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铜绿假单胞菌RhlR抗血清制备
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作者 訾静 王军 +3 位作者 高磊 张琨 张绪 万一 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2019年第1期72-75,共4页
目的在原核系统中表达铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PA)PAO1的调控蛋白RhlR,制备兔抗RhlR抗血清。方法构建重组表达载体pGEX-4T-1-rhlR和pET-22b-rhlR并转化至大肠埃希菌BL21感受态细胞中,IPTG诱导表达GST-RhlR和His-RhlR蛋白,... 目的在原核系统中表达铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PA)PAO1的调控蛋白RhlR,制备兔抗RhlR抗血清。方法构建重组表达载体pGEX-4T-1-rhlR和pET-22b-rhlR并转化至大肠埃希菌BL21感受态细胞中,IPTG诱导表达GST-RhlR和His-RhlR蛋白,经GST或Ni2+亲和层析纯化重组蛋白。将His-RhlR蛋白免疫新西兰大白兔,制备RhlR抗血清,GST-RhlR蛋白包被ELISA板,检测效价。结果构建的表达载体pGEX-4T-1-rhlR和pET-22b-rhlR经双酶切及测序鉴定证明构建正确;构建的工程菌表达的目的蛋白His-RhlR和GST-RhlR相对分子质量分别为29 000和54 000,表达量均约占菌体总蛋白的85%,纯度大于90%。制备的RhlR抗血清效价可达1∶80 000。结论获得高效价的RhlR抗血清,为PA中rhl调控系统的研究奠定基础。 展开更多
关键词 铜绿假单胞菌 原核表达 RhlR 抗血清
甘蔗花叶病毒辅助成分-蛋白酶基因原核表达及抗血清制备 预览
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作者 许小洁 于伟鹏 +4 位作者 杨广玲 韩士玲 何梦君 杨旭 李向东 《山东农业科学》 2019年第3期87-91,共5页
利用RT-PCR克隆甘蔗花叶病毒(Sugarcane mosaic virus, SCMV) DWK1分离物辅助成分-蛋白酶(helper component-proteinase,HC-Pro)基因,酶切后连接原核表达载体pEHISTEV,得到重组质粒pEHISTEV-SCMV-HC-Pro。将重组质粒转化大肠杆菌菌株Ros... 利用RT-PCR克隆甘蔗花叶病毒(Sugarcane mosaic virus, SCMV) DWK1分离物辅助成分-蛋白酶(helper component-proteinase,HC-Pro)基因,酶切后连接原核表达载体pEHISTEV,得到重组质粒pEHISTEV-SCMV-HC-Pro。将重组质粒转化大肠杆菌菌株Rosetta,经IPTG诱导后,表达出57 kD的融合蛋白。切胶回收融合蛋白,多点注射法免疫新西兰长耳兔,制备SCMV HC-Pro抗血清。间接ELISA结果表明,该血清效价为1∶8 192。感染DWK1的玉米叶片病汁液稀释128倍时,该血清仍然能够有效检测出HC-Pro。Western-blot检测结果表明,该血清可特异性检测SCMV第Ⅰ组分离物DWK1和第Ⅳ组分离物DWK2,与同属的烟草脉带花叶病毒(TVBMV)和马铃薯Y病毒(PVY)均无反应。本研究为准确、快速检测SCMV HC-Pro并进一步研究其功能和作用机制奠定了基础。 展开更多
关键词 甘蔗花叶病毒 辅助成分-蛋白酶 原核表达 抗血清 检测
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hAPOB的克隆、原核表达及抗体效价分析 预览
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作者 徐志伟 王期 +3 位作者 徐一然 陈永霞 徐小波 于建宁 《西南农业学报》 CSCD 北大核心 2019年第2期446-450,共5页
【目的】人载脂蛋白B(hAPOB)是保持人体血脂恒定的重要蛋白,检测hAPOB具有重要的临床价值。【方法】本研究将hAPOB(97-526AA)序列连接到原核表达载体pGEX-4T-1中,构建pGEX-4T-1-hAPOB(97-526AA)原核表达质粒,然后将其转入宿主菌BL21,宿... 【目的】人载脂蛋白B(hAPOB)是保持人体血脂恒定的重要蛋白,检测hAPOB具有重要的临床价值。【方法】本研究将hAPOB(97-526AA)序列连接到原核表达载体pGEX-4T-1中,构建pGEX-4T-1-hAPOB(97-526AA)原核表达质粒,然后将其转入宿主菌BL21,宿主菌表达出与预期分子量大小相符的80 kDa的融合蛋白;将纯化后的融合蛋白免疫湖羊,制备抗hAPOB血清并检测抗体效价。【结果】每次注射0.4 mg的原核表达抗原,湖羊抗血清的产生效果最佳;经间接酶联免疫分析(ID-ELISA)方法检测,原核表达蛋白免疫湖羊得到的hAPOB抗体效价为l︰40000。【结论】本试验获的抗血清能够满足商用标准,为后续拓展其应用奠定了基础。 展开更多
关键词 hAPOB PGEX-4T-1 抗血清 体效价 湖羊
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柯萨奇病毒A组6型衣壳蛋白VP1的原核表达及其抗血清的制备
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作者 刘宜 赵志磊 +2 位作者 孙世洋 姜春来 刘照惠 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2019年第2期160-164,共5页
目的原核表达柯萨奇病毒A组6型(Coxsackie virus group A 6 strain,CVA6)衣壳蛋白VP1,并制备其抗血清。方法合成经密码子优化的CVA6-VP1全长基因,克隆至原核表达载体pET-28a中,构建重组质粒pET-28a-VP1,转化感受态E. coli BL21(DE3),经I... 目的原核表达柯萨奇病毒A组6型(Coxsackie virus group A 6 strain,CVA6)衣壳蛋白VP1,并制备其抗血清。方法合成经密码子优化的CVA6-VP1全长基因,克隆至原核表达载体pET-28a中,构建重组质粒pET-28a-VP1,转化感受态E. coli BL21(DE3),经IPTG诱导表达目的蛋白,同时优化IPTG终浓度(0. 1、0. 2、0. 3、0. 5 mmol/L)、诱导温度(15、20、25、30℃)及诱导时间(6、8、12、16 h)。表达产物采用Ni-NTA柱亲和层析纯化,将纯化重组蛋白免疫新西兰兔,制备VP1抗血清,微量细胞病变法检测血清抗体效价。结果重组质粒p ET-28a-VP1经双酶切及测序鉴定,构建正确。重组蛋白最适诱导条件为:IPTG终浓度为0. 3 mmol/L,诱导温度为15℃,诱导时间为12 h。重组蛋白相对分子质量约34 000,于上清和包涵体中均有表达,纯化后纯度可达95%以上。兔血清效价均> 1∶8,呈阳性。结论成功于原核表达系统中高效表达了可溶性CVA6-VP1蛋白,且获得效价较高的抗血清。 展开更多
关键词 柯萨奇病毒A组6型 衣壳蛋白VP1 基因重组 原核表达 抗血清
甘蔗花叶病毒衣壳蛋白的原核表达及抗血清制备 预览
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作者 许小洁 张继武 +3 位作者 徐德坤 殷复伟 田延平 李向东 《山东农业科学》 2018年第8期106-109,共4页
将甘蔗花叶病毒(Sugarcane mosaic virus,SCMV)第Ⅰ组分离物DWK1和第Ⅳ组分离物DWK2的衣壳蛋白(coat protein,CP)基因分别克隆到原核表达载体pEHISTEV,得到重组质粒pEHISTEV-SCMV-Ⅰ-CP和pEHISTEV-SCMV-Ⅳ-CP。将两个重组质粒转化... 将甘蔗花叶病毒(Sugarcane mosaic virus,SCMV)第Ⅰ组分离物DWK1和第Ⅳ组分离物DWK2的衣壳蛋白(coat protein,CP)基因分别克隆到原核表达载体pEHISTEV,得到重组质粒pEHISTEV-SCMV-Ⅰ-CP和pEHISTEV-SCMV-Ⅳ-CP。将两个重组质粒转化大肠杆菌Rosetta,经IPTG诱导,均表达出分子量为38 kD的融合蛋白。切胶回收融合蛋白,免疫新西兰长耳兔5次,获得了SCMV-ⅠCP和SCMV-ⅣCP的多克隆抗体。间接ELISA结果表明,两种血清的效价均达到1∶8192。Western Blot结果表明,利用SCMV-ⅠCP制备的抗血清与DWK1反应更强,而利用SCMV-ⅣCP制备的抗血清与DWK2反应更强。本研究为SCMV检测及CP功能研究奠定了基础。 展开更多
关键词 甘蔗花叶病毒 衣壳蛋白 原核表达 抗血清 检测
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小麦蓝矮植原体SWP1效应蛋白的抗血清制备及检测应用
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作者 羊海珍 王楠 +2 位作者 吴薇 张子昂 吴云锋 《植物病理学报》 CSCD 北大核心 2018年第3期373-377,共5页
小麦蓝矮病是西北冬麦区一种重要的植原体病害,造成严重的产量损失。为进一步探究小麦蓝矮植原体的致病机理,通过原核表达获得其致病因子SWP1的重组蛋白并制备抗血清。将PCR扩增到的SWP1基因片段插入到原核表达载体pET-30a(+)上,导入... 小麦蓝矮病是西北冬麦区一种重要的植原体病害,造成严重的产量损失。为进一步探究小麦蓝矮植原体的致病机理,通过原核表达获得其致病因子SWP1的重组蛋白并制备抗血清。将PCR扩增到的SWP1基因片段插入到原核表达载体pET-30a(+)上,导入E.coli BL21(DE3)中,表达出约12 kDa含His标签的融合蛋白。用纯化的融合蛋白注射大白兔皮层,获得了特异性较强的SWP1抗血清,其效价为1∶4 000,并成功应用于SWP1在本氏烟中的检测。制备的抗血清在SWP1蛋白结构、功能及其与寄主的互作研究中具有重要意义。 展开更多
关键词 小麦蓝矮病植原体 SWP1 原核表达 抗血清
盐穗木HcDMC1的原核表达和抗血清的制备 预览
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作者 张冀 张丽丽 +1 位作者 张贝贝 张富春 《植物研究》 CSCD 北大核心 2018年第3期399-405,共7页
DMC1是减数分裂过程中同源染色体配对和重组修复所必需的减数分裂特异蛋白.根据盐胁迫下盐穗木转录组数据库,克隆获得的盐穗木DNA损伤修复基因命名为HcDMC1.为深入分析盐穗木HcDMC1基因的耐盐功能,通过原核表达获得盐穗木HcDMC1的融合蛋... DMC1是减数分裂过程中同源染色体配对和重组修复所必需的减数分裂特异蛋白.根据盐胁迫下盐穗木转录组数据库,克隆获得的盐穗木DNA损伤修复基因命名为HcDMC1.为深入分析盐穗木HcDMC1基因的耐盐功能,通过原核表达获得盐穗木HcDMC1的融合蛋白,用于免疫小鼠制备特异性的HcDMC1抗血清.结果表明,利用pET30a-HcDMC1能够在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达融合蛋白His-HcDMC1,纯化融合蛋白His-HcD-MC1的含量为1.0 mg·mL-1.每次每只小鼠免疫接种50 μg融合蛋白,三次免疫接种后进行抗体效价及特异性检测.ELISA检测抗血清滴度约为1∶400000,Western Blot检测证明了抗血清的特异性.本研究制备的小鼠抗血清能够为盐穗木HcDMC1蛋白的功能鉴定和免疫检测提供实验材料. 展开更多
关键词 盐穗木 HcDMC1 原核表达 融合蛋白 抗血清
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草鱼呼肠孤病毒VP56蛋白抗血清中和效果的检测
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作者 宋华丽 孙效迎 +1 位作者 郭正伟 裴超 《河南水产》 2018年第6期12-14,33共4页
草鱼呼肠孤病毒(grass carp reovirus,GCRV)隶属于呼肠孤病毒科,水生呼肠孤病毒属,该病毒主要引起草鱼在鱼种阶段发生出血病。GCRV基因组由11个分节段的双链RNA片段组成,VP56是由草鱼呼肠孤病毒GCRV-HN14株S7节段编码的蛋白。本实验对... 草鱼呼肠孤病毒(grass carp reovirus,GCRV)隶属于呼肠孤病毒科,水生呼肠孤病毒属,该病毒主要引起草鱼在鱼种阶段发生出血病。GCRV基因组由11个分节段的双链RNA片段组成,VP56是由草鱼呼肠孤病毒GCRV-HN14株S7节段编码的蛋白。本实验对草鱼呼肠孤病毒梯度稀释后,注射草鱼,按照Reed-Muench法测定该病毒的LD50,并检测了抗VP56抗血清对草鱼呼肠孤病毒的中和能力。实验结果显示,该病毒悬液作10^-3.3稀释后,每尾草鱼注射0.1mL,可以使50%的草鱼死亡。当用抗VP56抗血清和病毒混合液处理草鱼时,草鱼死亡延迟,死亡率下降,并且有10%存活率,这表明它可能对预防和控制草鱼呼肠孤病毒具有一定作用。 展开更多
关键词 草鱼呼肠孤病毒 VP56蛋白 抗血清 中和试验
双峰驼血清IgG纯化及其抗血清制备 预览
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作者 贾存瑜 韩熙梦 +5 位作者 聂佳琪 张欣 焦韵洁 刘宝元 周恩民 穆杨 《西北农业学报》 CSCD 北大核心 2018年第11期1584-1590,共7页
纯化双峰驼血清IgG并制备兔抗骆驼IgG抗血清,为制备针对特定蛋白的特异性纳米抗体储备材料,利用ProteinG纯化双峰驼血清IgG,并用纯化的IgG免疫成年家兔后采用ELISA方法检测抗血清效价;采用间接ELISA方法,利用制备的抗血清检测PCV2Cap蛋... 纯化双峰驼血清IgG并制备兔抗骆驼IgG抗血清,为制备针对特定蛋白的特异性纳米抗体储备材料,利用ProteinG纯化双峰驼血清IgG,并用纯化的IgG免疫成年家兔后采用ELISA方法检测抗血清效价;采用间接ELISA方法,利用制备的抗血清检测PCV2Cap蛋白免疫双峰驼血清中抗Cap蛋白的抗体水平,Westernblot技术检测制备的抗血清与从噬菌体纳米抗体库中筛选到的针对不同蛋白的纳米抗体的反应性,以确定抗血清的适用性。结果显示,从双峰驼血清中纯化到骆驼IgG,SDS-PAGE分析显示纯化的骆驼IgG包括3条链,约50ku的传统重链IgG1,约43ku缺失CH1的重链IgG3和约30ku的传统轻链;3次免疫后兔抗骆驼IgG抗血清效价达1∶512000;应用制备的抗血清检测PCV2Cap蛋白免疫5次的双峰驼血清中抗Cap蛋白的抗体效价达1∶1024000;制备的抗血清可以与原核表达的针对不同病毒蛋白的纳米抗体反应;说明制备的兔抗骆驼IgG抗血清可用于免疫骆驼血清和表达的纳米抗体的检测。研究结果为目标蛋白免疫骆驼后抗体效价检测及纳米抗体文库构建提供关键材料。 展开更多
关键词 骆驼 亲和层析 IGG 抗血清 纳米
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中华鲟Vtg间接竞争ELISA检测方法的建立和应用 预览
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作者 冷小茜 叶欢 +2 位作者 杜浩 李创举 危起伟 《水生生物学报》 CSCD 北大核心 2018年第4期779-785,共7页
卵黄蛋白原(Vitellogenin,Vtg)被认为是一种理想的雌激素和类雌激素标志物,通过建立一种中华鲟Acipenser sinensis血浆Vtg水平的检测方法,进而开发一项中华鲟性腺成熟度的诊断技术。首先通过RACEPCR方法扩增得到中华鲟vtg基因cDNA序列,... 卵黄蛋白原(Vitellogenin,Vtg)被认为是一种理想的雌激素和类雌激素标志物,通过建立一种中华鲟Acipenser sinensis血浆Vtg水平的检测方法,进而开发一项中华鲟性腺成熟度的诊断技术。首先通过RACEPCR方法扩增得到中华鲟vtg基因cDNA序列,氨基酸序列分析预测其蛋白分子量大小为196 kD。构建Vtg功能区段融合原核表达载体pET32a(+)-vtg并表达纯化重组蛋白,并以重组蛋白免疫兔子获得多克隆抗血清,Western blotting检测显示抗血清的特异性较好。以纯化的中华鲟重组Vtg蛋白为抗原,中华鲟Vtg多克隆抗血清为抗体,建立了中华鲟血浆Vtg的间接竞争酶联免疫检测方法(ELISA),标准曲线线性回归方程为y=–0.2916x+0.6794,相关系数R2为0.9976。该方法检测的灵敏度为4.12μg/mL,最低检测限为0.3μg/mL,批内和批间变异系数分别为2.52%和3.42%。通过对不同发育时期雌性中华鲟血样检测,表明此ELISA方法可初步用于雌性中华鲟性腺发育时期监测。 展开更多
关键词 中华鲟 卵黄蛋白原 ELISA 抗血清
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人乳头瘤病毒16型E7蛋白的表达、纯化及抗血清制备
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作者 颜学勤 王莹莹 +5 位作者 嵩钰佳 王鑫 陈思佳 魏兰兰 钟照华 商庆龙 《国际免疫学杂志》 CAS 2018年第5期514-518,共5页
目的建立人乳头瘤病毒(human papillomavims,HPV)16型E7蛋白的原核表达系统,表达HPv16E7蛋白,制备小鼠抗HPV16E7血清。方法采用PCR方法扩增HPV16E7基因,构建人pET21b质粒,重组表达载体经鉴定后转化大肠埃希菌BL21(DE3)。诱导表达后经十... 目的建立人乳头瘤病毒(human papillomavims,HPV)16型E7蛋白的原核表达系统,表达HPv16E7蛋白,制备小鼠抗HPV16E7血清。方法采用PCR方法扩增HPV16E7基因,构建人pET21b质粒,重组表达载体经鉴定后转化大肠埃希菌BL21(DE3)。诱导表达后经十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulphate,SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE)和westemblot鉴定表达产物。提取包涵体进行变性复性处理后纯化,纯化后的可溶性蛋白免疫Balb/C小鼠,检测小鼠体内γ-干扰素(interferon-γ,IFN-γ)水平、CD4/CD8比值和抗血清滴度变化。结果PcR扩增片段为0.3Kb,酶切和序列测定证实重组质粒构建正确。SDS—PAGE在11KD处出现蛋白条带。蛋白表达以包涵体为主。免疫后小鼠抗体效价升高,CD4/CD8比值无升高,IFN-γ无反应。结论成功制备可溶性HPV16E7蛋白和小鼠抗HPvl6E7高效价抗血清。 展开更多
关键词 人乳头瘤病毒16型 E7蛋白 抗血清
甘薯褪绿矮化病毒RNase3蛋白的原核表达及抗血清制备 预览
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作者 秦艳红 乔奇 +4 位作者 王爽 张德胜 王永江 田雨婷 张振臣 《植物保护》 CSCD 北大核心 2018年第3期138-141,共4页
以本实验室保存的重组质粒为模板,利用PCR方法扩增获得了甘薯褪绿矮化病毒SPCSV的RNase3基因,RNase3基因由690个核苷酸组成,编码229个氨基酸。将RNase3基因克隆到原核表达载体pET-28a(+),转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导,对诱导... 以本实验室保存的重组质粒为模板,利用PCR方法扩增获得了甘薯褪绿矮化病毒SPCSV的RNase3基因,RNase3基因由690个核苷酸组成,编码229个氨基酸。将RNase3基因克隆到原核表达载体pET-28a(+),转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导,对诱导产物进行SDS-PAGE分析。结果表明,RNase3在大肠杆菌中能高效表达,融合蛋白分子量约为26.5kD。以表达的融合蛋白为抗原,免疫家兔,制备了SPCSV-RNase3的特异性抗血清。ACP-ELISA检测结果表明,制备的抗血清对RNase3融合蛋白的效价达10万倍。 展开更多
关键词 甘薯褪绿矮化病毒 RNase3基因 原核表达 抗血清
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人源程序性死亡配体PD-L2蛋白的原核表达与抗血清制备
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作者 杨娟娟 刘照 +3 位作者 夏菁潞 罗岭 俞博彤 孟春 《福州大学学报:自然科学版》 北大核心 2018年第3期438-444,共7页
利用原核表达系统获得包涵体表达形式的重组蛋白h PD-L220~123(Ig V结构域)和h PD-L220~208(Ig V结构域和Ig C结构域);将重组蛋白利用Ni-NTA柱亲和层析纯化与复性后,作为免疫原免疫Balb/c雌性小鼠制备鼠抗人的多抗血清,经ELISA法检... 利用原核表达系统获得包涵体表达形式的重组蛋白h PD-L220~123(Ig V结构域)和h PD-L220~208(Ig V结构域和Ig C结构域);将重组蛋白利用Ni-NTA柱亲和层析纯化与复性后,作为免疫原免疫Balb/c雌性小鼠制备鼠抗人的多抗血清,经ELISA法检测其效价均达到1∶106;Western-blot实验结果表明,制备的多抗血清均能特异性识别h PD-L2蛋白.以制备的多抗血清进行IHC实验评估与鉴定,结果显示:以h PD-L220~123重组蛋白为免疫原制备的多抗血清阳性较弱且定位模糊,以h PD-L220~208重组蛋白为免疫原制备的多抗血清具有很强的膜定位且背景清晰. 展开更多
关键词 人源PD-L2蛋白 主要原表位区 原核表达 抗血清
中国水仙NtPLATZ1抗血清的制备及效价分析 预览
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作者 王伟英 邹晖 +2 位作者 李海明 戴艺民 林江波 《东南园艺》 2018年第2期20-23,共4页
将本试验前期成功表达的中国水仙锌指蛋白Nt PLATZ1基因融合蛋白免疫大白兔,收集抗血清,制备多克隆抗体。用酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测其效价,通过免疫印迹检测(western-blot)分析该血清的特异性。ELISA检测得出多克隆抗体的效... 将本试验前期成功表达的中国水仙锌指蛋白Nt PLATZ1基因融合蛋白免疫大白兔,收集抗血清,制备多克隆抗体。用酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测其效价,通过免疫印迹检测(western-blot)分析该血清的特异性。ELISA检测得出多克隆抗体的效价为l∶6 400,Western blotting结果表明,制备的抗血清能与诱导表达的融合蛋白发生特异性反应。免疫大白兔获得的血清特异性强,效价高,可用于Nt PLATZ1蛋白功能的研究。 展开更多
关键词 中国水仙 NtPLATZ1 抗血清 WESTERN-BLOT
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西瓜花叶病毒抗血清制备及其应用
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作者 冀树娴 王姝雯 +3 位作者 王健 李向东 朱天生 田延平 《植物病理学报》 CSCD 北大核心 2018年第6期833-837,共5页
西瓜花叶病毒(Watermelon mosaic virus,WMV)是危害葫芦科作物的重要病毒。制备特异性强、效价高的抗血清对快速准确检测和鉴定WMV具有重要意义。本研究将WMV外壳蛋白(Coatprotein,CP)基因克隆到原核表达载体pE-HISTEV获得pEHISTEV-WMV... 西瓜花叶病毒(Watermelon mosaic virus,WMV)是危害葫芦科作物的重要病毒。制备特异性强、效价高的抗血清对快速准确检测和鉴定WMV具有重要意义。本研究将WMV外壳蛋白(Coatprotein,CP)基因克隆到原核表达载体pE-HISTEV获得pEHISTEV-WMV-CP。将pEHISTEV-WMV-CP转化大肠杆菌Rosetta,经IPTG诱导,成功表达出分子量约为36kDa的蛋白,与预期WMVCP大小一致。切胶回收WMVCP,与等体积弗氏不完全佐剂充分乳化后免疫健康新西兰大白兔。Westernblotting结果表明,制备的抗血清与WMVCP有反应,与同属的番木瓜环斑病毒(Papaya ringspot virus,PRSV)、马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)、小西葫芦黄花叶病毒(Zucchini yellow mosaic virus,ZYMV)和烟草花叶病毒属的黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumber green mottle mosaicvirus,CGMMV)均无反应。酶联免疫吸附测定(PTA-ELISA)结果表明,本研究制备的WMV抗血清效价为1:8192,并且能够检测稀释512倍的病毒汁液。利用该抗血清对田间采集的10个RT-PCR检测为阳性的样品进行检测,全部呈现阳性。本研究利用大肠杆菌表达的CP制备的WMV抗血清具有较高的特异性和灵敏度。研究结果为WMV的快速检测和鉴定奠定了基础。 展开更多
关键词 抗血清 外壳蛋白 原核表达 西瓜花叶病毒
牛冠状病毒S蛋白抗原表位基因的串联表达及抗血清制备 预览
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作者 程凯慧 沈付娆 +6 位作者 邹积振 朱彤 苗自利 张亮 解晓莉 杨宏军 何洪彬 《中国兽医杂志》 北大核心 2018年第10期59-61,66共4页
为了构建牛冠状病毒(BCoV)抗原表位基因原核表达载体,并制备多克隆抗体,利用基因合成技术获得BCoV S蛋白两段抗原表位(351 aa~403 aa、771 aa~784 aa)的基因串联体R,将其重组到pET-28a(+)质粒中,转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,诱... 为了构建牛冠状病毒(BCoV)抗原表位基因原核表达载体,并制备多克隆抗体,利用基因合成技术获得BCoV S蛋白两段抗原表位(351 aa~403 aa、771 aa~784 aa)的基因串联体R,将其重组到pET-28a(+)质粒中,转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,诱导表达抗原表位融合蛋白,用纯化的蛋白免疫新西兰兔制备多克隆抗体。结果显示,成功构建了BCoV抗原表位基因重组表达质粒,获得了融合蛋白的抗血清,Western-Blot检测显示,该抗血清可与BCoV的融合蛋白特异性结合。表明成功构建了BCoV抗原表位基因原核表达载体并获得了BCoV抗血清,本研究为BCoV诊断试剂盒的开发和BCoV多表位疫苗的研究奠定了基础。 展开更多
关键词 牛冠状病毒 原表位 串联表达 抗血清
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辣椒轻斑驳病毒印基因的原核表达及抗血清制备
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作者 洪鲲 郑兴华 +3 位作者 李欲轲 龚记熠 乙引 万睛姣 《植物病理学报》 CSCD 北大核心 2017年第5期598-604,共7页
辣椒轻斑驳病毒(Pepper mild mottle virus, PMMoV)属于烟草花叶病毒属,是辣椒的重要病毒种类之一。将PMMoV的外壳蛋白(cp)基因克隆至原核表达载体pET32a(+)中,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导,重组PMMoV CP蛋白以可溶形式表... 辣椒轻斑驳病毒(Pepper mild mottle virus, PMMoV)属于烟草花叶病毒属,是辣椒的重要病毒种类之一。将PMMoV的外壳蛋白(cp)基因克隆至原核表达载体pET32a(+)中,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导,重组PMMoV CP蛋白以可溶形式表达,纯化后获得分子量约35 kDa的融合CP蛋白。以该重组蛋白为抗原免疫新西兰兔制备了PMMoV CP特异性抗血清。Western blot检测结果表明该抗血清与重组CP蛋白发生强烈的免疫反应,间接酶联免疫吸附测定(ID-ELISA)结果显示该抗血清针对重组CP蛋白的效价达1∶25 600,针对PMMoV病汁液的效价达1∶4 000,检测灵敏度为1∶3 200,且该抗血清不与PMMoV同属或不同属的其它6种病毒汁液发生免疫反应,具有较好的特异性。利用该抗血清对42份田间辣椒病样进行检测,阳性率达38%,与进口商品化试剂盒检测结果一致,说明该抗血清可用于PMMoV的ELISA诊断。 展开更多
关键词 辣椒轻斑驳病毒 外壳蛋白 原核表达 抗血清
己烯雌酚人工抗原的合成及抗血清的制备 预览
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作者 杨兴东 胡骁飞 +1 位作者 王方雨 曾宪垠 《江苏农业科学》 北大核心 2017年第8期149-152,共4页
由己烯雌酚(diethylstilbestrol,DES)经过一系列化学反应,合成含有1个羟基活性基团的半抗原己烯雌酚-单羧基丙基醚(DES-MCPE);应用活泼酯法,使DES-MCPE与牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)偶联,合成人工免疫抗原DES-BSA和... 由己烯雌酚(diethylstilbestrol,DES)经过一系列化学反应,合成含有1个羟基活性基团的半抗原己烯雌酚-单羧基丙基醚(DES-MCPE);应用活泼酯法,使DES-MCPE与牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)偶联,合成人工免疫抗原DES-BSA和包被抗原DES-OVA,采用紫外分光光度法(UV)和聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行鉴定,初步判定偶联成功。用DES-BSA以60 μg/只的剂量免疫3只BALB/c小鼠,4次免疫后,采集血清,使用间接ELISA和间接竞争ELISA分别测定抗血清的效价与抑制,3只小鼠的效价均可达到1×104以上,其中2号小鼠的半抑制率(IC50)为18.221 μg/L,表明已获得灵敏、特异、高效价的抗血清。 展开更多
关键词 己烯雌酚 完全 人工合成 抗血清 ELISA 高效价 灵敏
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α-CD-PAMAM抗血清阳离子聚合物的构建及其作为基因载体的性能评价 被引量:1
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作者 秦凌浩 曹端文 +1 位作者 潘仕荣 陈建海 《药学学报》 CAS CSCD 北大核心 2017年第1期139-145,共7页
本文合成了一种α-环糊精(α-cyclodextrin,α-CD)与聚酰胺-胺(polyamidoamine,PAMAM)的接枝聚合物(Cy D-G1)。1H核磁测试结果表明,每个环糊精分子上平均接枝了6.4个PAMAM-G1分子。凝胶电泳结果显示,Cy D-G1可以有效结合DNA,并保... 本文合成了一种α-环糊精(α-cyclodextrin,α-CD)与聚酰胺-胺(polyamidoamine,PAMAM)的接枝聚合物(Cy D-G1)。1H核磁测试结果表明,每个环糊精分子上平均接枝了6.4个PAMAM-G1分子。凝胶电泳结果显示,Cy D-G1可以有效结合DNA,并保护DNA免于核酸酶DNase I的降解。当载体与DNA复合物的N/P比为40时,可以压缩DNA形成平均粒径为120 nm左右的粒子,复合物表面的zeta电位约为+21 m V。该复合物可以在血清存在的条件下保持粒子的完整性并在360 min内稳定性良好。与对照品PEI-25K载体相比,Cy D-G1在高浓度时仍表现出较低的细胞毒性。将Cy D-G1与市售Lipofectamine 2000和PEI-25K对比转染发现,Cy D-G1/DNA复合物在多种细胞系中具有较高的转染率,而且转染水平不受血清影响。通过激光共聚焦观察并结合流式细胞分析表明,该阳离子聚合物介导DNA可以在4 h内有效进入细胞核内。上述结果证明,该阳离子聚合物作为一种非病毒型基因传递系统具有优良的性能以及体内给药应用的潜在可行性。 展开更多
关键词 环糊精 聚酰胺-胺 抗血清 基因载体
铜绿假单胞菌LasR蛋白的表达及抗血清制备 预览
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作者 訾静 王军 +3 位作者 高磊 张琨 张绪 万一 《微生物学免疫学进展》 2017年第5期11-15,共5页
目的将铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PA)中的调控蛋白LasR在原核系统中进行表达,制备LasR抗血清,为PA中las调控系统的研究奠定基础。方法以PA模式菌株PAO1全基因组为模板,PCR扩增lasR基因,PCR产物用Bam HI/EcoRI双酶切连接至p... 目的将铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PA)中的调控蛋白LasR在原核系统中进行表达,制备LasR抗血清,为PA中las调控系统的研究奠定基础。方法以PA模式菌株PAO1全基因组为模板,PCR扩增lasR基因,PCR产物用Bam HI/EcoRI双酶切连接至p GEX-4T-1载体,获得重组表达载体p GEX-4T-1-lasR;PCR产物经Nco I/Xho I双酶切连接至p ET28a载体,获得重组表达载体p ET28a-lasR。将重组表达载体分别转化至大肠杆菌感受态细胞BL21中,分别以异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactoside,IPTG)诱导表达GST-LasR和His-LasR蛋白,通过GST或Ni^2+亲和层析纯化重组蛋白。将纯化后的His-LasR蛋白免疫新西兰大白兔,制备LasR抗血清;纯化后的GST-LasR蛋白用于LasR抗血清ELISA效价的检测。结果 lasR基因序列大小为717 bp;成功构建p GEX-4T-1-lasR和p ET28a-lasR表达载体。构建的工程菌能够有效表达目的蛋白His-LasR和GST-LasR,蛋白纯度大于95%;LasR抗血清的效价为1∶60 000。结论在原核系统中成功表达了可溶性LasR重组蛋白,并获得高效价的LasR抗血清,为PA中las调控系统的研究奠定了基础。 展开更多
关键词 铜绿假单胞菌 LasR 原核表达 抗血清
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