-12-BMSCs对裸鼠CT26移植瘤体生长有明显的抑制作用。 展开更多
关键词 结直肠癌 人白细胞介素12 鼠骨髓间充质干细胞 病毒载体 干细胞 福建省自然科学基金 结直肠肿瘤 白细胞介素12 骨髓 间质干细胞 病毒感染 组织工程
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Runx2慢病毒转染骨髓间充质干细胞修复骨性关节炎的关节损伤 预览
7
作者 段志斌 仇志强 +4 位作者 彭鲲 徐泽敏 成科 陈翔 矢庆明 《中国组织工程研究》 北大核心 2018年第29期4607-4613,共7页
背景:研究发现骨髓间充质干细胞作为种子细胞可分化为成软骨细胞和成骨细胞,Runx2能够诱导骨髓间充质干细胞向成软骨细胞和成骨细分化、成熟,从而促进骨愈合。目的:探讨Runx2慢病毒转染骨髓间充质干细胞在骨性关节炎关节损伤修复中的作... 背景:研究发现骨髓间充质干细胞作为种子细胞可分化为成软骨细胞和成骨细胞,Runx2能够诱导骨髓间充质干细胞向成软骨细胞和成骨细分化、成熟,从而促进骨愈合。目的:探讨Runx2慢病毒转染骨髓间充质干细胞在骨性关节炎关节损伤修复中的作用。方法:①分离培养C57BL/6小鼠骨髓间充质干细胞,用Lenti-Runx2-EGFP慢病毒(Runx2组)转染细胞,同时转染不含Runx2基因的慢病毒(阴性对照组),并设置未用慢病毒转染的空白对照组;转染48 h后荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达,计算转染效率,并用嘌呤霉素筛选稳定转染的细胞株;②将C57BL/6小鼠膝关节前交叉韧带切断建立骨性关节炎模型,并随机分为生理盐水组、单纯骨髓间充质干细胞组、Runx2转染骨髓间充质干细胞组;分别于小鼠膝关节腔内注射0.1 mL生理盐水、0.1 mL含1×107个单纯骨髓间充质干细胞的生理盐水、0.1 mL含1×107个Runx2慢病毒转染骨髓间充质干细胞的生理盐水。结果与结论:①骨髓间充质干细胞表面标志抗原CD90、CD105高表达,慢病毒转染效率(88.57±3.07)%,经4 mg/L嘌呤霉素筛选得到稳定转染细胞;②Runx2转染骨髓间充质干细胞组软骨完整,无明显退化,关节面平整;其他2组软骨退变,关节面不平;③Runx2转染骨髓间充质干细胞组软骨细胞多,软骨层厚;其他2组软骨细胞减少,软骨层变薄,且Runx2转染骨髓间充质干细胞组Mankin’s评分低于其他2组;④Runx2转染骨髓间充质干细胞组Ⅱ型胶原蛋白阳性率大于其他2组,Ⅹ型胶原蛋白阳性率小于其他2组;⑤Runx2转染骨髓间充质干细胞组Runx2、骨形成蛋白2、碱性磷酸酶、骨钙素和骨桥蛋白蛋白及mRNA表达高于其他2组;⑥结果说明,Runx2慢病毒转染骨髓间充质干细胞能够促进骨性关节炎关节损伤修复,从而为骨性关节炎的临床治疗提供新的方向。 展开更多
关键词 RUNX2 病毒 骨髓间充质干细胞 骨形成蛋白2 碱性磷酸酶 骨钙素 骨桥蛋白 骨性关节炎 干细胞 骨关节炎 病毒感染 组织工程
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病毒介导骨形态发生蛋白2和血管内皮生长因子165双基因转染促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化 预览
8
作者 周桢杰 李强 +2 位作者 李诗鹏 陶旋 马跃刚 《中国组织工程研究》 北大核心 2018年第25期3950-3955,共6页
背景:骨形态发生蛋白2(bone morphogenetic protein 2,BMP-2)和血管内皮生长因子165(vascular endothelial growth factor 165,VEGF-165)均为骨修复过程中必不可少的细胞因子,利用慢病毒转染干细胞研究双因子作用下细胞的生物学改变具... 背景:骨形态发生蛋白2(bone morphogenetic protein 2,BMP-2)和血管内皮生长因子165(vascular endothelial growth factor 165,VEGF-165)均为骨修复过程中必不可少的细胞因子,利用慢病毒转染干细胞研究双因子作用下细胞的生物学改变具有重要意义。目的:探讨慢病毒介导人BMP-2和人VEGF-165双基因转染(2次转染)骨髓间充质干细胞的可行性以及转染后细胞的诱导成骨性能。方法:将骨髓间充质干细胞分为4组:①未转染组;②空载组:通过2次相同感染复数的空载慢病毒转染细胞;③BMP-2组:转染了单个目的基因的细胞(Lv-BMP-2/GFP);④BMP-2/VEGF-165组:通过2次转染后携带双目的基因的细胞(Lv-BMP-2/GFP,Lv-VEGH-165/RFP)。转染后不同时间点Western Blot检测目的蛋白表达,MTT法检测各组细胞增殖活性,转染后14 d检测各组细胞碱性磷酸酶活性。结果与结论:①空载组、BMP-2组、BMP-2/VEGF-165组在荧光显微镜下均可见相应的绿色及红色荧光蛋白表达;②转染后3 d,BMP-2组、BMP-2/VEGF-165组均有相应目的蛋白高表达;转染后7,14,21 d,目的蛋白检测无明显变化(P>0.05);③BMP-2/VEGF-165组增殖稍快于BMP-2组(P<0.05),BMP-2组明显快于未转染组、空载组(P<0.05);④BMP-2组、BMP-2/VEGF-165组碱性磷酸酶活力明显高于未转染组、空载组;⑤结果表明,慢病毒介导的hBMP-2和hVEGF-165双基因经2次转染成功转入兔骨髓间充质干细胞内,并长期稳定表达,该双因子的表达能通过刺激细胞碱性磷酸酶生成促使细胞更好的向成骨细胞分化。 展开更多
关键词 骨髓间充质干细胞 骨形态发生蛋白2 血管内皮生长因子165 病毒 基因转染 细胞增殖 碱性磷酸酶 干细胞 国家自然科学基金 骨髓 间质干细胞 骨形态发生蛋白质类 血管内皮生长因子类 病毒感染 细胞增殖 组织工程
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Let-7c慢病毒载体对骨髓间充质干细胞体外诱导分化为神经细胞的影响 预览 被引量:4
9
作者 王静 赵绍云 +5 位作者 李明哲 景黎君 焦淑洁 彭涛 滕军放 贾延劼 《中国组织工程研究》 CAS 北大核心 2016年第1期20-25,共6页
背景:微小RNA参与调控干细胞增殖、分化、衰老等过程,通过了解Let-7家族成员Let-7c对骨髓间充质干细胞向神经细胞分化的影响可以为干细胞移植治疗提供新思路。目的:探讨Let-7c慢病毒载体在体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞向神经细胞分... 背景:微小RNA参与调控干细胞增殖、分化、衰老等过程,通过了解Let-7家族成员Let-7c对骨髓间充质干细胞向神经细胞分化的影响可以为干细胞移植治疗提供新思路。目的:探讨Let-7c慢病毒载体在体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞向神经细胞分化中的作用。方法:构建Let-7c上调及下调慢病毒载体并体外转染大鼠骨髓间充质干细胞,筛选最适转染复数;实验分为未转染组、阴性转染组(转染空白慢病毒)、转染上调组(转染LV-rno-Let-7c-up)、转染下调组(转染LV-rno-Let-7c-5p-inhibition);采用法舒地尔诱导转染后的大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经细胞,倒置荧光显微镜下观察骨髓间充质干细胞转染后荧光表达,免疫细胞化学染色检测神经元标记物NSE和MAP-2的表达,RT-PCR检测MAP-2 m RNA的表达,MTT法检测细胞存活率。结果与结论:倒置荧光显微镜下观察大鼠LV-rno-Let-7c-up和LV-rno-Let-7c-5p-inhibition慢病毒载体转染成功。法舒地尔可以诱导骨髓间充质干细胞分化为神经细胞,与阴性转染组相比,转染上调组的诱导效率升高(P〈0.05),NSE和MAP-2表达率上升(P〈0.05),转染下调组的诱导效率下降,NSE和MAP-2表达率下降(P〈0.05)。转染LV-rno-Let-7c-up后骨髓间充质干细胞经法舒地尔诱导向神经细胞分化比率增加,Let-7c可能具有促进骨髓间充质干细胞向神经细胞分化的作用。 展开更多
关键词 骨髓 间质干细胞 微RNAS 神经元 细胞分化 病毒感染 组织工程 干细胞 骨髓干细胞 骨髓间充质干细胞 let-7c 病毒 转染 神经分化 国家自然科学基金
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慢病毒介导的microRNA-155过表达对肝癌细胞HepG2增殖的影响 预览
10
作者 牛连杰 张雅敏 武兆国 《天津医药》 CAS 北大核心 2018年第11期1151-1154,共4页
目的通过构建慢病毒(LV)介导的miRNA-155(miR-155)过表达载体,探讨上调miR-155对肝癌细胞系HepG2增殖的影响.方法针对目标序列合成特异性miR-155过表达片段并克隆入慢病毒载体pGCSHL-GFP,将重组miR-155-hRNA-LV和阴性对照空病毒载... 目的通过构建慢病毒(LV)介导的miRNA-155(miR-155)过表达载体,探讨上调miR-155对肝癌细胞系HepG2增殖的影响.方法针对目标序列合成特异性miR-155过表达片段并克隆入慢病毒载体pGCSHL-GFP,将重组miR-155-hRNA-LV和阴性对照空病毒载体转染HepG2细胞,建立稳定过表达miR-155的细胞系.细胞设过表达组(H组)、阴性对照组(negativecontrol,NC组)和正常组(normal,N组).实时荧光聚合酶链式反应(qRT-PCR)方法检测各组miR-155和PTEN的表达水平;Western blot检测各组PTEN、CyclinD1、CyclinA1+A2蛋白表达情况;细胞增殖-毒性检测(CCK-8)细胞增殖情况.结果H组miR-155表达量明显高于其NC组及N组,靶基因PTEN的表达量低于NC组及N组(均P〈0.05).H组PTEN蛋白的表达量明显低于NC组和N组,而CyclinD1、CyclingA1+A2蛋白的表达量明显高于NC组和N组(均P〈0.05).CCK-8结果显示3组12h时吸光度值开始出现差异,24h、48h、72hH组吸光度值均明显大于NC组和N组(P〈0.05),但后2组差异无统计学意义.结论过表达miR-155可促进肝癌细胞系HepG2细胞增殖. 展开更多
关键词 肝肿瘤 肝细胞 微RNAS 病毒感染 microRNA-155
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基因工程化Treg细胞对小鼠异基因骨髓移植后急性移植物抗宿主病的作用 被引量:4
11
作者 曹江 李莉 +4 位作者 陈翀 曾令宇 李振宇 潘秀英 徐开林 《中华血液学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2011年第2期83-88,共6页
目的探讨输注慢病毒载体介导的鼠基因工程调节性T淋巴细胞(Treg细胞)对小鼠异基因骨髓移植后移植物抗宿主病(GVHD)的影响。方法利用慢病毒载体介导,将鼠Foxp3基因转导人BALB/c小鼠的CD4^=CD25-T淋巴细胞,即为基因工程Treg细胞。... 目的探讨输注慢病毒载体介导的鼠基因工程调节性T淋巴细胞(Treg细胞)对小鼠异基因骨髓移植后移植物抗宿主病(GVHD)的影响。方法利用慢病毒载体介导,将鼠Foxp3基因转导人BALB/c小鼠的CD4^=CD25-T淋巴细胞,即为基因工程Treg细胞。建立小鼠异基因骨髓移植模型,在移植时联合输注基因工程Treg,通过受鼠移植后生存期、GVHD临床评分、组织病理学改变、供者T淋巴细胞激活、炎性细胞因子浓度等指标评价其防治GVHD的作用。结果单纯照射组、移植对照组、工程Treg组和空载体对照组小鼠存活时间分别为(8.8±0.6)、(36.7±2.5)、(51.6±4.0)和(34.1±2.3)d,工程Treg组小鼠存活时间明显长于其他各组(P〈0.05)。移植对照组及空载体对照组小鼠肝脏、皮肤和小肠病理切片均存在GVHD病理改变,工程Treg组长期存活小鼠的肝脏、皮肤和小肠常规病理切片结构基本正常,未见GVHD病理表现,该组GVHD评分明显低于移植对照组及空载体对照组。移植后3d(+3d)、+4d工程Treg组受鼠脾脏中供者T淋巴细胞数明显低于移植对照组和空载体对照组(P〈0.05),且+4d工程Treg组受鼠脾脏供者T淋巴细胞中IFN-γ^+细胞比例较后两组明显降低(P〈0.05)。在+21~+28d移植对照组、工程Treg组、空载体对照组受鼠血清IFN-γ、IL-2和TNF-α浓度达高峰,工程Treg组在+21d时IFN-γ、IL-2和TNF-α浓度高峰较其他两组为低(P〈0.05)。结论小鼠异基因骨髓移植时联合输注基因工程Treg细胞可通过减少受鼠移植后供者T淋巴细胞的早期扩增、激活以及炎性细胞因子的分泌有效减少GVHD的发生,减轻其严重程度。 展开更多
关键词 骨髓移植 T淋巴细胞 调节性 移植物抗宿主病 病毒感染
迁移和侵袭抑制蛋白(MIIP)荧光素酶报告基因稳定共表达HCT116^MIIP-Luc结肠癌细胞系的建立
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作者 熊欣 颜广 +3 位作者 王秦豪 茹懿 严奉奇 李霞 《细胞与分子免疫学杂志》 CSCD 北大核心 2018年第2期136-140,共5页
目的 建立迁移和侵袭抑制蛋白(MIIP)荧光素酶报告基因稳定过表达的结肠癌HCT116细胞系, 为MIIP基因的在体功能研究提供细胞模型。方法 将MIIP基因插入慢病毒载体pLEX-MCS-HA中获得重组慢病毒载体pLEX-MCS-HA-MIIP。利用该重组载体pLEX... 目的 建立迁移和侵袭抑制蛋白(MIIP)荧光素酶报告基因稳定过表达的结肠癌HCT116细胞系, 为MIIP基因的在体功能研究提供细胞模型。方法 将MIIP基因插入慢病毒载体pLEX-MCS-HA中获得重组慢病毒载体pLEX-MCS-HA-MIIP。利用该重组载体pLEX-MCS-HA-MIIP及包装载体VSVG、△8.9, 共转染HEK293T细胞, 包装表达MIIP的慢病毒, 将其感染HCT116细胞后, 采用适宜浓度的嘌呤霉素筛选, 建立MIIP稳定过表达的HCT116细胞。利用表达荧光素酶报告基因的慢病毒进行二次感染, 建立MIIP和荧光素酶报告基因稳定共表达的HCT116MIIP-Luc细胞和仅表达荧光素酶报告基因的HCT116Luc细胞。利用实时荧光定量PCR检测MIIP的mRNA水平, Western blot法检测MIIP蛋白水平, 小动物活体成像技术观察HCT116MIIP-Luc细胞和HCT116Luc细胞的荧光强弱。结果 成功建立了MIIP荧光素酶报告基因稳定共表达的HCT116MIIP-Luc细胞和仅表达荧光素酶报告基因的HCT116Luc细胞, 在HCT116MIIP-Luc细胞中实现了MIIP过表达, 生物发光成像结果显示HCT116MIIP-Luc细胞和HCT116Luc细胞均可产生较强的荧光。结论 分别建立了可传代的MIIP过表达及荧光素酶报告基因稳定共表达的结肠癌HCT116细胞株。 展开更多
关键词 结肠癌 迁移和侵袭抑制蛋白(MIIP) 荧光素酶报告基因 病毒感染
稳定表达人巨噬细胞集落刺激因子的L929细胞株的建立 预览
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作者 陆琤 周晨辰 +2 位作者 张鹏飞 张硌 张鹏 《中国医学装备》 2018年第11期155-157,共3页
目的:建立稳定表达人巨噬细胞集落刺激因子(hMCSF)的L929细胞株,用于体外培养人源巨噬细胞。方法:采用慢病毒感染的方法将载体质粒pCDH-hMCSF-HA导入L929细胞中,通过荧光显微镜观察病毒感染情况,利用免疫印迹实验检测细胞及培养上清... 目的:建立稳定表达人巨噬细胞集落刺激因子(hMCSF)的L929细胞株,用于体外培养人源巨噬细胞。方法:采用慢病毒感染的方法将载体质粒pCDH-hMCSF-HA导入L929细胞中,通过荧光显微镜观察病毒感染情况,利用免疫印迹实验检测细胞及培养上清中hMCSF的表达。结果:慢病毒感染的方法使L929细胞株能够稳定表达hMCSF,并已稳定传代。结论:采用慢病毒重组系统能够成功建立稳定表达hMCSF的L929细胞株,并高效表达hMCSF,为体外培养人源的巨噬细胞提供高效途径。 展开更多
关键词 L929细胞株 巨噬细胞集落刺激因子 病毒感染
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结缔组织生长因子重组干扰载体慢病毒颗粒的构建及其对视网膜血管内皮细胞内源性结缔组织生长因子表达的抑制作用
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作者 牛瑞 东莉洁 +4 位作者 马腾 杜雪利 何燕华 崔伟娜 胡博杰 《中华眼底病杂志》 CSCD 北大核心 2018年第6期580-585,共6页
目的构建结缔组织生长因子(CTGF)重组干扰载体(shRNA),观察其对视网膜血管内皮细胞内源性CTGF表达的抑制作用。 方法构建人源CTGF shRNA,应用三质粒包装系统获得高滴度的CTGF shRNA慢病毒颗粒。感染视网膜血管内皮细胞,利用干扰... 目的构建结缔组织生长因子(CTGF)重组干扰载体(shRNA),观察其对视网膜血管内皮细胞内源性CTGF表达的抑制作用。 方法构建人源CTGF shRNA,应用三质粒包装系统获得高滴度的CTGF shRNA慢病毒颗粒。感染视网膜血管内皮细胞,利用干扰载体中的红色荧光标记示踪并筛选慢病毒的最佳感染复数及起效时间。将细胞分为空白对照组(正常培养)、感染对照组(Scramble shRNA病毒感染)及CTGF敲低组(CTGF shRNA病毒感染)。通过Transwell细胞迁移实验观察3组细胞的迁移能力;实时定量聚合酶链反应(PCR)和蛋白免疫印迹法(Western blot)检测3组细胞的结缔组织生长因子(CTGF)、纤连蛋白(FN)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、Ⅰ型胶原蛋白(ColⅠ)的mRNA和蛋白表达。3组间数据比较采用方差分析。 结果CTGF shRNA的最佳感染复数为20,最佳起效时间是72 h。Transwell细胞迁移实验结果显示,CTGF敲低组穿过小孔细胞数较空白对照组及感染对照组明显降低,差异均有统计学意义(F=20.64,P=0.002)。实时定量PCR及Western blot检测结果显示,CTGF敲低组CTGF、FN、α-SMA、ColⅠ mRNA(F=128.83、124.44、144.76、1 374.44,P=0.000、0.000、0.000、0.000)和蛋白表达(F=22.55、41.60、25.73、161.68,P=0.002、0.000、0.001、0.000)较空白对照组、感染对照组明显降低,差异均有统计学意义。 结论成功构建的CTGF shRNA慢病毒颗粒可有效抑制视网膜血管内皮细胞迁移并下调内源性CTGF的表达。 展开更多
关键词 结缔组织生长因子 病毒感染 视网膜血管/细胞学 内皮细胞
携带小鼠KLF4基因重组慢病毒的构建及对RAW264.7细胞增殖的影响 预览
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作者 杨红艳 李鑫 +5 位作者 向国安 王如刚 蔡卫红 罗虎 梁婧 姬文婕 《天津医药》 CAS 北大核心 2018年第1期1-6,共6页
目的 构建小鼠Krüppel样因子4(KLF4)慢病毒表达载体,并建立KLF4过表达小鼠腹腔巨噬细胞RAW264.7细胞株.方法 采用聚合酶链式反应(PCR)技术扩增目的基因KLF4后,构建重组质粒pLVX-KLF4,并通过PCR、双酶切和测序方法对其进行鉴定... 目的 构建小鼠Krüppel样因子4(KLF4)慢病毒表达载体,并建立KLF4过表达小鼠腹腔巨噬细胞RAW264.7细胞株.方法 采用聚合酶链式反应(PCR)技术扩增目的基因KLF4后,构建重组质粒pLVX-KLF4,并通过PCR、双酶切和测序方法对其进行鉴定.重组质粒与pSPAX2、pMD2.G辅助质粒通过Lipofectamine?3000共转染293T细胞,包装病毒并测定病毒滴度.将获得的慢病毒感染RAW264.7细胞,实时定量PCR法检测KLF4 mRNA的表达.分选流式细胞仪分选GFP阳性RAW264.7细胞.流式细胞术检测KLF4对RAW264.7细胞周期的影响.EdU法检测KLF4对RAW264.7细胞增殖的影响.结果 经PCR、双酶切鉴定和测序证实,成功构建了包含小鼠KLF4基因的慢病毒穿梭质粒,RT-PCR证实Lenti-KLF4感染的RAW264.7细胞中KLF4 mRNA表达高于未感染的对照组RAW264.7细胞(P〈0.05).初次浓缩后测定小鼠KLF4基因重组慢病毒的滴度为2.05×108 TU/mL.分选出KLF4过表达的RAW264.7细胞.KLF4过表达的RAW264.7细胞周期变化显示为S期延长,G0/G1期缩短.EdU检测显示KLF4过表达的RAW264.7细胞增殖活性增高.结论 成功构建了KLF4的慢病毒表达载体,并建立KLF4过表达的RAW264.7细胞株,KLF4过表达促进了RAW264.7细胞的增殖. 展开更多
关键词 Krüppel样转录因子类 病毒感染 遗传载体 细胞周期 细胞增殖 Krüppel样因子4
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亚急性硬化性全脑炎临床与病理分析 预览 被引量:3
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作者 方莹莹 钟思陶 《中国神经精神疾病杂志》 CAS CSCD 北大核心 2000年第6期 354-356,共3页
目的:通过分析已确诊的亚急性硬化全脑炎(SSPE)病例,探讨其临床特点及早期诊断要点。方法:回顾分析5例经病理或免疫学检查证实的SSPE的临床资料及病理结果。结果:5例 有高级神经系统损害的表现、肌阵挛、锥体束损害及... 目的:通过分析已确诊的亚急性硬化全脑炎(SSPE)病例,探讨其临床特点及早期诊断要点。方法:回顾分析5例经病理或免疫学检查证实的SSPE的临床资料及病理结果。结果:5例 有高级神经系统损害的表现、肌阵挛、锥体束损害及特征性脑电图改变,早期临床表现常为智能减退。病理改变为脑的灰质和白质均广泛受累,血管周围淋巴细胞和浆细胞袖套状浸润,胶质细胞增生,白质片状脱髓鞘改变,神经细胞和胶质细胞核及胞浆内可见嗜 展开更多
关键词 亚急性硬化性全脑炎 病毒感染 病理 诊断
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慢病毒载体转染内皮祖细胞移植治疗肺动脉高压并黄芪总苷干预 预览
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作者 周小雄 魏伟超 +5 位作者 孙策 叶桃春 王嵩 卿立金 吴辉 冼绍祥 《中国组织工程研究》 北大核心 2018年第9期1425-1431,共7页
背景:CD40通路的激活对内皮祖细胞的疗效起负向调节作用,而抑制该通路能增强内皮祖细胞的生物学功能。目的:比较CD40基因沉默的内皮祖细胞(shRNA-CD40转染内皮祖细胞)与常规内皮祖细胞移植治疗肺动脉高压模型的疗效,并探讨黄芪总苷... 背景:CD40通路的激活对内皮祖细胞的疗效起负向调节作用,而抑制该通路能增强内皮祖细胞的生物学功能。目的:比较CD40基因沉默的内皮祖细胞(shRNA-CD40转染内皮祖细胞)与常规内皮祖细胞移植治疗肺动脉高压模型的疗效,并探讨黄芪总苷在内皮祖细胞移植治疗肺动脉高压中的干预作用。方法:将90只SD大鼠以随机数字表法分为5组,分别为正常对照组(n=24)、模型组(n=24)、慢病毒转染组(n=18)、常规移植组(n=18)及黄芪总苷组(n=6)。除正常对照组外,其余4组均以野百合碱诱发肺动脉高压模型,慢病毒转染组大鼠分别于野百合碱注射后第7,14,21天尾静脉注射Lv-shRNA-CD40转染的内皮祖细胞,每个时间点6只;常规移植组大鼠分别于野百合碱注射后第7,14,21天尾静脉注射内皮祖细胞,每个时间点6只;黄芪总苷组在野百合碱注射后第21天时间点注射Lv-shRNA-CD40转染的内皮祖细胞,同时在第1-21天每日一次给予80 mg/(kg?d)黄芪总苷腹腔注射。野百合碱注射后第28天,进行血流动力学、血浆内皮素1水平与右心室肥大指数检测。结果与结论:①与正常对照组比较,模型组右心室压力、平均肺动脉压、右心室肥大指数均升高(P<0.05)。与模型组比较,慢病毒转染组、常规移植组右心室压力、平均肺动脉压、右心室肥大指数均明显下降(P<0.05)。随着移植内皮祖细胞时间的延长,2个细胞移植组右心室压力、平均肺动脉压、右心室肥大指数均有逐渐升高趋势,但慢病毒转染组变化差异不明显;②与正常对照组比较,模型组大鼠血浆内皮素1水平升高(P<0.05);与模型组比较,慢病毒转染组、常规移植组血浆内皮素1水平降低(P<0.05);慢病毒转染组相同移植时间点的血浆内皮素1水平低于常规移植组(P<0.05);③黄芪总苷组的血流动力学、血浆内皮素1水平及右心室肥大指数均� 展开更多
关键词 高血压 肺性 内皮细胞 病毒感染 CD40配体 黄芪 组织工程
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UHRF1基因沉默可促进人肺腺癌A549细胞的凋亡 被引量:4
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作者 杨从容 赵学涛 +5 位作者 王军 吴凤鹏 刘青 程云杰 景绍武 边晨峰 《肿瘤》 CAS CSCD 北大核心 2015年第11期1222-1229,共8页
目的:探讨慢病毒介导的shRNA干扰泛素样含PHD和环指域1[ubiquitin—like with plant homeodomain(PHD)and ringfinger domain 1,UHRF1]基因表达对人肺腺癌A549细胞凋亡的影响及其可能的作用机制。方法:应用蛋白质印迹法从4条针对UH... 目的:探讨慢病毒介导的shRNA干扰泛素样含PHD和环指域1[ubiquitin—like with plant homeodomain(PHD)and ringfinger domain 1,UHRF1]基因表达对人肺腺癌A549细胞凋亡的影响及其可能的作用机制。方法:应用蛋白质印迹法从4条针对UHRF1基因的RNA干扰慢病毒载体中筛选出1条敲减效率最高的pGC—UHRF1-shRNA—LV-GFP#1包装成慢病毒。实验设未进行感染的空白对照组、感染非特异性shRNA的阴性对照组和感染pGC—UHRF1-shRNA—LV-GFP#1的UHRF1 shRNA组。慢病毒感染A549细胞后,应用RT—PCR法检测各组细胞中UHRF1 mRNA的表达水平,蛋白质印迹法检测各组细胞中UHRF1、Bax、caspase9和Bcl-2蛋白的表达水平;FCM法检测各组细胞的凋亡情况。结果:慢病毒pGC—UHRF1-shRNA—LV-GFP#1感染A549细胞后明显下调UHRF1 mRNA和蛋白表达水平(P值均〈0.01)。UHRF1 shRNA组A549细胞的凋亡率显著高于空白对照组和阴性对照组(P〈0.01),抗凋亡蛋白Bcl-2的表达水平显著下调(P〈0.01),而促凋亡蛋白Bax和caspase9的表达水平显著上调(P值均〈0.01)。结论:慢病毒介导的shRNA沉默UHRF1基因表达可促进人肺腺癌A549细胞的凋亡,其作用可能与上调Bax、caspase9蛋白表达和下调Bcl-2蛋白表达有关。 展开更多
关键词 肺肿瘤 病毒感染 RNA干扰 细胞凋亡 UHRF1基因
靶向OPN基因shRNA慢病毒载体的构建及其对人肺腺癌细胞A549侵袭能力的影响 预览
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作者 罗猛 裴登科 +2 位作者 孔德淼 刘波 金星 《贵州医科大学学报》 CAS 2018年第9期1012-1018,共7页
目的: 通过构建慢病毒介导的骨桥蛋白(OPN)基因沉默 shRNA载体,并转染人肺腺癌细胞A549建立OPN基因稳定沉默的肺癌细胞株,为进一步研究OPN与非小细胞肺癌侵袭转移相关分子机制奠定细胞学基础。 方法: 设计靶向OPN基因的3条siRNA靶... 目的: 通过构建慢病毒介导的骨桥蛋白(OPN)基因沉默 shRNA载体,并转染人肺腺癌细胞A549建立OPN基因稳定沉默的肺癌细胞株,为进一步研究OPN与非小细胞肺癌侵袭转移相关分子机制奠定细胞学基础。 方法: 设计靶向OPN基因的3条siRNA靶点系列,分别合成含有干扰系列的shRNA,与双酶切后的pLVX-shRNA2-puro载体连接,构建pLVX-shRNA2-puro-OPN1、pLVX-shRNA2-puro-OPN2和pLVX-shRNA2-puro-OPN3病毒载体,并转化于DH5ɑ感受态细胞,挑阳性克隆质粒测序,通过转染293T细胞,获取慢病毒颗粒,转染人肺腺癌细胞A549,用含嘌呤霉素培养基筛选培养,应用定量PCR及Western Blot检测OPN基因沉默效果,选用沉默效果最佳的pLVX-shRNA2-puro-OPN1建立OPN基因稳定沉默细胞株,并用transwell方法检测各组肺癌细胞株的侵袭能力。 结果: 经测序鉴定成功构建pLVX-shRNA2-puro-OPN慢病毒载体,定量PCR及Western Blot检测发现转染pLVX-shRNA2-puro-OPN-1、 pLVX-shRNA2-puro-OPN2慢病毒载体可明显降低A549细胞株中的OPN mRNA及蛋白水平;OPN基因稳定沉默明显抑制A549细胞株的侵袭能力。 结论: 成功构建pLVX-shRNA2-puro-OPN慢病毒载体,OPN基因稳定沉默明显抑制A549细胞株的侵袭能力。 展开更多
关键词 肺肿瘤 病毒感染 肿瘤转移 小发夹RNA 骨桥蛋白质
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Scleraxis慢病毒基因感染人羊膜间充质干细胞向肌腱细胞的定向分化 预览 被引量:2
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作者 朱喜忠 刘子铭 +7 位作者 吴术红 熊华章 杨继滨 李豫皖 尤奇 金瑛 左晨 刘毅 《中国组织工程研究》 北大核心 2017年第33期5382-5387,共6页
背景:Scleraxis作为肌腱细胞特异性表达分子,不仅参与肌腱祖细胞的聚集及分化,还影响肌腱细胞外基质的形成。人羊膜间充质干细胞具有多向分化潜能,在体外不同诱导条件下可分化为骨、软骨及其他结缔组织。目的:探讨Scleraxis慢病毒... 背景:Scleraxis作为肌腱细胞特异性表达分子,不仅参与肌腱祖细胞的聚集及分化,还影响肌腱细胞外基质的形成。人羊膜间充质干细胞具有多向分化潜能,在体外不同诱导条件下可分化为骨、软骨及其他结缔组织。目的:探讨Scleraxis慢病毒基因感染人羊膜间充质干细胞能否向肌腱细胞定向分化并观察其分化效果。方法:取足月产胎盘羊膜组织,两步酶消化法分离人羊膜间充质干细胞并采用倒置相差显微镜观察和流式细胞鉴定。取第3代细胞分3组进行培养,单纯人羊膜间充质干细胞培养组为空白组,人羊膜间充质干细胞经Slclerxis基因慢病毒感染后为过表达组,人羊膜间充质干细胞经不携带Scleraxis基因慢病毒感染后为空质粒组。细胞培养7d内CCK-8法检测各组细胞增殖能力细胞。细胞培养后3d和7d,分别进行实时荧光定量PCR和WesternBlot检测评价各组细胞向肌腱细胞定向分化的效果。结果与结论:①CCK-8检测显示:培养7d内,过表达组、空质粒组与空白组细胞在增殖能力上无明显差异(P>0.05);②Westenblot检测显示:过表达组Scleraxis蛋白表达水平明显高于空质粒组和空白组(P<0.05);③实时荧光定量PCR显示:3d时,过表达组Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、纤连蛋白及肌腱蛋白CmRNA表达水平明显高于空质粒组(P<0.05),而腱调蛋白的表达与空质粒组无明显差异(P>0.05);7d时,Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、纤连蛋白、肌腱蛋白C及腱调蛋白的表达水平明显高于空质粒组(P<0.05);④结果提示:人羊膜间充质干细胞经Scleraxis慢病毒基因感染后可向肌腱细胞定向分化。 展开更多
关键词 干细胞 分化 人羊膜间充质干细胞 SCLERAXIS 病毒感染 体外诱导 肌腱细胞 定向分化 病毒转染
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