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基于DPP4转导快速建立MERS-CoV假病毒感染小鼠模型
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作者 牛军伟 詹瑛 +1 位作者 邓瑶 谭文杰 《中华微生物学和免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2019年第4期250-255,共6页
目的快速建立一种动态便捷的观察中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)假病毒感染小鼠的可视化方法。方法本研究首先采用HeLa细胞体外验证重组腺病毒Ad5-hDPP4及假病毒荧光素酶的表达及功能;然后将表达MERS-CoV受体hDPP4的重组腺病毒通过... 目的快速建立一种动态便捷的观察中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)假病毒感染小鼠的可视化方法。方法本研究首先采用HeLa细胞体外验证重组腺病毒Ad5-hDPP4及假病毒荧光素酶的表达及功能;然后将表达MERS-CoV受体hDPP4的重组腺病毒通过胸腔注射和腹腔注射的方式转导BALB/c小鼠,继而以胸腔注射或腹腔注射的方式接种携带萤火虫荧光素酶报告基因的高滴度(3×10^7 TCID50)MERS-CoV假病毒,并通过荧光活体成像仪观察MERS-CoV假病毒在体内的感染过程与分布特点。结果重组腺病毒Ad5-hDPP4及假病毒荧光素酶在HeLa细胞中能有效表达;重组腺病毒经腹腔转导hDPP4,BALB/c小鼠接种MERS-CoV假病毒48~96 h后,在小鼠的腹部能检测到荧光素酶表达;胸腔转导hDPP4,BALB/c小鼠接种MERS-CoV假病毒后,在48 h左右可检测到荧光素酶在胸腔的表达。结论本研究报道了一种简便快捷建立MERS-CoV感染可视化小鼠模型的方法,为中和抗体或进入抑制剂的体内评价提供了有效手段。 展开更多
关键词 中东呼吸综合征冠状病毒假病毒 动物模型 小鼠 荧光素酶 活体成像
荧光素酶在蛋白质相互作用研究中的应用 被引量:1
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作者 宋晓菡 王楠 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第1期27-34,共8页
蛋白质相互作用参与细胞的多项生理活动,是生命科学研究的一个重要领域。化学发光,特别是基于生物酶的化学发光即生物发光,提供了极灵敏的检测信号,因而在实际应用中具有诸多优势。荧光素酶如萤火虫荧光素酶、细菌荧光素酶、海肾荧光素... 蛋白质相互作用参与细胞的多项生理活动,是生命科学研究的一个重要领域。化学发光,特别是基于生物酶的化学发光即生物发光,提供了极灵敏的检测信号,因而在实际应用中具有诸多优势。荧光素酶如萤火虫荧光素酶、细菌荧光素酶、海肾荧光素酶,以及近年来出现的几种低分子量荧光素酶,具有不同的酶催化特性及理化特征。它们应用于蛋白质片段互补与共振能量转移技术等各种生化检测方法,为观察蛋白质相互作用提供了更安全便捷的手段,拓宽了蛋白质相互作用检测技术的适用范围。本文综述了常用荧光素酶的特征和它们在各种蛋白质相互作用检测方法中使用的原理、策略及其适用性。 展开更多
关键词 生物发光 荧光素酶 蛋白质相互作用 片段互补 生物发光共振能量转移
荧光素酶标记A20鼠B细胞淋巴瘤移植模型的建立
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作者 赵莎莎 管立勋 +3 位作者 高哲 王飞雁 王莉莉 高春记 《中国实验血液学杂志》 CSCD 北大核心 2018年第1期153-158,共6页
目的:建立荧光素酶标记A20鼠B细胞淋巴瘤移植模型,为后期异基因造血干细胞移植中移植物抗肿瘤作用的研究提供实验工具。方法:将萤火虫荧光素酶作为标记基因导入A20鼠B细胞淋巴瘤细胞株,建立稳定表达荧光素酶的A20细胞株;将其与C57BL/... 目的:建立荧光素酶标记A20鼠B细胞淋巴瘤移植模型,为后期异基因造血干细胞移植中移植物抗肿瘤作用的研究提供实验工具。方法:将萤火虫荧光素酶作为标记基因导入A20鼠B细胞淋巴瘤细胞株,建立稳定表达荧光素酶的A20细胞株;将其与C57BL/6小鼠骨髓经尾静脉共同接种于辐射后的BALB/c小鼠体内,建立移植肿瘤模型;用活体荧光成像系统检测肿瘤的发生发展,并观察小鼠的活存,体重变化以及成瘤部位;取肿瘤组织和动物脏器行石蜡包埋、病理切片、HE染色观察其组织学特点。结果:经慢病毒转染和嘌呤霉素筛选获得了稳定表达荧光素酶基因的A20细胞株。活体荧光成像观察发现,在A20细胞接种第8天,即可观察到肿瘤发光,随着观察天数的增加荧光强度增强。相比较于骨髓移植(BMT)组,BMT+A2 0-Luc^+组小鼠存活率下降,体重降低明显。大体解剖显示,成瘤部位主要波及肝脏和脾脏,成瘤组织特征类似人弥漫大B细胞淋巴瘤。结论:成功构建了荧光素酶标记A20鼠B细胞淋巴瘤移植模型,为探讨异基因造血干细胞移植中移植物抗肿瘤作用提供了研究平台。 展开更多
关键词 A20细胞株 B细胞淋巴瘤 荧光素酶 骨髓移植 活体荧光成像 移植模型
携带荧光素酶基因肝癌细胞株的构建及在肝癌原位移植瘤模型中应用
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作者 翟向明 雷川 +2 位作者 梁芷冰 李红卫 杜红延 《生物技术》 2018年第1期71-76,共6页
[目的]构建稳定表达荧光素酶基因的人肝癌细胞株,建立可实时观察的肝癌原位移植瘤模型。[方法]构建含有萤光素酶基因的慢病毒载体,利用慢病毒三质粒系统磷酸钙共转染HEK 293T细胞,收集纯化病毒感染肝癌细胞SMMC7721,嘌呤霉素(puromyci... [目的]构建稳定表达荧光素酶基因的人肝癌细胞株,建立可实时观察的肝癌原位移植瘤模型。[方法]构建含有萤光素酶基因的慢病毒载体,利用慢病毒三质粒系统磷酸钙共转染HEK 293T细胞,收集纯化病毒感染肝癌细胞SMMC7721,嘌呤霉素(puromycin)结合有限稀释法筛选稳定转导细胞株,将细胞原位注射裸鼠肝组织,建立原位肝癌动物模型。[结果]包装纯化的慢病毒悬液的滴度为8.4×106TU/m L,感染肝癌细胞后成功筛选到稳定表达的肝癌细胞株。利用该细胞株成功建立原位注射肝癌裸鼠模型,经活体荧光成像系统观察到肝癌细胞在活体动物体内的分布情况。[结论]荧光素酶肝癌细胞株的成功构建及利用该细胞株建立的原位移植瘤肝癌动物模型为肝癌的治疗研究奠定了基础。 展开更多
关键词 荧光素酶 肝癌细胞 原位移植瘤 生物荧光成像 动物模型
穿膜肽标记的荧光素酶蛋白在大肠杆菌中表达条件的优化及其活性研究 预览
5
作者 余婷玉 方志远 +2 位作者 黄卫 王淋荆 徐宁 《实验技术与管理》 北大核心 2018年第2期62-66,共5页
将重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,在不同的诱导时机、诱导温度、IPTG的浓度和Mg(2+)浓度条件下培养大肠杆菌,通过SDS-PAGE和发光强度检测分析TAT-LUC的酶活性强度及表达量;将高活性的TAT-LUC与LUC对比检测ATP,通过发光强度分... 将重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,在不同的诱导时机、诱导温度、IPTG的浓度和Mg(2+)浓度条件下培养大肠杆菌,通过SDS-PAGE和发光强度检测分析TAT-LUC的酶活性强度及表达量;将高活性的TAT-LUC与LUC对比检测ATP,通过发光强度分析TAT-LUC的敏感性和可靠性。表明:在含Mg(2+)浓度为50mmol/L的LB培养基中将大肠杆菌培养至OD600为0.6时,加入终浓度为0.5mmol/L的IPTG,22℃诱导16h可获得大量高活性的TAT-LUC;相比LUC,TAT-LUC可以检测到小于10nmol/L的ATP,发光强度与ATP含量呈强相关性(R2=0.99);并且不用裂解细胞,TAT-LUC可直接检测至少40个细胞内ATP;穿膜肽标记的荧光素酶蛋白成功用于检测活细胞内的ATP含量。 展开更多
关键词 荧光素酶 穿膜肽 ATP 表达条件 活性
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精子顶体相关基因SPACA7的转录活性研究 预览
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作者 张菁华 周永翠 唐爱发 《生殖医学杂志》 CAS 2018年第5期431-436,共6页
目的研究精子顶体相关基因SPACA7转录起始位点上游-2 000bp至下游+84bp范围内启动子活性。方法利用启动子截短实验获得人类SPACA7基因转录起始位点上游-2 000bp与下游+84bp序列的系列不同长度的启动子共16个,以人肾上皮细胞293T基因组... 目的研究精子顶体相关基因SPACA7转录起始位点上游-2 000bp至下游+84bp范围内启动子活性。方法利用启动子截短实验获得人类SPACA7基因转录起始位点上游-2 000bp与下游+84bp序列的系列不同长度的启动子共16个,以人肾上皮细胞293T基因组DNA为模板,进行PCR反应,将不同长度的启动子重组至荧光素酶表达载体pGL3-basic中并转染细胞,转染24h后收集细胞加入裂解液,收集细胞裂解液,利用多功能酶标仪测定荧光素酶活性。结果我们研究了SPACA7启动子-2 000bp至+84bp序列,构建了16个不同长度的promoter::Luciferase,荧光素酶活性检测结果发现各个启动子都具有一定的活性,其中-1 500bp至+84bp序列启动子活性最高。结论初步证明精子顶体相关基因SPACA7启动子在-1 500bp至+84bp区域具有较强转录活性。 展开更多
关键词 启动子 荧光素酶 转录活性 精子顶体
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生物发光成像示踪干细胞移植的应用进展 预览
7
作者 赵年欢 崔邦平 +3 位作者 王朋 代文莉 田金玲 邓鹏裔 《巴楚医学》 2018年第1期125-128,共4页
干细胞移植在多种疾病的治疗研究中越来越受重视。但是目前,干细胞于体内移植后的归巢、迁移、分布、增殖及分化等生物学行为却难以实时动态监测。近年来,随着科学技术的日新月异,生物发光成像被应用于无创、活体、实时示踪评价干细胞... 干细胞移植在多种疾病的治疗研究中越来越受重视。但是目前,干细胞于体内移植后的归巢、迁移、分布、增殖及分化等生物学行为却难以实时动态监测。近年来,随着科学技术的日新月异,生物发光成像被应用于无创、活体、实时示踪评价干细胞移植情况,有效的减少了实验动物的数量以及个体差异而引起的误差。本文就生物发光成像在示踪干细胞移植中的研究进展做一简要综述。 展开更多
关键词 干细胞 生物发光成像 报告基因 荧光素酶
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用于活体成像裸鼠肺癌肿瘤模型的建立 被引量:1
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作者 范园园 李铁 +10 位作者 陈爽 李一权 荣凤君 李文杰 尹逊哲 韩继成 李善智 李敏 崔传信 李霄 金宁一 《中国兽医学报》 CSCD 北大核心 2018年第6期1177-1184,共8页
本研究构建1株能够稳定表达荧光素酶的人肺癌细胞,并进行生物学特性鉴定及体内成瘤情况验证。将携带有萤火虫荧光素酶基因的pGL4.50质粒转入A549细胞中,利用G418一直加压筛选出能够表达荧光素酶的阳性细胞克隆,并对阳性细胞克隆进... 本研究构建1株能够稳定表达荧光素酶的人肺癌细胞,并进行生物学特性鉴定及体内成瘤情况验证。将携带有萤火虫荧光素酶基因的pGL4.50质粒转入A549细胞中,利用G418一直加压筛选出能够表达荧光素酶的阳性细胞克隆,并对阳性细胞克隆进行稳定性和体外活体成像检测。测定A549-luc细胞和A549细胞的生长曲线、迁移、侵袭及细胞周期,确定转染前后细胞生物学特性变化。为检测A549-luc细胞在体内成瘤和发光情况,建立裸鼠皮下荷瘤模型并应用小动物活体成像系统观察。结果表明,通过G418一直加压筛选和荧光素酶活性检测,筛选出2株荧光素酶活性高的克隆Clone20和Clone28,并连续传至40代,每5代检测1次荧光素酶活性,最终保留荧光素酶活性和稳定性最高的Clone28,Clone28通过体外活体成像检测显示生物发光值与细胞数目呈正相关的线性关系(R^2=0.9948)。A549-luc细胞和A549细胞具有相似的生长特性、迁移和侵袭能力以及细胞周期。成功建立了裸鼠皮下荷瘤模型,其发光强度与肿瘤体积呈正相关的线性关系(R^2=0.9715)。本研究稳定表达荧光素酶的人肺癌细胞的构建并成功建立裸鼠皮下荷瘤模型,可通过活体生物成像系统动态监测肿瘤的变化。 展开更多
关键词 A549细胞 荧光素酶 活体成像 裸鼠 肺癌肿瘤模型
双分子荧光互补分析法检测α-突触核蛋白的聚集及在细胞间的传播 预览
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作者 任晓曦 赵云 +3 位作者 韩玉坤 郑焱 杨慧 张建亮 《中国老年学杂志》 北大核心 2018年第23期5769-5772,共4页
目的利用双分子荧光互补(BiFC)分析检测α-突触核蛋白的聚集及在细胞间的传播。方法首先利用高灵敏的荧光素酶human Gaussiaprinceps luciferase作为报告蛋白,将其N端(1~93)与C端(94~169)分别与α-突触核蛋白的C端融合,记作L1和L2,并将L... 目的利用双分子荧光互补(BiFC)分析检测α-突触核蛋白的聚集及在细胞间的传播。方法首先利用高灵敏的荧光素酶human Gaussiaprinceps luciferase作为报告蛋白,将其N端(1~93)与C端(94~169)分别与α-突触核蛋白的C端融合,记作L1和L2,并将L1和L2同时在SK-N-SH细胞中共同表达,结果显示BiFC分析可以特异地检测出α-突触核蛋白的聚集。接下来将L1和L2分别在SK-N-SH细胞中表达,收集L1的培养基加入到表达L2的细胞中。同理,收集L2的培养基加入到表达L1的细胞中。结果BiFC分析可检测到α-突触核蛋白在细胞间传播。结论BiFC可有效检测α-突触核蛋白的聚集及在细胞间传播。 展开更多
关键词 Α-突触核蛋白 聚集 传播 双分子荧光互补分析法 荧光素酶
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青海弧菌荧光素酶的异源表达条件的优化
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作者 李璠 丁武 +2 位作者 彭国霞 王妍稳 张莉丽 《中国食品学报》 CSCD 北大核心 2018年第5期167-172,共6页
生物发光标记以其可视化,便捷,快速,灵敏,可用于活体研究等诸多优点越来越多地应用于科学研究中。本研究通过Ca Cl2方法将实验室构建的带有青海弧菌荧光素酶基因lux AB的重组质粒导入大肠杆菌Top10中,利用酶切和核酸电泳检测荧光素酶基... 生物发光标记以其可视化,便捷,快速,灵敏,可用于活体研究等诸多优点越来越多地应用于科学研究中。本研究通过Ca Cl2方法将实验室构建的带有青海弧菌荧光素酶基因lux AB的重组质粒导入大肠杆菌Top10中,利用酶切和核酸电泳检测荧光素酶基因的存在,利用SDS-PAGE检测荧光素酶表达的情况,然后对其表达条件进行优化。单因素试验结果表明:在培养基初始pH值6.0,癸醛体积分数1.25‰,接种量1%,IPTG浓度0.1 mmol/L,装液量50 m L/150 m L,温度37℃条件下,重组菌的发光度最大,即表达量最高。正交试验结果表明:当pH 6,IPTG浓度0.08 mmol/L,接种量1.2%,温度36℃时重组大肠杆菌表达情况最好,发光度达1 262.7。本研究中的重组大肠杆菌为在益生菌等食品微生物中的应用提供技术依据。 展开更多
关键词 青海弧菌 荧光素酶 优化 生物发光
八种中草药乙醇提取物体外抗IBV增殖的研究
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作者 安红柳 梁雄燕 +1 位作者 王真 方守国 《黑龙江畜牧兽医》 北大核心 2018年第22期179-181,184共4页
为了研究不同中草药的乙醇提取物对禽传染性支气管炎病毒(IBV)增殖的抑制效果,试验利用嵌合了荧光素酶的重组病毒IBV-3ab-luc与底物结合发出荧光的特性,定量检测了八种中药乙醇提取物在H1299细胞中的抗病毒活性,并对其中抑制效果最好... 为了研究不同中草药的乙醇提取物对禽传染性支气管炎病毒(IBV)增殖的抑制效果,试验利用嵌合了荧光素酶的重组病毒IBV-3ab-luc与底物结合发出荧光的特性,定量检测了八种中药乙醇提取物在H1299细胞中的抗病毒活性,并对其中抑制效果最好的中药乙醇提取物的不同浓度药液对IBV增殖的抑制效果进行了检测。结果表明:皂荚乙醇提取物对IBV增殖的抑制效果最好,在病毒感染前期、中期加入皂荚乙醇提取物,病毒的数量与对照组相比均明显降低,抑制效力分别为4和5,且最佳使用浓度分别为0. 2 g/m L和0. 1 g/m L;白芍乙醇提取物在病毒感染中期加入效果较好,抑制效力为4;其他中草药乙醇提取物对病毒均无明显抑制效果。 展开更多
关键词 禽传染性支气管炎病毒(IBV) 荧光素酶 IBV-3ab-luc 中草药乙醇提取物 抗病毒活性
GFP/Luc双标食管癌细胞动物模型建立及其活体成像观察 预览
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作者 柏文 彭晓清 +3 位作者 王佩文 鞠前前 史辉 蒋茂荣 《中国比较医学杂志》 北大核心 2018年第11期89-94,共6页
目的 建立绿色荧光蛋白(GFP)/荧光素酶(Luc)双标的人食管癌ECA109细胞系(ECA109-Luc-GFP),采用一种非侵入性的生物活体成像方法监测食管癌裸鼠肿瘤模型。方法 MTT、流式细胞仪、划痕实验分析法检测ECA109-Luc-GFP细胞系与正常ECA109细... 目的 建立绿色荧光蛋白(GFP)/荧光素酶(Luc)双标的人食管癌ECA109细胞系(ECA109-Luc-GFP),采用一种非侵入性的生物活体成像方法监测食管癌裸鼠肿瘤模型。方法 MTT、流式细胞仪、划痕实验分析法检测ECA109-Luc-GFP细胞系与正常ECA109细胞的生物学特性差异。利用活体成像系统示踪肿瘤。结果 与正常ECA109相比,ECA109-Luc-GFP细胞在细胞活力、增殖和迁移能力方面差异均无显著性(P>0.05)。利用小动物活体成像实验技术观察了肿瘤生长、转移等生物学特性。结论 成功构建了GFP/Luc双标的人食管癌ECA109细胞系(ECA109-Luc-GFP),应用小动物活体成像应用技术并活体观察食管癌动物模型的生长、转移。 展开更多
关键词 荧光素酶 食管癌 移植瘤 肿瘤小鼠模型 活体成像
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NanoLuc标记的重组克里米亚-刚果出血热病毒及其初步用于抗病毒药物筛选
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作者 夏菡 袁志明 Dennis Bente 《中华实验和临床病毒学杂志》 CAS CSCD 2018年第6期620-624,共5页
目的为了构建可分泌表达NanoLuc荧光素酶的重组克里米亚-刚果出血热病毒(Crimean-Congo hemorrhagic fever virus,CCHFV)并探讨其用于抗病毒药物高通量快速初筛的可行性。方法将NanoLuc基因与CCHFVM节段上的mucin编码框融合,拯救重组病... 目的为了构建可分泌表达NanoLuc荧光素酶的重组克里米亚-刚果出血热病毒(Crimean-Congo hemorrhagic fever virus,CCHFV)并探讨其用于抗病毒药物高通量快速初筛的可行性。方法将NanoLuc基因与CCHFVM节段上的mucin编码框融合,拯救重组病毒,并以利巴韦林为阳性对照,评估Furin抑制剂在体外对重组病毒的抑制效果。结果成功获得可分泌表达NanoLuc荧光素酶的重组CCHFV(rCCHFV_mucin_NLuc),且在感染细胞上清中,表示NanoLuc活性的相对光单位(relative light unit,RLU)与病毒半数组织感染剂量(TCID50)呈显著正相关性(cor=0.998,P=0.001)。10μmol/L浓度下,Furin抑制剂处理后1~3d感染细胞上清中NanoLuc荧光素酶活力与利巴韦林处理组无明显差异(P>0.1),但第4天Furin抑制剂处理组上清中RLU值显著高于利巴韦林处理组(P=0.001),且与未处理病毒对照组无明显差异(P>0.1)。结论成功构建1株NanoLuc标记的rCCHFV并可用于抗病毒药物的体外快速初筛。 展开更多
关键词 荧光素酶 克里米亚-刚果出血热病毒 抗病毒药物 筛选
稳定表达荧光素酶基因的TC-1细胞系的构建 预览
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作者 韩笑笑 刘丽雅 +3 位作者 谭超月 李元 高君碧 韩丽萍 《郑州大学学报:医学版》 北大核心 2018年第4期429-432,共4页
目的:通过表达荧光素酶的慢病毒载体感染TC-1细胞株,建立稳定表达荧光素酶的TC-1细胞株。方法:根据荧光素酶基因设计引物,PCR扩增获得目的基因,构建表达荧光素酶的慢病毒载体并包装重组慢病毒,感染TC-1细胞。嘌呤霉素加压筛选,鉴定。... 目的:通过表达荧光素酶的慢病毒载体感染TC-1细胞株,建立稳定表达荧光素酶的TC-1细胞株。方法:根据荧光素酶基因设计引物,PCR扩增获得目的基因,构建表达荧光素酶的慢病毒载体并包装重组慢病毒,感染TC-1细胞。嘌呤霉素加压筛选,鉴定。用双荧光素酶报告基因检测试剂盒及体外成像系统进行荧光素酶活性检测。结果:经检测证实细胞感染及筛选后,成功构建了稳定高表达荧光素酶的TC-1细胞。结论:获得荧光素酶稳定表达的TC-1细胞,转染效果确切,荧光素酶基因表达稳定。 展开更多
关键词 TC-1细胞 荧光素酶 活体成像 生物发光 宫颈癌
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HIF-2α对胃癌BGC823细胞ERCC1基因调控的实验研究 预览
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作者 范宝化 骆玉霜 +3 位作者 李燕 吴密璐 郭启靖 刘昱君 《临床肿瘤学杂志》 CAS 北大核心 2018年第4期298-304,共7页
目的探讨低氧诱导因子-2α(HIF-2α)基因表达对胃癌BGC823细胞切除修复交叉互补基因1(ERCC1)表达的影响。方法以人HIF-2α基因为模板,突变两个氨基酸位点(P531A、P405A)来构建HIF-2α突变体(HIF-2α-d PA),获得HIF-2α-d PA慢... 目的探讨低氧诱导因子-2α(HIF-2α)基因表达对胃癌BGC823细胞切除修复交叉互补基因1(ERCC1)表达的影响。方法以人HIF-2α基因为模板,突变两个氨基酸位点(P531A、P405A)来构建HIF-2α突变体(HIF-2α-d PA),获得HIF-2α-d PA慢病毒表达载体重组质粒。通过慢病毒感染,建立稳定表达HIF-2α蛋白的BGC823细胞株,采用QPCR、Western blotting检测HIF-2α和ERCC1 mRNA及蛋白的表达。根据人ERCC1基因启动子序列设计引物,扩增人基因组DNA中的ERCC1启动子,将ERCC1基因启动子插入双酶切p GL3-Basic报告载体后,获得p GL3-Basic-ERCC1-promoter载体重组质粒。重组质粒p GL3-Basic-ERCC1-promoter转染BGC823细胞24 h后,通过荧光素酶检测ERCC1启动子活性。结果成功构建HIF-2α蛋白稳定表达的人胃癌BGC823细胞株(HIF-2α-d PA BGC823稳定株),HIF-2α-d PA BGC823稳定株与空质粒转染BGC823细胞、对照质粒转染BGC823细胞相比,HIF-2αmRNA相对表达量上调[(4.50±0.42)vs.(1.42±0.41)vs.(0.99±0.15),P〈0.01],HIF-2α蛋白相对表达量上调[(3.75±0.47)vs.(1.00±0.14)vs.(1.05±0.34),P〈0.01],而ERCC1 mRNA和蛋白相对表达量均无明显上调。成功构建p GL3-Basic-ERCC1-promoter报告基因载体重组质粒。质粒转染至BGC823细胞及HIF-2α-d PA BGC823稳定株后,两组ERCC1启动子活性明显高于对照组[(1.01±0.17)vs.(1.25±0.12)vs.(0.02±0.02),P〈0.01],HIF-2α-d PA BGC823稳定株较未经HIF-2α突变处理的BGC823细胞的ERCC1启动子活性没有明显增加。结论 HIF-2α高表达的胃癌BGC823细胞没有促进ERCC1表达的显著变化。HIF-2α过表达的BGC823细胞没有引起ERCC1启动子活性显著增加。因此,HIF-2α是否调控ERCC1基因的表达,仍需进一步深入探讨。 展开更多
关键词 胃癌 低氧诱导因子-2α(HIF-2α) 切除修复交叉互补基因1(ERCC1) 慢病毒 启动子 荧光素酶
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荧光素酶表达的淋巴瘤NCG小鼠模型的构建 预览
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作者 钟杨城 陆盼盼 +8 位作者 王亚楠 姜正涛 杨辛毅 杨鹤 潘含雨 赵琳 李博康 周牧涯 朱焕章 《复旦学报:自然科学版》 CSCD 北大核心 2018年第6期725-731,共7页
目前建立的淋巴瘤动物模型大多是通过裸鼠皮下注射淋巴瘤细胞得到的,通过游标卡尺测量肿瘤大小,存在测量数据误差大,不能发现微小病灶,小鼠模型不适应于评估嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)疗法等问题.本研究旨在通过慢病毒载体导入荧光素酶基... 目前建立的淋巴瘤动物模型大多是通过裸鼠皮下注射淋巴瘤细胞得到的,通过游标卡尺测量肿瘤大小,存在测量数据误差大,不能发现微小病灶,小鼠模型不适应于评估嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)疗法等问题.本研究旨在通过慢病毒载体导入荧光素酶基因,经嘌呤霉素筛选得到稳定表达荧光素酶的Raji细胞(Raji-luc+),细胞生物发光强度与细胞数量成正比,NOD-Prkdc^em26Cd52Il2rg^em26Cd22/Nju(NCG)免疫缺陷小鼠尾静脉注射Raji-luc+(1×10^6)细胞,通过活体成像仪连续检测,发现注射Raji-luc+细胞后发光强度逐渐增强,意味着淋巴瘤细胞在小鼠体内逐渐增殖和扩散,并建立生存曲线.这些数据表明成功建立了荧光素酶标记的淋巴瘤小鼠模型. 展开更多
关键词 淋巴瘤 RAJI细胞 荧光素酶 活体成像 NCG 嵌合抗原受体T细胞
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重组溶瘤腺病毒对荧光素酶标记和非标记人肺癌A549细胞抑制作用比较
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作者 马艺珍 范园园 +10 位作者 聂鑫 孙丽丽 朱羿龙 李一权 李文杰 尹逊哲 李善智 赵津 李霄 郭焱 金宁一 《中国肿瘤生物治疗杂志》 CSCD 北大核心 2018年第12期1264-1269,共6页
目的:探讨重组溶瘤腺病毒Ad-Apoptin-hTERTp-E1A(ATV)对荧光素酶标记人肺癌细胞(A549-luc)和人肺癌细胞(A549)的体外抑制作用差异。方法:利用ATV分别感染A549细胞和A549-luc细胞,通过WST-1和结晶紫染色法确定ATV的抑制作用的差异性,通过... 目的:探讨重组溶瘤腺病毒Ad-Apoptin-hTERTp-E1A(ATV)对荧光素酶标记人肺癌细胞(A549-luc)和人肺癌细胞(A549)的体外抑制作用差异。方法:利用ATV分别感染A549细胞和A549-luc细胞,通过WST-1和结晶紫染色法确定ATV的抑制作用的差异性,通过Hoechst和AnnexinV-FITC/PI染色验证ATV的抑制方式。结果:ATV对A549和A549-luc细胞均具有明显抑制作用(P<0.05)。ATV在24、48、72h对两种细胞均有明显抑制作用(P<0.05或P<0.01),且72h抑制率最强;剂量分别为1、10和100MOI的ATV对两种细胞均有抑制作用,且100MOI抑制率最高。A549细胞和A549-luc细胞感染ATV后,均呈现核碎裂典型浓染和边集的凋亡现象,且凋亡率随时间的增加而增大,具有显著的时间效应(P<0.05或P<0.01),且凋亡率均在72h达到峰值。结论:荧光素酶的插入没有明显改变ATV对A549-luc细胞的抑制作用和抑制方式,ATV是通过诱导A549-luc细胞和A549细胞凋亡从而达到对其显著性体外抑制作用。 展开更多
关键词 溶瘤腺病毒 荧光素酶 A549-luc细胞 抑制作用
荧光素酶表达载体构建及其在巴斯德毕赤酵母的表达
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作者 罗展浩 吴清平 +4 位作者 张菊梅 丁郁 李程思 潘力 吴慧清 《现代食品科技》 北大核心 2018年第6期88-96,共9页
萤火虫荧光素酶(Firefly Luciferase,FL)是ATP快速检测技术的核心组件,通过荧光强度与ATP浓度的对应关系,在食品行业检测微生物数量发挥着重大作用。本文为实现荧光素酶在重组毕赤酵母GS115中的异源表达,通过从载体pGL2-control中扩... 萤火虫荧光素酶(Firefly Luciferase,FL)是ATP快速检测技术的核心组件,通过荧光强度与ATP浓度的对应关系,在食品行业检测微生物数量发挥着重大作用。本文为实现荧光素酶在重组毕赤酵母GS115中的异源表达,通过从载体pGL2-control中扩增荧光素酶基因luc,克隆到真核表达载体p PIC9K中,线性化后电击转化毕赤酵母GS115菌株,筛选阳性重组菌株。在甲醇的诱导下进行酶的表达,对粗酶液进行生物活性发光分析,然后对粗酶进行超滤、阴离子层析和分子筛凝胶层析三步纯化。甲醇诱导表达96 h发现胞外和胞内粗酶液均有相对较高的酶发光活性,酶活分别为1.45×10^6 RLU/mL和1.58×10^9 RLU/mL。SDS-PAGE与Western blot分析重组荧光蛋白大小约为70 ku,最终纯化得到的荧光素酶,其比活为7.0×10^8 RLU/mg,纯化倍数达到19.3倍,产量为48 mg/L。以上结果表明,荧光素酶能够在毕赤酵母表达系统获得较好的表达和纯化效果。 展开更多
关键词 ATP生物发光 真核表达 荧光素酶 毕赤酵母 纯化
荧光素酶与金丝桃素-镁离子配合物的相互作用 预览
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作者 丁怡 李晓婷 +1 位作者 周林 周家宏 《南京师大学报:自然科学版》 CSCD 北大核心 2018年第1期61-67,共7页
采用紫外-可见光谱法、荧光光谱法、圆二色谱法等研究了荧光素酶(Luc)与金丝桃素-镁离子配合物(Hyp-Mg 2+)的相互作用,包括结合位点、结合常数、结合力强弱、生物大分子构象变化等因素的影响.紫外-可见光谱表明,Hyp-Mg 2+与荧光素酶发... 采用紫外-可见光谱法、荧光光谱法、圆二色谱法等研究了荧光素酶(Luc)与金丝桃素-镁离子配合物(Hyp-Mg 2+)的相互作用,包括结合位点、结合常数、结合力强弱、生物大分子构象变化等因素的影响.紫外-可见光谱表明,Hyp-Mg 2+与荧光素酶发生反应且改变了荧光素酶的分子结构.荧光数据表明Hyp-Mg 2+与荧光素酶通过生成非荧光复合物的静态猝灭而有效地猝灭了荧光素酶的荧光.对荧光光谱数据处理得到298 K下Hyp-Mg 2+与荧光素酶的结合常数为3.13×10 5 L/mol.CD光谱表明,Hyp-Mg 2+可改变荧光素酶的分子构象. 展开更多
关键词 金丝桃 荧光素酶 紫外-可见光谱 荧光光谱 圆二色谱
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无义突变型荧光素酶稳定表达细胞株的建立
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作者 谢骁祥 袁辉 +4 位作者 王震宇 程静 吴磊 杜柳涛 江高峰 《药物分析杂志》 CSCD 北大核心 2017年第4期583-588,共6页
目的:建立稳定表达含无义突变位点荧光素酶的细胞株,用以筛选新的无义突变通读剂。方法:酶切质粒p GL4-WT和p GL4-MUT,得到野生型和无义突变荧光素酶编码c DNA,分别插入到慢病毒载体p LVX-IRES-Neo多克隆位点。酶切及PCR鉴定后,将重... 目的:建立稳定表达含无义突变位点荧光素酶的细胞株,用以筛选新的无义突变通读剂。方法:酶切质粒p GL4-WT和p GL4-MUT,得到野生型和无义突变荧光素酶编码c DNA,分别插入到慢病毒载体p LVX-IRES-Neo多克隆位点。酶切及PCR鉴定后,将重组载体包装成慢病毒颗粒,感染HEK 293细胞,单克隆细胞抗性筛选获得稳定细胞株,提取总RNA,经逆转录PCR方法验证荧光素酶m RNA表达。最后用已知阳性无义突变通读剂G 418处理细胞,Western blot方法检测处理前后荧光素酶蛋白表达水平,同时分析荧光素酶活性。结果:经酶切获得2.7 kb长野生型和无义突变荧光素酶编码c DNA,与p LVX-IRES-Neo连接获得重组慢病毒载体p LVX-WT、p LVX-MUT,EcoRⅠ单酶切、NheⅠ与BamHⅠ双酶切结果证明序列正确插入,PCR也扩增出目的片段;稳定感染慢病毒的HEK293WT和HEK293MUT细胞经逆转录PCR方法成功检测到荧光素酶m RNA表达;阳性通读剂G 418处理细胞后发现,HEK293WT细胞在处理前后均表达荧光素酶蛋白,荧光素酶活性也基本相同,而HEK293MUT细胞在处理前不表达荧光素酶蛋白,无荧光素酶活性,处理后恢复了部分荧光素酶蛋白表达,其荧光素酶活性相当于HEK293WT细胞的20%。结论:成功建立了稳定表达无义突变荧光素酶的细胞株,可用于筛选新的无义突变通读剂。 展开更多
关键词 基因治疗药物筛选 无义突变通读剂 提前终止密码子 荧光素酶 蛋白质截短试验 荧光素酶报告基因检测方法
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