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不同试剂盒提取质粒中内毒素水平的比较 预览
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作者 李卫玲 易初丽 《江汉大学学报:自然科学版》 2019年第1期36-40,共5页
目的比较几种不同质粒提取试剂盒提取质粒中内毒素水平。方法选用6种市售商业化试剂盒:QIAGEN质粒小提试剂盒Plasmid Mini Kit(12123),QIAGNE无内毒素质粒大提试剂盒EndoFree Plasmid Maxi Kit(12362),康为世纪高纯质粒中提试剂盒(CW050... 目的比较几种不同质粒提取试剂盒提取质粒中内毒素水平。方法选用6种市售商业化试剂盒:QIAGEN质粒小提试剂盒Plasmid Mini Kit(12123),QIAGNE无内毒素质粒大提试剂盒EndoFree Plasmid Maxi Kit(12362),康为世纪高纯质粒中提试剂盒(CW0502),A厂家无内毒素质粒中提试剂盒,B厂家无内毒素质粒小提试剂盒,C厂家无内毒素质粒小提试剂盒(BSC01S2D)。分别提取质粒DNA,应用鲎试剂显色基质法和凝胶法检测所提质粒中内毒素水平。结果6种试剂盒提取质粒得率、A260/A280及A260/A230值均较好,但内毒素水平各不相同,其中各厂家标明无内毒素试剂盒提取质粒中内毒素水平相对较低,QIAGEN无内毒素质料大提试剂盒提取的质粒中内毒素小于0.125EU/μg。结论6种质粒提取试剂盒使用时应根据实际情况进行选择。 展开更多
关键词 质粒 内毒素 鲎试剂 质粒提取试剂盒
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涂布介入器械的人血管内皮生长因子真核表达载体的构建 预览
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作者 张一林 贺迎坤 +3 位作者 李天晓 刘刚 胡延忠 崔秀坤 《中华介入放射学电子杂志》 2019年第1期40-43,共4页
目的:构建可涂布于介入器械的人血管内皮生长因子(VEGF)真核表达载体。方法:根据人VEGFA(NM_001025366)目的序列设计引物制备目的基因及载体,双酶切载体pIRES2-ZsGreen1和目的基因homo VEGFA进行连接后转化入大肠杆菌,构建质粒pIRES2-Zs... 目的:构建可涂布于介入器械的人血管内皮生长因子(VEGF)真核表达载体。方法:根据人VEGFA(NM_001025366)目的序列设计引物制备目的基因及载体,双酶切载体pIRES2-ZsGreen1和目的基因homo VEGFA进行连接后转化入大肠杆菌,构建质粒pIRES2-ZsGreen1-homo-VEGFA并测序鉴定。结果:目的基因VEGFA已连接到载体pIRES2-ZsGreen1,大小约1400 bp,与人VEGFA(NM_001025366)目的序列比对结果一致,未见变异。质粒pIRES2-ZsGreen1-homo-VEGFA构建成功。结论:成功构建重组人血管内皮生长因子真核表达载体,可用于涂布介入器械表面进行下一步实验。 展开更多
关键词 血管内皮生长因子 介入器械 质粒 基因
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拉萨市鸡沙门氏菌耐药质粒研究 预览
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作者 刘会杰 王燕 +2 位作者 马宏财 冯静 元振杰 《现代畜牧兽医》 2019年第2期5-8,共4页
由拉萨市养鸡场分离鉴定得到致病性沙门氏菌,采用K-B法,对其耐药性进行检测,并对耐药性较高的4株沙门氏菌进行质粒的提取与检测,采用变温SDS法进行质粒消除试验,分析其耐药菌谱和耐药质粒之间的关系,对耐药基因进行定位。结果表明,3株... 由拉萨市养鸡场分离鉴定得到致病性沙门氏菌,采用K-B法,对其耐药性进行检测,并对耐药性较高的4株沙门氏菌进行质粒的提取与检测,采用变温SDS法进行质粒消除试验,分析其耐药菌谱和耐药质粒之间的关系,对耐药基因进行定位。结果表明,3株沙门氏菌菌有耐药质粒的存在,质粒数目为1~4个,大小为1.8~36 kb之间,质粒携带率为75%。质粒消除试验结果表明所检测的3株菌对大部分药物恢复了敏感性。检测质粒介导的耐药基因有AMX、ERY、TET、CIP、NOR、CMP。 展开更多
关键词 沙门氏菌 耐药性 质粒 耐药基因
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苏州市患病水生动物体内细菌的分离鉴定及药敏试验 预览
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作者 冯永杰 孙振丽 +8 位作者 宣引明 蒋明 潘云生 张益明 龚叶平 薛仁宇 胡小龙 曹广力 贡成良 《淡水渔业》 CSCD 北大核心 2019年第1期75-80,共6页
为了解苏州市不同地区患病水生动物组织中感染细菌的种类及其耐药性,于2014年6~10月从不同地区采集的患病鱼、虾、蟹和中华鳖组织中共分离到14株细菌,通过16SrRNA基因分析对细菌进行了鉴定,并调查了他们对链霉素、恩诺沙星、强力霉素、... 为了解苏州市不同地区患病水生动物组织中感染细菌的种类及其耐药性,于2014年6~10月从不同地区采集的患病鱼、虾、蟹和中华鳖组织中共分离到14株细菌,通过16SrRNA基因分析对细菌进行了鉴定,并调查了他们对链霉素、恩诺沙星、强力霉素、庆大霉素硫酸盐和甲砜霉素等5种抗生素的抗性及最低抑菌浓度。结果显示:从不同地区水生动物分离到的同种细菌对同种抗生素的抗性有明显差异,其中,分离到的嗜水气单胞菌及摩根氏菌有多重耐药性;对14株细菌进行质粒抽提和琼脂糖凝胶电泳分析,发现8株细菌中存在分子量不同的质粒,且不同地区来源的同种细菌所含有的质粒的分子量不同,耐药性较强的嗜水气单胞菌和摩根氏菌均含有质粒;嗜水气单胞菌质粒的序列测定结果显示,该质粒与其抗药性无关;转化实验结果显示,从摩根氏菌分离的1.8kb质粒与氨苄青霉素抗药性有关。 展开更多
关键词 患病水生动物 细菌 分离鉴定 药敏试验 质粒
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猪尾小组织块贴壁培养法分离培养成纤维细胞及转染效率的研究 预览
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作者 张树华 张帆 +1 位作者 Christopher Burlak 陈庆 《华中科技大学学报:医学版》 CAS CSCD 北大核心 2019年第1期15-20,共6页
目的采取猪尾小组织块贴壁法成功分离培养出原代猪成纤维细胞并进行细胞不同时期的绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)阳性质粒转染效率的研究。方法猪尾小组织块贴壁培养法分离培养出原代猪成纤维细胞后,传代并进行冻存和复... 目的采取猪尾小组织块贴壁法成功分离培养出原代猪成纤维细胞并进行细胞不同时期的绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)阳性质粒转染效率的研究。方法猪尾小组织块贴壁培养法分离培养出原代猪成纤维细胞后,传代并进行冻存和复苏,比较猪成纤维细胞原代培养、传代培养和复苏细胞存活率。绘制细胞原代培养、传代培养和复苏后的生长情况。分别在猪尾小组织块贴壁培养获得原代成纤维细胞,细胞传代和复苏后进行细胞GFP阳性质粒的Neon电转染,比较不同转染时期细胞存活率和生长情况,转染后24h和48h分别采用荧光显微镜和流式细胞仪检测细胞的GFP质粒阳性表达率。结果猪尾小组织块贴壁培养可以成功分离培养出猪成纤维细胞,细胞冻存后复苏能保持原代细胞生物学特性,原代细胞活力很高,细胞存活率97.670%,传代培养后细胞存活率95.670%,复苏细胞存活率仍在90%以上。原代培养、传代培养和复苏培养细胞生长曲线均呈"S"型,复苏细胞生长略微缓慢。原代培养、传代培养和复苏细胞电转染后细胞存活率均有少许下降,细胞生长增殖能力减弱,但是细胞生长曲线仍呈"S"型曲线。Neon电转染后24h均可获得GFP质粒阳性表达的猪成纤维细胞,荧光显微镜均检测到GFP质粒阳性表达的成纤维细胞,48h后流式细胞仪检测显示原代细胞阳性率8.01%,稍高于传代细胞的7.91%和复苏细胞的7.86%。复苏细胞存活率下降,转染后细胞活力下降,但转染后仍可得到7.86%GFP质粒阳性表达的猪成纤维细胞,原代培养细胞能够获得更高的阳性率,差异有统计学意义。结论猪尾小组织块贴壁培养法可以成功分离培养出成纤维细胞,细胞传代会对细胞活力有影响,冻存后复苏也会影响细胞的存活率和细胞增殖能力。原代细胞、传代细胞和复苏细胞转染均能获得GFP阳性质粒表达。原代培养细胞具有 展开更多
关键词 猪成纤维细胞 贴壁培养 生长曲线 电转染 质粒 绿色荧光蛋白
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质粒介导LAPTM4B过表达胰腺癌细胞株PANC-1的构建及鉴定 预览
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作者 张光涛 梁悦 李明华 《岭南现代临床外科》 2019年第1期44-47,共4页
目的筛选低表达LAPTM4B-35 细胞株并构建质粒介导的LAPTM4B 过表达胰腺癌细胞株并进行鉴定。方法通过RT-PCR 及Western-Blot 方法检测3 种胰腺癌细胞LAPTM4B 的表达,筛选出现低表达LAPTM4B细胞株。通过质粒稳定转染胰腺癌细胞PANC-1,pcD... 目的筛选低表达LAPTM4B-35 细胞株并构建质粒介导的LAPTM4B 过表达胰腺癌细胞株并进行鉴定。方法通过RT-PCR 及Western-Blot 方法检测3 种胰腺癌细胞LAPTM4B 的表达,筛选出现低表达LAPTM4B细胞株。通过质粒稳定转染胰腺癌细胞PANC-1,pcDNA3.0-AE过表达LAPTM4B基因,应用RT-PCR,Western-blot进行鉴定。结果成功扩增提取pcDNA3.0-AE质粒,转染并筛选稳定细胞株。RT-PCR 及Western-Blot 显示相对空白对照,稳定株的过表达LAPTM4B-35明显。结论成功构建筛选低表达细胞株,并建立稳定过表达LAPTM4B的胰腺癌细胞株。 展开更多
关键词 LAPTM4B PANC-1 质粒 稳定株 胰腺癌
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大肠埃希菌外膜囊泡作为新型外源质粒递送载体的研究
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作者 舒聪妍 王世杰 +2 位作者 高福兰 黄惟巍 马雁冰 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2019年第1期10-14,19共6页
目的探讨大肠埃希菌外膜囊泡(outer membrane vesicles,OMVs)作为新型DNA疫苗递送载体的潜力及价值。方法从大肠埃希菌DH5α的培养上清中经过滤、超滤、超速离心等步骤收集天然分泌的OMVs,采用密度梯度离心法纯化OMVs。将纯化后的OMVs... 目的探讨大肠埃希菌外膜囊泡(outer membrane vesicles,OMVs)作为新型DNA疫苗递送载体的潜力及价值。方法从大肠埃希菌DH5α的培养上清中经过滤、超滤、超速离心等步骤收集天然分泌的OMVs,采用密度梯度离心法纯化OMVs。将纯化后的OMVs与哺乳动物吞噬细胞及非吞噬细胞进行体外孵育,观察不同细胞对OMVs的摄取效率。通过电击转化方式将带绿色荧光蛋白的真核表达质粒pIRES2-EGFP转入OMVs中,并与RAW264.7细胞共孵育,观察OMVs携带真核表达质粒进入细胞并表达绿色荧光蛋白的情况。结果密度梯度离心法可有效纯化OMVs,纯化后的OMVs进入不同哺乳动物细胞的效率不同,进入吞噬细胞的效率高于非吞噬细胞,经电击转化后,质粒DNA可被导入OMVs中,并随吞噬细胞摄取及表达。结论约5 300 bp的真核表达质粒可用电击方式导入OMVs中,并通过OMVs介导该质粒在吞噬细胞中表达,提示OMVs具有作为新型质粒DNA递送载体的潜力。 展开更多
关键词 细菌外膜囊泡 质粒 递送系统 DNA疫苗
三种方法浓缩慢病毒后绿色荧光蛋白转染效率的比较 预览
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作者 毕冉冉 白睿 +1 位作者 刘志强 刘惠亮 《武警医学》 CAS 2019年第1期62-66,共5页
目的比较超滤管法、超速离心法及病毒浓缩液法浓缩慢病毒后绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的转染效率。方法用摇床过夜摇pMD2. G、psPAX2及GFP载体菌种并用试剂盒提取这三种质粒;将pMD2. G、psPAX2及GFP载体质粒与转染试... 目的比较超滤管法、超速离心法及病毒浓缩液法浓缩慢病毒后绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的转染效率。方法用摇床过夜摇pMD2. G、psPAX2及GFP载体菌种并用试剂盒提取这三种质粒;将pMD2. G、psPAX2及GFP载体质粒与转染试剂按比例混合后转染293T细胞生产病毒;收集病毒上清液并用超滤管法、超速离心法及病毒浓缩液法浓缩慢病毒;将接种的293T细胞分为3组,并向每组接种有293T细胞的培养液中加入2、4、8、16μl三种方法浓缩的病毒浓缩液,48 h后用荧光显微镜观察和流式细胞仪检测三种方法浓缩慢病毒后转染293T细胞的GFP表达情况。结果荧光显微镜观察结果显示随着转染量的增加,GFP表达率增加,超滤管法浓缩病毒转染293T细胞后GFP的表达效率最高;流式检测显示病毒浓缩液法组2、4、8、16μl GFP的表达率分别为(2. 4±0. 1)%、(3. 8±0. 3)%、(8. 2±0. 6)%、(12. 2±0. 3)%;超滤管法组2、4、8、16μl GFP的表达率分别为(5. 4±0. 3)%、(7. 4±0. 4)%、(12. 7±0. 1)%、(17. 3±0. 6)%;超速离心法组2、4、8、16μl GFP的表达率分别为(0. 7±0. 1)%、(1. 2±0. 1)%、(2. 1±0. 1)%、(0. 4±0. 2)%。超滤管法组与其他两组比较,P <0. 05,差异有统计学意义。结论不同方法浓缩慢病毒后的GFP转染效率不同,三种慢病毒浓缩方法中超滤管法浓缩慢病毒后的GFP转染效率最高。 展开更多
关键词 质粒 慢病毒 绿色荧光蛋白
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抗菌药物浓度对整合子内耐药基因盒重组效率影响的研究
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作者 杨泽华 胡敏 +5 位作者 周双艳 杜建明 申彬 杜怡青 罗晓旭 梁转霞 《中华检验医学杂志》 CSCD 北大核心 2018年第7期531-535,共5页
目的研究在不同浓度链霉素下,aadA2基因盒在整合子attI位点的整合频率。方法将已知序列的1类整合子克隆到pACYC184质粒,该重组质粒命名为pACIDA;将该整合子上的整合酶基因克隆到pET28a质粒,该重组质粒命名为pETINT;这两重组质粒依... 目的研究在不同浓度链霉素下,aadA2基因盒在整合子attI位点的整合频率。方法将已知序列的1类整合子克隆到pACYC184质粒,该重组质粒命名为pACIDA;将该整合子上的整合酶基因克隆到pET28a质粒,该重组质粒命名为pETINT;这两重组质粒依次转化大肠杆菌BL21(DE3)。转化后的大肠杆菌在加不同浓度的链霉素的LB液体培养基中,37 ℃过夜培养。使用荧光定量PCR技术分别测定aadA2基因盒在attI位点发生整合作用的整合子的拷贝数和总整合子的拷贝数,前者除以后者即可获得整合频率。结果高表达整合酶的情况下,在加入的链霉素浓度分别为0、20、30、40、50 μg/ml时,aadA2基因盒在attI位点的整合频率依次为(1.97±0.24)×10-3、(3.23±1.77)×10-3、(3.27±0.67)×10-3、0.45±0.13、1.32±0.11。而在没有整合酶高表达的情况下背景频率低于(1.75±0.33)×10-7。结论高浓度的链霉素能够促进整合子中aadA2基因盒在整合子中attI位点的重组效率。(中华检验医学杂志,2018, 41:531-535) 展开更多
关键词 整合子类 链霉素 抗药性 微生物 质粒 实时聚合酶链反应
m^6A修饰RNA结合蛋白YTHDF2的克隆、表达及其活性分析
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作者 苏晨 史祥 +1 位作者 付汉江 郑晓飞 《军事医学》 CSCD 北大核心 2018年第1期34-37,共4页
目的构建YTH结构域m6A结合蛋白2(YTHDF2)重组表达载体,获得具有结合m6A修饰RNA活性的YTHDF2重组蛋白。方法以mRNA为模板采用RT-PCR方法扩增YTHDF2基因编码区序列,构建pET-28a-YTHDF2重组表达质粒,在大肠杆菌BL21中诱导表达YTHDF2... 目的构建YTH结构域m6A结合蛋白2(YTHDF2)重组表达载体,获得具有结合m6A修饰RNA活性的YTHDF2重组蛋白。方法以mRNA为模板采用RT-PCR方法扩增YTHDF2基因编码区序列,构建pET-28a-YTHDF2重组表达质粒,在大肠杆菌BL21中诱导表达YTHDF2融合蛋白,利用Ni2-NTA亲和胶纯化融合蛋白,Ni2-NTA磁球分析融合蛋白活性。结果与结论成功构建了pET-28a-YTHDF2重组表达载体,纯化获得了YTHDF2融合蛋白,该融合蛋白具有结合m6A修饰RNA活性。重组YTHDF2融合蛋白的获得为研究m6A修饰RNA的生物学功能提供了重要工具分子。 展开更多
关键词 质粒 重组融合蛋白质类 RNA YTHDF2蛋白 甲基转移酶类 基因表达调控
猕猴桃溃疡病菌质粒的分离与功能分析 预览
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作者 王月 董俊 +2 位作者 吴群 汤小美 刘普 《华中农业大学学报》 CSCD 北大核心 2018年第3期39-45,共7页
分离猕猴桃溃疡病菌中的质粒,从质粒角度探索细菌的致病机制,分析其编码的主要基因、毒力因子。用试剂盒提取分离自安徽省岳西县猕猴桃溃疡病菌株JF8的质粒,对质粒DNA进行高通量测序及生物信息学分析。质粒基因组拼接显示菌株JF8质粒全... 分离猕猴桃溃疡病菌中的质粒,从质粒角度探索细菌的致病机制,分析其编码的主要基因、毒力因子。用试剂盒提取分离自安徽省岳西县猕猴桃溃疡病菌株JF8的质粒,对质粒DNA进行高通量测序及生物信息学分析。质粒基因组拼接显示菌株JF8质粒全长65 149 bp,GC含量56.29%,包含45个假定蛋白(hypothetical protein)和38个有预测功能的蛋白。生物信息学分析发现,质粒携带多达8个直接参与基因重组和转移的转运蛋白(mobile element protein),5个基因直接参与细菌Ⅳ型分泌系统、1个基因参与细菌Ⅲ型分泌系统。基因ParA编码的蛋白是一个ATP酶,对质粒的分配以及维持质粒稳定具有重要作用,编码转录激活蛋白的基因LuxR与细菌的群体感应机制相关,影响毒力因子的表达和分泌,基因UmuC是细菌中SOS应答系统的组分之一,控制细胞中聚合酶Ⅴ的量。 展开更多
关键词 丁香假单胞菌 猕猴桃溃疡病 质粒 功能分析
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质粒介导的多黏菌素耐药基因mcr-1研究进展
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作者 刘向君 吕媛 《中华微生物学和免疫学杂志》 CSCD 北大核心 2018年第4期305-312,共8页
多黏菌素作为治疗多重耐药革兰阴性菌感染的“最后一道防线”。得到广泛关注。2015年国际首次报道质粒介导的多黏菌素耐药基因mcr-1,刷新了既往人们对多黏菌素耐药机制的认知,对临床耐药菌感染的治疗带来了巨大冲击。自mcr-1发现以来... 多黏菌素作为治疗多重耐药革兰阴性菌感染的“最后一道防线”。得到广泛关注。2015年国际首次报道质粒介导的多黏菌素耐药基因mcr-1,刷新了既往人们对多黏菌素耐药机制的认知,对临床耐药菌感染的治疗带来了巨大冲击。自mcr-1发现以来,已在全球30多个国家和地区检测到mcr-1,遍布世界五大洲。世界各国对此高度重视,纷纷加强多黏菌素的管控,采用措施遏制mcr-1的传播和扩散。本文主要从mcr-1的结构特征、流行情况、分子生物学特点、预防等方面进行综述,旨在加强对mcr-1的认识和防控。 展开更多
关键词 多黏菌素 mcr-1 质粒 细菌耐药
MCR-1介导多粘菌素耐药机制的研究进展
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作者 王新兴 郑常委 +4 位作者 王巧云 胡栋 王佳 翟静 常维山 《中国动物传染病学报》 北大核心 2018年第6期80-83,共4页
MCR-1主要作用是介导肠杆菌科细菌对多粘菌素产生抗药性,其基因mcr-1由1626个碱基组成,其中鸟嘌呤和胞嘧啶的含量约占了一半。根据实验推断mcr-1基因所翻译出来的是一段具有介导磷酸乙醇胺转移作用的酶,由541个氨基酸组成。菌株可携带... MCR-1主要作用是介导肠杆菌科细菌对多粘菌素产生抗药性,其基因mcr-1由1626个碱基组成,其中鸟嘌呤和胞嘧啶的含量约占了一半。根据实验推断mcr-1基因所翻译出来的是一段具有介导磷酸乙醇胺转移作用的酶,由541个氨基酸组成。菌株可携带完整的ISApl1或ISApl1片段。mcr-1是质粒上的一段基因,介导多粘菌素类药物耐药,但它并不耐受目前所有的抗生素。mcr-1耐药机制是其整合于质粒,可以随着质粒在不同细菌中水平传播,甚至可以与其他的耐药基因共同存在于单一质粒,表达后产生多种耐药机制。本文就mcr-1的发现、流行、耐药性等方面的研究进展进行简要综述。 展开更多
关键词 MCR-1 多粘菌素 耐药性 质粒
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髓鞘黏连相关蛋白与阿尔茨海默病患者认知功能损害相关性及机制 预览
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作者 徐德恩 邹炎 +6 位作者 陈心怡 孙杨 何培成 高明珠 韩志君 周永华 许永良 《中华老年心脑血管病杂志》 CAS 北大核心 2018年第12期1248-1252,共5页
目的 分析髓鞘黏连相关蛋白(Caspr)与阿尔茨海默病(AD)患者认知功能损害的相关性,进一步探讨Caspr参与认知功能损害的机制。方法 选择AD患者67例,根据简易智能状态检查量表和临床痴呆量表评分标准分为轻度组27例和中重度组40例,选择同... 目的 分析髓鞘黏连相关蛋白(Caspr)与阿尔茨海默病(AD)患者认知功能损害的相关性,进一步探讨Caspr参与认知功能损害的机制。方法 选择AD患者67例,根据简易智能状态检查量表和临床痴呆量表评分标准分为轻度组27例和中重度组40例,选择同期健康老年志愿者37例为对照组,应用RT-PCR检测入选者外周血清Caspr和微管相关蛋白轻链3(LC3)mRNA表达,并进行相关性分析,将Caspr和空载质粒转染到HEK293细胞依次为Caspr组和空载组,分别利用免疫荧光技术和蛋白印迹法观察过表达Caspr的HEK 293细胞内LC3分布及蛋白水平。结果 与对照组比较,轻度组和中重度组血清Caspr mRNA表达水平均降低,差异有统计学意义(0.65±0.21和0.28±0.12 vs 1.00±0.00,P<0.05);LC3mRNA表达水平明显升高(1.81±0.44和3.11±0.73 vs1.00±0.00,P<0.05);Caspr与LC3mRNA表达水平呈负相关(r=-0.41,P=0.001)。蛋白印迹法显示,Caspr组细胞中LC3Ⅰ蛋白水平和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值较空载组明显降低(t=33.599,P=0.02;t=38.706,P=0.003)。结论 AD患者认知功能损害与Caspr表达水平下降有关,Caspr通过诱导自噬参与AD的发病机制。 展开更多
关键词 髓鞘 阿尔茨海默病 认知障碍 质粒 转染
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晚期糖基化终末产物受体对宫颈癌细胞生物学行为的影响 预览
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作者 周璐璐 朱雪洁 +1 位作者 李如意 朱雪琼 《浙江医学》 CAS 2018年第17期1913-1917,共5页
目的探讨晚期糖基化终末产物受体(RAGE)对宫颈癌SiHa细胞增殖、凋亡等生物学行为及裸鼠成瘤能力的影响及相关机制.方法SiHa细胞分3组培养,空白对照组为仅添加凝聚胺,空载体组为添加凝聚胺+转染空载体质粒,过表达组为添加凝聚胺+转染... 目的探讨晚期糖基化终末产物受体(RAGE)对宫颈癌SiHa细胞增殖、凋亡等生物学行为及裸鼠成瘤能力的影响及相关机制.方法SiHa细胞分3组培养,空白对照组为仅添加凝聚胺,空载体组为添加凝聚胺+转染空载体质粒,过表达组为添加凝聚胺+转染RAGE过表达质粒.采用pLenti-C-mGFP-RAGE质粒转染方法构建RAGE基因稳定过表达的宫颈鳞癌SiHa细胞.采用Westernblot法检测SiHa细胞RAGE、增殖细胞核抗原(PCNA)、B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、与Bcl-2相互作用的细胞死亡调节因子(Bim)蛋白表达水平,CCK-8法检测RAGE基因对SiHa细胞增殖的影响,流式细胞仪检测RAGE基因对SiHa细胞凋亡的影响.采用裸鼠皮下成瘤法,动态观察RAGE基因对宫颈癌肿瘤生长的影响.结果转染pLenti-C-mGFP-RAGE质粒可明显上调SiHa细胞中RAGE蛋白的表达.过表达组SiHa细胞的增殖力均明显高于空白对照组及空载体组(均P〈0.05),而过表达组SiHa细胞的凋亡率均明显低于空白对照组及空载体组(均P〈0.05).过表达组PCNA及Bcl-2蛋白表达水平均明显高于空白对照组及空载体组(均P〈0.05),而Bax/Bcl-2表达水平均明显低于空白对照组及空载体组(均P〈0.05),3组Bax及Bim蛋白表达水平比较差异均无统计学意义(均P〉0.05).过表达组裸鼠皮下瘤体体积和瘤体质量均显著高于空载体组的体积和瘤体质量,差异均有统计学意义(均P〈0.05).结论上调RAGE基因的表达可促进SiHa细胞增殖,抑制SiHa细胞凋亡,促进宫颈癌瘤体的生长,该作用和抗凋亡蛋白Bcl-2相关. 展开更多
关键词 晚期糖基化终末产物受体 SIHA 慢病毒 质粒 增殖 凋亡 成瘤
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腺病毒载体构建小鼠趋化素基因缺陷性细胞系 预览
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作者 陈婷婷 曹园芝 +1 位作者 熊玮 董少红 《中国组织工程研究》 北大核心 2018年第24期3875-3879,共5页
背景:趋化素在动脉粥样硬化中的表达水平上调,趋化素可能参与了动脉粥样硬化的病理过程。目的:应用腺病毒介导的RNA干扰技术,构建并有效沉默趋化素基因的表达体,为研究其对动脉粥样硬化机制奠定实验技术基础。方法:以小鼠趋化素基因m... 背景:趋化素在动脉粥样硬化中的表达水平上调,趋化素可能参与了动脉粥样硬化的病理过程。目的:应用腺病毒介导的RNA干扰技术,构建并有效沉默趋化素基因的表达体,为研究其对动脉粥样硬化机制奠定实验技术基础。方法:以小鼠趋化素基因mRNA序列作为干扰靶点,以腺病毒基因pCD316-ZsGreen-shRNA作为质粒载体,设计4组靶向趋化素基因的shRNA序列,构建靶向鼠趋化素的shRNA表达质粒,另构建不针对任何已知mRNA的阴性对照shRNA表达质粒,筛选出干扰效果最好的shRNA,并在293T细胞对腺病毒进行包装和滴度测定。体外培养小鼠黑色素瘤细胞B16F10,转染腺病毒形成趋化素基因缺陷性B16F10细胞,用qPCR和Western blot检测感染腺病毒后细胞中趋化素mRNA和蛋白水平。结果与结论:(1)PCR以及基因测序结果表明Chemerin shRNA腺病毒载体构建成功,腺病毒的滴度为2×10^10 PFU/mL,pCD-shRNA4对趋化素基因的抑制效果最显著(P〈0.001);(3)qPCR和Western检测B16F10细胞中趋化素mRNA水平和蛋白水平,结果显示Chemerin-shRNA4达到一定的敲低效果;(2)表明腺病毒介导的shRNA-Chemerin4可有效沉默B16F10中趋化素基因的表达。 展开更多
关键词 趋化素 腺病毒 RNA干扰 动脉粥样硬化 质粒 基因转染 免疫印迹 组织工程 血管平滑肌细胞
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2株耐碳青霉烯类植生拉乌尔菌耐药基因检测分析
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作者 鲁勇 汪一萍 +2 位作者 马坚 应建飞 俞燕红 《中华医院感染学杂志》 CSCD 北大核心 2018年第6期815-817,821共4页
目的研究耐碳青霉烯类抗菌药物的植生拉乌尔菌耐药机制。方法收集2014年10月-2015年03月临床分离的两株来自痰液标本耐碳青霉烯类植生拉乌尔菌,采用Vitek2-compact全自动微生物分析仪进行细菌鉴定,并用16SrRNA进行菌株确认,采用E-test... 目的研究耐碳青霉烯类抗菌药物的植生拉乌尔菌耐药机制。方法收集2014年10月-2015年03月临床分离的两株来自痰液标本耐碳青霉烯类植生拉乌尔菌,采用Vitek2-compact全自动微生物分析仪进行细菌鉴定,并用16SrRNA进行菌株确认,采用E-test进行药敏试验,用PCR扩增检测碳青霉烯酶(KPC、GES、IMI、NDM、VIM、IMP、SIM、OXA-48)、超广谱β内酰胺酶(TEM、SHV、CTX-M、VEB、PER)、质粒介导的喹诺酮耐药基因(qnrA、qnrB、qnrS、aac(6')-Ib-cr)以及Ⅰ类整合子可变区结构,Southern杂交方法检测2株菌株质粒相关情况。结果 1号菌株携带blaKPC-2和qnrB4耐药基因,Ⅰ类整合子基因盒种类为arr-3-dfrA27;2号菌株携带blaIMP-4、blaTEM-1、blaCTX-M-3、blaSHV-12、qnrS1和aac(6')-Ib-cr等耐药基因,但无相关整合子基因盒结构。质粒分析发现blaKPC-2和blaIMP-4均位于54kb-60kb可结合质粒上。结论两株耐碳青霉烯类泛耐药植生拉乌尔菌分别产KPC-2和IMP-4型碳青霉烯酶,需加强耐药监测,避免多重耐药菌播散。 展开更多
关键词 植生拉乌尔菌 碳青霉烯酶 质粒 KPC-2 IMP-4
g6pd基因在野生型斑马鱼胚胎发育过程中的表达
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作者 夏海雄 李莉 +3 位作者 周艳华 任平平 何志旭 舒莉萍 《浙江大学学报:医学版》 CSCD 北大核心 2018年第1期57-63,共7页
目的:观察g6pd基因在野生型斑马鱼胚胎早期发育过程中的表达情况。方法:利用基因数据库和BLAST软件分别进行g6pd基因的共线性分析和G6pd蛋白质序列相似性分析。原位杂交技术观察不同时相斑马鱼胚胎中g6pd基因的表达;构建g6pd-EGFP-pC... 目的:观察g6pd基因在野生型斑马鱼胚胎早期发育过程中的表达情况。方法:利用基因数据库和BLAST软件分别进行g6pd基因的共线性分析和G6pd蛋白质序列相似性分析。原位杂交技术观察不同时相斑马鱼胚胎中g6pd基因的表达;构建g6pd-EGFP-pCS~(2+)重组质粒,并将其显微注射入斑马鱼胚胎内,荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达;蛋白质印迹法检测24、48、72 hpf斑马鱼胚胎中G6pd蛋白的表达量;改良G6pd定量比值法检测24、48、72 hpf斑马鱼胚胎中G6pd酶活性。结果:g6pd基因在进化过程中相对保守,斑马鱼与人类的G6pd蛋白质相似度为88%,斑马鱼与小鼠的G6pd蛋白质相似度为87%。原位杂交试验结果显示,g6pd基因主要表达于斑马鱼的造血组织,显微注射g6pd-EGFP-p CS2+重组质粒后观察的结果与原位杂交试验结果一致。24、48、72 hpf斑马鱼胚胎中G6pd蛋白相对表达量分别为1.44±0.03、1.47±0.05、1.54±0.02,差异无统计学意义(P〉0.05);G6pd酶活性分别为1.74±0.17、1.75±0.12、1.71±0.22,差异无统计学意义(P〉0.05)。结论:成功观察到斑马鱼体内g6pd基因表达部位及其变化规律,并测定了不同发育时相斑马鱼胚胎中G6pd蛋白表达和酶活性,为建立斑马鱼G6PD缺乏症模型奠定了基础。 展开更多
关键词 葡糖磷酸脱氢酶缺乏 葡糖磷酸脱氢酶 原位杂交 DNA 重组 质粒 基因表达 斑马鱼 胚胎发育
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一株食窦魏斯氏菌的分离鉴定及其质粒的序列分析 预览
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作者 张广峰 张楠笛 +3 位作者 赵婷婷 许琴 谭霄 向文良 《食品工业科技》 CSCD 北大核心 2018年第8期100-105,共6页
目的:探究四川泡菜中含质粒的乳酸菌,并对质粒进行序列和功能分析。方法:采用平板涂布法和碱裂解法分离含质粒乳酸菌,通过菌落形态、生理生化和16S r DNA序列分析法对其进行鉴定。利用单酶酶切质粒,并在测序质粒片段的基础上设计引物... 目的:探究四川泡菜中含质粒的乳酸菌,并对质粒进行序列和功能分析。方法:采用平板涂布法和碱裂解法分离含质粒乳酸菌,通过菌落形态、生理生化和16S r DNA序列分析法对其进行鉴定。利用单酶酶切质粒,并在测序质粒片段的基础上设计引物扩增质粒的剩余片段,对拼接成功的质粒进行序列分析。结果:从四川泡菜中分离出一株含质粒的食窦魏斯氏菌W5(Weissella cibaria)。该菌株中质粒p A010全长为11630 bp,GC含量为34.6%,编码了4个可识别功能蛋白,包括酪氨酸重组酶、复制蛋白、抗毒素Pem I和毒素Pem K。比较酪氨酸重组酶和复制蛋白,推断该质粒为θ型复制质粒。其中Pem I和Pem K构成的II-TA系统对质粒的稳定有一定作用且可能提升食窦魏斯氏菌对周围环境的适应力。结论:食窦魏斯式菌W5是一株含质粒乳酸菌,其序列分析为构建耐受环境胁迫的载体提供了可能。 展开更多
关键词 四川泡菜 食窦魏斯氏菌 质粒 复制蛋白 TA系统
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DNA疫苗免疫增强效应研究进展
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作者 赵芳芳 翟永贞 冯国和 《国际流行病学传染病学杂志》 CAS 2018年第2期124-128,共5页
DNA疫苗技术近年来迅速发展,但当被实际应用于人体试验时免疫原性不足仍是其最大的弱点。国内外科研工作者尝试了多种策略来解决这一问题,包括重组质粒载体的构建及编码抗原的基因优化,电穿孔疫苗免疫、接种方案优化、与能增强转染... DNA疫苗技术近年来迅速发展,但当被实际应用于人体试验时免疫原性不足仍是其最大的弱点。国内外科研工作者尝试了多种策略来解决这一问题,包括重组质粒载体的构建及编码抗原的基因优化,电穿孔疫苗免疫、接种方案优化、与能增强转染基因表达和疫苗诱导免疫的分子佐剂共免疫等。熟悉DNA疫苗的作用机制能更好地利用宿主天然免疫应答以增强疫苗的免疫原性。该综述总结了DNA疫苗免疫效应增强技术的新进展,以及这些进展对DNA疫苗未来发展方向可能产生的影响。 展开更多
关键词 疫苗 DNA 免疫原性 质粒 分子佐剂
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