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断裂内含肽介导的亲和介质与亲和标签的应用 认领
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作者 杜夜星 周挺峻 +1 位作者 陈浩然 夏海锋 《高校化学工程学报》 EI CAS CSCD 北大核心 2020年第2期438-446,共9页
应用Cfa断裂内含肽构建了一种新型的亲和纯化系统,并完成对目的蛋白无标签纯化。首先对Cfa断裂内含肽的IN片段与IC片段进行分子改造,通过研究在自由混合条件下的断裂情况,测定了其断裂速率。其次以改造后的IN片段作为配体与环氧活化的... 应用Cfa断裂内含肽构建了一种新型的亲和纯化系统,并完成对目的蛋白无标签纯化。首先对Cfa断裂内含肽的IN片段与IC片段进行分子改造,通过研究在自由混合条件下的断裂情况,测定了其断裂速率。其次以改造后的IN片段作为配体与环氧活化的琼脂糖微球载体偶联,制备了IN亲和层析介质;IC片段作为亲和标签与目的蛋白GFP融合,并利用IN亲和层析介质实现对目的蛋白进行无标签纯化。结果表明,将IN与IC-GFP片段混合后,30s内即可断裂超过50%,4 h内即可完全断裂;IN亲和层析介质的静态载量为66.78 mg·mL^-1,动态吸附载量约为30 mg·mL^-1;纯化后的绿色荧光蛋白(GFP)纯度达到了96.7%,回收率为29.3%。Cfa断裂内含肽的应用为开发新型亲和纯化技术提供了一种潜在的方法。 展开更多
关键词 Cfa断裂内含肽 蛋白纯化 亲和层析 剪切 无标签纯化
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人源酪蛋白激酶Ⅱ催化亚基的构建及表达纯化 认领
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作者 柏学 李彩虹 +2 位作者 佟红娜 胡克平 高海 《现代生物医学进展》 CAS 2020年第7期1201-1205,共5页
目的:构建人源CK2催化亚基pET-28a(+)-hcsnk2a1和pET-28a(+)-hcsnk2a2重组质粒,并进行原核表达纯化得到高纯度融合蛋白,为进一步开展CK2生理病理机制研究以及CK2作为肿瘤抑制靶点相关抑制剂的筛选和评价提供实验基础。方法:利用合成的人... 目的:构建人源CK2催化亚基pET-28a(+)-hcsnk2a1和pET-28a(+)-hcsnk2a2重组质粒,并进行原核表达纯化得到高纯度融合蛋白,为进一步开展CK2生理病理机制研究以及CK2作为肿瘤抑制靶点相关抑制剂的筛选和评价提供实验基础。方法:利用合成的人源csnk2a1和csnk2a2目的基因片段,将酶切连接得到的重组质粒经测序验证后,进行大肠杆菌感受态BL21 (DE3)/Transetta (DE3)转化。使用合适浓度IPTG诱导融合蛋白的表达以得到可溶性的融合蛋白,并应用AKTA avant蛋白纯化仪和Ni2+-NTA预装柱进行纯化,蛋白纯度最后经SDS-PAGE胶分离后考马斯亮蓝染色和Western Blot检测鉴定。结果:测序结果表明pET-28a(+)-hcsnk2a1和pET-28a(+)-hcsnk2a2质粒均成功被构建;经转化诱导表达后,成功纯化得到相对分子量为42KD的his-hcsnk2a1和38KD的his-hcsnk2a2目的融合蛋白。结论:首次成功构建得到pET-28a(+)-hcsnk2a1和pET-28a(+)-hcsnk2a2质粒;并表达纯化得到高浓度和高纯度的his-hcsnk2a1和his-hcsnk2a2融合蛋白,为后期的蛋白功能研究和抑制剂筛选评价提供了基础。 展开更多
关键词 原核表达 蛋白纯化 蛋白激酶Ⅱ csnk2a1 csnk2a2
卵形鲳鲹JAK3蛋白的原核表达与纯化 认领
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作者 杨萌 高爽爽 +3 位作者 谢业扬 段家文 陆专灵 韦友传 《广东农业科学》 CAS 2020年第1期137-142,共6页
【目的】纯化获取卵形鲳鲹(Trachinotus ovatus)JAK3(TroJAK3)重组蛋白,为了解TroJAK3蛋白功能、相互作用及抗体制备奠定基础。【方法】应用分子生物学技术构建重组质粒pET-32a-TroJAK3,转化大肠杆菌BL21感受态细胞,经IPTG诱导表达,SDS-... 【目的】纯化获取卵形鲳鲹(Trachinotus ovatus)JAK3(TroJAK3)重组蛋白,为了解TroJAK3蛋白功能、相互作用及抗体制备奠定基础。【方法】应用分子生物学技术构建重组质粒pET-32a-TroJAK3,转化大肠杆菌BL21感受态细胞,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western blot检测TroJAK3重组蛋白表达情况。【结果】PCR扩增片段长度为3333 bp,经双酶切鉴定、测序确认序列和开放阅读框正确,结果显示成功构建重组质粒pET-32a-TroJAK3。经终浓度为1 mmol/L IPTG 37℃诱导4 h后进行SDS-PAGE检测,结果表明TroJAK3重组蛋白以包涵体形式大量表达,分子量约为140 ku。经Ni-IDA树脂柱纯化,获得纯化的重组蛋白。Western blot检测结果显示有140 ku的条带,表明TroJAK3重组蛋白能被抗His抗体识别。【结论】成功构建了重组质粒pET-32a-TroJAK3,纯化得到高纯度的TroJAK3融合蛋白。 展开更多
关键词 卵形鲳鲹 JAK3蛋白 原核表达 蛋白纯化
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白色念珠菌谷氧还蛋白的表达纯化及多克隆抗体的制备 认领
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作者 王巧 谢霞 +1 位作者 常帅 周佳 《中国病原生物学杂志》 CSCD 北大核心 2020年第4期377-381,共5页
目的纯化白色念株菌(Candida albicans)谷氧还蛋白(glutaredoxin,Grx)并制备多克隆抗体。方法从NCBI网站搜索白色念株菌Grx蛋白序列,采用利用生物信息学方法分析其生物学特性。以白色念珠菌DNA为模板,PCR扩增Grx基因,双切后与质粒pET28... 目的纯化白色念株菌(Candida albicans)谷氧还蛋白(glutaredoxin,Grx)并制备多克隆抗体。方法从NCBI网站搜索白色念株菌Grx蛋白序列,采用利用生物信息学方法分析其生物学特性。以白色念珠菌DNA为模板,PCR扩增Grx基因,双切后与质粒pET28a相连,连接产物pET28a-Grx转入表达菌BL21(DE3),使用IPTG诱导目的蛋白表达,使用亲和层析纯化目的蛋白。用Grx蛋白免疫小鼠,制备抗血清,进行Western blot和ELISA检测。结果白色念珠菌Grx蛋白含有一个CXXC结构域,属跨膜蛋白。其二级结构中58.8%的氨基酸为α-螺旋,12.6%为β片层,23.5%为无规卷曲,三级结构与酵母Grx蛋白结构相似。Grx蛋白具有多个B细胞表位。获得Grx基因并成功构建重组质粒pET28a-Grx,转染DE3后表达15.2×103的重组蛋白。用纯化的重组Grx蛋白免疫小鼠,获得的多克隆抗体ELISA效价为1:10240。结论成功表达白色念株菌Grx蛋白并制备了高滴度的多克隆抗体,为Grx的活性研究奠定了实验基础。 展开更多
关键词 白色念珠菌 谷氧还蛋白 蛋白纯化 多克隆抗体
阿胶粗多糖脱蛋白方法比较及抑制酪氨酸酶活性研究 认领
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作者 刘春媛 廖峰 +3 位作者 汝文文 张建岭 李萍 苏宁 《安徽农业科学》 CAS 2020年第3期182-184,235共4页
[目的]研究阿胶多糖的分离提纯工艺及其抑制酪氨酸酶活性。[方法]针对阿胶多糖提取中蛋白质的干扰,通过对几种脱蛋白方法(TCA法、Sevage法、蛋白酶法)的比较,优选出阿胶多糖提取液的脱蛋白方法,并探讨阿胶多糖对酪氨酸酶的抑制作用。[结... [目的]研究阿胶多糖的分离提纯工艺及其抑制酪氨酸酶活性。[方法]针对阿胶多糖提取中蛋白质的干扰,通过对几种脱蛋白方法(TCA法、Sevage法、蛋白酶法)的比较,优选出阿胶多糖提取液的脱蛋白方法,并探讨阿胶多糖对酪氨酸酶的抑制作用。[结果]TCA法、Sevage法及蛋白酶法的脱蛋白率分别为78.94%、87.73%和29.97%,多糖保留率分别为73.96%、32.14%和72.57%。所得阿胶多糖对酪氨酸酶有一定的抑制作用,当浓度为1 mg/mL时,抑制率为24.42%。[结论]TCA法脱蛋白率较高、多糖损失率较低,筛选方法可有效去除阿胶粗多糖中的蛋白,所得阿胶多糖具有良好的抑制酪氨酸酶作用。 展开更多
关键词 阿胶 多糖 蛋白方法 蛋白纯化 酪氨酸酶
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重组高迁移率组蛋白N2蛋白入胞与细胞定位研究 认领
6
作者 马骁 徐恩杰 +1 位作者 尹佳 周许辉 《中国临床医学》 2020年第2期308-312,共5页
目的:体外制备高迁移率组蛋白N2(high mobility group chromosal protein N2,HMGN2)蛋白,观察其能否转运入骨肉瘤细胞及入胞后的细胞定位。方法:构建HMGN2过表达慢病毒质粒并包装慢病毒,在HEK-293FT细胞中过表达并纯化。用纯化的HMGN2... 目的:体外制备高迁移率组蛋白N2(high mobility group chromosal protein N2,HMGN2)蛋白,观察其能否转运入骨肉瘤细胞及入胞后的细胞定位。方法:构建HMGN2过表达慢病毒质粒并包装慢病毒,在HEK-293FT细胞中过表达并纯化。用纯化的HMGN2蛋白处理骨肉瘤细胞。通过免疫细胞化学检测外源性HMGN2能否转运入骨肉瘤细胞及细胞定位。结果:成功制备、纯化HMGN2蛋白,并发现外源性HMGN2能转运入骨肉瘤细胞,主要定位于细胞核。结论:外源性HMGN2能转运入细胞并定位于细胞核,为其发挥生物学效应奠定基础。 展开更多
关键词 骨肉瘤 转移 高迁移率组蛋白N2 蛋白纯化
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固定化金属亲和层析介质在蛋白纯化中的应用进展 认领
7
作者 侯恒磊 池伟亚 +6 位作者 安宁 公丕胜 靳海波 齐莉 何广湘 郭晓燕 张荣月 《当代化工研究》 2020年第3期1-4,共4页
随着生物制药技术的发展,生物制品的生产规模日益扩大,对下游分离纯化技术也提出新的挑战,为满足高效获得符合要求的产品这一需求,各种快速分离纯化蛋白的技术应运而生,其中固定化金属亲和层析色谱在蛋白纯化中的应用取得了快速发展。... 随着生物制药技术的发展,生物制品的生产规模日益扩大,对下游分离纯化技术也提出新的挑战,为满足高效获得符合要求的产品这一需求,各种快速分离纯化蛋白的技术应运而生,其中固定化金属亲和层析色谱在蛋白纯化中的应用取得了快速发展。固定化金属亲和层析具有配基选择简单且稳定性高、特异性好、蛋白结合载量高、蛋白洗脱条件温和、介质易再生、制备工艺简单、造价低等多项优点,逐渐成为蛋白质分离纯化及多个相关领域中最有效的分离技术之一。本文对固定化金属亲和色谱的工作原理、构成、应用现状进行了阐述,其中主要对蛋白载量和金属离子泄露问题进行概括,对螯合层析介质在蛋白质纯化中的前景进行了展望。 展开更多
关键词 金属螯合层析介质 蛋白纯化 蛋白载量 金属离子泄露
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猪瘟病毒E2蛋白酵母表达及其免疫活性研究 认领
8
作者 周稳 金前跃 +9 位作者 陈晓 丁培阳 李旭峰 王垚 柴永笑 张雨航 周恩民 郭军庆 郅玉宝 张改平 《动物医学进展》 北大核心 2020年第1期1-7,共7页
猪瘟(CSF)是由猪瘟病毒(CSFV)引起的一种急性、热性、高度接触性传染病,呈世界性分布,对养猪业危害严重。猪瘟病毒属于黄病毒科、瘟病毒属,在自然条件下只感染猪。E2蛋白是猪瘟病毒的重要结构蛋白,也是猪瘟病毒的主要保护性抗原。以猪... 猪瘟(CSF)是由猪瘟病毒(CSFV)引起的一种急性、热性、高度接触性传染病,呈世界性分布,对养猪业危害严重。猪瘟病毒属于黄病毒科、瘟病毒属,在自然条件下只感染猪。E2蛋白是猪瘟病毒的重要结构蛋白,也是猪瘟病毒的主要保护性抗原。以猪瘟病毒E2蛋白胞外区基因为模板,构建毕赤酵母表达载体pPICZαA-E2,并通过电转获得毕赤酵母X-33阳性克隆,经SDS-PAGE、Western blot鉴定筛选出猪瘟病毒E2蛋白表达菌株。通过亲和层析技术纯化蛋白,并将蛋白免疫动物,进行免疫原性分析。结果表明,猪瘟病毒E2蛋白在毕赤酵母中成功分泌性表达,经纯化纯度达95%以上;动物试验显示,该蛋白具有良好的免疫原性,为猪瘟病毒亚单位疫苗及相关检测技术的开发奠定了基础。 展开更多
关键词 猪瘟病毒 E2蛋白 毕赤酵母 蛋白纯化 免疫活性
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类弹性蛋白多肽的原核表达与纯化 认领
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作者 韩鹏飞 陈雪利 +4 位作者 张贵虎 闫梦 徐丹华 王小引 王天云 《新乡医学院学报》 CAS 2020年第2期113-115,共3页
目的构建类弹性蛋白多肽(ELPs)的表达质粒并获得类弹性蛋白多肽。方法构建含ELPs的原核表达载体,转化E.coli BL21感受态细胞,异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷诱导ELPs蛋白表达并对其进行纯化,聚丙烯酰胺凝胶电泳检测蛋白纯度。结果成功构... 目的构建类弹性蛋白多肽(ELPs)的表达质粒并获得类弹性蛋白多肽。方法构建含ELPs的原核表达载体,转化E.coli BL21感受态细胞,异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷诱导ELPs蛋白表达并对其进行纯化,聚丙烯酰胺凝胶电泳检测蛋白纯度。结果成功构建pET-28a-ELPs原核表达载体,在相对分子质量55 000处出现目的条带,与目的蛋白分子量大小一致,蛋白纯度为95%。结论成功表达并纯化出ELPs蛋白,为ELPs在组织工程方面的应用奠定了基础。 展开更多
关键词 类弹性蛋白多肽 原核表达 相变温度 蛋白纯化
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大肠杆菌UvrB基因的克隆、表达与功能研究 认领
10
作者 方佳炜 张梦 +2 位作者 杨一鸣 叶依杨 王中山 《生物技术》 CAS 2020年第1期7-11,共5页
[目的]在大肠杆菌表达系统表达UvrB蛋白,优化其表达和纯化的条件,并初步研究其对抗紫外线伤害的功能。[方法]克隆大肠杆菌MG1655菌株UvrB编码序列,采用酶切连接的方法构建表达载体p Waldo-GFP-UvrB,并转入BL21(DE3)表达菌株诱导蛋白质表... [目的]在大肠杆菌表达系统表达UvrB蛋白,优化其表达和纯化的条件,并初步研究其对抗紫外线伤害的功能。[方法]克隆大肠杆菌MG1655菌株UvrB编码序列,采用酶切连接的方法构建表达载体p Waldo-GFP-UvrB,并转入BL21(DE3)表达菌株诱导蛋白质表达,采用Ni-NTA亲和层析以及分子筛层析的方法纯化蛋白质,采用紫外光刺激的方法研究其细胞内功能。[结果]成功构建UvrB表达载体,获得UvrB在BL21(DE3)中重组菌株,其表达条件为22℃,0. 2 mmol/L IPTG诱导20 h,UvrB以可溶蛋白的形式存在。SDS-PAGE结果显示UvrB蛋白质分子量约76 k Da与预期相符;经纯化后UvrB蛋白质得率约为0. 6 mg/L培养基,纯度> 85%,为其进一步研究奠定了基础。[结论]研究克隆并构建了大肠杆菌UvrB蛋白的原核表达体系,优化了其纯化方案,得到纯度> 85%的可溶UvrB蛋白质,为进一步研究UvrB蛋白质功能奠定了基础。 展开更多
关键词 UVRB DNA损伤 切除修复 蛋白表达 蛋白纯化
人同型融合和蛋白质分选复合体亚基的原核表达、蛋白纯化及功能验证 认领
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作者 陈玉 郭仁朋 +2 位作者 黄赛飞 宋丹 刘蓉 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第1期133-142,共10页
同型融合和蛋白质分选复合体(HOPS)由VPS11、VPS16、VPS18、VPS33、VPS39和VPS41这6种蛋白组成,能够通过膜融合机制来调节生物体内的膜泡运输。已有研究表明其可以作为融合因子来促进自噬体与溶酶体膜融合过程。为在体外确定HOPS复合体... 同型融合和蛋白质分选复合体(HOPS)由VPS11、VPS16、VPS18、VPS33、VPS39和VPS41这6种蛋白组成,能够通过膜融合机制来调节生物体内的膜泡运输。已有研究表明其可以作为融合因子来促进自噬体与溶酶体膜融合过程。为在体外确定HOPS复合体与自噬性SNARE蛋白STX17是否具有直接相互作用,首先利用PCR技术从已有质粒中扩增得到6种基因的编码序列,将其连接至pGEX 4T-1-GST或pET-His-NusA原核表达载体上,经菌落PCR初步鉴定和DNA测序无误后成功构建6种原核表达重组质粒并转化至大肠杆菌BL21(DE3);利用谷胱甘肽琼脂糖树脂与镍柱对重组蛋白进行纯化,烟草蚀纹病毒(TEV)蛋白酶酶切掉GST或His-NusA标签,得到分子量约为105 kDa的HA-VPS11蛋白、97 kDa的Flag-VPS16蛋白、108 kDa的HA-VPS18蛋白、70 kDa的Flag-VPS33蛋白、97 k Da的HA-VPS39蛋白和98 kDa的Flag-VPS41蛋白;通过体外GST pull-down技术对6种蛋白的功能进行验证,证实自噬性SNARE蛋白STX17和6种重组蛋白在体外均具有直接相互作用,为深入探究HOPS复合体参与自噬体与溶酶体膜融合过程中的功能及作用机制奠定实验基础。 展开更多
关键词 人同型融合和蛋白质分选复合体(HOPS) 原核表达 蛋白纯化 自噬
罗非鱼源无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)新型AI-2信号分子受体RbsB蛋白结晶生长研究 认领
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作者 樊博琳 潘丽霞 +3 位作者 王忠良 黎源 简纪常 王蓓 《海洋与湖沼》 CAS CSCD 北大核心 2020年第1期132-140,共9页
为了开展无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)核糖结合蛋白(Ribose binding protein B,RbsB)结构功能的研究,本实验根据已知无乳链球菌ZQ0910全基因组序列设计相关引物。采用PCR方法扩增其RbsB基因,随后将该基因定向克隆到原核表达载... 为了开展无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)核糖结合蛋白(Ribose binding protein B,RbsB)结构功能的研究,本实验根据已知无乳链球菌ZQ0910全基因组序列设计相关引物。采用PCR方法扩增其RbsB基因,随后将该基因定向克隆到原核表达载体pGEX-6p-1中,在大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中进行IPTG诱导表达;采用HRV 3C蛋白酶切除GST标签,分子筛分离获得RbsB蛋白;运用生物信息学软件对RbsB基因序列进行分析,并对RbsB蛋白二级和三级结构进行预测;采用NeXtal Tubes JCSG Core Suite结晶试剂盒筛选蛋白结晶条件。研究结果表明,该基因全长为969碱基,编码322个氨基酸,RbsB蛋白理论分子量33.9ku,等电点为9.41,二级结构中α螺旋结构所占比重最高,建立RbsB蛋白三维结构模式图;经IPTG诱导后表达的融合蛋白分子量为59ku,筛选RbsB蛋白的初始结晶条件为(0.2mol/L di-Potassium hydrogen phosphate,20%(W/V)PEG3350;1.5mol/L ammonium sulfate,25%(V/V)Glycerol),获得RbsB蛋白结晶体。本研究结果可为无乳链球菌核糖结合蛋白(RbsB)的功能解析提供实验及理论基础。 展开更多
关键词 无乳链球菌 RbsB蛋白 蛋白纯化 结晶化
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人穿孔素在sf9昆虫细胞中的表达和纯化 认领
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作者 陈风晔 刘孟雨 +3 位作者 周雅博 梁晓雨 黄波 解静 《基础医学与临床》 CSCD 2020年第1期54-59,共6页
目的建立重组人穿孔素的表达和快速纯化方法。方法在sf9昆虫细胞内表达带His标签人穿孔素。使用人工制作简易的镍(Ni)柱装置进行蛋白质亲和层析。采用考马斯亮蓝染色、银染法及流式细胞计量术纯化的蛋白分析其理化性质;用人乳腺癌细胞MC... 目的建立重组人穿孔素的表达和快速纯化方法。方法在sf9昆虫细胞内表达带His标签人穿孔素。使用人工制作简易的镍(Ni)柱装置进行蛋白质亲和层析。采用考马斯亮蓝染色、银染法及流式细胞计量术纯化的蛋白分析其理化性质;用人乳腺癌细胞MCF-7的PI染色法鉴定其生物学活性。结果纯化出的穿孔素具有在细胞膜打孔的生物学活性。与常规蛋白纯化方法如离子交换色谱、分子筛和疏水作用层析等方法相比,该方法操作简便、成本低,为人穿孔素接下来的研究以及其他蛋白质的纯化提供一定参考。结论以一种简单的方法在sf9昆虫细胞内表达并纯化出了有活性的人穿孔素。 展开更多
关键词 蛋白纯化 人穿孔素 蛋白活性 打孔
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猪瘟病毒E2蛋白A-D抗原表位区的原核表达与蛋白纯化 认领
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作者 潘小慧 《福建畜牧兽医》 2020年第3期24-28,共5页
为制备具有活性的猪瘟ELISA抗体检测试剂盒包被抗原,本研究将猪瘟病毒E2蛋白主要抗原表位区A-D部分基因插入表达载体pET-28a中,构建重组质粒pET-28a-E2AD,将其转化至大肠杆菌Transetta(DE3)感受态细胞中进行诱导表达。对IPTG浓度和诱导... 为制备具有活性的猪瘟ELISA抗体检测试剂盒包被抗原,本研究将猪瘟病毒E2蛋白主要抗原表位区A-D部分基因插入表达载体pET-28a中,构建重组质粒pET-28a-E2AD,将其转化至大肠杆菌Transetta(DE3)感受态细胞中进行诱导表达。对IPTG浓度和诱导时间进行优化,确定在37℃条件下、IPTG终浓度为0.2 mmol/L时诱导表达4 h,E2AD蛋白的表达量最高。通过对包涵体的纯化条件进行摸索,最终获得目的蛋白的浓度为0.2 g/L。Western blot分析结果显示,E2AD蛋白能够被猪瘟阳性血清特异性识别,表明纯化后的E2AD蛋白具有良好的反应原性。该结果为进一步开展猪瘟ELISA抗体检测试剂盒的研制工作奠定了基础。 展开更多
关键词 猪瘟病毒 E2蛋白 蛋白纯化
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重组鸡细胞外脂肪酸结合蛋白的原核表达及鉴定 认领
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作者 田志雄 李娜娜 +9 位作者 卢晓晓 郭敏 张宁 李欣 张鼎 赵宇军 闫芳 高荣琨 宁官保 田文霞 《山西农业科学》 2020年第6期855-859,888,共6页
细胞外脂肪酸结合蛋白(Extracellular Fatty Acid-Binding Protein,Ex-FABP)是一种鸡胚发育过程中表达于肥大软骨、肌肉纤维和血粒细胞中的脂蛋白,大小约为21 ku。试验通过构建Ex-FABP原核表达载体,以实现Ex-FABP蛋白的大量表达,并对其... 细胞外脂肪酸结合蛋白(Extracellular Fatty Acid-Binding Protein,Ex-FABP)是一种鸡胚发育过程中表达于肥大软骨、肌肉纤维和血粒细胞中的脂蛋白,大小约为21 ku。试验通过构建Ex-FABP原核表达载体,以实现Ex-FABP蛋白的大量表达,并对其进行纯化及鉴定;以艾维茵肉鸡胫骨软骨总RNA为模板,RT-PCR扩增Ex-FABP基因,连接pGEM-T克隆载体后,再与载体pET-28a连接并转化,获得含pET-28a-Ex-FABP重组表达质粒的Escherichia coli BL21(DE3)表达菌株;使用IPTG诱导表达蛋白,SDS-PAGE鉴定表达情况,利用镍柱亲和层析法纯化蛋白,对纯化蛋白进行Western Blot鉴定。结果表明,试验成功构建重组表达载体pET-28a-Ex-FABP;表达产物经SDS-PAGE和Western Blot鉴定,结果显示,目的蛋白在24 ku附近出现特异性条带,表明表达蛋白正确。试验成功表达了大量纯度比较高的Ex-FABP蛋白,可为后续的动物试验以及家禽疾病的研究提供理论依据。 展开更多
关键词 细胞外脂肪酸结合蛋白 基因克隆 原核表达 蛋白纯化
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小麦(Triticum aestivum L.)UDP-葡萄糖基转移酶TaUGT6基因的原核表达及蛋白纯化 认领
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作者 刘祥 何漪 +2 位作者 俞立璇 旦巴 马鸿翔 《分子植物育种》 CAS CSCD 北大核心 2020年第11期3470-3475,共6页
为了研究小麦抗赤霉病相关UDP-葡萄糖基转移酶TaUGT6基因的功能,利用TaUGT6基因的编码区构建了原核表达载体pGEX-TaUGT6,转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株后,经异丙基硫代半乳糖苷(isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside,IPTG)诱导表达对培... 为了研究小麦抗赤霉病相关UDP-葡萄糖基转移酶TaUGT6基因的功能,利用TaUGT6基因的编码区构建了原核表达载体pGEX-TaUGT6,转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株后,经异丙基硫代半乳糖苷(isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside,IPTG)诱导表达对培养温度、培养时间进行了探索;然后利用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)检测重组蛋白,进行蛋白纯化。结果表明:Ta UGT6的编码区为1473 bp,导入大肠杆菌的TaUGT6基因能够被诱导表达,重组蛋白在25℃经过夜诱导和37℃经6 h诱导效果较好,表达重组蛋白的表现分子量与理论分子量基本一致,利用蛋白层析系统获得了纯度较高的重组可溶性蛋白。本研究为今后通过体外酶活分析、抗体制备等方法深入研究该基因的功能提供了依据。 展开更多
关键词 小麦赤霉病 脱氧雪腐镰刀菌烯醇 葡萄糖基转移酶 原核表达 蛋白纯化
塞尼卡病毒VP1与VP3蛋白原核表达及蛋白纯化 认领
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作者 张金勇 张赫 +9 位作者 孙文超 肖朋朋 南福龙 韩继成 解长占 哈卓 庄忻雨 许汪 鲁会军 金宁一 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第3期463-468,475共7页
利用原核表达系统表达塞尼卡病毒(Seneca Valley virus,SVV)VP1与VP3蛋白,优化其诱导表达条件,并进行蛋白纯化研究。扩增SVV VP1与VP3目的基因,并分别将VP1、VP3克隆至pET32a(+)载体,构建pET32a-VP1与pET32a-VP3重组质粒,将两者分别转化... 利用原核表达系统表达塞尼卡病毒(Seneca Valley virus,SVV)VP1与VP3蛋白,优化其诱导表达条件,并进行蛋白纯化研究。扩增SVV VP1与VP3目的基因,并分别将VP1、VP3克隆至pET32a(+)载体,构建pET32a-VP1与pET32a-VP3重组质粒,将两者分别转化至BL21(DE3)大肠杆菌,经IPTG诱导表达。优化蛋白表达条件,利用His标签镍离子蛋白纯化柱纯化蛋白。RT-PCR结果显示可扩增出792bp SVV VP1与717bp VP3目的片段,将VP1与VP3目的基因成功克隆至pET32a(+)载体,分别转化至BL21(DE3),成功地表达50000pET32a-VP1重组蛋白以及48000pET32a-VP3重组蛋白;pET32a-VP1及pET32a-VP3重组蛋白均在条件为37℃、0.6mmol/L诱导剂诱导5h表达量最高,重组蛋白均以包涵体的形式进行表达并且可纯化出目的蛋白。结果表明,本试验成功地利用原核表达系统表达并纯化SVV VP1与VP3重组蛋白,为制备单克隆与多克隆抗体、检测试剂盒研发以及新型疫苗的研发奠定了基础。 展开更多
关键词 塞尼卡病毒 VP1 VP3 原核表达 蛋白纯化
玉米质体型淀粉磷酸化酶抗体的制备 认领
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作者 申蕾阳 青芸 +3 位作者 吴楠 何姗 黄玉碧 余国武 《玉米科学》 CAS CSCD 北大核心 2020年第1期104-110,共7页
通过同源基因基因克隆、原核表达载体构建、GST融合蛋白诱导表达与纯化、新西兰大白兔免疫、抗血清分离和纯化制备了SPI多克隆抗体,并进行了玉米体内蛋白Western blot验证。结果表明,成功构建的PGEX-6T-1-SPI-C表达载体在大肠杆菌中表... 通过同源基因基因克隆、原核表达载体构建、GST融合蛋白诱导表达与纯化、新西兰大白兔免疫、抗血清分离和纯化制备了SPI多克隆抗体,并进行了玉米体内蛋白Western blot验证。结果表明,成功构建的PGEX-6T-1-SPI-C表达载体在大肠杆菌中表达并纯化了GST-SPI-C融合蛋白,通过免疫新西兰大白兔制备并纯化了SPI多克隆抗体。制备的SPI多克隆抗体不但能识别GST-SPI-C融合蛋白,而且能识别玉米体内全长SPI蛋白(112 kD),并具有较好的特异性。玉米子粒和胚乳的Western blot检测表明,SPI蛋白主要积累在胚乳中,与mRNA定量结果一致。 展开更多
关键词 玉米 淀粉磷酸化酶 载体构建 蛋白纯化 抗体制备
抗苗勒管激素的单克隆抗体制备与鉴定 认领
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作者 苏晓菱 李丽蓥 +4 位作者 李苗苗 何洁 王瑞雪 王勇 罗树红 《分子诊断与治疗杂志》 2020年第2期239-243,共5页
目的表达高纯度的抗苗勒管激素蛋白,以该蛋白作为抗原制备单克隆抗体,并鉴定抗体亚型,为进一步开发优质的抗苗勒管激素诊断试剂盒做技术储备。方法在表达载体pET⁃28a(+)质粒中接入经密码子优化的抗苗勒管激素基因(AMH)片段,转化于BL21... 目的表达高纯度的抗苗勒管激素蛋白,以该蛋白作为抗原制备单克隆抗体,并鉴定抗体亚型,为进一步开发优质的抗苗勒管激素诊断试剂盒做技术储备。方法在表达载体pET⁃28a(+)质粒中接入经密码子优化的抗苗勒管激素基因(AMH)片段,转化于BL21细菌中,异丙基硫代⁃β⁃D⁃半乳糖苷(IPTG)诱导重组蛋白大量表达,对上清中可溶性蛋白进行纯化。使用SDS⁃PAGE分析纯化蛋白的纯度。经纯化的抗原蛋白3次皮下免疫小鼠,挑选产生高效价的抗体的小鼠,取其脾细胞,制备悬液。经细胞杂交技术与骨髓瘤细胞进行融合,筛选能稳定持久分泌抗AMH抗体的杂交瘤细胞株,并制备腹水抗体。通过亲和层析技术、BCA蛋白检测方法等测定手段,纯化抗体、检测抗体浓度。结果筛选到2株能持久分泌抗AMH蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别为克隆细胞株3F6和4E7,分泌抗体均为IgG1亚型。结论筛选出稳定分泌高纯度的抗苗勒管激素抗体的2株杂交瘤细胞,并制备单克隆抗体。下一步将其应用于AMH检测试剂盒的开发。 展开更多
关键词 抗苗勒管激素 单克隆抗体制备 蛋白纯化
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PRRSV GP2a胞外区的原核表达及免疫原性分析 认领
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作者 扣莉云 张改平 +5 位作者 史西保 张小转 车志芬 周景明 祁艳华 王爱萍 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第2期231-236,共6页
为获得有活性的猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)BJ-4株GP2a胞外区蛋白,以真核质粒pcDNA3.1-ORF2为模板,设计针对GP2a胞外区(41-208aa)的特异性引物,通过PCR等方法,获得重组表达质粒... 为获得有活性的猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)BJ-4株GP2a胞外区蛋白,以真核质粒pcDNA3.1-ORF2为模板,设计针对GP2a胞外区(41-208aa)的特异性引物,通过PCR等方法,获得重组表达质粒pET-32a-eORF2,转化宿主菌Rosetta(DE3),并用1 mmol/L异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导。SDS-PAGE结果表明,重组的GP2a胞外区蛋白以包涵体形式表达,相对分子质量约36000;将包涵体纯化、复性后,以50μg/只的剂量免疫BALB/c小鼠,三免后,抗体效价达1∶102400;这表明GP2a胞外区成功表达,且具有良好的免疫原性。 展开更多
关键词 PRRSV GP2a胞外区 原核表达 蛋白纯化
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