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二重环介导等温扩增法快速检测乳粉中沙门氏菌和金黄色葡萄球菌 认领
1
作者 徐文文 梁玉林 +6 位作者 王云霞 刘秀 尹建军 周广军 宋全厚 丁梦璇 周鹏飞 《食品与发酵工业》 CAS 北大核心 2021年第2期241-246,共6页
为建立能够同时检测乳粉中沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的二重环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)方法。针对沙门氏菌invA基因、金黄色葡萄球菌nuc基因保守区域设计LAMP引物,优化引物浓度,并通过熔解曲线分析判... 为建立能够同时检测乳粉中沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的二重环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)方法。针对沙门氏菌invA基因、金黄色葡萄球菌nuc基因保守区域设计LAMP引物,优化引物浓度,并通过熔解曲线分析判断扩增靶标来源,建立同时检测沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的二重LAMP检测方法。结果表明,当沙门氏菌与金黄色葡萄球菌引物浓度比为3∶1时,建立的二重检测体系扩增效率最佳;该方法特异性强、灵敏度高,对6株目标菌株和9株非目标菌株进行检测,未产生任何假阳性和假阴性结果,对2种食源性致病菌的检测灵敏度均达到102 fg/μL;根据熔解曲线中的退火温度可准确判断目标菌株,实现不同菌株的有效区分。建立的二重LAMP方法可用于乳制品企业大规模乳粉样品中沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的现场快速筛查。 展开更多
关键词 等温扩增 沙门氏菌 金黄色葡萄球菌 熔解曲线 快速检测
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多重荧光PCR-熔解曲线法同时检测常见病原真菌方法学的建立及诊断价值 认领
2
作者 朱芳 朱以军 +2 位作者 胡益飞 倪红英 单小云 《中华危重症医学杂志:电子版》 CAS CSCD 2020年第4期270-276,共7页
目的建立多重荧光PCR-熔解曲线法,并评价其同时检测假丝酵母菌、曲霉菌及新型隐球菌的诊断价值。方法建立多重荧光PCR-熔解曲线法并对其检测体系进行优化。收集临床高度怀疑为侵袭性真菌感染(IFI)的各类临床样本179例,其中血液65例、深... 目的建立多重荧光PCR-熔解曲线法,并评价其同时检测假丝酵母菌、曲霉菌及新型隐球菌的诊断价值。方法建立多重荧光PCR-熔解曲线法并对其检测体系进行优化。收集临床高度怀疑为侵袭性真菌感染(IFI)的各类临床样本179例,其中血液65例、深部痰液35例、尿液30例、脑脊液18例、胸腹水12例、肺泡灌洗液10例、新鲜肺组织9例。通过敏感性、特异性、重复性实验验证多重荧光PCR-熔解曲线法的检测性能,并应用受试者工作特征(ROC)曲线评价该方法的诊断效能。结果建立的多重荧光PCR-熔解曲线法可同时检测8种常见病原真菌,包括4种假丝酵母菌(白假丝酵母菌、热带假丝酵母菌、光滑假丝酵母菌、克柔假丝酵母菌)、3种曲霉菌(烟曲霉、黄曲霉、黑曲霉)和新型隐球菌。其最低检测限为1×10^4 cfu/mL,且常见细菌无扩增反应,重复性实验解链温度波动小于0.5℃。179例临床样本中,以培养法、镜检法、病理诊断等“金标准”方法诊断IFI阳性为112例,多重荧光PCR-熔解曲线法检测阳性为96例。多重荧光PCR-熔解曲线法同时检测假丝酵母菌、曲霉菌及新型隐球菌的敏感度为0.857,特异度为0.970,阳性预测值为0.980,阴性预测值为0.802,ROC曲线下面积为0.914,95%置信区间为0.868~0.959,P<0.001。结论本研究建立的多重荧光PCR-熔解曲线法可快速、准确、高通量同时检测假丝酵母菌、曲霉菌及新型隐球菌,对于IFI的早期诊断具有重要意义。 展开更多
关键词 真菌 多重荧光PCR 熔解曲线
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遗传性耳聋基因突变在诊断苏南地区耳聋家系中的研究 认领
3
作者 刘英华 时敬业 +5 位作者 宋小艳 刘敏娟 向菁菁 唐慧 于正 毛君 《中国优生与遗传杂志》 2020年第6期682-683,737,共3页
目的初步研究苏南地区遗传性耳聋的发生率及热点基因突变率,并探讨在苏南地区开展遗传性耳聋检测的重要性和必要性。方法收集11个耳聋家系的41例家系成员的临床资料,采用荧光PCR熔解曲线技术对常见耳聋基因的15个突变位点(GJB2:c.35delG... 目的初步研究苏南地区遗传性耳聋的发生率及热点基因突变率,并探讨在苏南地区开展遗传性耳聋检测的重要性和必要性。方法收集11个耳聋家系的41例家系成员的临床资料,采用荧光PCR熔解曲线技术对常见耳聋基因的15个突变位点(GJB2:c.35delG,c.176-191del16bp,c.235delC,c.299-300delAT,GJB3:c.538C>T,SLC26A4:IVS7-2A>G,c.1174 A>T,c.1226 G>A,c.1229 C>T,c.1707+5 G>A,c.1975 G>C,c.2027 T>A,c.2168 A>G和线粒体DNA 12S rRNA:1494 C>T,1555 A>G)进行检测。结果41例耳聋家系样本中,共检测出耳聋基因异常28例(68.29%),其中4例样本为GJB2基因的c.235delC纯合突变,10例样本为GJB2基因的c.235delC杂合突变,1例样本为GJB2基因的c.235delC和SLC26A4基因c.299-300delAT复合杂合突变,2例携带SLC26A4基因c.299-300delAT杂合突变,2例样本为SLC26A4基因的IVS7-2A>G纯合突变,5例携带SLC26A4基因IVS7-2A>G杂合突变,4例患儿为线粒体基因mt1555A>G同质性突变,其他家系成员均未见异常。结论耳聋相关基因检测对耳聋患者的诊断有重要的指导价值,可为患儿家庭提供再生育指导,从而有效的降低耳聋的发生。 展开更多
关键词 耳聋基因 熔解曲线 家系分析
基于InDel标记的斑节对虾早期性别鉴定方法的建立 认领
4
作者 黄智康 江世贵 +5 位作者 周发林 黄建华 杨其彬 姜松 李运东 杨丽诗 《南方水产科学》 CAS CSCD 北大核心 2020年第3期113-118,共6页
为分辨斑节对虾(Penaeus monodon)发育早期的性别,利用改良的插入/缺失(InDel)标记追踪了从受精卵、无节幼体、溞状幼体、糠虾幼体、仔虾后1 d(PL1)、仔虾后30 d(PL30)及亚成虾个体的性别,建立了测序和荧光定量PCR熔解曲线的检测方法。... 为分辨斑节对虾(Penaeus monodon)发育早期的性别,利用改良的插入/缺失(InDel)标记追踪了从受精卵、无节幼体、溞状幼体、糠虾幼体、仔虾后1 d(PL1)、仔虾后30 d(PL30)及亚成虾个体的性别,建立了测序和荧光定量PCR熔解曲线的检测方法。结果表明,InDel标记可扩增获得雌雄特异性序列,用测序法判定亚成虾性别的结果与外部观察结果一致,准确率达100%,对受精卵、无节幼体、溞状幼体及糠虾幼体均可得到雌雄特异性序列;进而建立了基于SYBR Green实时荧光定量PCR(Quantitative real-time polymerase chain reaction,q RT-PCR)熔解曲线的快速鉴定斑节对虾性别的方法,其中雄性特异序列的熔解温度(Melting temperature,Tm)为(79.10±0.10)℃,雌性为(78.45±0.20)℃,通过特异的熔解曲线可准确区分PL30、亚成虾和无节幼体Ⅵ期个体,准确率可达96.3%以上。 展开更多
关键词 斑节对虾 性别鉴定 INDEL标记 实时荧光定量PCR 熔解曲线 发育早期
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多重荧光PCR-熔解曲线法检测福尔马林固定石蜡包埋肺组织样本中病原真菌的价值 认领
5
作者 朱芳 朱以军 +2 位作者 翟晓利 胡益飞 倪红英 《国际流行病学传染病学杂志》 CAS 2020年第1期50-54,共5页
目的比较多重荧光PCR-熔解曲线法与病理诊断法检测福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)肺组织样本中病原真菌的价值。方法选择2014—2019年本院病理科病原真菌阳性患者的42份肺组织样本(念珠菌8份、曲霉菌23份、隐球菌11份)作为阳性组,病原真菌... 目的比较多重荧光PCR-熔解曲线法与病理诊断法检测福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)肺组织样本中病原真菌的价值。方法选择2014—2019年本院病理科病原真菌阳性患者的42份肺组织样本(念珠菌8份、曲霉菌23份、隐球菌11份)作为阳性组,病原真菌阴性的肺组织样本50份作为阴性组,均进行多重荧光PCR-熔解曲线法检测,并应用配对χ2检验和Kappa值对两种方法的检测结果进行比较。结果阳性组42份样本多重荧光PCR-熔解曲线法检出23份阳性,并可分辨至种水平,其中念珠菌4份(白色念珠菌2份、热带念珠菌1份、克柔念珠菌1份)、曲霉菌13份(烟曲霉11份、黄曲霉2份)、新型隐球菌6份。阴性组50份样本多重荧光PCR-熔解曲线法检测均阴性。Kappa值0.568,以病理诊断法为"金标准",多重荧光PCR-熔解曲线法检测病原真菌的灵敏度为54.8%(23/42)、特异性为100.0%(50/50)。结论多重荧光PCR-熔解曲线法检测FFPE样本中病原真菌的灵敏度不高,但可以将病原真菌鉴定至种,是病理诊断法的补充。 展开更多
关键词 真菌 荧光PCR 多重 熔解曲线 福尔马林固定石蜡包埋组织
多重PCR技术研究进展 认领 被引量：5
6
作者 钟泽澄 王进 张师音 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第2期171-179,共9页
多重PCR(Multiplex polymerase chain reaction,MPCR)是指通过一次PCR反应同时对多个靶标进行扩增,结合一定的检测手段对扩增产物进行检测从而实现对多个靶标进行诊断的技术。MPCR具有高效率、高通量、低成本的特性而被深入研究。目前M... 多重PCR(Multiplex polymerase chain reaction,MPCR)是指通过一次PCR反应同时对多个靶标进行扩增,结合一定的检测手段对扩增产物进行检测从而实现对多个靶标进行诊断的技术。MPCR具有高效率、高通量、低成本的特性而被深入研究。目前MPCR技术已被广泛应用于科学研究和疾病诊断等领域,文中从MPCR扩增与检测两方面概述了MPCR技术发展及其应用,讨论了MPCR技术的优点及存在的问题,并且提出将反应体系分隔成小液滴或结合管式对流PCR(CapillaryconvectivePCR,CCPCR)技术的方式有望提高固相载体表面的扩增效率,从而开发出扩增效率高、一致性好、体系稳定、检测重数高的多重PCR技术。 展开更多
关键词 多重PCR 熔解曲线 微流控 膜层析 Luminex液相芯片
荧光PCR探针熔解曲线法检测珠海市孕妇MTHFR和MTRR基因多态性研究 认领
7
作者 李恋湘 肖奇志 +3 位作者 王格 周玉球 李磊 胡玲玲 《临床医药实践》 2020年第8期608-612,640,共6页
目的:评价荧光PCR探针熔解曲线法(PMCA)检测亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)C677T,A1298C和蛋氨酸合成酶还原酶(MTRR)A66G基因多态性的适用性,并探讨珠海市孕妇各基因多态性分布特点及同型半胱氨酸(Hcy)水平情况。方法:通过双盲方式,对珠海... 目的:评价荧光PCR探针熔解曲线法(PMCA)检测亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)C677T,A1298C和蛋氨酸合成酶还原酶(MTRR)A66G基因多态性的适用性,并探讨珠海市孕妇各基因多态性分布特点及同型半胱氨酸(Hcy)水平情况。方法:通过双盲方式,对珠海市400例孕妇分别采用PMCA技术和DNA测序技术检测MTHFR C677T,A1298C和MTRR A66G基因多态性,以DNA测序为标准,评价PMCA法的检测效能。统计各检测位点的基因型频率,对孕妇叶酸利用能力的遗传风险进行评估,并分析其与血清同型半胱氨酸水平的相关性。结果:PMCA法检测上述基因多态性的结果与DNA测序结果完全吻合。珠海市孕妇MTHFR C677T位点TT,MTHFR A1298C位点CC,MTRR A66G位点GG纯合子频率分别为12.5%,1.7%和6.8%;MTRR A66G位点AG杂合子频率34.0%。高风险组血清Hcy水平与未发现风险组比较差异有统计学意义(t=-4.958,P<0.05)。结论:PMCA技术能快速准确检测MTHFR和MTRR基因多态性。珠海市孕妇MTHFR和MTRR基因型频率分布有其自身特点。孕妇血清同型半胱氨酸水平对临床叶酸个性化用药有指导作用。 展开更多
关键词 熔解曲线 叶酸 亚甲基四氢叶酸还原酶 蛋氨酸合成酶还原酶
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荧光PCR-探针熔解曲线法在缺失型α-地中海贫血快速诊断中的应用 认领
8
作者 李恋湘 肖奇志 +1 位作者 张素粉 吴洪秋 《中国当代医药》 2020年第15期24-27,F0004,共5页
目的探讨荧光PCR-探针熔解曲线法(PMCA)在缺失型α-地中海贫血(简称“α-地贫”)快速诊断中的应用。方法收集2019年10~12月珠海市妇幼保健院2261份血样本和35份羊水样本。通过双盲法,采用PMCA和单管多重PCR技术(gap-PCR)同时对上述2296... 目的探讨荧光PCR-探针熔解曲线法(PMCA)在缺失型α-地中海贫血(简称“α-地贫”)快速诊断中的应用。方法收集2019年10~12月珠海市妇幼保健院2261份血样本和35份羊水样本。通过双盲法,采用PMCA和单管多重PCR技术(gap-PCR)同时对上述2296份临床样本进行3种常见缺失型α-地贫基因检测,结果不符样本用DNA测序技术以确认。结果2296份临床样本中,除PMCA检测出1例未知突变基因之外,其余与gap-PCR检测结果一致,两者符合率为99.9%,此例经DNA测序显示在探针覆盖区域发生了单个碱基突变(A>G)。结论PMCA技术能快速准确检测3种常见缺失型α-地贫基因,可作为gap-PCR技术的替代或验证方法,也可用于大规模人群筛查及产前诊断。 展开更多
关键词 探针 熔解曲线 Α-地中海贫血 多重聚合酶链反应
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基于单核苷酸多态性位点的多重实时荧光定量聚合酶链式反应法鉴别当雄高山牦牛肉 认领
9
作者 刘睿茜 其美次仁 +3 位作者 李家鹏 韦忆萱 李金春 王守伟 《肉类研究》 北大核心 2020年第10期47-52,共6页
通过比对5个不同地区牦牛线粒体基因的差异,筛选出用于鉴定当雄高山牦牛的11个单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms,SNP)位点,将这些SNP位点作为引物3′端,同时引入引物碱基错配理念,设计出8对特异性引物,构建出2个三重和1... 通过比对5个不同地区牦牛线粒体基因的差异,筛选出用于鉴定当雄高山牦牛的11个单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms,SNP)位点,将这些SNP位点作为引物3′端,同时引入引物碱基错配理念,设计出8对特异性引物,构建出2个三重和1个二重实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time polymerase chain reaction,RT-PCR)体系,建立一种基于SNP位点和多重RT-PCR技术鉴别当雄高山牦牛肉的方法。结果表明:该方法特异性较好、简便快捷、结果直观可靠,能够有效鉴别当雄高山牦牛肉;方法中3个RT-PCR反应体系扩增产物对应的熔解温度(melting temperature,Tm)范围分别为反应体系A:73.1~75.2、76.0~77.3、79.0~80.0℃,反应体系B:69.5~72.8、75.0~77.9、78.5~80.0℃,反应体系C:76.1~78.1、79.5~80.7℃;根据3个反应体系中熔解曲线峰的有无以及Tm是否符合取值范围来判定样品是否为当雄高山牦牛肉;市售样品测定结果表明,该方法可用于实际样品中当雄高山牦牛肉的快速鉴别。 展开更多
关键词 当雄高山牦牛 品种鉴别 单核苷酸多态性位点 多重实时荧光定量聚合酶链式反应 熔解曲线
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熔解曲线结合RT-PCR在餐饮食品中对5种致病菌的检测 认领
10
作者 姚艳玲 刘骆强 管佳丽 《食品研究与开发》 CAS 北大核心 2019年第4期142-148,共7页
建立快速检测餐饮食品中沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、单核增生李斯特氏菌、大肠埃希氏菌O157:H7及副溶血性弧菌5种致病菌的实时聚合酶链式反应体系(real-time polymerase chain reaction,RT-PCR)。通过增菌时间的比较,调整RT-PCR反映体... 建立快速检测餐饮食品中沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、单核增生李斯特氏菌、大肠埃希氏菌O157:H7及副溶血性弧菌5种致病菌的实时聚合酶链式反应体系(real-time polymerase chain reaction,RT-PCR)。通过增菌时间的比较,调整RT-PCR反映体系中的退火温度,建立5种致病菌相同的检测体系。试验结果表明,5个目标菌达到检测灵敏度的最短增菌时间范围为2 h~8 h,5种致病菌的试验灵敏度范围为7.4×10 CFU/mL~2.4×103 CFU/mL。5种目标菌的熔解温度Tm值分别为沙门氏菌87.32℃,金黄色葡萄球菌79.57℃,单核增生李斯特氏菌82.02℃,大肠埃希氏菌O157:H7 82.24℃,副溶血性弧菌87.15℃。试验建立的RT-PCR快速检测反应体系,与常规微生物检测方法相比,有效地缩短了检测时间,且灵敏度与特异性均能满足检测要求。 展开更多
关键词 实时聚合酶链式反应 熔解曲线 沙门氏菌 金黄色葡萄球菌 单核增生李斯特氏菌 大肠埃希氏菌O157:H7 副溶血性弧菌
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杂交探针技术结合熔解曲线鉴别川贝母与伊贝母的研究 认领 被引量：1
11
作者 潘杰 陈虹 +2 位作者 冯睿 胡青 季申 《中药新药与临床药理》 CAS CSCD 北大核心 2019年第3期344-348,共5页
目的建立一种快速、准确鉴别川贝母和伊贝母的方法。方法针对川贝母与伊贝母的ITS1基因特异性位点设计杂交探针,采用聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)扩增特异性片段,将其与探针杂交后,引发荧光共振能量转移,通过实时PCR仪... 目的建立一种快速、准确鉴别川贝母和伊贝母的方法。方法针对川贝母与伊贝母的ITS1基因特异性位点设计杂交探针,采用聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)扩增特异性片段,将其与探针杂交后,引发荧光共振能量转移,通过实时PCR仪绘制目标DNA片段扩增过程中的熔解曲线,根据熔解温度(Melting Temperature,T_m)对川贝母正伪品进行分析。结果两种贝母的熔解曲线、T_m具有特异性,通过该方法可以有效鉴别出川贝母和伊贝母,模版DNA最低检出限达到了0.2 pg,具有较高的灵敏度。结论该技术可用于川贝母质量控制,可作为《中国药典》方法的有效补充,对其他疑难品种的鉴别具有借鉴作用。 展开更多
关键词 川贝母 伊贝母 杂交探针 熔解曲线 鉴别
3种米香基因型鉴定方法比较研究 认领
12
作者 陈晓军 白海波 +5 位作者 惠建 马洪文 马静 王昕 殷延勃 李树华 《中国农学通报》 2019年第36期122-126,共5页
为了利用分子标记高效地进行米香性状的定向育种,以11份香稻材料,1份对照材料以及10份回交材料为试验材料,分别建立了直接测序、聚丙酰胺凝胶法、熔解曲线法3种方法,对米香基因BADH2进行基因分型研究,比较了每种方法的优点与不足,筛选... 为了利用分子标记高效地进行米香性状的定向育种,以11份香稻材料,1份对照材料以及10份回交材料为试验材料,分别建立了直接测序、聚丙酰胺凝胶法、熔解曲线法3种方法,对米香基因BADH2进行基因分型研究,比较了每种方法的优点与不足,筛选了一套快速、高效的米香基因型鉴定方法。结果表明直接测序、聚丙酰胺凝胶法、熔解曲线法3种方法均能对所试材料进行准确的基因分型。熔解曲线法较其他方法具有灵敏、高效、简单等特性。本研究开发了79个碱基为目标扩增区域的引物,建立了方法流程,能够达到快速分型的目的,为高通量定向培育米香水稻材料提供了技术手段。 展开更多
关键词 香味 熔解曲线 基因型 分子育种 水稻
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甲型流感病毒快速基因分型POCT方法的建立 认领 被引量：2
13
作者 王大刚 王雅杰 +6 位作者 潘美晨 焦炳欣 郭杰 王爽 郭晶晶 徐飞 吴吟妮 《传染病信息》 2019年第4期307-311,共5页
目的建立一种无需核酸提取,直接检测鼻咽拭子中甲型流感病毒H1HA pdm09、H3HA亚型和季节性流感病毒H1HA non-pdm09的POCT快速分型方法。方法针对3种流感病毒的血凝素(hemagglutinin,HA)基因序列保守区设计高度特异性的引物和HyBeacon探... 目的建立一种无需核酸提取,直接检测鼻咽拭子中甲型流感病毒H1HA pdm09、H3HA亚型和季节性流感病毒H1HA non-pdm09的POCT快速分型方法。方法针对3种流感病毒的血凝素(hemagglutinin,HA)基因序列保守区设计高度特异性的引物和HyBeacon探针,同时以人类RNaseP基因作为内参。优化多重PCR反应条件,建立用熔解曲线分析甲型流感病毒基因分型的方法,并将其应用到ParaDNA核酸POCT检测仪,对50例甲型流感病毒抗原初筛阳性且经过实时荧光定量PCR检测的临床鼻咽拭子标本进行检测。结果该方法可在1.5 h内完成对3种甲型流感病毒亚型HA基因的特异性扩增和分型,与其他7种呼吸道病原微生物无交叉反应,其核酸检测下限为50 copies/μl。对临床50例甲型流感病毒抗原阳性的鼻咽拭子标本进行直接检测,检出H1HA pdm09阳性标本48例,H3HA阳性标本2例,未检出季节性流感H1HA nonpdm09阳性标本。结论基于HyBeacon探针和ParaDNA核酸POCT检测仪所建立的甲型流感病毒快速分型方法能同时检测H1HA pdm09、H3HA和季节性流感病毒H1HA non-pdm09。该方法无需核酸提取,操作简便,检测时间短,适于对甲型流感病毒抗原初筛阳性的鼻咽拭子开展现场基因分型检测,可为流感的诊治和防控提供及时快速的实验室依据。 展开更多
关键词 甲型流感 HyBeacon探针 熔解曲线 ParaDNA 基因分型
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基于探针熔解曲线分析技术的非缺失型地中海贫血基因检测方法的建立 认领 被引量：1
14
作者 胡晓艳 吴宇亮 +3 位作者 李科铮 钟宇萍 徐颂周 王存艳 《广东医学》 CAS 2019年第17期2444-2449,共6页
目的结合多重不对称PCR技术和荧光探针熔解曲线法,建立一种快速、准确、简便的非缺失型地中海贫血基因检测方法。方法设计针对9个常见非缺失型地中海贫血基因位点(αWSα、αQSα、αCSα、βIVSⅡ654、βCD-17、β-28、βCD41-42、βCD... 目的结合多重不对称PCR技术和荧光探针熔解曲线法,建立一种快速、准确、简便的非缺失型地中海贫血基因检测方法。方法设计针对9个常见非缺失型地中海贫血基因位点(αWSα、αQSα、αCSα、βIVSⅡ654、βCD-17、β-28、βCD41-42、βCD-71-72、βCD-26)的引物对、荧光探针以及对应等位基因的靶序列;使用熔解曲线法验证荧光探针与对应等位基因的靶序列的工作效果,确认不同基因型的熔解温度;使用30份已知基因型别的临床样本,提取全血样本的DNA并PCR扩增其9个等位基因目标片段,利用对应荧光探针的熔解温度变化区分不同位点的基因型;收集疑似地中海贫血病例的血液样本200例,按照双盲对照实验原则,分别用反向斑点杂交法试剂盒和多重不对称PCR探针熔解曲线法对这200例样本进行基因分型检测,比较两种方法的结果是否一致,并对两种方法的优缺点进行比较。结果多重不对称PCR探针熔解曲线法可以同时对9个非缺失型地中海贫血的基因位点进行检测,并通过对应荧光探针的熔解温度的变化区分不同位点的基因型,检测结果与反向斑点杂交法相比较有相同的准确度,且有操作简便、耗时短、成本低、污染风险低等优势。结论本研究建立了一种基于多重不对称PCR探针熔解曲线的基因分型方法,并成功用于9个非缺失型地中海贫血基因位点的诊断,该方法是一种简便、快速、低成本的检测方法,在地中海贫血筛查中有较好的应用前景。 展开更多
关键词 地中海贫血 多重不对称PCR 荧光探针 熔解曲线
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本地区鄂温克与汉族HBV基因型分布及其种族差异研究 认领
15
作者 马佳 范晓燕 刘恩才 《当代医学》 2019年第24期88-90,共3页
目的了解本地区鄂温克族及汉族人群中乙型肝炎病毒(HBV)基因型的分布情况及其种族差异。方法收集内蒙古呼伦贝尔地区鄂温克族和汉族HBsAg阳性血清共720例,利用实时荧光定量PCR熔解曲线法检测HBV基因型,根据分型结果探讨本地区鄂温克、汉... 目的了解本地区鄂温克族及汉族人群中乙型肝炎病毒(HBV)基因型的分布情况及其种族差异。方法收集内蒙古呼伦贝尔地区鄂温克族和汉族HBsAg阳性血清共720例,利用实时荧光定量PCR熔解曲线法检测HBV基因型,根据分型结果探讨本地区鄂温克、汉族HBV基因型分布是否具有种族差异。结果720例标本中,680例分型成功,40例因HBV DNA定量低于本方法的最低检出限未能分型。鄂温克族标本330例分型成功,其中B型90例,C型240例;汉族标本350例分型成功,其中B型100例,C型250例。结论内蒙古呼伦贝尔地区鄂温克族及汉族HBV基因型均为B型和C型,两者统计结果差异无统计学意义,优势基因型为C型。 展开更多
关键词 乙型肝炎病毒(HBV) 熔解曲线 基因型 鄂温克族
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基于熔解曲线峰形特异性鉴别川贝母真伪 认领 被引量：1
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作者 陈慕媛 李辉标 +5 位作者 唐洪梅 闫雪 陈洁 林霖 陈国培 朱成杰 《中药新药与临床药理》 CAS CSCD 北大核心 2019年第5期592-597,共6页
目的探讨基于熔解曲线峰形及退火温度(Tm值)在川贝母真伪鉴别中的应用方法。采用《中国药典》2015年版聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)鉴别法检测川贝母样品。使用CLUSTALX软件比对NCBI-Genbank数据库下载的川贝母及其... 目的探讨基于熔解曲线峰形及退火温度(Tm值)在川贝母真伪鉴别中的应用方法。采用《中国药典》2015年版聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)鉴别法检测川贝母样品。使用CLUSTALX软件比对NCBI-Genbank数据库下载的川贝母及其常见伪品特征序列,设计并验证引物与实时荧光PCR,检测市售样品。结果川贝母熔解曲线呈尖锐峰且Tm值为80.98℃,与常见伪品峰形有明显区别。结论此研究利用熔解曲线峰形特异性鉴定川贝母,实验操作简单,鉴定结果直观。 展开更多
关键词 川贝母 鉴别 熔解曲线 实时荧光PCR
SYBR Green Ⅰ染料法荧光RT-PCR鉴别乙型两系流感病毒 认领 被引量：2
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作者 徐翮飞 张瑾 +5 位作者 董梅 薛晓宁 杜辉 张娟 朱可 陈晓光 《中国国境卫生检疫杂志》 CAS 2019年第1期13-16,20共5页
目的建立SYBR GreenⅠ染料法荧光RT-PCR快速鉴别乙型流感病毒Yamagate系和Victoria系。方法比对乙型流感病毒Yamagate系和Victoria系的HA基因,设计特异性引物,采用SYBR GreenⅠ染料法荧光RT-PCR扩增两系病毒,进行熔解曲线分析,测定各系... 目的建立SYBR GreenⅠ染料法荧光RT-PCR快速鉴别乙型流感病毒Yamagate系和Victoria系。方法比对乙型流感病毒Yamagate系和Victoria系的HA基因,设计特异性引物,采用SYBR GreenⅠ染料法荧光RT-PCR扩增两系病毒,进行熔解曲线分析,测定各系扩增产物的熔解温度。优化反应体系及条件,进行特异性、灵敏性及重复性评价。结果熔解曲线分析结果显示,乙型流感病毒Yamagate系和Victoria系扩增产物的熔解温度相差较大,Yamagate系为80.40℃,Victoria系为79.04℃。特异性实验表明,该方法能检测乙型流感病毒,与甲型流感病毒、冠状病毒HCoV-229E、HCoV-0C43、HCoV-NL63、HCoV-HKU1等呼吸道病毒没有交叉反应。灵敏性实验表明,该方法对Yamagate系和Victoria系乙型流感病毒最低检测限均为102拷贝/μl。对105份乙型流感病毒阳性鼻咽拭子样本的检测结果与WHO的TaqMan探针法完全一致。结论建立的SYBR GreenⅠ染料法荧光RT-PCR方法可快速检测乙型流感病毒并对两系乙型流感病毒进行鉴别。 展开更多
关键词 乙型流感病毒 实时RT-PCR 熔解曲线
染料法荧光PCR鉴别卵形疟原虫curtisi和wallikeri亚种 认领
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作者 张瑾 李刚 +5 位作者 徐翮飞 薛晓宁 王勇 张娟 朱可 陈晓光 《中国国境卫生检疫杂志》 CAS 2019年第5期305-308,共4页
目的建立染料法荧光PCR快速鉴别卵形疟原虫curtisi和wallikeri亚种。方法比对卵形疟原虫curtisi和wallikeri亚种的网织红细胞结合蛋白2(porbp2)基因,设计特异性引物,建立扩增卵形疟原虫curtisi和wallikeri亚种的染料法荧光PCR方法,进行... 目的建立染料法荧光PCR快速鉴别卵形疟原虫curtisi和wallikeri亚种。方法比对卵形疟原虫curtisi和wallikeri亚种的网织红细胞结合蛋白2(porbp2)基因,设计特异性引物,建立扩增卵形疟原虫curtisi和wallikeri亚种的染料法荧光PCR方法,进行熔解曲线分析,测定各亚种扩增产物的熔解温度,进行特异性、重复性和准确性评价。结果熔解曲线分析结果显示,建立的方法扩增卵形疟原虫curtisi和wallikeri亚种的熔解温度相差明显,curtisi亚种为74.2℃,wallikeri亚种为75.7℃。该方法虽可检测到其他3种疟原虫,但敏感度较低,卵形疟与其他3种疟原虫的熔解温度差别明显。重复性实验表明,该方法扩增卵形疟原虫curtisi和wallikeri亚种熔解温度变异系数均低于1%,重复性良好。对27份卵形疟原虫阳性样本的检测结果与巢式PCR分型结果完全一致。结论建立的染料法荧光PCR方法可快速对两种亚型卵形疟原虫进行鉴别。 展开更多
关键词 卵形疟原虫 亚种 染料法PCR 熔解曲线
Gene-Xpert MTB/RiF与熔解曲线法检测结核分枝杆菌利福平耐药分析 认领 被引量：2
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作者 韦红 张阳 +2 位作者 刘韦卓 王少华 李明虎 《河南预防医学杂志》 2019年第12期895-896,899共3页
目的评价Gene-Xpert MTB/RiF法与熔解曲线法检测结核分枝杆菌利福平耐药的不同应用价值。方法入选235例涂阳结核病患者痰标本分别做传统比例法药敏试验、Gene-Xpert MTB/RiF和熔解曲线法检测结核分枝杆菌的利福平耐药,以传统药敏试验作... 目的评价Gene-Xpert MTB/RiF法与熔解曲线法检测结核分枝杆菌利福平耐药的不同应用价值。方法入选235例涂阳结核病患者痰标本分别做传统比例法药敏试验、Gene-Xpert MTB/RiF和熔解曲线法检测结核分枝杆菌的利福平耐药,以传统药敏试验作为金标准进行比较。结果 235例标本中比例法药敏试验利福平耐药12例(5.1%)、Gene-Xpert MTB/RiF利福平耐药例15例(6.4%)、熔解曲线法利福平耐药19例(8.1%),Gene-Xpert MTB/RiF和熔解曲线法敏感度分别为91.7%和100.0%;特异度分别为98.2%和96.7%。结论Gene-Xpert MTB/RiF和熔解曲线法两者均可应用于结核分枝杆菌利福平耐药性的快速检测,Gene-Xpert MTB/RiF法在我国开展结核菌耐多药筛查具更有较强的实用性,有更广的应用前景。 展开更多
关键词 结核病 比例法药敏试验 Gene-Xpert MTB/RiF 熔解曲线
定量PCR快速鉴别念珠菌种方法的建立 认领
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作者 刘建钗 柳焕章 +5 位作者 刘彦威 张鹤平 宋阔阔 李聚芹 乔铁库 吴志勇 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2019年第1期58-66,共9页
由于禽类念珠菌种类多样,具有条件致病和感染症状非典型的特性,在临床上区分定植和感染状态并确诊何种念珠菌感染是困难的。为了快速准确地检测禽类念珠菌感染和鉴别病原种类,本研究借助Primer Express 6.0软件设计目标念珠菌基因组DNA... 由于禽类念珠菌种类多样,具有条件致病和感染症状非典型的特性,在临床上区分定植和感染状态并确诊何种念珠菌感染是困难的。为了快速准确地检测禽类念珠菌感染和鉴别病原种类,本研究借助Primer Express 6.0软件设计目标念珠菌基因组DNA的种特异引物,采用real-time qPCR技术,通过检测不同念珠菌种的菌株培养物而建立鉴别方法,并用人工感染鸡的血液和肝脏样本对建立的方法进行检验。结果,成功找出三种念珠菌(白色念珠菌、光滑念珠菌和热带念珠菌)的3对特异引物和1对共用引物;特异引物分别形成相应种的特异熔解曲线,共用引物形成对应于3个种且明显分开的三条熔解曲线,与参照病原菌无交叉反应;该方法对念珠菌样本检测最低限度可达1×10~1copies/L以下,敏感度高于常规PCR约100倍以上;同种念珠菌不同模板浓度Tm值不变,同一浓度3个重复C_t值的变异系数小于2.5%,说明离散度较低,重复性好。所建方法可以通过对感染鸡的血液和肝脏样本的检测确定目标念珠菌感染和病原种类,检测周期约2~3 h。综上,通过适当的引物设计,采用定量PCR技术可以在一定范围内快速、准确、定量地检测和鉴别感染样本中的目标念珠菌种类。 展开更多
关键词 特异引物 念珠菌 定量PCR 熔解曲线 快速检测
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