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人血管紧张素Ⅱ2型受体AT2R重组细胞系的构建与鉴定 预览
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作者 陈惠莹 毛莹莹 +3 位作者 裴娜娜 颜仁和 万鹏飞 李红卫 《暨南大学学报:自然科学与医学版》 CAS CSCD 北大核心 2019年第3期187-194,共8页
目的:构建人血管紧张素Ⅱ2型受体(hAT2R)过表达稳定细胞系,探讨AT2R激动剂Compound 21等对前列腺癌细胞的作用及机制.方法:构建含hAT2R基因的慢病毒表达载体pLV-CMV-hAT2R-IRES-eGFP并包装成慢病毒.将重组慢病毒载体pLV-CMV-IRES-eGFP-h... 目的:构建人血管紧张素Ⅱ2型受体(hAT2R)过表达稳定细胞系,探讨AT2R激动剂Compound 21等对前列腺癌细胞的作用及机制.方法:构建含hAT2R基因的慢病毒表达载体pLV-CMV-hAT2R-IRES-eGFP并包装成慢病毒.将重组慢病毒载体pLV-CMV-IRES-eGFP-hAT2R感染前列腺癌细胞,并利用流式细胞术筛选出单克隆细胞株,RT-PCR及Western blot方法检测重组细胞系中hAT2R表达水平,使用AT2R激动剂CGP42112检测受体功能.结果:重组慢病毒载体感染PC-3、DU145前列腺癌细胞24 h后均能观察到eGFP表达,用流式细胞术分别筛选出单克隆细胞株,RT-PCR及Western blot检测结果显示目的基因hAT2R在两株重组细胞系中表达显著升高,CGP42112处理24 h后,重组细胞系细胞活力较正常PC-3、DU145细胞显著降低.结论:成功构建hAT2R过表达稳定细胞系. 展开更多
关键词 hAT2R Compound21 慢病毒 稳定细胞系 前列腺癌
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可诱导表达hFGFR1α稳定细胞系的建立与表达优化 预览
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作者 朱先玉 王历 +3 位作者 杨茂 吴婷 何涛 杨文理 《西南医科大学学报》 2019年第3期215-218,共4页
目的:构建hFGFR1α(human fibroblast growth factor receptor 1 alpha, hFGFRα)稳定细胞系,优化获得最适诱导表达条件,实现可诱导的、高效的稳定表达。方法:将hFGFR1α基因编码区全长克隆入pcDNA5/FRT/TO/2 × Flag表达载体,连同p... 目的:构建hFGFR1α(human fibroblast growth factor receptor 1 alpha, hFGFRα)稳定细胞系,优化获得最适诱导表达条件,实现可诱导的、高效的稳定表达。方法:将hFGFR1α基因编码区全长克隆入pcDNA5/FRT/TO/2 × Flag表达载体,连同pOG44重组酶质粒共转染人宿主细胞Flp-InTM-T-RexTM-293细胞系(HEK293H),潮霉素B筛选获得阳性克隆细胞系HEK293H/hFGFR1ɑ。用不同浓度强力霉素(doxycline, Dox)或者不同作用时间对HEK293H/hFGFR1ɑ细胞系进行诱导表达,Western Blot鉴定hFGFR1ɑ蛋白的表达情况。结果:构建了pcDNA5-FRT/TO/2 × Flag/hFGFR1ɑ重组表达载体,获得了可被Dox诱导表达的HEK293H/hFGFR1ɑ稳定细胞系;0.001μg/mL Dox即可诱导hFGFR1ɑ蛋白表达,0.01μg/mL Dox即可诱导表达量达峰值;Dox对该细胞系作用2 h即诱导hFGFR1ɑ蛋白表达,对其作用24 h后该细胞系的表达明显增强。结论:成功构建了可诱导的、高效的稳定表达细胞系HEK293H/hFGFR1ɑ;Dox诱导该细胞系表达具有剂量差异性和时间依赖性。 展开更多
关键词 FGFR1 稳定细胞系 蛋白质表达 Doxycline 诱导
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中国荷斯坦奶牛MD-2基因在HEK293细胞中的表达及稳定细胞系的构建
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作者 焦寒伟 赵宇 +4 位作者 帅学宏 伍莉 陈吉轩 王红均 黄庆洲 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2019年第4期493-498,共6页
将中国荷斯坦奶牛髓样分化蛋白-2 (myeloid differentiation protein-2,MD-2) cDNA全长克隆至pEGFP-N1真核表达载体,利用双酶切与测序进行鉴定。经脂质体2000,将pMD-2-EGFP重组质粒转染至HEK293细胞中,应用倒置荧光显微镜、流式细胞术和... 将中国荷斯坦奶牛髓样分化蛋白-2 (myeloid differentiation protein-2,MD-2) cDNA全长克隆至pEGFP-N1真核表达载体,利用双酶切与测序进行鉴定。经脂质体2000,将pMD-2-EGFP重组质粒转染至HEK293细胞中,应用倒置荧光显微镜、流式细胞术和Western-blot分别检测融合蛋白的表达,利用极限稀释的方法获取单细胞,并利用G418抗性筛选,获取稳定细胞系。结果发现,目的基因含有一个483 bp的开放阅读框,编码160个氨基酸。双酶切鉴定和测序结果均表明,MD-2基因编码区正确插入pEGFP-N1真核表达载体,读码框架正确,MD-2-EGFP融合蛋白在HEK293细胞中,能够成功表达;极限稀释获取单细胞,用250?g/mL的G418筛选得到的细胞系,经流式细胞术和Western-blot检测,在pMD-2-EGFP稳定细胞系组,分子质量约为46 ku处,发现了特异性条带,而pEGFP-N1空载稳定细胞组,以及空白的HEK293细胞对照组,均未发现条带。综上所述,本研究成功构建了真核表达载体pMD-2-EGFP,并在HEK293细胞中能够成功表达;经极限稀释,并利用G418抗性筛选,成功获得了pMD-2-EGFP和pEGFP-N1稳定细胞系,这为进一步研究中国荷斯坦奶牛奶牛MD-2基因的生物学功能奠定基础。 展开更多
关键词 中国荷斯坦奶牛 髓样分化蛋白-2 EGFP 真核表达 稳定细胞系
稳定表达GFP-LC3蛋白的THP-1细胞系的构建 预览
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作者 雷蕾 黄珊 +6 位作者 于明航 刘志强 刘师伟 李婷 赵秀娟 李泽兴 王玺 《天津医药》 CAS 北大核心 2018年第4期341-344,共4页
目的构建稳定表达GFP-LC3的人急性单核细胞白血病细胞(THP-1)。方法采用pCDH-CMV-GFPLC3-EF1α-puro转染293T细胞构建慢病毒质粒系统,获取的慢病毒感染THP-1细胞,用嘌呤霉素(Puromycin)筛选稳定表达GFP-LC3蛋白的细胞系。通过Westernblo... 目的构建稳定表达GFP-LC3的人急性单核细胞白血病细胞(THP-1)。方法采用pCDH-CMV-GFPLC3-EF1α-puro转染293T细胞构建慢病毒质粒系统,获取的慢病毒感染THP-1细胞,用嘌呤霉素(Puromycin)筛选稳定表达GFP-LC3蛋白的细胞系。通过Westernblot和流式细胞术检测THP-1细胞中GFP-LC3蛋白的表达,并利用该稳定表达细胞系观察饥饿和雷帕霉素诱导时细胞发生的自噬变化。结果筛选得到稳定表达GFP-LC3蛋白的THP-1细胞系,在倒置荧光显微镜下观察可见绿色荧光。Westernblot和流式细胞术检测证实了GFP-LC3融合蛋白的表达。激光共聚焦法和Westernblot均证实饥饿和雷帕霉素可以诱导自噬的发生,且GFP-LC3融合蛋白可以反映内源LC3蛋白的变化,包括蛋白聚集和发生剪切修饰。结论应用慢病毒质粒系统成功构建了高效稳定表达GFPLC3蛋白的THP-1细胞系,从而为后续利用GFP-LC3融合蛋白研究自噬变化提供了细胞模型。 展开更多
关键词 自噬 GFP-LC3 THP-1细胞 稳定细胞系 雷帕霉素
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H5N1型禽流感NS1基因在HEK293细胞中的表达及稳定细胞系的构建 被引量:1
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作者 王红均 张其彬 +5 位作者 伍莉 陈吉轩 帅学宏 丁孟建 黄庆洲 焦寒伟 《中国兽医学报》 CSCD 北大核心 2018年第11期2125-2130,共6页
将H5N1型禽流感病毒NS1(non-structural protein 1)基因插入pEGFP-N1真核表达载体中,获得重组质粒pNS1-EGFP,经酶切鉴定并测序后,去内毒素提取pNS1-EGFP质粒,在脂质体转染试剂作用下将pNS1-EGFP质粒转染HEK293细胞,利用倒置荧光显微镜... 将H5N1型禽流感病毒NS1(non-structural protein 1)基因插入pEGFP-N1真核表达载体中,获得重组质粒pNS1-EGFP,经酶切鉴定并测序后,去内毒素提取pNS1-EGFP质粒,在脂质体转染试剂作用下将pNS1-EGFP质粒转染HEK293细胞,利用倒置荧光显微镜、FCM和Western blot 3种方法检测NS1-EGFP融合蛋白的表达,利用极限稀释的方法获取单细胞,并利用G418抗性筛选获取稳定细胞系。结果显示,NS1基因正确插入pEGFP-N1真核表达载体,NS1-EGFP融合蛋白读码框架正确;3种检测方法表明,NS1-EGFP融合蛋白在HEK293细胞中能够表达;pEGFP-N1和NS1-EGFP稳定细胞系流式细胞仪检测,阳性率分别为95.74%和96.10%,Western blot检测结果发现,HEK293空白细胞和pEGFP-N1稳定细胞系未见任何条带,NS1-EGFP稳定细胞系在51 000处见特异性条带,综上说明稳定细胞系构建成功。本试验为进一步深入研究禽流感病毒NS1基因的生物学功能作铺垫。 展开更多
关键词 H5N1型禽流感病毒 非结构蛋白1 EGFP 融合蛋白 真核表达 稳定细胞系
猴源rab基因shRNA文库及其稳定细胞株的构建
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作者 郭珍珍 鲁绍芳 +7 位作者 樊爽爽 李国利 韩立强 鲁维飞 王江 陈丽颖 杨国宇 褚贝贝 《中国兽医学报》 CSCD 北大核心 2018年第3期469-475,共7页
为揭示Rab蛋白在猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)入侵进入宿主细胞后的功能,本研究以PRRSV易感的猴胚胎肾上皮细胞Marc-145为模型,构建了针对猴源rab基因的短发夹RNA(shRNA)文... 为揭示Rab蛋白在猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)入侵进入宿主细胞后的功能,本研究以PRRSV易感的猴胚胎肾上皮细胞Marc-145为模型,构建了针对猴源rab基因的短发夹RNA(shRNA)文库。此文库中的shRNA以pLKO.1为载体质粒,与pMD2.G和psPAX2包装质粒共同转染HEK293T/17细胞,获得慢病毒;利用慢病毒感染Marc-145,通过puromycin筛选获得稳定抑制猴源rab基因表达的细胞株。通过荧光定量PCR方法检测各细胞株中rab基因的敲减效率。本试验构建的文库包含187个克隆、涉及62种rab基因。荧光定量PCR结果证明,筛选出的稳定细胞株中相应rab基因mRNA的表达量均有显著下降。结果显示本试验成功构建了猴源rab基因shRNA文库并筛选出了稳定细胞株,可用于后续进一步研究Rab蛋白在PRRSV生活周期中发挥的重要功能。 展开更多
关键词 rab基因 shRNA文库 PRRSV 慢病毒 MARC-145细胞 稳定细胞系
猪GM—CSF稳定表达细胞系的建立 预览
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作者 李俊敏 雍艳红 +4 位作者 巩栋梁 冯园 韦璇 何玉林 巨向红 《畜牧兽医学报》 CSCD 北大核心 2017年第5期963-970,共8页
旨在建立能稳定表达猪GM-CSF的细胞系。本研究利用NCBI已公布猪GM-CSF基因序列设计引物,采用RT-PCR法扩增出猪GM-CSF开放阅读框(ORF)。发现其长435bp,编码144个核苷酸的蛋白。该蛋白分子质量为16.3ku,等电点为7.15。与绵羊、马、猫、... 旨在建立能稳定表达猪GM-CSF的细胞系。本研究利用NCBI已公布猪GM-CSF基因序列设计引物,采用RT-PCR法扩增出猪GM-CSF开放阅读框(ORF)。发现其长435bp,编码144个核苷酸的蛋白。该蛋白分子质量为16.3ku,等电点为7.15。与绵羊、马、猫、牛、狗和人的同源性分别为77.1%、73.6%、72.2%、71.5%、71.3%和70.8%。通过EcoR I和BamH I酶切后,将GM-CSF基因插入pIRES2-EGFP载体中,构建出pIRES2-EGFP-pGM-CSF重组质粒。该重组质粒转染猪肠上皮细胞(IPEC-J2)后,G418筛选阳性细胞。在转染后24h,荧光定量PCR可见GM-CSF mRNA表达量较对照组及空载体组细胞显著升高(P〈0.01),荧光显微镜下亦可见大量绿色荧光表达。该细胞系在含有G418的培养液中连续传代30次,仍可见GM-CSF基因和蛋白水平的高表达。本研究成功构建了真核表达载体pIRES2-EGFP-pGM-CSF和能稳定表达猪GM-CSF的细胞系。 展开更多
关键词 GM -CSF 真核表达 稳定细胞系
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HIV-1型Nef基因重组表达载体的构建及其稳定表达细胞系的建立 预览
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作者 李苗苗 杨霄旭 +2 位作者 杨朝霞 向双林 韩梅 《湖南师范大学自然科学学报》 CAS 北大核心 2017年第1期31-36,共6页
为了构建艾滋病毒HIV-1型Nef基因重组表达载体,利用PCR从p NL4-3质粒上扩增HIV-1型Nef基因,获得Nef基因完整的编码区,构建可表达Nef蛋白的p EB-myc-nef重组表达载体.经鉴定正确后,利用LipofectamineTM2000将重组质粒转染SW480细胞,通过W... 为了构建艾滋病毒HIV-1型Nef基因重组表达载体,利用PCR从p NL4-3质粒上扩增HIV-1型Nef基因,获得Nef基因完整的编码区,构建可表达Nef蛋白的p EB-myc-nef重组表达载体.经鉴定正确后,利用LipofectamineTM2000将重组质粒转染SW480细胞,通过Western Blot技术检测Nef蛋白的瞬时表达.为了建立稳定表达Nef基因的SW480细胞系,采用G418筛选建立稳定表达细胞系的方法,筛选出单克隆细胞系.扩大培养克隆细胞后,通过RT-PCR和Western Blot分别检测Nef的mRNA转录水平及蛋白表达水平,经长达60 d的传代,最终获得稳定表达Nef基因的SW480细胞系,为研究RNAi在艾滋病治疗方面的应用提供了细胞模型. 展开更多
关键词 Nef基因 SW480细胞 G418 稳定细胞系
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猪流行性腹泻病毒CH-HuN1301株N基因重组表达载体的构建及稳定表达细胞系的建立 预览
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作者 唐青海 杨海 +4 位作者 黎露 陈果亮 何丽芳 刘最 王芳宇 《中国畜牧兽医》 北大核心 2017年第8期2261-2268,共8页
本研究旨在建立猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)CH-HuN1301株N蛋白稳定表达细胞系。采用RT-PCR扩增PEDV新流行毒株CH-HuN1301株N基因,分别克隆至原核表达载体pET28a和真核表达载体pEGFP-C1构建重组表达载体,... 本研究旨在建立猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)CH-HuN1301株N蛋白稳定表达细胞系。采用RT-PCR扩增PEDV新流行毒株CH-HuN1301株N基因,分别克隆至原核表达载体pET28a和真核表达载体pEGFP-C1构建重组表达载体,所测定的序列采用Mega 5.0软件进行进化分析。将原核表达的N蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,重组真核表达载体pEGFP-PEDV-N转染HEK293细胞,经用G418筛选获得稳定的表达细胞系。荧光倒置显微镜观察细胞荧光,免疫过氧化物酶单层细胞染色法(IPMA)检测N蛋白的表达。结果表明,PEDV HuN1301-14毒株N基因大小为1 323bp,原核表达重组N蛋白分子质量约60ku,其多克隆抗体与PEDV呈特异性反应,荧光倒置显微镜观察和IPMA检测结果显示N蛋白在HEK293细胞中稳定表达。该细胞系的建立为进一步研究PEDV的诊断方法提供了基础材料。 展开更多
关键词 猪流行性腹泻病毒 CH-HuN1301毒株 N基因 稳定细胞系
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猪TRIM11基因克隆及其促进猪伪狂犬病毒在体外增殖的研究 预览
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作者 宋爽 曾磊 +7 位作者 鲁绍芳 郭珍珍 鲁维飞 韩立强 王江 王月影 褚贝贝 杨国宇 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第6期1239-1246,共8页
为初步研究猪TRIM11的免疫学功能,以猪颌下淋巴结cDNA为模板扩增TRIM11基因cDNA并对该基因进行了蛋白质结构预测和组织表达谱分析,将该基因与PiggyBac载体相连获得真核表达载体PB-TRIM11,之后转染PK15细胞获得稳定表达细胞系。用猪伪狂... 为初步研究猪TRIM11的免疫学功能,以猪颌下淋巴结cDNA为模板扩增TRIM11基因cDNA并对该基因进行了蛋白质结构预测和组织表达谱分析,将该基因与PiggyBac载体相连获得真核表达载体PB-TRIM11,之后转染PK15细胞获得稳定表达细胞系。用猪伪狂犬病毒(PRV)刺激过表达TRIM11PK15细胞和对照组细胞后,于不同时间收获细胞上清,比较两组细胞上清中病毒滴度变化。结果表明,猪TRIM11的ORF长度为1 407bp,编码468个氨基酸,该氨基酸序列含有3个TRIM家族保守的结构域。组织表达谱分析显示,猪TRIM11在脂肪组织、肺的表达量较高,而在心、回肠、十二指肠、直肠中的转录量较低。成功克隆了猪TRIM11cDNA序列并构建了真核转录载体PB-TRIM11,qRT-PCR检测结果表明TRIM11在PK15细胞系中成功表达。检测感染PRV后过表达TRIM11PK15细胞和对照组细胞上清液病毒的TCID50发现过表达TRIM11组的病毒滴度始终高于对照组。过表达TRIM11有一定的促进PRV增殖的作用,为进一步研究猪TRIM11在天然免疫中的作用奠定了基础。 展开更多
关键词 三基序结合蛋白 猪伪狂犬病毒 病毒增殖 稳定细胞系
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利用CRISPR/Cas9慢病毒系统敲除人源HOIP基因 预览 被引量:1
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作者 高欣 段小涛 李爱玲 《科学技术与工程》 北大核心 2016年第20期26-29,共4页
泛素化修饰是一种能调节诸多细胞功能的重要蛋白质翻译后修饰,近几年研究发现了一种新的泛素化修饰即线性泛素化修饰,LUBAC(linear ubiquitin chain assembly complex)是目前已知唯一的导致蛋白质发生线性泛素化修饰的E3酶。目前LUBA... 泛素化修饰是一种能调节诸多细胞功能的重要蛋白质翻译后修饰,近几年研究发现了一种新的泛素化修饰即线性泛素化修饰,LUBAC(linear ubiquitin chain assembly complex)是目前已知唯一的导致蛋白质发生线性泛素化修饰的E3酶。目前LUBAC复合物的底物和功能所知甚少。为了探索LUBAC复合物新的底物和功能,利用CRISPR/Cas9慢病毒系统构建稳定敲除LUBAC核心组分HOIP基因的HeLa细胞系,通过质谱鉴定此细胞系和对照细胞的差异泛素化修饰蛋白质,即可能是LUBAC新的底物。首先将靶向HOIP基因的不同CRISPR序列插入lenti CRISPRv2载体中,制备慢病毒质粒感染He La细胞,然后使用嘌呤霉素压力筛选,用Western Blot方法检测HOIP基因的敲除效果,最后成功地构建HOIP基因稳定敲除HeLa细胞系。此稳定细胞系的构建为日后深入研究LUBAC的功能提供一个人类细胞模型。 展开更多
关键词 CRISPR/Cas9 慢病毒 HOIP 稳定细胞系
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具有长期感应尿酸浓度功能的稳定细胞系的构建与鉴定 预览
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作者 凌婧怡 赵威 +4 位作者 曲国龙 阚乃鹏 温国霞 刘刚 陈惠鹏 《生物技术通讯》 CAS 2016年第2期153-157,共5页
目的:利用合成生物学方法构建具有尿酸感应作用的基因回路,稳定转染细胞系,构建长期自发稳定感应尿酸浓度的细胞系p-HucO8-SEAP-mUTs。方法:以耐辐射型球菌R1基因组中转录抑制物基因hucR及其结合位点基因hucO为基本元件,人工合成优化... 目的:利用合成生物学方法构建具有尿酸感应作用的基因回路,稳定转染细胞系,构建长期自发稳定感应尿酸浓度的细胞系p-HucO8-SEAP-mUTs。方法:以耐辐射型球菌R1基因组中转录抑制物基因hucR及其结合位点基因hucO为基本元件,人工合成优化的转录抑制物基因mUTs及其结合位点的8串联结构基因hucO8,将m UTs和hucO8作为已知功能的生物模块,用于完成基因回路的构建,并稳定转染HepG2细胞;通过实时定量PCR检测稳定细胞系中目的基因表达的稳定性,通过检测分泌型碱性磷酸酶(SEAP)的表达量来验证对尿酸的感应作用回路及其长期可逆性。结果和结论:构建了p-HucO8-SEAP-m UTs稳定细胞系,稳定株不同代数之间目的基因的表达稳定;p-HucO8-SEAP-mUTs稳定细胞系能有效地反映环境中的尿酸浓度,且比瞬时转染细胞系更加敏感,可逆性良好,没有明显的"记忆效应"。 展开更多
关键词 合成生物学 基因回路 尿酸 稳定细胞系
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高表达p55PIK细胞株的建立及其对结肠癌LoVo细胞周期的影响 预览 被引量:1
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作者 曹小年 胡发涌 +3 位作者 杨熹 来森艳 孙威 胡俊波 《华中科技大学学报:医学版》 CAS CSCD 北大核心 2016年第2期128-131,共4页
目的构建p55PIK高表达的质粒,筛选稳定高表达p55PIK的LoVo细胞系,检测其对LoVo细胞周期的影响。方法以基因组cDNA为模板,聚合酶链反应(PCR)扩增目的片段,通过限制性核酸内切酶进行酶切,T4DNA连接酶将目的片段插入pcDNA3.1质粒中;将携... 目的构建p55PIK高表达的质粒,筛选稳定高表达p55PIK的LoVo细胞系,检测其对LoVo细胞周期的影响。方法以基因组cDNA为模板,聚合酶链反应(PCR)扩增目的片段,通过限制性核酸内切酶进行酶切,T4DNA连接酶将目的片段插入pcDNA3.1质粒中;将携带p55PIK基因的pcDNA3.1质粒转染LoVo细胞,加入适量的G418筛选(500μg/mL),并通过实时定量PCR(qPCR)和Western blot方法检测p55PIK mRNA水平和蛋白水平,进一步通过BrdU/PI掺入法检测p55PIK对LoVo细胞周期和DNA合成的影响。结果成功构建了p55PIK高表达的质粒,并筛选出稳定高表达p55PIK的LoVo细胞系;在LoVo细胞中高表达p55PIK能够促进细胞S期的进程和DNA的合成。结论成功构建了pcDNA3.1-p55PIK质粒,并筛选出p55PIK稳定高表达的LoVo细胞系,高表达p55PIK能够促进LoVo细胞S期的进程和DNA的合成。 展开更多
关键词 p55PIK 稳定细胞系 LOVO细胞 细胞周期 DNA合成
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稳定高效表达猪CD163的Marc-145细胞系的构建与鉴定 预览
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作者 吴香菊 李芳韬 +9 位作者 陈蕾 丛晓燕 孙文博 于江 陈智 郭立辉 吴家强 杜以军 赵孝民 王金宝 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2015年第8期2074-2080,共7页
试验旨在构建一株高效表达猪CD163(pCD163)的Marc-145细胞系,为猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)的临床分离和疫苗生产奠定基础。根据GenBank中序列设计引物从猪肺泡巨噬细胞(... 试验旨在构建一株高效表达猪CD163(pCD163)的Marc-145细胞系,为猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)的临床分离和疫苗生产奠定基础。根据GenBank中序列设计引物从猪肺泡巨噬细胞(PAM)中扩增pCD163基因,将其插入真核表达载体pCI-neo构建真核表达质粒pCIpCD163,将该重组质粒转染Marc-145细胞,通过G418筛选、单克隆化并扩大培养筛选获得表达pCD163的Marc-145细胞系,IFA、Western blotting鉴定其表达情况。IFA结果显示,构建的pCD163-Marc细胞系中荧光明显亮于普通Marc-145细胞;Western blotting结果显示,pCD163-Marc细胞系中CD163蛋白表达量约为对照Marc-145细胞中CD163蛋白表达量的8.7倍。且该细胞系可稳定传至20代,各代次之间表达量无差异。证明高效表达猪CD163的Marc-145细胞系构建成功。 展开更多
关键词 MARC-145 CD163 稳定细胞系
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稳定表达EGFP-LC3蛋白的HeLa细胞系的构建
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作者 兰蓓 万雅娟 +2 位作者 王雨 杨寅 张翠竹 《南开大学学报:自然科学版》 CAS CSCD 北大核心 2015年第1期21-25,共5页
自噬是指细胞自身将细胞质蛋白或细胞器经溶酶体降解的一种过程.微管相关蛋白1轻链3(LC3)是自噬的标志蛋白,利用荧光显微镜观察EGFP-LC3荧光蛋白是否聚集成点状是检测自噬的方法之一.首先构建了表达EGFP-LC3蛋白的真核表达质粒,其具... 自噬是指细胞自身将细胞质蛋白或细胞器经溶酶体降解的一种过程.微管相关蛋白1轻链3(LC3)是自噬的标志蛋白,利用荧光显微镜观察EGFP-LC3荧光蛋白是否聚集成点状是检测自噬的方法之一.首先构建了表达EGFP-LC3蛋白的真核表达质粒,其具有荧光和药物筛选双标签.转染到HeLa细胞中,利用药物初步筛选后,再稀释到96孔板中筛选出有荧光的单细胞克隆,得到稳定表达EGFP-LC3蛋白的HeLa单克隆细胞系.该细胞系在饥饿诱导条件下EGFP-LC3蛋白可聚集成点状,验证了该细胞系能够用于指示自噬,为今后自噬研究奠定了基础. 展开更多
关键词 自噬 EGFP-LC3 HELA细胞 稳定细胞系
抗siRNA的GFP-Plk1同义突变表达载体及其稳定细胞系的构建 预览
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作者 李伟 李峰生 +4 位作者 于楠 刘萱 李平 江其生 曹诚 《生物技术通讯》 CAS 2015年第2期207-210,共4页
目的:构建GFP-Plk1同义突变表达载体及其稳定转染细胞系。方法:设计Polo样激酶1(Plk1)siRNA序列及相对应的同义突变引物,并利用二次PCR方法扩增Plk1基因,定向克隆到pRex-EGFP-IRES-Hygro载体中,构建pRex-EGFP-rPlk1-IRES-Hygro... 目的:构建GFP-Plk1同义突变表达载体及其稳定转染细胞系。方法:设计Polo样激酶1(Plk1)siRNA序列及相对应的同义突变引物,并利用二次PCR方法扩增Plk1基因,定向克隆到pRex-EGFP-IRES-Hygro载体中,构建pRex-EGFP-rPlk1-IRES-Hygro表达载体;利用逆转录病毒感染的方法,构建HeLa/GFP-rPlk1稳定细胞系;利用免疫印迹及激光共聚焦显微镜,验证Plk1 siRNA的干扰效果及稳定细胞系的构建。结果:双酶切鉴定和测序结果表明构建的pRex-EGFP-rPlk1-IRES-Hygro正确;免疫印迹实验证明Plk1 siRNA序列可以有效抑制HeLa/GFP-rPlk1细胞中内源性Plk1蛋白的表达,但不能干扰掉外源GFP-rPlk1蛋白;在荧光共聚焦显微镜下,观察到有丝分裂的前中期和末期,GFP-rPlk1分别定位于着丝粒和中间体上。结论:构建了Plk1同义突变表达载体pRex-EGFP-rPlk1-IRES-Hygro和HeLa/GFP-rPlk1稳定细胞系,为下一步研究Plk1在有丝分裂期的调控机制提供了模型。 展开更多
关键词 PLK1 抗siRNA 同义突变 稳定细胞系
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肝癌Wnt通路可溶性跨膜受体Frizzled-7稳定表达细胞株的构建与鉴定 被引量:1
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作者 裴哲 曾中秋 +3 位作者 陈雨文 李文华 TANG Yunjie 唐亚雄 《应用与环境生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第6期1076-1079,共4页
Wnt信号的异常持续激活可导致肝癌的发生发展,跨膜受体Frizzled-7在绝大多数肝癌临床肿瘤组织中呈现高度表达特征.为探索可溶性跨膜受体sFZD7在肝癌细胞中的抗癌活性,本研究主要通过分子克隆手段构建sFZD7的重组慢病毒表达载体,实现其... Wnt信号的异常持续激活可导致肝癌的发生发展,跨膜受体Frizzled-7在绝大多数肝癌临床肿瘤组织中呈现高度表达特征.为探索可溶性跨膜受体sFZD7在肝癌细胞中的抗癌活性,本研究主要通过分子克隆手段构建sFZD7的重组慢病毒表达载体,实现其在肝癌细胞Mahlavu中的超量表达,并通过抗生素筛选获得稳定表达sFZD7的肝癌细胞株,从而为研究sFZD7在肝癌中的生物学功能奠定基础.具体方法是首先提取人正常肝细胞HL-7702的总RNA,通过RT-PCR获取sFZD7 cDNA片段,分别将其插入慢病毒表达载体p LVX-IRES-Zs Green1与p LVX-Puro中,并通过酶切鉴定及测序分析以验证该慢病毒重组表达质粒的成功构建.其次,包装sFZD7重组慢病毒,并将制备的重组慢病毒悬液感染人胚肾HEK293T细胞,分别通过荧光显微镜与Western blot技术检测sFZD7的表达.最后,通过病毒感染与嘌呤霉素筛选获取稳定表达sFZD7的Mahlavu细胞株.实验结果表明,通过分子生物学手段已经成功地获得sFZD7慢病毒重组表达质粒p LVX-IRES-Zs Green1-sFZD7与p LVX-Puro-sFZD7;与此同时,已获得sFZD7重组慢病毒,感染HEK293T细胞后已通过荧光显微镜技术及Western blot证实了sFZD7的正确表达;此外,通过该sFZD7重组慢病毒感染肝癌Mahlavu细胞并经嘌呤霉素筛选手段成功地获得了稳定表达sFZD7的肝癌细胞株.上述结果可为sFZD7在肝癌细胞中的生物学功能与分子机制后续研究奠定基础. 展开更多
关键词 WNT信号 sFZD7 肝癌 重组慢病毒 Mahlavu 稳定细胞系
可诱导表达Mesp1的慢病毒载体构建及P19细胞稳定表达系的建立 预览
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作者 宋文 高建芳 +6 位作者 陈辉 邓云 李永青 袁婺洲 吴秀山 戴国 王跃群 《激光生物学报》 CAS CSCD 2014年第4期351-355,共5页
Mesp1属于b HLH转录因子家族,对早期心脏中胚层的形成十分重要。为研究Mesp1在心脏发育过程中的功能,本文构建了可诱导表达Mesp1的慢病毒载体,转染进P19细胞,经嘌呤霉素筛选并扩大培养后,成功建立起经强力霉素诱导后可稳定过表达Mesp1... Mesp1属于b HLH转录因子家族,对早期心脏中胚层的形成十分重要。为研究Mesp1在心脏发育过程中的功能,本文构建了可诱导表达Mesp1的慢病毒载体,转染进P19细胞,经嘌呤霉素筛选并扩大培养后,成功建立起经强力霉素诱导后可稳定过表达Mesp1基因的细胞系P19-Mesp1,为研究Mesp1心脏发育相关功能提供有用的细胞研究模型。 展开更多
关键词 可诱导慢病毒载体 Mesp1 强力霉素 P19 稳定细胞系
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野生型及突变型HIV-1 LTR驱动的荧光素酶稳定表达细胞株的建立 预览 被引量:2
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作者 刘林 杨少宗 +4 位作者 林师冠 王晓辉 孔垂瑾 曲喜英 朱焕章 《复旦学报:自然科学版》 CAS CSCD 北大核心 2013年第2期278-283,共6页
HIV潜伏感染是造成抗病毒疗法无法根除病人体内病毒的主要原因.建立有效的药物筛选模型,是成功筛选高效、低毒性HIV潜伏激活剂的关键.本研究中,我们构建了野生型及κB和TAR顺式元件突变型HIV-1LTR驱动的荧光素酶表达载体,并通过质粒转... HIV潜伏感染是造成抗病毒疗法无法根除病人体内病毒的主要原因.建立有效的药物筛选模型,是成功筛选高效、低毒性HIV潜伏激活剂的关键.本研究中,我们构建了野生型及κB和TAR顺式元件突变型HIV-1LTR驱动的荧光素酶表达载体,并通过质粒转染人胚肾293细胞,通过G418筛选,获得了稳定表达的细胞克隆.从每个克隆中抽提基因组DNA,进行PCR扩增和序列分析,结果显示:报告载体稳定整合在细胞基因组中.进一步通过TNF-α去处理这些细胞模型,结果显示:10ng/mL TNF-α可以有效地激活野生型LTR和ΔTARLTR细胞,对ΔκB LTR细胞中荧光素酶表达水平没有影响.激活效果还在同一细胞的不同细胞克隆中得到了重复验证. 展开更多
关键词 HIV-1 LTR NF-κB 稳定细胞系
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miR-143在鼻咽癌细胞系中的表达及其对高转移细胞株5-8F的影响 预览
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作者 钟文 何本夫 +3 位作者 全天一 朱成全 周思朗 陈永乐 《南方医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第4期582-585,共4页
目的检测鼻咽癌细胞系中miR-143表达情况,建立稳定高表达miR-143的鼻咽癌细胞系,为研究其在鼻咽癌的发生和发展中的作用机制提供可靠的细胞模型。方法采用QPCR方法检测鼻咽癌细胞系CEN1、CNE2、HONE1、5-8F、6-10B及人永生化鼻咽上皮细... 目的检测鼻咽癌细胞系中miR-143表达情况,建立稳定高表达miR-143的鼻咽癌细胞系,为研究其在鼻咽癌的发生和发展中的作用机制提供可靠的细胞模型。方法采用QPCR方法检测鼻咽癌细胞系CEN1、CNE2、HONE1、5-8F、6-10B及人永生化鼻咽上皮细胞NP69中miR-143的表达水平。构建重组逆转录病毒质粒pMSCV-puro-miR-143,包装逆转录病毒pMSCV-miR-143和pMSCV-Vector并感染鼻咽癌细胞,建立稳定高表达miR-143的鼻咽癌细胞系,并应用细胞黏附实验检测过表达mir-143后,鼻咽癌细胞对胞外基质的黏附性。结果鼻咽癌细胞系中miR-143的表达水平均低于对照组NP69细胞,其中高转移潜能细胞株5-8F的表达量最低,仅为对照组的3.03%,成瘤但不转移细胞株6-10B表达量最高,为对照组的63.59%。实时荧光定量PCR显示筛选后第7代细胞miR-143的表达水平比对照组高出达1080倍(P〈0.05)。细胞黏附实验结果显示,过表达mir-143可降低5-8F细胞对胞外基质的黏附性。结论 miR-143在鼻咽癌细胞系中表达失常,其作用可能与鼻咽癌细胞的侵袭和转移相关;成功建立了稳定高表达miR-143的鼻咽癌细胞系,并初步确定miR-143能抑制5-8F细胞的黏附能力,为探索miR-143在鼻咽癌的发生和发展中的作用机制奠定了实验基础。 展开更多
关键词 MIR-143 鼻咽癌 逆转录病毒 稳定细胞系 黏附
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