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His标记STAT4(565-748氨基酸)肽段融合蛋白原核表达及纯化 预览
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作者 贺美 徐艳 +3 位作者 姚芳玲 邹纯 于颍 黎明 《中国免疫学杂志》 CSCD 北大核心 2018年第5期708-711,717共5页
目的:构建His标记的人STAT4 C-端565-748氨基酸肽段原核表达载体,埃希氏菌中诱导表达,并纯化蛋白。方法:PCR扩增编码STAT4 C-端565-748氨基酸肽段的基因片段,克隆到pET-28a原核表达载体,转化感受态细菌BL21,IPTG诱导蛋白表达,经包涵... 目的:构建His标记的人STAT4 C-端565-748氨基酸肽段原核表达载体,埃希氏菌中诱导表达,并纯化蛋白。方法:PCR扩增编码STAT4 C-端565-748氨基酸肽段的基因片段,克隆到pET-28a原核表达载体,转化感受态细菌BL21,IPTG诱导蛋白表达,经包涵体变性、复性、树脂纯化、透析。免疫印迹鉴定纯化的融合蛋白。结果:PCR扩增获得目的片段,克隆到pET-28a,转化感受态细胞,IPTG诱导发现融合蛋白存在于包涵体。经变性、复性、树脂纯化和透析,免疫印迹实验发现融合蛋白表达、被纯化。结论:成功构建人STAT4(565-748aa)肽段原核表达质粒并获纯化融合蛋白。 展开更多
关键词 STAT4 基因克隆 蛋白表达 融合蛋白纯化
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AATF-Che1超家族基因原核表达及其融合蛋白纯化
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作者 周俊 曹江 +6 位作者 孟凡静 冯浩 潘秀英 吴庆运 陈翀 牛铭山 徐开林 《国际输血及血液学杂志》 CAS 2014年第4期337-342,共6页
目的 体外构建抗凋亡转录因子(AATF)-Che1重组蛋白原核表达载体pGEx-4T-1-AATF-Che1,优化pGEX-4T-1-AATF-Che1重组载体原核诱导表达条件,并获得可溶性的纯化谷胱甘肽巯基转移酶(GST)融合蛋白.方法 采用聚合酶链反应(PCR)法从pGEX-... 目的 体外构建抗凋亡转录因子(AATF)-Che1重组蛋白原核表达载体pGEx-4T-1-AATF-Che1,优化pGEX-4T-1-AATF-Che1重组载体原核诱导表达条件,并获得可溶性的纯化谷胱甘肽巯基转移酶(GST)融合蛋白.方法 采用聚合酶链反应(PCR)法从pGEX-4T-1-AATF重组质粒扩增出AATF-Che1基因,将其与原核表达载体pGEX-4T-1双酶切后,回收目的基因片段.通过T4连接酶定向连接AATF-Che1基因和线性化原核表达载体pGEX-4T-1,获得重组蛋白AATF-Che1原核表达质粒pGEX-4T-1-AATF-Che1.将构建正确的表达质粒转化入大肠埃希菌感受态细胞BL21,并采用诱导剂异丙基硫代β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导蛋白AATF-Che1的表达.考察不同诱导剂IPTG浓度、诱导时间和诱导温度对重组蛋白表达量及表达方式的影响,从而对诱导条件进行优化.采用谷胱甘肽琼脂糖凝胶珠对可溶形式的GST融合蛋白进行纯化,并采用Western蛋白免疫印记(WB)法鉴定获得的纯化蛋白.结果 原核表达质粒pGEX-4T-1-AATF-Che1的酶切、PCR鉴定结果及测序结果均正确;IPTG诱导蛋白在约65 kD处出现了1条新的蛋白条带,即AATF-Che1与GST的融合蛋白.不同的诱导时间及不同的IPTG浓度条件下,诱导融合蛋白的量均未见明显变化;37℃诱导时,重组蛋白主要以包涵体的形式存在于沉淀中,而16℃诱导时,融合蛋白可溶性地存在于上清液中.最终成功获得AATF-Che1可溶性纯化的融合蛋白,且WB法鉴定其抗原性良好.结论 体外成功构建AATF-Che1基因重组蛋白原核表达载体pGEX-4T-1-AATF-Che1,寻找到优化的重组载体原核诱导表达条件,并获得了大量可溶形式纯化的GST融合蛋白,为进一步研究AATF-Che1超家族基因在肿瘤中的作用奠定了基础. 展开更多
关键词 AATF-Che1超家族结构域 原核表达 融合蛋白纯化
小麦赤霉病菌α-微管蛋白原核表达及纯化研究 被引量:2
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作者 徐建强 张聪 +2 位作者 于金凤 彭迪 周明国 《植物病理学报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第3期 252-259,共8页
为了制备小麦赤霉病菌的α-微管蛋白,以小麦赤霉病菌cDNA为模板,PCR扩增出α1-、α2-微管蛋白基因,将其克隆到pET30a+表达载体上,转化到表达宿主菌Rossatta(DE3)pLysS,筛选阳性克隆,进行蛋白诱导表达。SDS-PAGE及Wes-tern-b1ot结果... 为了制备小麦赤霉病菌的α-微管蛋白,以小麦赤霉病菌cDNA为模板,PCR扩增出α1-、α2-微管蛋白基因,将其克隆到pET30a+表达载体上,转化到表达宿主菌Rossatta(DE3)pLysS,筛选阳性克隆,进行蛋白诱导表达。SDS-PAGE及Wes-tern-b1ot结果表明:融合蛋白主要以包涵体形式存在;融合蛋白分子量约为52.1和55.9 kD;融合蛋白能与抗6×His的单抗发生特异性反应。通过对包涵体洗涤及透析复性后采用HisTrapTMHP Columns对融合蛋白进行纯化,可以得到纯度较高的融合蛋白。该研究为体外筛选以微管蛋白为靶标的杀菌剂提供了物质基础。 展开更多
关键词 小麦赤霉病菌 Α-微管蛋白 包涵体 融合蛋白纯化
PRRSV新疆株N基因原核表达条件的优化及蛋白纯化 预览
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作者 沙娜瓦尔·塔希 王传锋 +2 位作者 买买提艾力·斯迪克 张伟 冉多良 《新疆农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2011年第6期 1110-1114,共5页
【目的】获得重组表达质粒pGEX-6P—N在大肠杆菌B121中高效表达,分析表达蛋白的免疫学活性及纯化后蛋白的浓度。【方法】通过优化诱导剂终浓度和诱导时间来实现融合蛋白的高效表达,使用BCA法测定蛋白浓度,利用Westernblotting分析融... 【目的】获得重组表达质粒pGEX-6P—N在大肠杆菌B121中高效表达,分析表达蛋白的免疫学活性及纯化后蛋白的浓度。【方法】通过优化诱导剂终浓度和诱导时间来实现融合蛋白的高效表达,使用BCA法测定蛋白浓度,利用Westernblotting分析融合蛋白的免疫学活性。【结果】融合蛋白在37℃条件下,经终浓度为1.2mmol/L的IPTG诱导表达4.5h后获得了较高的表达水平。纯化后的融合蛋白经BCA法测定蛋白浓度达到0.587ms/mL。Westernblotting试验表明,GST—N蛋白能与抗PRRSV阳性血清发生特异性反应。[结论]为建立N特异性抗体的间接ELISA检测方法及PRRS诊断试剂盒的研制奠定了基础,为新疆PRRS的防控提供了理论支持。 展开更多
关键词 PRRSV N基因 条件优化 融合蛋白纯化 免疫印迹
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编码刚地弓形虫棒状体蛋白2与主要表面抗原1基因的克隆和表达 预览
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作者 张佃波 高红刚 +6 位作者 崔勇 魏庆宽 宰德富 李瑾 柏雪莲 赵立江 刘克义 《中国病原生物学杂志》 CSCD 2006年第3期 202-206,共5页
目的 构建编码弓形虫RH株棒状体蛋白2(ROP2)和主要表面抗原1的重组表达质粒,纯化和复性的融合蛋白为弓形虫病快速诊断试剂盒及蛋白质疫苗的研制作准备。方法 用PCR技术从弓形虫基因组DNA中扩增出ROP2和P30基因片段,分别克隆人pMDl8-... 目的 构建编码弓形虫RH株棒状体蛋白2(ROP2)和主要表面抗原1的重组表达质粒,纯化和复性的融合蛋白为弓形虫病快速诊断试剂盒及蛋白质疫苗的研制作准备。方法 用PCR技术从弓形虫基因组DNA中扩增出ROP2和P30基因片段,分别克隆人pMDl8-T载体,并对重组人外源基因的质粒通过PCR、双酶切和测序鉴定,将pMD-ROP2中RoP2基因片段经EcoRI和HindⅢ酶切、连接等反应,亚克隆入pET-30a(+)原核表达载体,构建pET-ROP2载体,然后再将pMD-P30中的P30基因片段与经同样NcoI和EcoRI酶切的pET-30a(+)载体连接,经含卡那霉素的LB平板筛选,酶切和PCR鉴定。阳性重组质粒转化到大肠埃希菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导,表达产物用SDS-PAGE进行鉴定。大量的表达融合蛋白经纯化和复性后,用Westernblot分析。结果 从弓形虫RH株DNA中扩增出特异的RoP2和P30基因片段,成功克隆出pET-ROP2和pET-P30载体。结论 成功构建了pET-ROP2和pET-P30重组体,获得纯化和复性的弓形虫ROP2和P30的高效表达产物,为弓形虫病的诊断和疫苗研究奠定了基础。 展开更多
关键词 刚地弓形虫 P30基因 ROP2基因 融合蛋白纯化 WESTERN BLOT
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刚地弓形虫P30(SAG1)重组抗原的高效表达和体外纯化 预览
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作者 张佃波 宰德富 +5 位作者 公茂庆 李瑾 魏庆宽 崔勇 黄炳成 刘克义 《中国人兽共患病杂志》 CSCD 北大核心 2005年第12期 1089-1093,共5页
目的表达和纯化弓形虫P30(SAG1)蛋白,为弓形虫病快速诊断试剂盒及蛋白质疫苗的研制奠定基础.方法 PCR法从弓形虫基因组DNA 中扩增 P30基因片段,P30产物克隆到表达质粒pET-30a(+) 构建重组载体,将其转化到DH5α中.经PCR扩增和质粒酶切及... 目的表达和纯化弓形虫P30(SAG1)蛋白,为弓形虫病快速诊断试剂盒及蛋白质疫苗的研制奠定基础.方法 PCR法从弓形虫基因组DNA 中扩增 P30基因片段,P30产物克隆到表达质粒pET-30a(+) 构建重组载体,将其转化到DH5α中.经PCR扩增和质粒酶切及基因测序鉴定后,阳性重组质粒转化到大肠埃氏菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导,表达产物用SDS-PAGE和Western blot进行鉴定.大量的诱导表达产物用SNBC 3S NTA Resin方法纯化并进行复性.结果扩增的P30基因片段为750bp, 重组表达融合蛋白量单位为30ku,与理论值相符.结论成功构建重组体,获得纯化和复性的弓形虫主要表面抗原P30的高效表达产物,为弓形虫病的诊断和疫苗研究奠定了基础. 展开更多
关键词 刚地弓形虫 P30基因 融合蛋白纯化
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抗重组GST单克隆抗体的制备及其在融合蛋白纯化中的应用 被引量:7
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作者 严馨蕊 鲍永利 +1 位作者 董学斌 柳忠辉 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2001年第4期 365-367,共3页
目的制备抗重组 GST的单克隆抗体 (mAb), 并用来纯化重组 GST融合蛋白。方法用含重组 GST融合蛋白基因的 pGEX4T -1质粒转化 E.coli BL21, IPTG诱导 GST融合蛋白表达,亲和层析和凝胶过滤法分离表达的重组 GST融合蛋白。以此蛋白作为... 目的制备抗重组 GST的单克隆抗体 (mAb), 并用来纯化重组 GST融合蛋白。方法用含重组 GST融合蛋白基因的 pGEX4T -1质粒转化 E.coli BL21, IPTG诱导 GST融合蛋白表达,亲和层析和凝胶过滤法分离表达的重组 GST融合蛋白。以此蛋白作为抗原,免疫 Balb/c小鼠,按传统的杂交瘤技术制备 mAb。将抗 GST mAb经 Protein A纯化后,与 Sepharose 4B偶联。结果经 3次亚克隆后,获得两株分泌抗 GST载体特异性 mAb的杂交瘤。采用该 mAb对两种不同的 GST融合蛋白进行亲和层析纯化后,经 SDS-PAGE鉴定达到了商品化 Glutathione-Resin的亲和层析纯化效果。结论用抗 GST蛋白特异性 mAb亲和层析纯化融合蛋白是一种经济、实用的方法,且可用于 Glutathione-Resin亲和层析纯化后的二次纯化。 展开更多
关键词 抗重组GST单克隆抗体 制备 融合蛋白纯化
埃兹蛋白(Ezrin)及其突变体的原核表达与纯化 预览
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作者 刘腾飞 陈妙娟 +2 位作者 高学娟 刘小会 刘朗夏 《氨基酸和生物资源》 CAS 2012年第4期29-34,共6页
Thr567位点磷酸化是ezrin活化的必需条件。利用定点突变引物将T567突变为A或D,通过PCR扩增出相应的基因片段,将其通过T4连接酶连接至含His标签的原核表达载体pET-20b(+),构建了原核重组质粒pET-20b(+)~Ez WT,pET-20b(+)-E... Thr567位点磷酸化是ezrin活化的必需条件。利用定点突变引物将T567突变为A或D,通过PCR扩增出相应的基因片段,将其通过T4连接酶连接至含His标签的原核表达载体pET-20b(+),构建了原核重组质粒pET-20b(+)~Ez WT,pET-20b(+)-EzT567A和pET-20b(+)-EzT567D。转化表达宿主大肠杆菌Rosseta后,用异丙基-伊硫代半乳糖诱导重组蛋白的表达。重组蛋白经亲和镍柱纯化以后,应用westernblot鉴定纯化的融合蛋白。Ezrin野生型及其组成型激活和显性负突变质粒的成功构建及其目的蛋白His-EzwT,His-EzT576A和His—EzT576D的成功表达纯化,为更深入地研究ezrin生物学功能奠定基础。 展开更多
关键词 埃兹蛋白 野生型 组成型激活突变 显性负突变 融合蛋白表达与纯化
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人PPARαLBD在大肠杆菌中的表达纯化及鉴定 预览
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作者 李苌清 袁野 +2 位作者 杨贵忠 章涛 周岐新 《中国生物工程杂志》 CAS CSCD 北大核心 2006年第12期 18-21,共4页
过氧化物酶体增殖物活化受体α(pemxisome prolifterator-activatéd receptor α,PPARα)属于Ⅱ型核受体,通过其配体结合区(ligand binding domain,LBD)结合特定的激动剂对参与机体代谢的关键酶、受体等的表达起调节作用。... 过氧化物酶体增殖物活化受体α(pemxisome prolifterator-activatéd receptor α,PPARα)属于Ⅱ型核受体,通过其配体结合区(ligand binding domain,LBD)结合特定的激动剂对参与机体代谢的关键酶、受体等的表达起调节作用。从人肝组织提取总RNA,RT-PCR扩增出PPARαLBD的cDNA,将其克隆入表达载体pMAL-p2X麦芽糖结合蛋白(maltose binding protein,MBP)编码基因malE序列的下游,重组质粒转化E·coli TB1,进行了高效的可溶性融合蛋白表达。产物经多糖亲和树脂(amylose-resin)纯化后,获得了电泳纯的MBP-PPARαLBD。MBP-PPARαLBD用Xa因子酶切,经Amylose-resin亲和层析、DE-52阴离子交换层析纯化回收,获得了电泳纯的PPARαLBD。为进一步比较MBP-PPARαLBD和PPARαLBD的功能,筛选PPARα配体奠定了基础。 展开更多
关键词 PPARαLBD MBP融合蛋白表达纯化
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