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CRISPR/Cas系统在植物抗病毒中的应用 预览
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作者 闫洪波 高艳丽 +2 位作者 孙世卫 窦炎丹 吴志明 《草业科学》 CAS CSCD 2019年第5期1405-1414,共10页
近年来,CRISPR/Cas系统因其简易性和有效性不仅在植物基因组编辑中得到广泛应用,而且开始应用于植物抗病毒研究。本文介绍了CRISPR/Cas系统的研究进展,详述了CRISPR/Cas9和CRISPR/Cas13a在抗植物病毒中的应用,以及靶向病毒基因组和靶向... 近年来,CRISPR/Cas系统因其简易性和有效性不仅在植物基因组编辑中得到广泛应用,而且开始应用于植物抗病毒研究。本文介绍了CRISPR/Cas系统的研究进展,详述了CRISPR/Cas9和CRISPR/Cas13a在抗植物病毒中的应用,以及靶向病毒基因组和靶向宿主植物基因组两种抗病毒基本策略;同时讨论了CRISPR/Cas12a和相关原核Ago系统在抗植物病毒上的潜在应用前景,并指出CRISPR/Cas在应用中存在的挑战。由于CRISPR/Cas系统在抗植物病毒研究中的优势,可能给植物抗病毒育种带来革命性变化。 展开更多
关键词 CRISPR/Cas9 CRISPR/Cas13a 植物病毒 病毒基因组 宿主植物基因组 抗病毒策略 Ago系统
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利用CRISPR/Cas9系统在Beta-TC-6细胞株中剔除Sidt2基因 预览
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作者 吕康甲 梁飞腾 +4 位作者 郑慧豪 张杨 徐海平 董莹莹 高家林 《皖南医学院学报》 CAS 2019年第3期214-218,共5页
目的:利用CRISPR/Cas9基因编辑系统和电穿孔技术,在小鼠胰岛素瘤胰岛β细胞(Beta-TC-6)中剔除溶酶体膜蛋白Sidt2基因。方法:针对小鼠Sidt2基因设计向导RNA(sgRNA),sgRNA退火合成双链后克隆到px459载体中。测序鉴定成功的重组质粒命名为p... 目的:利用CRISPR/Cas9基因编辑系统和电穿孔技术,在小鼠胰岛素瘤胰岛β细胞(Beta-TC-6)中剔除溶酶体膜蛋白Sidt2基因。方法:针对小鼠Sidt2基因设计向导RNA(sgRNA),sgRNA退火合成双链后克隆到px459载体中。测序鉴定成功的重组质粒命名为px459-Sidt2并大量扩增。使用NEPA21高效基因转染系统将px459-Sidt2重组质粒电转到Beta-TC-6细胞中,电转染48h后使用嘌呤霉素加压进行阳性细胞筛选。阳性细胞扩增冻存,得到Sidt2基因剔除混合克隆细胞株,提取细胞DNA及蛋白,利用T7酶以及Western blot方法检测细胞株中Sidt2的敲除效果。结果:成功构建靶向小鼠Sidt2基因的px459重组质粒px45-Sidt2。使用NEPA21高效基因转染系统电转Beta-TC-6的最佳电转参数为脉冲电压150V,脉冲时间5ms,脉冲间隔50ms,脉冲次数2次,电压衰减10%,电穿孔模式为正方向。与对照组细胞相比,嘌呤霉素加压筛选得到的Beta-TC-6阳性细胞中的Sidt蛋白表达缺失(P<0.05),成功在小鼠胰岛素瘤胰岛β细胞(Beta-TC-6)中剔除溶酶体膜蛋白Sidt2基因。结论:利用CRISPR/Cas9基因编辑系统以及电穿孔技术,在相对难转染的小鼠胰岛素瘤胰岛β细胞Beta-TC-6成功剔除Sidt2基因。 展开更多
关键词 CRISPR/Cas9 电穿孔 Sidt2 Beta-TC-6
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CRISPR-Cas9系统编辑DNA诱导基因敲除的发展及优缺点 预览
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作者 张佳珊 谭韬(指导) 《中国免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2019年第6期767-770,共4页
CRISPR是一种特别的免疫系统,它可以对入侵到细菌或古生菌体内的病毒和核酸进行特异性识别,利用Cas9蛋白酶进行切割,达到自身免疫的效果,它是绝大部分细菌和一些古生菌的天然免疫系统。本文通过对近期CRISPR的研究文献的阅读,总结了CRIS... CRISPR是一种特别的免疫系统,它可以对入侵到细菌或古生菌体内的病毒和核酸进行特异性识别,利用Cas9蛋白酶进行切割,达到自身免疫的效果,它是绝大部分细菌和一些古生菌的天然免疫系统。本文通过对近期CRISPR的研究文献的阅读,总结了CRISPR-Cas9系统的工作原理,对不同目标的基因敲除的实验原理和实验过程进行了分析,比较了CRISPR基因编辑技术与传统的基因编辑技术的不同,初步讨论如何提高CRISPR的敲除效率;结合以上实验的研究,总结了CRISPR的优缺点,通过对近期发现的大规模脱靶效应现象进行讨论,进一步讨论了关于CRISPR技术未来的发展。 展开更多
关键词 CRISPR-Cas9 靶向敲除 基因编辑 Guide-RNA 脱靶
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通过优化gRNA设计提高CRISPR/Cas9系统中基因编辑效率的方法
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作者 李秋月 王小柯 +3 位作者 张亚飞 孙珍珠 王旭 江东 《分子植物育种》 CAS CSCD 北大核心 2019年第10期3274-3282,共9页
CRISPR/Cas9系统是一种广泛应用于动物、植物、真菌、细菌的新一代基因定点编辑技术,如何提高g RNA的编辑效率是该技术的关键点也是许多研究者关注的焦点。本研究利用CRISPR/Cas9技术对番茄miR167a前体序列进行基因编辑,根据番茄miR167... CRISPR/Cas9系统是一种广泛应用于动物、植物、真菌、细菌的新一代基因定点编辑技术,如何提高g RNA的编辑效率是该技术的关键点也是许多研究者关注的焦点。本研究利用CRISPR/Cas9技术对番茄miR167a前体序列进行基因编辑,根据番茄miR167a前体序列在线设计候选g RNA,同时结合体外编辑检测的方法筛选出能够在体外成功编辑的g RNA-G1,把其连接到含有荧光标记的pP1C.1C表达载体,转化番茄子叶,产生愈伤组织数116个,得到5个含有表达载体的材料,经测序发现,其中3个材料发生了编辑。结果表明,通过体外检测和在线软件设计相结合的方法来快速检测g RNA的编辑效率,能筛选出最优的g RNA用于载体的构建,与未采用体外编辑检测来设计g RNA的方法相比,显著提高了CRISPR/Cas9的编辑效率。本研究通过优化g RNA,创新了一种高效利用CRISPR/Cas9进行基因编辑的方法。 展开更多
关键词 gRNA设计 CRISPR/Cas9 体外检测 基因编辑
CRISPR/Cas9技术在人类重要病毒性传染病中的应用
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作者 张珊 胡康洪 +2 位作者 魏艳红 孙鸽 孙殿兴 《中国病原生物学杂志》 CSCD 北大核心 2019年第4期491-496,F0003共7页
近年来,CRISPR/Cas9作为一种新型的基因编辑工具,具备特异性强、使用广泛、操作相对简便等特点。通过对病毒基因组进行基因编辑从而干扰病毒复制和清除感染,以及在重要宿主因子、受体靶蛋白等方面应用都具有明显优势。本文着重以CRISPR/... 近年来,CRISPR/Cas9作为一种新型的基因编辑工具,具备特异性强、使用广泛、操作相对简便等特点。通过对病毒基因组进行基因编辑从而干扰病毒复制和清除感染,以及在重要宿主因子、受体靶蛋白等方面应用都具有明显优势。本文着重以CRISPR/Cas9技术在一些导致人类重要传染性疾病的病毒如乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、Epstein-Barr病毒(EBV)、单纯疱疹病毒(HSV)、寨卡病毒(ZIKV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)中的应用、面临的技术瓶颈问题和解决方案及治疗前景进行讨论。 展开更多
关键词 CRISPR/Cas9 乙型肝炎病毒(HBV) 丙型肝炎病毒(HCV) Epstein-Barr病毒(EBV) 单纯疱疹病毒(HSV) 寨卡病毒(ZIKV) 人类免疫缺陷病毒(HIV) 综述
CRISPR/Cas9系统在植物基因组编辑中技术改进与创新的研究进展
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作者 苏钺凯 邱镜仁 +2 位作者 张晗 宋振巧 王建华 《植物学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第3期385-395,共11页
CRISPR/Cas9基因组编辑技术是一项对基因组进行精准修饰的技术,可实现对靶标基因的碱基插入、缺失或DNA片段替换。随着人们对CRISPR/Cas9系统的了解逐渐加深,其在科研、农业和医疗等领域的应用也越来越广泛。该文简要介绍了CRISPR/Cas9... CRISPR/Cas9基因组编辑技术是一项对基因组进行精准修饰的技术,可实现对靶标基因的碱基插入、缺失或DNA片段替换。随着人们对CRISPR/Cas9系统的了解逐渐加深,其在科研、农业和医疗等领域的应用也越来越广泛。该文简要介绍了CRISPR/Cas9基因组编辑技术的发展以及工作原理,总结了近几年对该技术进行优化与改进的研究进展,包括基因组编辑效率的提升、基因组编辑范围的扩展、单碱基精准编辑以及多基因同时编辑、基因组编辑安全性的提升以及基因片段替换与基因靶向转录调控,以期为深入开展这一领域的研究提供参考。 展开更多
关键词 CRISPR/Cas9 基因组编辑 遗传改良 植物基因组
水稻OsDUF393基因编辑突变体的创建 预览
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作者 王荃 石雨鹭 +5 位作者 邳瑞雪 孔晓聪 靳亚军 梁闪闪 张泗举 栾维江 《中国稻米》 2019年第2期40-45,共6页
DUFs家族是一类未知功能结构域蛋白家族,转录谱和蛋白谱分析发现,DUFs蛋白在生物的生长和发育中发挥着至关重要的作用,因此对DUFs基因功能的研究将有助于了解生物体复杂的生长发育机制。目前该家族基因功能仍鲜见报道。为了探究水稻(Ory... DUFs家族是一类未知功能结构域蛋白家族,转录谱和蛋白谱分析发现,DUFs蛋白在生物的生长和发育中发挥着至关重要的作用,因此对DUFs基因功能的研究将有助于了解生物体复杂的生长发育机制。目前该家族基因功能仍鲜见报道。为了探究水稻(Oryza sativa)OsDUF393(Domains of Unknown Function 393)基因的生物学功能,利用CRISPR/Cas9技术构建了水稻DUFs家族基因OsDUF393的载体,同时利用农杆菌介导的遗传转化将构建的CRISPR/Cas9载体转化水稻品种中花11中,经潮霉素抗性基因鉴定,获得了100株T0代转基因植株。对转基因植株的靶位点进行测序分析后发现有单碱基插入和大片段DNA序列缺失2种类型。通过RT-PCR分析突变体中OsDUF393基因的表达水平,结果表明,目的基因在不同纯合编辑突变体中转录水平均有下降。上述结果表明,CRISPR/Cas9重组载体成功实现了对OsDUF393基因的定向编辑。这些编辑突变体材料为后续该基因功能研究奠定了基础。 展开更多
关键词 水稻 OsDUF393 基因编辑 CRISPR/Cas9
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利用CRISPR/Cas9技术构建稳定表达人白蛋白基因的中国仓鼠卵巢细胞系
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作者 周松涛 陈蕴 +2 位作者 龚笑海 金坚 李华钟 《中国生物工程杂志》 CAS CSCD 北大核心 2019年第4期52-59,共8页
通过目的基因的随机整合方式,构建得到的CHO表达细胞系,常会因为目的基因插入到染色体内不稳定区域,而在长期传代过程中出现表达不稳定的现象,这主要是由于位点效应所导致的。为了解决这个问题,现利用CRISPR/Cas9技术介导的同源重组,将... 通过目的基因的随机整合方式,构建得到的CHO表达细胞系,常会因为目的基因插入到染色体内不稳定区域,而在长期传代过程中出现表达不稳定的现象,这主要是由于位点效应所导致的。为了解决这个问题,现利用CRISPR/Cas9技术介导的同源重组,将目的基因直接整合于CHO细胞染色体上的稳定表达区域,以克服位点效应带来的CHO表达细胞系的长期表达不稳定。利用该技术总共获得了2株外源基因(人白蛋白基因)定点整合细胞系;Western blot结果显示,细胞上清液的产物具有人白蛋白抗原性;细胞在贴壁状态下,两株细胞系在第3、12、23、35、50代,细胞每日表达的HSA质量接近,且均维持在0. 5pg cell/d;选取一株表达细胞系,经悬浮驯化后,在批次条件培养下,第1、25、50代的悬浮细胞,在摇瓶内的表达浓度均稳定在13~14mg/L。显示了将外源基因定点整合于CHO细胞基因组内的可行性;且外源基因整合在稳定表达区域后,重组细胞系具有对外源基因长期表达的稳定性。 展开更多
关键词 中国仓鼠卵巢细胞 定点整合 CRISPR/Cas9 蛋白质表达
转录因子ZnF-706在鳞翅目昆虫中的进化格局及在家蚕中的功能 预览
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作者 崔勇 朱亚楠 +4 位作者 黄悦莹 谭丽庄 冯启理 王文 相辉 《昆虫学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第1期9-20,共12页
【目的】探讨家蚕Bombyx mori的潜在驯化基因--转录因子ZnF-706在鳞翅目(Lepidoptera)昆虫进化过程及家蚕驯化过程中的分子进化格局;并基于CRISPR/Cas9家蚕基因组编辑平台,探讨ZnF-706基因在家蚕中的功能。【方法】首先分析了家蚕ZnF-70... 【目的】探讨家蚕Bombyx mori的潜在驯化基因--转录因子ZnF-706在鳞翅目(Lepidoptera)昆虫进化过程及家蚕驯化过程中的分子进化格局;并基于CRISPR/Cas9家蚕基因组编辑平台,探讨ZnF-706基因在家蚕中的功能。【方法】首先分析了家蚕ZnF-706序列特征,并利用已发表芯片数据调研该基因在家蚕幼虫组织中的表达格局;利用Phylogenetic Analysis by Maximum Likelihood(PAML)分支检验方法,分析该基因在鳞翅目不同类群中的分子进化格局。基于已发表的家蚕-野桑蚕Bombyx mandarina群体基因组多态性数据,对ZnF-706进行基因区域人工选择信号分析;对ZnF-706基因上游2 kb的调控区域进行单核苷酸多态性位点频率检测,发掘在家蚕群体中固定下来的突变位点;针对突变位点所在区域进行转录因子结合活性预测。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除ZnF-706基因,获得纯和突变体;以野生型家蚕为对照,检测突变体的茧重及蛹重变化。【结果】家蚕ZnF-706的编码蛋白具有典型的锌指蛋白结构域。ZnF-706在家蚕5龄第3天幼虫各组织中广泛表达,尤其表皮、脂肪体和生殖腺中有很高的表达量;该基因在鳞翅目、蚕蛾总科(Bombycoidea)及天蚕Antherea yamamai 3个分支中均呈现快速进化信号,在家蚕中有强烈的人工选择信号。该基因所在基因组区域的家蚕-野桑蚕种群分歧度参数Fst明显升高,家蚕群体中的群体多样性π明显降低,表明它位于一个选择扫荡区域内;该基因在家蚕-野桑蚕中的9个SNP位点存在于上游调控区,并位于转录因子结合活性区域内。该基因的纯合家蚕突变体ΔZnF-706生存力减弱,并且茧重以及蛹重与野生型家蚕相比都显著降低。但与黑腹果蝇Drosophila melanogaster中不同的是,家蚕中该基因的突变并不致死。【结论】ZnF-706可能在鳞翅目尤其是泌丝昆虫中进化,并在家蚕驯化过程中受到选择压力,提示其对于特征性状茧丝� 展开更多
关键词 鳞翅目 家蚕 泌丝昆虫 驯化基因 转录因子 CRISPR/Cas9
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CRISPR/Cas基因组编辑技术研究进展及其在植物中的应用
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作者 丁莉萍 张杰伟 +3 位作者 马艳 陈亚娟 王宏芝 魏建华 《植物生理学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第4期411-424,共14页
基因组编辑技术利用人工核酸酶以精准和可预测的方式来快速改造和修饰基因组,加速了基础研究和植物育种的进程。近年来兴起的II型CRISPR/Cas9基因组编辑技术成功应用于多种动植物中。CRISPR/Cas9系统在可定制的小型非编码RNA的指导下定... 基因组编辑技术利用人工核酸酶以精准和可预测的方式来快速改造和修饰基因组,加速了基础研究和植物育种的进程。近年来兴起的II型CRISPR/Cas9基因组编辑技术成功应用于多种动植物中。CRISPR/Cas9系统在可定制的小型非编码RNA的指导下定向切割基因组DNA双链,并通过非同源末端连接(NHEJ)和同源重组(HDR)机制进行基因修饰,从而实现基因组靶标基因的定点改造。本综述介绍了CRISPR/Cas系统的结构及作用原理,讨论了CRISPR/Cas9系统的靶点效率、脱靶效应以及Cas9突变体的筛选,并对CRISPR/Cas9系统的表观遗传调控进行了分析。最后我们详细阐述了CRISPR/Cas9技术在植物中的最新应用进展,并对CRISPR/Cas9系统的发展和应用前景进行了展望,希望为开展植物基因组编辑方面的研究工作提供参考。 展开更多
关键词 CRISPR/Cas9 基因组编辑 植物
CD8^+T细胞PD-1基因CRISPR/Cas9编辑体系电穿孔条件的优化 预览
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作者 王淑敏 张代群 +1 位作者 李峰 张毅 《郑州大学学报:医学版》 CAS 北大核心 2019年第3期327-332,共6页
目的:通过优化电穿孔递送条件,提高基于CRISPR/Cas9编辑体系对T细胞PD-1基因编辑效率。方法:在前期研究基础上,通过优化电转缓冲液和脉冲条件组合,对CD8^+T细胞的PD-1基因进行敲除编辑,检测电穿孔后CD8^+T细胞凋亡、分化、增殖和PD-1表... 目的:通过优化电穿孔递送条件,提高基于CRISPR/Cas9编辑体系对T细胞PD-1基因编辑效率。方法:在前期研究基础上,通过优化电转缓冲液和脉冲条件组合,对CD8^+T细胞的PD-1基因进行敲除编辑,检测电穿孔后CD8^+T细胞凋亡、分化、增殖和PD-1表达情况。结果:与传统电穿孔方案(P3电转染缓冲液+EO115脉冲)相比,优化方案(P2电转染缓冲液+EH100脉冲)能显著提高PD-1敲除效率,但不影响T细胞存活、分化状态以及增殖。结论:P2电转染缓冲液+EH100脉冲的组合对T细胞PD-1基因的编辑效率较高。 展开更多
关键词 CRISPR/Cas9 基因编辑 T细胞 免疫抑制受体 PD-1
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棉花U3和U6启动子在CRISPR/Cas9基因组编辑体系中的功能鉴定 预览
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作者 藏旭阳 代培红 +3 位作者 李继洋 蒲艳 顾爱星 刘晓东 《棉花学报》 CSCD 北大核心 2019年第1期31-39,共9页
【目的】对已克隆的海岛棉U3和U6启动子进行功能鉴定,为构建棉花CRISPR/Cas9多位点基因编辑技术体系提供更多可用的U3和U6启动子。【方法】分别构建以GbU3-2P和GbU6-7P为启动子驱动sgRNA,以抗旱负调控基因GGB为靶序列的CRISPR/Cas9基因... 【目的】对已克隆的海岛棉U3和U6启动子进行功能鉴定,为构建棉花CRISPR/Cas9多位点基因编辑技术体系提供更多可用的U3和U6启动子。【方法】分别构建以GbU3-2P和GbU6-7P为启动子驱动sgRNA,以抗旱负调控基因GGB为靶序列的CRISPR/Cas9基因编辑载体,然后在新海16的棉花叶片原生质体中进行功能鉴定。通过Polymerasechainreaction方法富集构建好的CRISPR/Cas9基因编辑载体的核心片段,并利用PEG瞬时转化法将核心片段转入原生质体中。提取转化后的原生质体基因组DNA,采用酶切/Polymerase chain reaction法分析棉花GGB基因的突变情况并测序验证。最后绘制靶基因突变的频率分布图来计算该CRISPR/Cas9系统的编辑效率和确认突变的真实性。【结果】靶基因测序结果显示靶标位点序列突变的类型全部为碱基替换。【结论】以GbU3-2P和GbU6-7P为启动子的CRISPR/Cas9基因编辑体系可以成功地定点编辑棉花GGB基因的序列,引起基因突变。 展开更多
关键词 棉花 CRISPR/Cas9 基因组编辑 U3/U6启动子 原生质体
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利用CRISPR/Cas9敲除葡萄VviPDS1基因的研究
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作者 郭晔 万东艳 +2 位作者 柴壮壮 王跃进 文颖强 《园艺学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第4期623-634,共12页
选择葡萄八氢番茄红素脱氢酶(Phytoene desaturase)基因VviPDS1为靶标,利用CRISPR/Cas9系统构建基因敲除载体,瞬时转化葡萄叶片原生质体,检测到不同类型的突变。通过农杆菌介导转化‘无核白’葡萄胚性愈伤组织,筛选获得卡那霉素抗性植... 选择葡萄八氢番茄红素脱氢酶(Phytoene desaturase)基因VviPDS1为靶标,利用CRISPR/Cas9系统构建基因敲除载体,瞬时转化葡萄叶片原生质体,检测到不同类型的突变。通过农杆菌介导转化‘无核白’葡萄胚性愈伤组织,筛选获得卡那霉素抗性植株71株。经PCR鉴定,其中53株为阳性植株,阳性率为74.64%。测序结果表明,共有20株在靶点发生不同类型的突变,编辑效率为37.74%;其中9株产生了双等位基因突变。对其进行氨基酸序列预测,在第202位氨基酸之后发生了不同程度的变异。利用CRISPR/Cas9系统敲除VviPDS1获得的突变体植株呈现整体矮化,其叶片出现不同程度白化。表明CRISPR/Cas9系统可以通过细胞中的瞬时或稳定表达进行基因编辑,可以实现在葡萄编辑植株中产生纯合敲除。 展开更多
关键词 葡萄 CRISPR/Cas9 PDS1 基因编辑
基于CRISPR-Cas9系统的Saccharomyces cerevisiae基因删除 预览
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作者 牛潇迪 李天明 +3 位作者 刘金雷 杨天勇 李子怡 冯惠勇 《食品科学》 EI CAS CSCD 北大核心 2019年第6期151-158,共8页
建立CRISPR-Cas9介导的在Saccharomyces cerevisiae双倍体细胞中进行基因敲除的方法。以can1基因敲除后的表型验证该CRISPR-Cas9系统的有效性,can1基因的失活效率达到4%。利用该系统又分别敲除了pdc、adh3、adh2、adh1、 pdh等基因,单... 建立CRISPR-Cas9介导的在Saccharomyces cerevisiae双倍体细胞中进行基因敲除的方法。以can1基因敲除后的表型验证该CRISPR-Cas9系统的有效性,can1基因的失活效率达到4%。利用该系统又分别敲除了pdc、adh3、adh2、adh1、 pdh等基因,单基因编辑效率分别为4/48、3/48、1/48、3/28、1/16。确定了基因连续敲除的方法流程,pdc、adh3、adh2三个基因全部敲除,整个过程用时17 d。探索了双基因一次转化同时敲除的方法,将adh5、lip两个基因同时敲除用时6 d,基因编辑效率分别为9/32和10/32。 展开更多
关键词 酿酒酵母 CRISPR-Cas9 基因组工程 基因敲除
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CRISPR/Cas9系统靶向沉默Fas基因在肝衰竭细胞凋亡机制中的作用
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作者 庄鹏 李志莹 罗敏虹 《热带医学杂志》 CAS 2019年第4期434-437,共4页
目的探讨利用CRISPR/Cas9敲除系统沉默Fas基因介导的细胞凋亡在肝衰竭发生机制的作用。方法构建靶向Fas基因的CRISPR/Cas系统(pX330-Fas-G1)质粒并转染HepG2细胞(设非转染细胞HepG2为对照组),提取DNA后T7E1酶切法检测突变体;Western blo... 目的探讨利用CRISPR/Cas9敲除系统沉默Fas基因介导的细胞凋亡在肝衰竭发生机制的作用。方法构建靶向Fas基因的CRISPR/Cas系统(pX330-Fas-G1)质粒并转染HepG2细胞(设非转染细胞HepG2为对照组),提取DNA后T7E1酶切法检测突变体;Western blotting检测Fas蛋白的表达。刀豆素A药物处理后MTT法检测细胞增殖,克隆增生法检测细胞增生,AnnexinV/PI荧光双染分析细胞凋亡情况。结果 T7E1酶切分析显示,pX330-Fas-G1质粒的Guide RNA在Fas基因组上产生了有效切割,切割效率为50%;同时Western blotting检测结果显示,pX330-Fas-G1质粒转染至HepG2细胞后,与空白质粒pX330-GFP组比较,Fas蛋白的表达降低,差异有统计学意义(P<0.01)。经刀豆素A药物诱导细胞凋亡后,MTT法测定pX330-Fas-G1质粒转染的HepG2细胞组活力值为(68.0±5.0)%,高于非转染细胞组的(51.5±5.8)%,差异有统计学意义(P<0.05);克隆增生法检测结果显示,pX330-Fas-G1质粒转染的HepG2细胞组在细胞克隆形成数量为(128.8±5.1),高于非转染组的(100.0±9.3),差异有统计学意义(P<0.05)。给予刀豆素A药物处理诱导细胞凋亡后,通过Annexin V和PI双染色,采用流式细胞技术检测显示,经pX330-Fas-G1质粒转染后的细胞组有10.0%的细胞为凋亡细胞,低于对照组细胞的33.3%,差异有统计学意义(P<0.01)。结论 CRISPR/Cas9系统可通过下调Fas基因的表达来抑制细胞凋亡的进展,为临床开展急性肝衰竭的基因治疗提供理论依据和技术支持。 展开更多
关键词 CRISPR/Cas9 FAS 凋亡 肝衰竭
p53基因及NHEJ相关基因表达水平对基因组编辑效率的影响 预览
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作者 于洋 孔明圣 +6 位作者 雷颖首 徐畅 张亚倩 张一帆 张文峰 沈晗 邵红伟 《国际医药卫生导报》 2019年第9期1365-1373,共9页
目的研究CRISPR/Cas9基因组编辑系统在不同细胞中编辑效率的差异及相关的影响因素。方法基于靶向人TCRα链C区(TRAC)基因的CRISPR/Cas9重组载体分别对293T、HEK-293、HeLa、sw480、Jurkat、K562等细胞进行基因组编辑,检测编辑效率的差... 目的研究CRISPR/Cas9基因组编辑系统在不同细胞中编辑效率的差异及相关的影响因素。方法基于靶向人TCRα链C区(TRAC)基因的CRISPR/Cas9重组载体分别对293T、HEK-293、HeLa、sw480、Jurkat、K562等细胞进行基因组编辑,检测编辑效率的差异。同时检测p53基因在不同细胞中的突变情况,通过RT-qPCR分析参与非同源末端连接(NHEJ)通路的17个主要基因的表达情况。结果流式检测各细胞的转染效率:293T为30.50%,HEK-293为29.30%,Hela为17.70%,SW480为21.90%,Jurkat为13.08%,K562为18.51%。根据克隆测序结果计算出各种细胞中基因组的编辑率:293T为74.70%、HEK-293为68.00%、Hela为13.47%、sw480为32.70%、Jurkat为65.52%、K562为77.18%。测序结果表明293T、Jurkat、K562细胞的p53基因发生了突变,而HEK-293、Hela和SW480的p53基因为野生型。qPCR结果显示,在编辑效率较高的细胞系中,大部分NHEJ相关基因的表达水平也较高,且其表达水平在p53功能异常细胞系中要比在p53功能正常细胞系中的高。结论本研究发现p53的异常程度以及NHEJ相关基因的表达水平与基因组编辑效率存在相关性。 展开更多
关键词 CRISPR/Cas9 非同源重组末端连接 P53 基因突变 人类基因编辑 NHEJ 修复相关基因
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基因编辑技术原理及其在动植物研究中的应用 预览
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作者 张泗举 栾维江 《天津师范大学学报:自然科学版》 CAS 北大核心 2019年第3期1-9,共9页
自人类基因组计划开展以来,越来越多生物的基因组序列得到了测定,基因的功能逐步得到鉴定.人们期望通过对基因表达的改变,来治疗人类疾病或提高生物的产量和品质.早期突变技术对基因的改变是不定向的,近年来,锌指核酸酶(ZFN)、转录激活... 自人类基因组计划开展以来,越来越多生物的基因组序列得到了测定,基因的功能逐步得到鉴定.人们期望通过对基因表达的改变,来治疗人类疾病或提高生物的产量和品质.早期突变技术对基因的改变是不定向的,近年来,锌指核酸酶(ZFN)、转录激活子样效应因子核酸酶(TALEN)和CRISPR/Cas9等技术可对某个已知基因进行编辑.特别是CRISPR/Cas9技术,由于具有操作方便、效率高等优点,因此成为对基因进行定向操作的强有力工具.本文对几种基因编辑技术的原理和应用进行简要介绍和展望. 展开更多
关键词 基因编辑 CRISPR/Cas9 转录激活子样效应因子核酸酶 锌指核酸酶
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利用基因编辑技术改良水稻性状的研究进展与展望 预览
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作者 杨平 陈春莲 +3 位作者 熊运华 黄永萍 姚晓云 尹建华 《江西农业学报》 CAS 2019年第4期8-12,共5页
介绍了锌指核酸酶(zinc-finger nucleases, ZFNs)系统、类转录激活效应因子核酸酶(transcriptional activation-like effector nuclease, TALEN)系统、CRISPR/Cas9系统、最新开发的CRISPR/Cpf1和单碱基编辑技术,并综述了基因编辑技术在... 介绍了锌指核酸酶(zinc-finger nucleases, ZFNs)系统、类转录激活效应因子核酸酶(transcriptional activation-like effector nuclease, TALEN)系统、CRISPR/Cas9系统、最新开发的CRISPR/Cpf1和单碱基编辑技术,并综述了基因编辑技术在水稻遗传性状改良中的应用进展及前景。 展开更多
关键词 基因编辑技术 CRISPR/Cas9 水稻 遗传改良 性状
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CRISPR/Cas9系统在植物基因功能研究中的应用进展
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作者 霍晋彦 李姣 +2 位作者 荆雅峰 冯宝民 于宗霞 《植物生理学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第3期241-246,共6页
随着基因组时代到来,涌现出海量基因数据,仅依靠传统过量表达、RNA干扰(RNAi)等手段难以满足大量基因功能分析的需求。依赖于微生物的CRISPR/Cas系统依靠其操作简便、基因编辑效率高、适用范围广的特点,迅速成为研究植物、动物、微生物... 随着基因组时代到来,涌现出海量基因数据,仅依靠传统过量表达、RNA干扰(RNAi)等手段难以满足大量基因功能分析的需求。依赖于微生物的CRISPR/Cas系统依靠其操作简便、基因编辑效率高、适用范围广的特点,迅速成为研究植物、动物、微生物基因功能的重要手段。本文主要介绍了CRISPR/Cas系统的产生、发展和作用机理,并重点介绍了CRISPR/Cas9在植物基因功能研究方面的应用,从而为该系统的进一步优化和多元化应用提供参考。 展开更多
关键词 CRISPR/Cas9 基因编辑 植物基因功能
CRISPR/Cas9技术在创制番茄雄性不育株系中的应用研究
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作者 刘玉琛 丘式浚 +5 位作者 金曼 邓汉超 尹梅 陈竹锋 周向阳 唐晓艳 《农业生物技术学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第6期951-960,共10页
杂种优势利用能极大提高番茄(Solanum lycopersicum)的产量、抗病及抗逆表现,是重要的育种手段。生产上以雄性不育系作为母本能减少人工去雄的工作量。然而,不育系的选育和转育通常需要较长的周期,限制了不育系的品种培育及推广应用。... 杂种优势利用能极大提高番茄(Solanum lycopersicum)的产量、抗病及抗逆表现,是重要的育种手段。生产上以雄性不育系作为母本能减少人工去雄的工作量。然而,不育系的选育和转育通常需要较长的周期,限制了不育系的品种培育及推广应用。利用现代生物技术编辑番茄雄蕊发育相关重要基因,可以更好地解析番茄雄蕊发育的分子机制,缩短番茄不育系品种的育种年限。番茄中SlAP3 (Solanum lycopersicum APETALA3, SlAP3)是拟南芥(Arabidopsis thaliana)花器官发育APETALA3 (AP3)的直系同源基因,该基因突变导致番茄雄蕊发育异常,形成雄性不育表型。本研究利用CRISPR/Cas9基因组编辑系统,分别在番茄SlAP3的外显子上选择2个带有前间区序列邻近基序(protospacer adjacent motifs, PAM)序列的靶点(Targ1和Targ2),构建入CRISPR/Cas9系统表达载体,利用农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的遗传转化获得番茄T0代转基因植株;通过PCR扩增2个靶位点周围DNA序列后回收条带测序鉴定,获得成功敲除的植株,并对其花器官表型进行观察。研究结果表明,2个载体分别获得20和18株转基因阳性苗,对Targ1和Targ2靶点的10株及9株植物进行克隆及序列比对分析发现,在PAM上游的1~9 bp的碱基处均发生不同的缺失突变,导致SlAP3蛋白序列上的氨基酸缺失及提前终止。植株花器官表型观察发现,纯合突变植株均发生了花瓣、雄蕊等花器官同源异型突变及器官数目减少的表型。本研究利用CRISPR/Cas9系统构建的载体能够特异性地靶向编辑目的基因SlAP3,导致该基因突变,从而形成番茄雄蕊同源异型即雄性不育表型。研究结果为利用CRISPR/Cas9系统创制番茄雄性不育系材料提供了一定的理论指导和技术支持。 展开更多
关键词 番茄雄性不育 SlAP3 CRISPR/Cas9
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