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变形链球菌耐氟菌株gtfB基因失活菌株的构建 预览 被引量:1
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作者 李文月 高爽 +6 位作者 张志鹰 张红 超博 武玉凤 李贺 王春萌 张志民 《口腔医学研究》 北大核心 2018年第5期490-494,共5页
目的:构建变形链球菌(S.mutans)耐氟菌株UA159-FR中gtfB基因失活株,为研究耐氟菌株gtfB基因的功能奠定基础。方法:培养UA159-FR并以其为模板扩增gtfB基因上游、下游同源臂片段,以质粒pEGFP-N1为模板扩增kan基因;通过重叠延伸聚合酶... 目的:构建变形链球菌(S.mutans)耐氟菌株UA159-FR中gtfB基因失活株,为研究耐氟菌株gtfB基因的功能奠定基础。方法:培养UA159-FR并以其为模板扩增gtfB基因上游、下游同源臂片段,以质粒pEGFP-N1为模板扩增kan基因;通过重叠延伸聚合酶链反应法(overlap extension polymerase chain reaction,OE-PCR)获取上述3个片段的同源重组片段;与pEASY-Blunt Cloning Vector连接形成重组质粒后,进行PCR鉴定和测序鉴定;将重组片段电转化入UA159-FR感受态细胞中得到gtfB基因失活菌株,并进行PCR鉴定。结果:经PCR鉴定和测序鉴定,含有gtfB基因重组片段的重组质粒构建成功;经PCR鉴定,UA159-FR的gtfB基因失活株构建成功。结论:成功构建了含有gtfB基因重组片段的重组质粒和S.mutans耐氟菌株UA159-FR的gtfB基因失活株,可用于gtfB基因功能的研究。 展开更多
关键词 变形球菌耐氟菌株 gtfB基因 重叠延伸聚合酶链反应 同源重组 基因失活
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利用Gateway克隆技术构建人Hiwi腺病毒载体 预览
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作者 马宁 董晓燕 +2 位作者 姜艳芳 刘蒙蒙 刘子玲 《吉林大学学报:医学版》 CAS CSCD 北大核心 2014年第4期898-903,I0004共7页
目的:获得人的全长Hiwi编码区基因,构建携带绿色荧光蛋白(GFP)的人Hiwi腺病毒载体,为进一步研究Hiwi诱导白血病干细胞分化和凋亡的作用和机制奠定基础。方法:运用重叠延伸PCR方法扩增Hiwi编码区基因全长;利用Gateway克隆技术将Hiwi... 目的:获得人的全长Hiwi编码区基因,构建携带绿色荧光蛋白(GFP)的人Hiwi腺病毒载体,为进一步研究Hiwi诱导白血病干细胞分化和凋亡的作用和机制奠定基础。方法:运用重叠延伸PCR方法扩增Hiwi编码区基因全长;利用Gateway克隆技术将Hiwi编码区基因全长插入带有GFP的载体Flag-IRES-hrGFP中构建成为pDown-Hiwi-3×flag-IRES-hrGFP,再将克隆载体pDown-Hiwi-3×flag-IRES-hrGFP与表达载体pAV.Des1d进行同源重组反应,得到重组腺病毒载体pAV.Ex1d-Hiwi-3×flag-IRES-hrGFP。经PCR筛选阳性克隆提取重组腺病毒质粒,包装成重组Ad-Hiwi-3×flag-IRES-hrGFP腺病毒。结果:人Hiwi全长编码区基因克隆成功,经酶切及基因测序鉴定证实重组Ad-Hiwi-3×flag-IRES-hrGFP腺病毒质粒构建成功。采用Lipofectamine法将Ad-Hiwi-3×flag-IRES-hrGFP转染入HEK293A细胞中,在荧光显微镜下,可以观察到转染细胞中的绿色荧光。结论:成功构建重组Ad-Hiwi-3×flag-IRES-hrGFP腺病毒质粒,其可在HEK293A细胞内表达。 展开更多
关键词 Hiwi基因 腺病毒 重叠延伸聚合酶链反应 Gateway克隆技术
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重叠延伸PCR构建EB病毒BMRF1-BZLF1N融合基因 预览
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作者 伊强 陈丹 +1 位作者 杨滨 欧启水 《临床检验杂志》 CAS CSCD 北大核心 2013年第4期279-281,共3页
目的构建EB病毒BMRF1-BZLF1N融合基因,并分析其克隆表达。方法用重叠延伸PCR将EB病毒的BMRF1基因和BZLF1N基因通过多肽接头(Gly4Ser)2的DNA序列进行连接,构建BMRF1-BZLF1N融合基因,并进行核苷酸序列测定。结果 DNA序列分析结果表明,... 目的构建EB病毒BMRF1-BZLF1N融合基因,并分析其克隆表达。方法用重叠延伸PCR将EB病毒的BMRF1基因和BZLF1N基因通过多肽接头(Gly4Ser)2的DNA序列进行连接,构建BMRF1-BZLF1N融合基因,并进行核苷酸序列测定。结果 DNA序列分析结果表明,该融合基因BMRF1-Linker-BZLF1N的连接顺序、方向及序列完全正确。结论成功构建了EB病毒BMRF1-BZLF1N融合基因,为该融合基因克隆表达产物的应用研究提供了依据。 展开更多
关键词 EB病毒 融合基因 重叠延伸聚合酶链反应
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重叠延伸PCR法定点突变微生物产谷氨酰胺转氨酶基因 被引量:3
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作者 叶程 邵坤彦 +3 位作者 王亚南 覃桂 代风娇 何冬兰 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2013年第5期670-674,共5页
目的 通过重叠延伸PCR法,定点突变微生物产谷氨酰胺转氨酶(Microbial transglutaminase,MTG)基因。方法 根据GenBank中登录的Streptomyces sp.H197基因中MTG序列及重叠延伸PCR定点突变技术的原理,利用DNA-MAN5.0软件设计引物,以提取的... 目的 通过重叠延伸PCR法,定点突变微生物产谷氨酰胺转氨酶(Microbial transglutaminase,MTG)基因。方法 根据GenBank中登录的Streptomyces sp.H197基因中MTG序列及重叠延伸PCR定点突变技术的原理,利用DNA-MAN5.0软件设计引物,以提取的Streptomyces sp.H197基因组DNA为模板,PCR扩增MTG基因,以扩增的MTG基因片段为模板,采用重叠延伸PCR技术对一个位点进行定点突变,胶回收PCR产物,与克隆载体pMD19-T连接后,转化感受态E.coliDH5α,提取质粒,经PCR及单、双酶切鉴定,并测序。结果 重叠延伸PCR产物可见含有酶切位点和突变位点的特异性片段;重组质粒pMD19-T-MTG经PCR及单、双酶切鉴定,证明构建正确;测序结果表明,与野生型序列比对,仅有一个碱基发生改变,即第773位腺嘌呤突变为胞嘧啶,突变位点与预期一致,实现了目标位点的定点突变。结论 重叠延伸PCR法对MTG基因序列预定位点突变成功,证明阳性克隆子含突变位点,为下阶段突变型功能表达奠定基础。 展开更多
关键词 谷氨酰胺转氨 重叠延伸聚合酶链反应 点突变
鸡柔嫩艾美耳球虫CDPK和鸡IFN-γ重组质粒的构建与体外表达 被引量:1
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作者 徐守振 李卫华 +1 位作者 尹燕博 汪明 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2010年第9期920-924,共5页
采用SOE-PCR技术将鸡柔嫩艾美耳球虫CDPK抗原基因与鸡干扰素-γ(IFN-γ)基因用(GGGGS)315个疏水柔性氨基酸接头融合,扩增出IFN-γ-CDPK融合基因,将其克隆到pMAL-p2X载体上,构建了重组原核表达质粒pMAL-IFN-γ-CDPK,用IPTG诱导表达... 采用SOE-PCR技术将鸡柔嫩艾美耳球虫CDPK抗原基因与鸡干扰素-γ(IFN-γ)基因用(GGGGS)315个疏水柔性氨基酸接头融合,扩增出IFN-γ-CDPK融合基因,将其克隆到pMAL-p2X载体上,构建了重组原核表达质粒pMAL-IFN-γ-CDPK,用IPTG诱导表达并纯化重组蛋白,经免疫印迹分析该蛋白的生物学活性。结果显示,成功构建了共表达IFN-γ-CDPK融合基因的原核表达载体,表达纯化了具有良好的免疫反应性的IFN-γ-CDPK融合蛋白,表达纯化的IFN-γ-CDPK融合蛋白能够和鸡柔嫩艾美耳球虫甘肃株抗血清发生特异性结合,为进一步研制高效力的鸡球虫新型基因工程疫苗奠定了基础。 展开更多
关键词 柔嫩艾美耳球虫 重叠延伸聚合酶链反应 CDPK基因 IFN-Γ基因 共表达
重叠延伸聚合酶链反应克隆大鼠Foxo3a基因及序列测定 预览 被引量:1
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作者 代婷婷 何援利 《南昌大学学报:医学版》 CAS 2010年第1期 21-24,共4页
目的获得大鼠Foxo3a基因全长编码区基因。方法运用重叠延伸PCR方法从大鼠脾脏总RNA中扩增Foxo3a编码区基因全长,将其插入pMD19-T载体中进行酶切及测序鉴定。结果Foxo3a编码区基因全长2019bp,与GenBank中大鼠Foxo3a基因同源性为99.9... 目的获得大鼠Foxo3a基因全长编码区基因。方法运用重叠延伸PCR方法从大鼠脾脏总RNA中扩增Foxo3a编码区基因全长,将其插入pMD19-T载体中进行酶切及测序鉴定。结果Foxo3a编码区基因全长2019bp,与GenBank中大鼠Foxo3a基因同源性为99.9%。结论运用重叠延伸PCR技术可成功克隆高GC含量大鼠Foxo3a的cDNA,为进一步研究该基因奠定了基础。 展开更多
关键词 Foxo3a基因 克隆 重叠延伸聚合酶链反应
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小鼠2型金属硫蛋白基因的克隆 预览 被引量:1
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作者 修佳祺 李云 +4 位作者 张云建 陈强 李鹏 凌翎 任淑萍 《中国实验诊断学》 2007年第8期 1091-1094,共4页
目的 构建含有小鼠Ⅱ型金属硫蛋白(MT)基因的真核表达载体,为进行MT抗氧化作用的体内功能实验奠定基础。方法 采用重叠延伸PCR技术设计两对引物,利用引物间的互补序列作为模板合成小鼠Ⅱ型MT基因。结果 将PCR产物经连接反应,连接产物... 目的 构建含有小鼠Ⅱ型金属硫蛋白(MT)基因的真核表达载体,为进行MT抗氧化作用的体内功能实验奠定基础。方法 采用重叠延伸PCR技术设计两对引物,利用引物间的互补序列作为模板合成小鼠Ⅱ型MT基因。结果 将PCR产物经连接反应,连接产物转化JM109,摇菌后提取质粒,质粒的酶切鉴定及最后的测序结果均表明本实验所获得的小鼠Ⅱ型MT基因与GENEBANK中的目标基因序列完全一致。结论 本实验通过重叠PCR技术成功构建了小鼠Ⅱ型MT编码基因,重叠PCR技术是合成目的基因片段的有效的手段。 展开更多
关键词 金属硫蛋白 基因 重叠延伸聚合酶链反应
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大鼠细胞色素P450—2J3基因的克隆及其在293细胞中的表达 预览
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作者 闫哲 王明太 +1 位作者 李仁立 汪道文 《中原医刊》 2006年第7期 6-9,共4页
目的 克隆大鼠CYP2J3基因并构建pcDNA3.1(+)-CYP2J3真核表达我体,检测其在293细胞中的表达。方法 提取大鼠肝脏组织总RNA,采用逆转录聚合酶链反应(RT—PCR)和重叠延伸聚合酶链反应(OE—PCR)扩增大鼠CYP2J3基因,克隆入真核表... 目的 克隆大鼠CYP2J3基因并构建pcDNA3.1(+)-CYP2J3真核表达我体,检测其在293细胞中的表达。方法 提取大鼠肝脏组织总RNA,采用逆转录聚合酶链反应(RT—PCR)和重叠延伸聚合酶链反应(OE—PCR)扩增大鼠CYP2J3基因,克隆入真核表达我体pcDNA3.1(+)。脂质体转染293细胞,用Western blotting鉴定其在293细胞表达。结果 运用RT—PCR和OE—PCR获得CYP2J3基因开放读码框架(ORF)全长序列,经酶切鉴定正确。测序结果与基因GenBank提交序列完全一致并成功构建真核表达载体pcDNA3.1(+)-CYP2J3。Western blotting结果显示,转染pcD—NA3.1(+)-CYP2J3后的293细胞能稳定有效表达CYP2J3蛋白。结论 大鼠CYP2J3基因的成功克隆以及pcDNA3.1(+)-CYP2J3载体的成功构建,为CYP2J3基因的功能研究和相关疾病的研究提供了可行的工具。 展开更多
关键词 CYP2J3 基因克隆 聚合酶链反应 转染 基因表达 重叠延伸聚合酶链反应
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OE-PCR法扩增获得犬瘟热病毒缺失疏水区的融合蛋白基因片段 预览
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作者 乌仁高娃 杨敬 陈振文 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2005年第6期 585-587,共3页
根据犬瘟热病毒(CDV)Onderstepoort株的核苷酸序列,设计合成引物,通过RT-PCR,从CDVOnderstepoort 株RNA中扩增出2197 bp的CDV全长融合蛋白(F)基因.将其与pGEM-T easy载体连接,通过软件分析其序列中的疏水区后,以pGEM-T/F为模板,PCR扩增... 根据犬瘟热病毒(CDV)Onderstepoort株的核苷酸序列,设计合成引物,通过RT-PCR,从CDVOnderstepoort 株RNA中扩增出2197 bp的CDV全长融合蛋白(F)基因.将其与pGEM-T easy载体连接,通过软件分析其序列中的疏水区后,以pGEM-T/F为模板,PCR扩增出约254 bp和1017 bp的F蛋白疏水区外编码序列.以2个扩增产物为模板,以OE-PCR(overlap extension-PCR)扩增出约1271bp的缺失疏水区的F基因(dF),测序结果表明,dF的序列除在疏水区以4个甘氨酸序列替代外,其余部分与F基因的同源性为99.2%.这表明,OE-PCR扩增法已成功地使CDV F基因疏水区缺失. 展开更多
关键词 CDV F基因 疏水区缺失 重叠延伸聚合酶链反应
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