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CRISPR/Cas系统在植物抗病毒中的应用 预览
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作者 闫洪波 高艳丽 +2 位作者 孙世卫 窦炎丹 吴志明 《草业科学》 CAS CSCD 2019年第5期1405-1414,共10页
近年来,CRISPR/Cas系统因其简易性和有效性不仅在植物基因组编辑中得到广泛应用,而且开始应用于植物抗病毒研究。本文介绍了CRISPR/Cas系统的研究进展,详述了CRISPR/Cas9和CRISPR/Cas13a在抗植物病毒中的应用,以及靶向病毒基因组和靶向... 近年来,CRISPR/Cas系统因其简易性和有效性不仅在植物基因组编辑中得到广泛应用,而且开始应用于植物抗病毒研究。本文介绍了CRISPR/Cas系统的研究进展,详述了CRISPR/Cas9和CRISPR/Cas13a在抗植物病毒中的应用,以及靶向病毒基因组和靶向宿主植物基因组两种抗病毒基本策略;同时讨论了CRISPR/Cas12a和相关原核Ago系统在抗植物病毒上的潜在应用前景,并指出CRISPR/Cas在应用中存在的挑战。由于CRISPR/Cas系统在抗植物病毒研究中的优势,可能给植物抗病毒育种带来革命性变化。 展开更多
关键词 CRISPR/Cas9 CRISPR/Cas13a 植物病毒 病毒基因组 宿主植物基因组 抗病毒策略 Ago系统
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骨形态发生蛋白9基因敲除小鼠的构建 预览
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作者 周珂 辛智倩 +4 位作者 刘佩娟 马翠 师长宏 王华 张海 《中国实验动物学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第3期311-315,共5页
目的运用CRISR/Cas9技术敲除小鼠基因组中Bmp9基因片段,构建Bmp9基因敲除小鼠。方法根据Bmp9基因的外显子序列,设计一段sgRNA并合成。sgRNA体外转录后和Cas9mRNA混合后显微注射受精卵细胞,注射后的受精卵细胞移植至受体动物获得子代小... 目的运用CRISR/Cas9技术敲除小鼠基因组中Bmp9基因片段,构建Bmp9基因敲除小鼠。方法根据Bmp9基因的外显子序列,设计一段sgRNA并合成。sgRNA体外转录后和Cas9mRNA混合后显微注射受精卵细胞,注射后的受精卵细胞移植至受体动物获得子代小鼠。提取子代小鼠基因组DNA测序鉴定其基因型。基因型鉴定正确的小鼠与野生型交配后筛选纯合子小鼠。同时取纯合子小鼠心脏、肝、脾、肺、肾,匀浆后提取总RNA和总蛋白,通过qPCR、WB和免疫组化检测BMP9在各组织中的表达。结果设计并合成20bp的sgRNA并进行体外转录,显微注射并回植后得到基因突变小鼠,连续交配后得F2代纯合子。测序结果显示,突变小鼠存在两种基因型,一种为5bp缺失突变,另一种为13bp缺失并伴有1bp插入突变。与野生型C57BL/6相比,qPCR、WB和免疫组化结果均表明基因敲除小鼠肝中BMP9表达显著降低。结论利用CRISPR/Cas9技术成功构建出了BMP9基因敲除小鼠。 展开更多
关键词 CRISPR/Cas9 BMP9 基因敲除小鼠
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基于CRISPR/Cas9技术建立敲除Plac9基因的人胚肾细胞株 预览
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作者 薛璐 欧阳聪 +1 位作者 孙宁远 秦绪慧 《中南民族大学学报:自然科学版》 CAS 2019年第2期189-192,共4页
目的:通过CRISPR/Cas9基因编辑技术和流式细胞术相结合,获得可编辑Plac9基因敲除的人胚肾细胞株(293T).方法:根据Plac9外显子设计了4个sgRNAs(S1,S2,S3,S4),分别将其与PX458载体连接,构建了PX458-S1(S2/S3/S4)载体.通过转染试剂lipo200... 目的:通过CRISPR/Cas9基因编辑技术和流式细胞术相结合,获得可编辑Plac9基因敲除的人胚肾细胞株(293T).方法:根据Plac9外显子设计了4个sgRNAs(S1,S2,S3,S4),分别将其与PX458载体连接,构建了PX458-S1(S2/S3/S4)载体.通过转染试剂lipo2000将表达载体分别转染至293T细胞中,并以流式细胞术对带绿色荧光蛋白标记的细胞进行单细胞分选,分选后的细胞培养一段时间后,用基因组测序和错配酶酶切进行筛选.从筛选好的细胞中提取蛋白,进行WesternBlot检测敲除效率.结果:采用CRISPR/Cas9和流式细胞术结合技术成功构建了Plac9蛋白表达缺失的人胚肾细胞株.结论:该方法简便快捷、效率高,可广泛地用于编辑各种细胞和细胞功能研究. 展开更多
关键词 CRISPR/Cas9 基因编辑技术 基因敲除 Plac9
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敲除RIG-I基因流感病毒高产MDCK细胞系的建立及功能研究
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作者 曾为俊 许曼 +5 位作者 王辉 鲁国涛 邵玉乐 陈洪岩 刘建华 孟庆文 《中国家禽》 北大核心 2019年第11期12-17,共6页
利用CRISPR/Cas9技术构建RIG-I基因敲除MDCK细胞株,并验证其生物学功能。试验设计并构建了2个靶向RIG-I基因的导向RNA(sgRNA)表达载体,与pCAG-Cas9-EGFP表达载体共转染MDCK细胞,采用PAGE胶基因型检测、定点测序和Western blot筛选细胞株... 利用CRISPR/Cas9技术构建RIG-I基因敲除MDCK细胞株,并验证其生物学功能。试验设计并构建了2个靶向RIG-I基因的导向RNA(sgRNA)表达载体,与pCAG-Cas9-EGFP表达载体共转染MDCK细胞,采用PAGE胶基因型检测、定点测序和Western blot筛选细胞株;通过荧光定量PCR检测H9N2亚型禽流感病毒(AIV)感染后MAVS、IRF3、IFN-β、IL-6、Mx1 mRNA表达水平和病毒基因拷贝数,测定TCID50。结果表明:获得两株稳定敲除RIG-I基因的MDCK细胞(MDCK-RIG-I-/-),Western blot检测RIG-I蛋白不表达;荧光定量PCR结果显示病毒感染后MDCK-RIG-I-/-的MAVS、IRF3、IFN-β、IL-6、Mx1 mRNA表达水平显著降低,表明RIG-I基因敲除后RIG-I-Ⅰ型干扰素信号通路受阻;病毒基因拷贝数、TCID50测定结果显示,差异最高可分别达到野生型MDCK的2.16倍、3.19倍,表明RIG-I基因敲除后流感病毒复制增加。该研究利用CRISPR/Cas9技术建立了敲除RIG-I基因流感病毒MDCK细胞株,为研究RIG-I天然免疫应答机制奠定基础;该技术方法和策略也为流感疫苗生产及产业更新换代提供候选细胞株。 展开更多
关键词 RIG-I CRISPR/Cas9 MDCK细胞系 基因敲除 H9N2亚型流感病毒
利用CRISPR/Cas9技术建立小鼠Bdh2、Dnmt3a和Dusp9敲除新型胚胎干细胞系
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作者 付宇婷 曹硕 +4 位作者 陈杨林 吴宝江 多曙光 李喜和 包斯琴 《内蒙古大学学报:自然科学版》 CAS 北大核心 2019年第5期501-512,共12页
胚胎干细胞因其具有体外自我更新以及多向分化的能力,成为研究基因功能、细胞治疗和组织再生等的有力工具.胚胎干细胞的基因敲除模型在基因功能研究中起着重要作用.我们利用实验室现有的G3-AH和tWG3II-2两种胚胎干细胞系,通过脂质体转... 胚胎干细胞因其具有体外自我更新以及多向分化的能力,成为研究基因功能、细胞治疗和组织再生等的有力工具.胚胎干细胞的基因敲除模型在基因功能研究中起着重要作用.我们利用实验室现有的G3-AH和tWG3II-2两种胚胎干细胞系,通过脂质体转染嘌呤霉素(puromycin)标记的PX459-sgRNA载体,使用CRISPR-Cas9技术分别构建Bdh2、Dnmt3a和Dusp9敲除的胚胎干细胞系,通过基因型鉴定、PCR产物测序、qPCR和Western Blot等实验得到Bdh2、Dnmt3a和Dusp9纯合缺失的胚胎干细胞系.之后,qPCR、免疫荧光染色分别检测了Bdh2、Dnmt3a和Dusp9缺失的胚胎干细胞中多能基因、DNA甲基化相关基因和胚层分化相关基因表达变化.另外,通过嵌合体制备方法检测Dusp9基因敲除对胎儿卵黄囊(yolk sac)和胎盘(placenta)等发育的影响.实验结果表明,KO细胞系中分别敲除的基因(Bdh2、Dnmt3a和Dusp9)在mRNA水平和蛋白水平的表达均显著降低(p<0.05),且不同程度地影响了DNA甲基化相关基因和胚层分化相关基因的表达.Dusp9KO嵌合体结果显示,Dusp9KO均能贡献到胎儿及卵黄囊,但是,能否贡献到胎盘尚待进一步深入探究.本研究成功获得纯合敲除Bdh2、Dnmt3a和Dusp9基因的胚胎干细胞系,为研究Bdh2、Dnmt3a和Dusp9三种基因在胚胎干细胞中的作用提供了重要依据. 展开更多
关键词 胚胎干细胞 CRISPR/Cas9 Bdh2 Dnmt3a Dusp9
质粒电穿孔Jurkat细胞递送CRISPR/Cas9系统的优化
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作者 赵日 蒙露 +8 位作者 冯建琼 刘攀 家婷 郑武燕 张悦 刘佳慧 张涛 邹强 李华 《中国细胞生物学学报》 CAS CSCD 2019年第4期702-709,共8页
CRISPR/Cas9是一种应用广泛的高效基因编辑技术。运用CRISPR/Cas9对T细胞进行基因修饰能增强T细胞的特异性免疫应答能力,在过继性肿瘤免疫T细胞治疗中具有巨大应用前景。CRISPR/Cas9的递送途径及效率影响着其基因编辑的效率。电穿孔是... CRISPR/Cas9是一种应用广泛的高效基因编辑技术。运用CRISPR/Cas9对T细胞进行基因修饰能增强T细胞的特异性免疫应答能力,在过继性肿瘤免疫T细胞治疗中具有巨大应用前景。CRISPR/Cas9的递送途径及效率影响着其基因编辑的效率。电穿孔是一种安全、简单、经济、高效、适用范围广和重复性好的转染方法,可用来高效递送CRISPR/Cas9系统。本研究以常用的T淋巴细胞系癌细胞Jurkat细胞为T细胞模型材料,利用绿色荧光蛋白基因质粒观测转染效率,探索质粒电穿孔Jurkat细胞的最优体系,进一步采用该优化体系成功递送CRISPR/Cas9系统进入Jurkat细胞,高效地敲除目的β2M基因,使之成为HLA-I~-Jurkat细胞。该研究提供了适用于质粒CRISPR/Cas9系统电穿孔T细胞的优化系统,为后续将CRISPR/Cas9基因编辑系统运用于过继性T细胞肿瘤治疗奠定了基础。 展开更多
关键词 CRISPR/Cas9 电穿孔 基因编辑 优化 CAR-T
艰难梭菌sigB基因簇CRISPR-Cas9敲除载体的构建及验证 预览
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作者 陈相好 蔡梦迪 +4 位作者 陈峥宏 谷俊莹 文学琴 洪伟 崔古贞 《贵州医科大学学报》 CAS 2019年第7期751-756,共6页
目的:构建艰难梭菌rsbV(编码anti-anti-sigma因子)、rsbW(编码anti-sigma因子)及sigB基因(编码sigma-B因子)的CRISPR-Cas9敲除载体。方法:利用重叠延伸PCR技术分别扩增针对艰难梭菌rsbV、rsbW及sigB基因的gRNA序列及同源臂序列,并分别... 目的:构建艰难梭菌rsbV(编码anti-anti-sigma因子)、rsbW(编码anti-sigma因子)及sigB基因(编码sigma-B因子)的CRISPR-Cas9敲除载体。方法:利用重叠延伸PCR技术分别扩增针对艰难梭菌rsbV、rsbW及sigB基因的gRNA序列及同源臂序列,并分别将其克隆到pJZ23载体上,采用菌落PCR结合DNA测序验证所构建的基因敲除载体。结果:扩增获得艰难梭菌rsbV、rsbW、sigB基因的gRNA序列及同源臂序列,菌落PCR及测序均表明成功构建了艰难梭菌rsbV、rsbW、sigB基因的敲除载体。结论:成功构建了艰难梭菌rsbV、rsbW、sigB基因CRISPR-Cas9敲除载体。 展开更多
关键词 艰难梭菌 CRISPR-Cas9 sigma-B因子 rsbW rsbV
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遗传性神经系统离子通道病基因治疗的研究进展
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作者 王小艺 苏文娜 +1 位作者 薛天阔 朱雨岚 《中国综合临床》 2019年第4期381-384,共4页
目的遗传性神经系统离子通道病现有的治疗方法往往难以控制病情或者患者耐受度较低,因此探索新的治疗方法势在必行。基因治疗在多项研究中显示可能应用于神经系统疾病,并可能成为未来遗传性神经系统离子通道病的有效治疗手段。同时,光... 目的遗传性神经系统离子通道病现有的治疗方法往往难以控制病情或者患者耐受度较低,因此探索新的治疗方法势在必行。基因治疗在多项研究中显示可能应用于神经系统疾病,并可能成为未来遗传性神经系统离子通道病的有效治疗手段。同时,光遗传学、化学遗传学方法、基因编辑技术的不断进步也为遗传性神经系统离子通道病的基因治疗提供了良好的发展基础。我们将就遗传性神经系统离子通道病基因治疗的方法机制、转导载体、启动子及给药途径作一综述。 展开更多
关键词 离子通道病 基因治疗 基因编辑 CRISPR/Cas9
利用CRISPR/Cas9系统在Beta-TC-6细胞株中剔除Sidt2基因 预览
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作者 吕康甲 梁飞腾 +4 位作者 郑慧豪 张杨 徐海平 董莹莹 高家林 《皖南医学院学报》 CAS 2019年第3期214-218,共5页
目的:利用CRISPR/Cas9基因编辑系统和电穿孔技术,在小鼠胰岛素瘤胰岛β细胞(Beta-TC-6)中剔除溶酶体膜蛋白Sidt2基因。方法:针对小鼠Sidt2基因设计向导RNA(sgRNA),sgRNA退火合成双链后克隆到px459载体中。测序鉴定成功的重组质粒命名为p... 目的:利用CRISPR/Cas9基因编辑系统和电穿孔技术,在小鼠胰岛素瘤胰岛β细胞(Beta-TC-6)中剔除溶酶体膜蛋白Sidt2基因。方法:针对小鼠Sidt2基因设计向导RNA(sgRNA),sgRNA退火合成双链后克隆到px459载体中。测序鉴定成功的重组质粒命名为px459-Sidt2并大量扩增。使用NEPA21高效基因转染系统将px459-Sidt2重组质粒电转到Beta-TC-6细胞中,电转染48h后使用嘌呤霉素加压进行阳性细胞筛选。阳性细胞扩增冻存,得到Sidt2基因剔除混合克隆细胞株,提取细胞DNA及蛋白,利用T7酶以及Western blot方法检测细胞株中Sidt2的敲除效果。结果:成功构建靶向小鼠Sidt2基因的px459重组质粒px45-Sidt2。使用NEPA21高效基因转染系统电转Beta-TC-6的最佳电转参数为脉冲电压150V,脉冲时间5ms,脉冲间隔50ms,脉冲次数2次,电压衰减10%,电穿孔模式为正方向。与对照组细胞相比,嘌呤霉素加压筛选得到的Beta-TC-6阳性细胞中的Sidt蛋白表达缺失(P<0.05),成功在小鼠胰岛素瘤胰岛β细胞(Beta-TC-6)中剔除溶酶体膜蛋白Sidt2基因。结论:利用CRISPR/Cas9基因编辑系统以及电穿孔技术,在相对难转染的小鼠胰岛素瘤胰岛β细胞Beta-TC-6成功剔除Sidt2基因。 展开更多
关键词 CRISPR/Cas9 电穿孔 Sidt2 Beta-TC-6
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通过优化gRNA设计提高CRISPR/Cas9系统中基因编辑效率的方法
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作者 李秋月 王小柯 +3 位作者 张亚飞 孙珍珠 王旭 江东 《分子植物育种》 CAS CSCD 北大核心 2019年第10期3274-3282,共9页
CRISPR/Cas9系统是一种广泛应用于动物、植物、真菌、细菌的新一代基因定点编辑技术,如何提高g RNA的编辑效率是该技术的关键点也是许多研究者关注的焦点。本研究利用CRISPR/Cas9技术对番茄miR167a前体序列进行基因编辑,根据番茄miR167... CRISPR/Cas9系统是一种广泛应用于动物、植物、真菌、细菌的新一代基因定点编辑技术,如何提高g RNA的编辑效率是该技术的关键点也是许多研究者关注的焦点。本研究利用CRISPR/Cas9技术对番茄miR167a前体序列进行基因编辑,根据番茄miR167a前体序列在线设计候选g RNA,同时结合体外编辑检测的方法筛选出能够在体外成功编辑的g RNA-G1,把其连接到含有荧光标记的pP1C.1C表达载体,转化番茄子叶,产生愈伤组织数116个,得到5个含有表达载体的材料,经测序发现,其中3个材料发生了编辑。结果表明,通过体外检测和在线软件设计相结合的方法来快速检测g RNA的编辑效率,能筛选出最优的g RNA用于载体的构建,与未采用体外编辑检测来设计g RNA的方法相比,显著提高了CRISPR/Cas9的编辑效率。本研究通过优化g RNA,创新了一种高效利用CRISPR/Cas9进行基因编辑的方法。 展开更多
关键词 gRNA设计 CRISPR/Cas9 体外检测 基因编辑
CRISPR-Cas9系统编辑DNA诱导基因敲除的发展及优缺点 预览
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作者 张佳珊 谭韬(指导) 《中国免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2019年第6期767-770,共4页
CRISPR是一种特别的免疫系统,它可以对入侵到细菌或古生菌体内的病毒和核酸进行特异性识别,利用Cas9蛋白酶进行切割,达到自身免疫的效果,它是绝大部分细菌和一些古生菌的天然免疫系统。本文通过对近期CRISPR的研究文献的阅读,总结了CRIS... CRISPR是一种特别的免疫系统,它可以对入侵到细菌或古生菌体内的病毒和核酸进行特异性识别,利用Cas9蛋白酶进行切割,达到自身免疫的效果,它是绝大部分细菌和一些古生菌的天然免疫系统。本文通过对近期CRISPR的研究文献的阅读,总结了CRISPR-Cas9系统的工作原理,对不同目标的基因敲除的实验原理和实验过程进行了分析,比较了CRISPR基因编辑技术与传统的基因编辑技术的不同,初步讨论如何提高CRISPR的敲除效率;结合以上实验的研究,总结了CRISPR的优缺点,通过对近期发现的大规模脱靶效应现象进行讨论,进一步讨论了关于CRISPR技术未来的发展。 展开更多
关键词 CRISPR-Cas9 靶向敲除 基因编辑 Guide-RNA 脱靶
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CRISPR/Cas9技术在人类重要病毒性传染病中的应用
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作者 张珊 胡康洪 +2 位作者 魏艳红 孙鸽 孙殿兴 《中国病原生物学杂志》 CSCD 北大核心 2019年第4期491-496,F0003共7页
近年来,CRISPR/Cas9作为一种新型的基因编辑工具,具备特异性强、使用广泛、操作相对简便等特点。通过对病毒基因组进行基因编辑从而干扰病毒复制和清除感染,以及在重要宿主因子、受体靶蛋白等方面应用都具有明显优势。本文着重以CRISPR/... 近年来,CRISPR/Cas9作为一种新型的基因编辑工具,具备特异性强、使用广泛、操作相对简便等特点。通过对病毒基因组进行基因编辑从而干扰病毒复制和清除感染,以及在重要宿主因子、受体靶蛋白等方面应用都具有明显优势。本文着重以CRISPR/Cas9技术在一些导致人类重要传染性疾病的病毒如乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、Epstein-Barr病毒(EBV)、单纯疱疹病毒(HSV)、寨卡病毒(ZIKV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)中的应用、面临的技术瓶颈问题和解决方案及治疗前景进行讨论。 展开更多
关键词 CRISPR/Cas9 乙型肝炎病毒(HBV) 丙型肝炎病毒(HCV) Epstein-Barr病毒(EBV) 单纯疱疹病毒(HSV) 寨卡病毒(ZIKV) 人类免疫缺陷病毒(HIV) 综述
CRISPR/Cas9系统在植物基因组编辑中技术改进与创新的研究进展
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作者 苏钺凯 邱镜仁 +2 位作者 张晗 宋振巧 王建华 《植物学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第3期385-395,共11页
CRISPR/Cas9基因组编辑技术是一项对基因组进行精准修饰的技术,可实现对靶标基因的碱基插入、缺失或DNA片段替换。随着人们对CRISPR/Cas9系统的了解逐渐加深,其在科研、农业和医疗等领域的应用也越来越广泛。该文简要介绍了CRISPR/Cas9... CRISPR/Cas9基因组编辑技术是一项对基因组进行精准修饰的技术,可实现对靶标基因的碱基插入、缺失或DNA片段替换。随着人们对CRISPR/Cas9系统的了解逐渐加深,其在科研、农业和医疗等领域的应用也越来越广泛。该文简要介绍了CRISPR/Cas9基因组编辑技术的发展以及工作原理,总结了近几年对该技术进行优化与改进的研究进展,包括基因组编辑效率的提升、基因组编辑范围的扩展、单碱基精准编辑以及多基因同时编辑、基因组编辑安全性的提升以及基因片段替换与基因靶向转录调控,以期为深入开展这一领域的研究提供参考。 展开更多
关键词 CRISPR/Cas9 基因组编辑 遗传改良 植物基因组
CRISPR/Cas9介导烟草多基因编辑体系的应用 预览
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作者 谢小东 高军平 +7 位作者 李泽锋 张剑锋 魏攀 罗朝鹏 王晨 武明珠 翟妞 杨军 《中国烟草学报》 EI CAS CSCD 北大核心 2019年第4期72-80,共9页
CRISPR/Cas9是一种新型的基因组定向编辑技术,近年来在烟草基因组的定向编辑中得到了广泛应用。CRISPR/Cas9介导的多基因编辑技术在许多物种中表现出很大的潜力,为了探索CRISPR/Cas9介导烟草多基因编辑的技术体系,本文针对烟草PCS1、HMA... CRISPR/Cas9是一种新型的基因组定向编辑技术,近年来在烟草基因组的定向编辑中得到了广泛应用。CRISPR/Cas9介导的多基因编辑技术在许多物种中表现出很大的潜力,为了探索CRISPR/Cas9介导烟草多基因编辑的技术体系,本文针对烟草PCS1、HMA2、eIF4E、TOM3、TOM1 5个不同性状相关的基因构建了多靶点敲除的CRISPR/Cas9系统,并借助农杆菌介导的遗传转化技术转化烟草品种K326。对阳性植株的筛选、靶位点基因组的PCR扩增与测序分析表明,构建的CRISPR/Cas9多基因编辑系统成功转化到烟草中,能够同时靶向突变5个基因。5个基因同时突变的检出率为53.8%,单基因的突变检出率在76.9%与92.3%之间。进一步的脱靶检测分析显示,在所预测脱靶的候选位点上均未发生脱靶现象。本文构建的CRISPR/Cas9多基因编辑系统可将多个基因进行有效突变,为烟草基因功能研究和基于CRISPR/Cas9技术的多性状改良奠定了基础。 展开更多
关键词 烟草 CRISPR/Cas9 多基因 突变
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CRISPR/Cas9系统靶向沉默Fas基因在肝衰竭细胞凋亡机制中的作用
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作者 庄鹏 李志莹 罗敏虹 《热带医学杂志》 CAS 2019年第4期434-437,共4页
目的探讨利用CRISPR/Cas9敲除系统沉默Fas基因介导的细胞凋亡在肝衰竭发生机制的作用。方法构建靶向Fas基因的CRISPR/Cas系统(pX330-Fas-G1)质粒并转染HepG2细胞(设非转染细胞HepG2为对照组),提取DNA后T7E1酶切法检测突变体;Western blo... 目的探讨利用CRISPR/Cas9敲除系统沉默Fas基因介导的细胞凋亡在肝衰竭发生机制的作用。方法构建靶向Fas基因的CRISPR/Cas系统(pX330-Fas-G1)质粒并转染HepG2细胞(设非转染细胞HepG2为对照组),提取DNA后T7E1酶切法检测突变体;Western blotting检测Fas蛋白的表达。刀豆素A药物处理后MTT法检测细胞增殖,克隆增生法检测细胞增生,AnnexinV/PI荧光双染分析细胞凋亡情况。结果 T7E1酶切分析显示,pX330-Fas-G1质粒的Guide RNA在Fas基因组上产生了有效切割,切割效率为50%;同时Western blotting检测结果显示,pX330-Fas-G1质粒转染至HepG2细胞后,与空白质粒pX330-GFP组比较,Fas蛋白的表达降低,差异有统计学意义(P<0.01)。经刀豆素A药物诱导细胞凋亡后,MTT法测定pX330-Fas-G1质粒转染的HepG2细胞组活力值为(68.0±5.0)%,高于非转染细胞组的(51.5±5.8)%,差异有统计学意义(P<0.05);克隆增生法检测结果显示,pX330-Fas-G1质粒转染的HepG2细胞组在细胞克隆形成数量为(128.8±5.1),高于非转染组的(100.0±9.3),差异有统计学意义(P<0.05)。给予刀豆素A药物处理诱导细胞凋亡后,通过Annexin V和PI双染色,采用流式细胞技术检测显示,经pX330-Fas-G1质粒转染后的细胞组有10.0%的细胞为凋亡细胞,低于对照组细胞的33.3%,差异有统计学意义(P<0.01)。结论 CRISPR/Cas9系统可通过下调Fas基因的表达来抑制细胞凋亡的进展,为临床开展急性肝衰竭的基因治疗提供理论依据和技术支持。 展开更多
关键词 CRISPR/Cas9 FAS 凋亡 肝衰竭
p53基因及NHEJ相关基因表达水平对基因组编辑效率的影响 预览
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作者 于洋 孔明圣 +6 位作者 雷颖首 徐畅 张亚倩 张一帆 张文峰 沈晗 邵红伟 《国际医药卫生导报》 2019年第9期1365-1373,共9页
目的研究CRISPR/Cas9基因组编辑系统在不同细胞中编辑效率的差异及相关的影响因素。方法基于靶向人TCRα链C区(TRAC)基因的CRISPR/Cas9重组载体分别对293T、HEK-293、HeLa、sw480、Jurkat、K562等细胞进行基因组编辑,检测编辑效率的差... 目的研究CRISPR/Cas9基因组编辑系统在不同细胞中编辑效率的差异及相关的影响因素。方法基于靶向人TCRα链C区(TRAC)基因的CRISPR/Cas9重组载体分别对293T、HEK-293、HeLa、sw480、Jurkat、K562等细胞进行基因组编辑,检测编辑效率的差异。同时检测p53基因在不同细胞中的突变情况,通过RT-qPCR分析参与非同源末端连接(NHEJ)通路的17个主要基因的表达情况。结果流式检测各细胞的转染效率:293T为30.50%,HEK-293为29.30%,Hela为17.70%,SW480为21.90%,Jurkat为13.08%,K562为18.51%。根据克隆测序结果计算出各种细胞中基因组的编辑率:293T为74.70%、HEK-293为68.00%、Hela为13.47%、sw480为32.70%、Jurkat为65.52%、K562为77.18%。测序结果表明293T、Jurkat、K562细胞的p53基因发生了突变,而HEK-293、Hela和SW480的p53基因为野生型。qPCR结果显示,在编辑效率较高的细胞系中,大部分NHEJ相关基因的表达水平也较高,且其表达水平在p53功能异常细胞系中要比在p53功能正常细胞系中的高。结论本研究发现p53的异常程度以及NHEJ相关基因的表达水平与基因组编辑效率存在相关性。 展开更多
关键词 CRISPR/Cas9 非同源重组末端连接 P53 基因突变 人类基因编辑 NHEJ 修复相关基因
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CRISPR/Cas9介导的低产尿素黄酒酵母工程菌的构建 预览
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作者 谢文娟 吴殿辉 +3 位作者 李晓敏 蔡国林 谢广发 陆健 《食品与发酵工业》 CAS CSCD 北大核心 2019年第13期45-51,共7页
通过代谢工程改造构建低产尿素的酿酒酵母工程菌,从根源上减少黄酒发酵液中尿素的含量及氨基甲酸乙酯(ethyl carbamate,EC)的形成。该研究利用融合PCR构建DUR3过表达组件“HOL-PGK1p-DUR3-PGK1t-HOR”,通过CRISPR/Cas9介导的基因组编辑... 通过代谢工程改造构建低产尿素的酿酒酵母工程菌,从根源上减少黄酒发酵液中尿素的含量及氨基甲酸乙酯(ethyl carbamate,EC)的形成。该研究利用融合PCR构建DUR3过表达组件“HOL-PGK1p-DUR3-PGK1t-HOR”,通过CRISPR/Cas9介导的基因组编辑技术转化酿酒酵母S.cerevisiae Na DUR1,2-Δcar1,在敲除CAR1和过表达DUR1,2基因的基础上过表达DUR3基因,获得工程菌S.cerevisiae Na DUR1,2/DUR3-Δcar1。实验室黄酒发酵实验结果表明,与亲本菌株S.cerevisiae Na相比,工程菌S.cerevisiae Na DUR1,2/DUR3-Δcar1所酿黄酒发酵液中尿素含量降低了92.1%,EC含量降低了58.6%;与出发菌株S.cerevisiae Na DUR1,2-Δcar1相比,工程菌S.cerevisiae Na DUR1,2/DUR3-Δcar1所酿黄酒发酵液中尿素含量降低了43.4%,EC含量降低了16.2%。过表达DUR3的工程菌S.cerevisiae Na DUR1,2/DUR3-Δcar1具有“尿素吸收”的能力,减少EC的形成。借助CRISPR/Cas9系统,构建的酵母工程菌无外源抗性基因的引入,具有工业化应用的潜在可能性。 展开更多
关键词 黄酒 酿酒酵母 尿素 氨基甲酸乙酯 CRISPR/Cas9
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基因编辑技术原理及其在动植物研究中的应用 预览
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作者 张泗举 栾维江 《天津师范大学学报:自然科学版》 CAS 北大核心 2019年第3期1-9,共9页
自人类基因组计划开展以来,越来越多生物的基因组序列得到了测定,基因的功能逐步得到鉴定.人们期望通过对基因表达的改变,来治疗人类疾病或提高生物的产量和品质.早期突变技术对基因的改变是不定向的,近年来,锌指核酸酶(ZFN)、转录激活... 自人类基因组计划开展以来,越来越多生物的基因组序列得到了测定,基因的功能逐步得到鉴定.人们期望通过对基因表达的改变,来治疗人类疾病或提高生物的产量和品质.早期突变技术对基因的改变是不定向的,近年来,锌指核酸酶(ZFN)、转录激活子样效应因子核酸酶(TALEN)和CRISPR/Cas9等技术可对某个已知基因进行编辑.特别是CRISPR/Cas9技术,由于具有操作方便、效率高等优点,因此成为对基因进行定向操作的强有力工具.本文对几种基因编辑技术的原理和应用进行简要介绍和展望. 展开更多
关键词 基因编辑 CRISPR/Cas9 转录激活子样效应因子核酸酶 锌指核酸酶
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利用基因编辑技术改良水稻性状的研究进展与展望 预览
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作者 杨平 陈春莲 +3 位作者 熊运华 黄永萍 姚晓云 尹建华 《江西农业学报》 CAS 2019年第4期8-12,共5页
介绍了锌指核酸酶(zinc-finger nucleases, ZFNs)系统、类转录激活效应因子核酸酶(transcriptional activation-like effector nuclease, TALEN)系统、CRISPR/Cas9系统、最新开发的CRISPR/Cpf1和单碱基编辑技术,并综述了基因编辑技术在... 介绍了锌指核酸酶(zinc-finger nucleases, ZFNs)系统、类转录激活效应因子核酸酶(transcriptional activation-like effector nuclease, TALEN)系统、CRISPR/Cas9系统、最新开发的CRISPR/Cpf1和单碱基编辑技术,并综述了基因编辑技术在水稻遗传性状改良中的应用进展及前景。 展开更多
关键词 基因编辑技术 CRISPR/Cas9 水稻 遗传改良 性状
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PK-15细胞敲除TANK结合激酶1基因促进猪伪狂犬病病毒复制的研究 预览
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作者 刘晓贺 巴根 +7 位作者 李坚 韩莹倩 张爽 明胜利 杜永坤 褚贝贝 杨国宇 王江 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第6期1239-1248,共10页
TANK结合激酶1(TBK1)是病毒感染时IRF3、IRF7磷酸化及Ⅰ型干扰素表达的关键酶,在抗病毒天然免疫应答和获得性免疫应答中发挥重要作用。为研究TBK1基因敲除对猪伪狂犬病病毒(PRV)复制的影响,首先利用CRISPR/Cas9技术构建猪TBK1基因稳定敲... TANK结合激酶1(TBK1)是病毒感染时IRF3、IRF7磷酸化及Ⅰ型干扰素表达的关键酶,在抗病毒天然免疫应答和获得性免疫应答中发挥重要作用。为研究TBK1基因敲除对猪伪狂犬病病毒(PRV)复制的影响,首先利用CRISPR/Cas9技术构建猪TBK1基因稳定敲除PK-15细胞系,并利用CCK-8检测敲除TBK1对PK-15细胞活力的影响。然后利用流式细胞术检测PRV-GFP荧光强度,用RT-qPCR检测PRV-gB、PRV-gE、PRV-TK、IL-1β、IFN-β和ISG15的转录水平,用Westernblot检测PRV-gB和PRV-gE蛋白表达水平,以及通过滴度测定检测子代病毒的感染力,综合评价TBK1基因稳定敲除PK-15细胞对PRV病毒复制的影响。结果显示:T7E1检测结果显示TBK1基因外显子2区的3个sgRNA靶位点均切出了目的条带,选取编辑效率最高的TBK1-sgRNA1细胞系进行单克隆化培养,获取6株稳定敲除TBK1基因的单克隆细胞,随机选取4号细胞株进行CCK-8检测,结果显示敲除TBK1对PK-15细胞活力无影响。流式检测结果显示PRV-GFP感染阳性细胞占总PK-15细胞的56.89%,PRV-GFP感染阳性细胞占总PK-15-TBK1-/-细胞的77.95%,表明PK-15-TBK1-/-细胞可以促进PRV-GFP复制。RT-qPCR及WB检测显示该细胞系可以促进PRVmRNA转录和蛋白表达。滴度测定结果显示,PRV-QXX在PK-15细胞复制后TCID50为10^6.8TCID50·0.1mL^-1,而在PK-15-TBK1-/-细胞中复制后TCID50为10^8.5TCID50·0.1mL^-1。另外,RT-qPCR结果显示该细胞系可以抑制PRV感染引起的IL-1β、IFN-β和ISG15转录上调。以上结果表明TBK1基因敲除PK-15细胞系促进PRV复制,可能与IL-1β、IFN-β和ISG15转录水平抑制有关。 展开更多
关键词 CRISPR/Cas9 TANK结合激酶1 基因敲除 猪伪狂犬病病毒
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