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5种埃博拉病毒多重实时荧光PCR方法的建立
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作者 师永霞 黄吉城 +4 位作者 袁帅 黎东红 孙芳芳 郑夔 戴俊 《中国国境卫生检疫杂志》 CAS 2019年第1期1-4,共4页
目的建立扎伊尔型(EBOZ)、苏丹型(EBOS)、科特迪瓦型(EBOC)、本迪布焦型(EBOB)和莱斯顿型(EBOR)埃博拉病毒多重实时荧光PCR检测方法,一次检测可实现5种埃博拉病毒的分型。方法比较5种15株埃博拉病毒基因组的保守性和特异性,设计5种埃博... 目的建立扎伊尔型(EBOZ)、苏丹型(EBOS)、科特迪瓦型(EBOC)、本迪布焦型(EBOB)和莱斯顿型(EBOR)埃博拉病毒多重实时荧光PCR检测方法,一次检测可实现5种埃博拉病毒的分型。方法比较5种15株埃博拉病毒基因组的保守性和特异性,设计5种埃博拉病毒特异性引物和探针用于核酸检测,EBOZ、EBOS、EBOC、EBOB和EBOR分别使用FAM、VIC、Texas red、FAM、VIC荧光基团标记探针。分2管对5种埃博拉病毒进行多重实时荧光PCR检测,其中管1检测EBOZ、EBOS和EBOC,管2检测EBOB和EBOR。使用不同浓度的埃博拉病毒阳性对照质粒进行检测,确定最佳的引物、探针用量和Mg2+用量,建立5种埃博拉病毒分型检测的多重实时荧光PCR方法。同时,对建立的方法进行灵敏度、特异性和灵敏度分析。结果优化的多重实时荧光PCR方法的引物和探针终浓度分别为160 nmol/L和80 nmol/L,Mg2+终浓度为2 mmol/L。建立的方法灵敏度为103拷贝/ml,EBOZ、EBOS、EBOC、EBOB和EBOR实时荧光PCR检测10次的CV值分别为0.16%、0.25%、0.24%、0.22%、0.28%。埃博拉病毒多重实时荧光PCR对马尔堡病毒阳性对照,登革病毒、黄热病毒、基孔肯雅病毒、寨卡病毒、裂谷热病毒等阳性毒株检测结果为阴性。结论建立的5种埃博拉病毒多重实时荧光PCR检测方法灵敏度高,特异性强,重复性好,可用于口岸输入性埃博拉出血热病例的早期检测和分型鉴别。 展开更多
关键词 扎伊尔埃博拉病毒 苏丹埃博拉病毒 科特迪瓦埃博拉病毒 本迪布焦埃博拉病毒 莱斯顿埃博拉病毒 多重实时荧光PCR
苏丹型埃博拉病毒糖蛋白原核表达及抗体间接ELISA检测方法的建立
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作者 吴芳芳 曹增国 +10 位作者 焦翠翠 王琪 迟航 侯朋飞 黄培 金宏丽 赵永坤 李忠义 王化磊 杨松涛 夏咸柱 《中国病原生物学杂志》 CSCD 北大核心 2018年第1期1-4,10共5页
目的 原核表达苏丹型埃博拉病毒(Sudan virus,SUDV)糖蛋白(GP),并作为包被抗原建立抗体间接ELISA检测方法。方法 PCR扩增SUDV GP基因片段,克隆至pET30a(+)表达载体,IPTG诱导表达SUDV GP,经HisNi柱纯化,SDS-PADE和Western blot鉴... 目的 原核表达苏丹型埃博拉病毒(Sudan virus,SUDV)糖蛋白(GP),并作为包被抗原建立抗体间接ELISA检测方法。方法 PCR扩增SUDV GP基因片段,克隆至pET30a(+)表达载体,IPTG诱导表达SUDV GP,经HisNi柱纯化,SDS-PADE和Western blot鉴定正确的SUDV GP作为包被抗原建立SUDV抗体间接ELISA方法,并对实验条件进行优化。结果SUDV GP在大肠杆菌中以包涵体的形式表达,建立的抗体间接ELISA检测方法最佳SUDV GP包被量为2μg/孔,待检血清最佳稀释度为1∶320,最佳作用时间1.5h,HRP标记羊抗鼠IgG最佳稀释度1∶10 000,TMB最佳显色时间为7min。该方法的特异性强,样品检测结果与已知血清的符合率为100%,检测SUDV阳性血清的敏感度为1∶40 960,SUDV GP批间及批内的实验结果变异系数(CV)均小于10%。结论成功表达SUDV GP并建立SUDV抗体间接ELISA检测方法,为疫苗免疫效果的评价、疫病的监测及SUDV抗体检测试剂盒的研发奠定了基础。 展开更多
关键词 苏丹埃博拉病毒 原核表达 糖蛋白 ELISA
含5种烈性出血热病毒的假病毒阳性参考品的制备 被引量:1
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作者 曹雪锋 康晓平 +4 位作者 冉鑫 霍耐凡 吴晓燕 李裕昌 杨银辉 《军事医学》 CAS CSCD 北大核心 2016年第9期713-716,737共5页
目的 利用慢病毒载体系统制备含有马尔堡病毒(Marburg virus)、扎伊尔型埃博拉病毒(Zaire Ebola virus)、苏丹型埃博拉病毒(Sudan Ebola virus)、拉沙热病毒(Lassa fever virus)和黄热病毒(Yellow fever virus)5种烈性病毒核... 目的 利用慢病毒载体系统制备含有马尔堡病毒(Marburg virus)、扎伊尔型埃博拉病毒(Zaire Ebola virus)、苏丹型埃博拉病毒(Sudan Ebola virus)、拉沙热病毒(Lassa fever virus)和黄热病毒(Yellow fever virus)5种烈性病毒核酸片段的假病毒,为其核酸检测提供一种通用的阳性参考品。方法 体外合成该5种病毒的目的基因片段,通过融合PCR技术将5个片段连接成一条基因,然后克隆到慢病毒表达载体上,并与其辅助载体共转染293T细胞;转染后分别于48、72 h收集培养上清,用DNase和RNase进行消化处理及纯化浓缩,最后提取核酸,利用普通PCR和实时荧光定量PCR鉴定假病毒是否包装成功。结果 测序结果表明,体外合成的该5种病毒的目的基因片段已正确连接并插入慢病毒载体中;载体转染293T细胞后收集上清中的假病毒,提取核酸经上述两种PCR鉴定均可特异性检测到靶基因,表明已成功包装出含该5种出血热病毒靶基因的假病毒颗粒。结论 该研究获得的假病毒颗粒可作为上述5种出血热相关烈性病毒核酸检测的通用阳性参考品。 展开更多
关键词 马尔堡病毒 扎伊尔埃博拉病毒 苏丹埃博拉病毒 拉沙热病毒 黄热病毒 病毒 阳性参考品
苏丹型埃博拉病毒焦磷酸测序方法的建立 预览
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作者 赵永刚 邹艳丽 +3 位作者 张永强 吴晓东 王清华 王志亮 《中国动物检疫》 CAS 2015年第9期77-81,共5页
[目的]本研究旨在通过对埃博拉病毒进行序列信息分析的基础上,利用焦磷酸测序技术对苏丹型埃博拉病毒进行快速检测和鉴定。[方法]通过序列信息比对,设计苏丹型埃博拉病毒基因保守区段的扩增引物及测序引物。通过人工方法合成一段基因序... [目的]本研究旨在通过对埃博拉病毒进行序列信息分析的基础上,利用焦磷酸测序技术对苏丹型埃博拉病毒进行快速检测和鉴定。[方法]通过序列信息比对,设计苏丹型埃博拉病毒基因保守区段的扩增引物及测序引物。通过人工方法合成一段基因序列,PCR扩增目的基因片段,经体外转录制备c RNA,RT-PCR扩增目的基因片段,采用焦磷酸测序技术针对目的基因进行保守核苷酸区段的测序分析。[结果]通过序列信息比对寻找到苏丹型埃博拉病毒基因型的核苷酸保守区段,经焦磷酸测序后能进一步确证毒株的序列信息为苏丹型埃博拉病毒。经过与华大基因公司进行Sanger法测序比较,结果完全一致。[结论]基于序列分析的焦磷酸测序技术可以作为进一步确证方法使用。 展开更多
关键词 苏丹埃博拉病毒 序列比对 焦磷酸测序
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