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神经束蛋白155高表达少突胶质细胞模型的构建 预览
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作者 胡斌 王成举 +1 位作者 陈鹏慧 张雨平 《山东医药》 CAS 2019年第18期28-31,共4页
目的构建神经束蛋白155(neurofascin155,NF155)高表达的少突胶质细胞模型。方法 RT-PCR法提取NF155 cDNA,经T-A克隆及双酶切将其与pUM-T simple重组,构建NF155慢病毒载体质粒,NheⅠ、AgeⅠ双酶切后,片段大小及基因测序均显示NF155慢病... 目的构建神经束蛋白155(neurofascin155,NF155)高表达的少突胶质细胞模型。方法 RT-PCR法提取NF155 cDNA,经T-A克隆及双酶切将其与pUM-T simple重组,构建NF155慢病毒载体质粒,NheⅠ、AgeⅠ双酶切后,片段大小及基因测序均显示NF155慢病毒载体质粒构建成功。取对数生长期少突胶质细胞分为空白对照组、阴性慢病毒感染组、NF155慢病毒感染组,空白对照组不做任何处理,阴性慢病毒感染组予10 μL空载体慢病毒+100 μL培养基,NF155慢病毒感染组予10 μL慢病毒载体质粒+100 μL培养基。培养12 h采用荧光定量PCR法检测NF155 mRNA,采用Western blotting法检测NF155蛋白。结果 NF155慢病毒感染组、空白对照组、阴性慢病毒感染组NF155 mRNA相对表达量分别为3.25±0.11、1.00±0.06、1.08±0.01,与空白对照组、阴性慢病毒感染组比较,NF155慢病毒感染组NF155 mRNA相对表达量升高( P 均<0.05)。NF155慢病毒感染组、空白对照组、阴性慢病毒感染组NF155 蛋白相对表达量分别为1.57±0.08、0.51±0.12、0.50±0.06,与空白对照组、阴性慢病毒感染组比较,NF155慢病毒感染组NF155蛋白相对表达量升高( P 均<0.05)。结论 成功构建NF155高表达的少突胶质细胞瞬转细胞模型。 展开更多
关键词 神经束蛋白155 慢病毒载体质粒 神经束蛋白155慢病毒载体质粒 少突胶质细胞 脑白质损伤
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PCDH10基因慢病毒载体构建及其在MDA-MB-231细胞中的表达 预览
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作者 张微 岳丽玲 +4 位作者 张延勇 韩翠翠 徐天娇 朱文斌 刘立琨 《系统医学》 2019年第16期27-29,38共4页
目的构建原钙黏蛋白10(PCDH10)基因慢病毒表达载体并建立稳定过表达PCDH10的MDA-MB-231细胞系。方法 2018年6—11月,根据PCDH10基因序列设计引物,应用PCR法扩增PCDH10全长片段,连接线性化的pLV-EF1α-GFP-Puro载体,获得pLV-PCDH10慢病... 目的构建原钙黏蛋白10(PCDH10)基因慢病毒表达载体并建立稳定过表达PCDH10的MDA-MB-231细胞系。方法 2018年6—11月,根据PCDH10基因序列设计引物,应用PCR法扩增PCDH10全长片段,连接线性化的pLV-EF1α-GFP-Puro载体,获得pLV-PCDH10慢病毒重组质粒,测序正确后进行PCDH10基因慢病毒载体的包装及滴度测定。将重组质粒pLV-PCDH10转染MDA-MB-231细胞,应用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot分别检测MDA-MB-231细胞中PCDH10的表达情况。结果测序结果证实成功构建慢病毒表达载体pLV-PCDH10,病毒滴度为5×10^8TU/mL;转染MDA-MB-231细胞后,RT-PCR和Western blot结果显示PCDH10的m RNA和蛋白表达较对照组高表达。结论成功构建pLV-PCDH10慢病毒载体并建立稳定过表达PCDH10的MDA-MB-231细胞系,为深入研究PCDH10基因在乳腺癌发生发展中的功能提供实验基础。 展开更多
关键词 PCDH10基因 慢病毒载体 载体构建 MDA-MB-231细胞
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HIF-1α基因慢病毒载体的构建及其转染骨髓间充质干细胞后的表达 预览
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作者 曾雯 巨容 +2 位作者 高淑强 胡旭红 马骄 《四川医学》 CAS 2019年第1期17-21,共5页
目的构建携带缺氧诱导因子-1α(Hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)的慢病毒载体pLVX-HIF-1α-IRES-ZsGreen1,并转染骨髓间充质干细胞(Bone marrow derived stem cells,BMSCs),检测该慢病毒载体在BMSCs的表达。方法从Puc-57-HIF-1... 目的构建携带缺氧诱导因子-1α(Hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)的慢病毒载体pLVX-HIF-1α-IRES-ZsGreen1,并转染骨髓间充质干细胞(Bone marrow derived stem cells,BMSCs),检测该慢病毒载体在BMSCs的表达。方法从Puc-57-HIF-1α载体中扩增出HIF-1α基因片段,将HIF-1α基因片段与载体连接,获得慢病毒载体pLVX-HIF-1α-IRES-ZsGreen1,将其与慢病毒包装系统共同转染到293T细胞内进行病毒包装,通过观察报告基因绿色荧光蛋白的表达来测定病毒滴度。将pLVX-HIF-1α-IRES-ZsGreen1转染到BMSCs细胞内,通过Real-Time PCR和CCK-8法分别检测HIF-1αmRNA表达及BMSCs增殖能力。结果PCR及测序结果显示慢病毒载体pLVX-HIF-1α-IRES-ZsGreen1构建正确,病毒滴度为3×10 8 TU/mL。pLVX-HIF-1α-IRES-ZsGreen1转染BMSCs后,BMSCs中HIF-1αmRNA表达水平及BMSCs细胞增殖能力明显高于非转染组(P﹤0.05)。结论成功构建HIF-1α基因慢病毒载体pLVX-HIF-1α-IRES-ZsGreen1,该慢病毒载体可以介导HIF-1α基因在BMSCs中稳定表达,并提高BMSCs增殖能力。 展开更多
关键词 骨髓间质干细胞 缺氧诱导因子-1Α 慢病毒载体
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PTEN shRNA慢病毒载体构建及转染人子宫腺肌病细胞的稳定细胞株筛选
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作者 郭宇丹 曾玉燕 +1 位作者 姜心禅 李坤寅 《中药新药与临床药理》 CAS CSCD 北大核心 2019年第8期990-995,共6页
目的构建携带绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的第10染色体丢失的磷酸酶基因(phasphatase and tensin homo-log deleted in chromosome 10,PTEN)的短发卡RNA(short hairpin RNA,shRNA)慢病毒载体,并在转染人子宫腺肌病(ade... 目的构建携带绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的第10染色体丢失的磷酸酶基因(phasphatase and tensin homo-log deleted in chromosome 10,PTEN)的短发卡RNA(short hairpin RNA,shRNA)慢病毒载体,并在转染人子宫腺肌病(adenomyosis,AM)细胞后筛选最优稳转株。方法设计合成3条特异性针对人PTEN基因的shRNA序列,构建到pHBLV-U6-MCS-CMV-ZsGreen-PGK-PURO载体中,测序鉴定载体构建情况,进而包装病毒并检测滴度。筛选出最优感染复数(multiplicity of infection,MOI)、嘌呤霉素杀灭浓度后,用慢病毒液转染AM细胞,以嘌呤霉素药筛建立PTEN敲低的稳定细胞株,采用实时定量聚合酶链反应(Real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)检测转染后细胞内PTEN mRNA表达水平,蛋白免疫印迹法(Western Blot,WB)检测PTEN蛋白表达水平,以检验转染效率并筛选出干扰效率最佳的shRNA序列。结果成功构建了3个PTEN shRNA慢病毒载体,包装后以MOI为50转染AM细胞,荧光显微镜观察绿色荧光表达明显,嘌呤霉素持续药筛建立了PTEN敲低的稳定细胞株,以PTEN shRNA3慢病毒载体的干扰效率最佳(92.98%)。结论成功构建了PTEN shRNA慢病毒载体,并在体外有效转染了AM细胞,建立了PTEN敲低的稳定细胞株。 展开更多
关键词 子宫腺肌病 慢病毒 PTEN SHRNA 稳定细胞株
慢病毒载体沉默ADAMTS6人非小细胞肺癌稳转株的构建
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作者 刘捷 施露露 +2 位作者 刘春燕 帅优 束永前 《现代生物医学进展》 CAS 2019年第8期1401-1405,1415共6页
目的:通过数据库预测ADAMTS6在非小细胞肺癌(Non-small-cell lung cancer,NSCLC)组织中的表达及其与NSCLC患者临床预后的关系,构建ADAMTS6的shRNA干扰载体并建立ADMATS6的NSCLC稳定敲减细胞株。方法:通过Oncomine数据库分析ADAMTS6在NS... 目的:通过数据库预测ADAMTS6在非小细胞肺癌(Non-small-cell lung cancer,NSCLC)组织中的表达及其与NSCLC患者临床预后的关系,构建ADAMTS6的shRNA干扰载体并建立ADMATS6的NSCLC稳定敲减细胞株。方法:通过Oncomine数据库分析ADAMTS6在NSCLC组织和肺正常组织的表达差异,通过Kaplan-Meier Plotter数据库分析ADAMTS6的表达水平与临床NSCLC患者预后关系,设计合成ADAMTS6的shRNA干扰序列,shRNA模板退火并与双酶切pGLV3-GFP线性化载体连接,转化挑取阳性菌落后送测序。干扰质粒进行病毒包装并感染人NSCLC细胞株NCI-H358,使用嘌呤霉素进行稳定敲减细胞株筛选。荧光观察慢病毒感染细胞密度,通过qRT-PCR和Western blot检测ADAMTS6的mRNA和蛋白水平的敲减效果。结果:Oncomine数据库分析结果显示NSCLC组织中ADAMTS6 mRNA表达较正常肺组织显著升高(P<0.001);Kaplan-Meier Plotter数据库分析结果显示高表达ADAMTS6的NSCLC患者预后较低表达ADAMTS6的NSCLC患者差(P<0.05);pGLV3-GFP载体双酶切线性化后与shRNA退火模板连接成功,测序结果正确。荧光观察显示慢病毒感染细胞密度在95%左右,通过qRT-PCR和Western blot检测ADAMTS6慢病毒干扰质粒已成功敲减ADAMTS6的m RNA和蛋白水平。结论:ADAMTS6的高表达可能与NSCLC患者的不良临床预后密切相关。本研究构建了ADAMTS6的慢病毒感染质粒,并成功建立NCI-H358稳定敲减细胞株,为进一步研究ADAMTS6在NSCLC中的作用及机制奠定了基础。 展开更多
关键词 ADAMTS6 慢病毒载体 肿瘤数据库 小发卡RNA 非小细胞肺癌
hTWEAK基因重组慢病毒载体构建、病毒包装及蛋白表达分析 预览
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作者 许媛 赵明才 《川北医学院学报》 CAS 2019年第1期5-8,15共5页
目的:构建携带人肿瘤坏死因子样微弱凋亡诱导剂(hTWEAK)基因的慢病毒表达载体,体外包装成病毒颗粒,并分析其感染人肝癌细胞HepG2后TWEAK的表达情况。方法:以pORF5-TWEAK为模板,采用普通PCR扩增TWEAK基因,通过酶切、连接等步骤构建Plenti... 目的:构建携带人肿瘤坏死因子样微弱凋亡诱导剂(hTWEAK)基因的慢病毒表达载体,体外包装成病毒颗粒,并分析其感染人肝癌细胞HepG2后TWEAK的表达情况。方法:以pORF5-TWEAK为模板,采用普通PCR扩增TWEAK基因,通过酶切、连接等步骤构建Plentilox3.7-TWEAK重组质粒,利用酶切和测序的方法对重组质粒进行鉴定。在293T细胞中包装含TWEAK基因的慢病毒颗粒并感染HepG2细胞,采用荧光定量PCR和Western-blot检测TWEAK表达水平,并通过间接免疫荧光(IMF)检测其细胞表达定位。结果:酶切与测序结果证明重组质粒构建成功,并能在293T细胞中与病毒包装质粒成功包装病毒颗粒。病毒转染的HepG2细胞中,TWEAK基因mRNA表达量约为对照组的500倍,TWEAK蛋白表达量明显高于对照组,且主要定位于胞浆。结论:本研究成功构建了含人TWEAK基因的慢病毒表达载体,其可在人肝癌细胞系HepG2中稳定表达,为后续的功能学研究打下了基础。 展开更多
关键词 慢病毒载体 hTWEAK HEPG2细胞
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脑源性神经生长因子过表达慢病毒载体构建及转染脂肪干细胞的研究
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作者 应诚诚 王勇 +2 位作者 李国灏 陈琳 郭永连 《中华实验外科杂志》 CAS CSCD 北大核心 2019年第5期895-897,共3页
目的构建携带大鼠脑源性神经生长因子(BDNF)基因的重组慢病毒表达载体,并转染脂肪干细胞(ADSCs)来获得治疗的种子细胞。方法从已构建好的含BDNF的质粒克隆模板pEGFP-C-BDNF中,利用聚合酶链反应(PCR)方法提取目的基因BDNF,将该基因克隆... 目的构建携带大鼠脑源性神经生长因子(BDNF)基因的重组慢病毒表达载体,并转染脂肪干细胞(ADSCs)来获得治疗的种子细胞。方法从已构建好的含BDNF的质粒克隆模板pEGFP-C-BDNF中,利用聚合酶链反应(PCR)方法提取目的基因BDNF,将该基因克隆到慢病毒载体表达质粒GV287(含Flag基因)中,得到重组的UBI-BDNF,通过PCR、酶切、测序和分析比对验证BDNF基因后,将UBI-BDNF质粒和包装质粒pHelper1.0、pHelper2.0共同转染人胚胎肾上皮细胞株293T细胞,经同源重组产生重组慢病毒UBI-BDNF。UBI-BDNF在293T细胞内大量扩增,应用实时定量聚合酶链反应(Real-time PCR)法鉴定和测定滴度,然后转染ADSCs,并通过免疫荧光法及酶联免疫吸附试验(ELISA)和蛋白质印迹法(Western blot)检测。结果克隆得到791 bp的目的BDNF全长基因,经过PCR扩增、酶切鉴定、序列测定证实,BDNF基因被成功克隆到慢病毒载体中,可实现BDNF基因的表达,且病毒滴度为2.0×109 TU/ml。免疫荧光检测BDNF在转染ADSCs中表达。ELISA检测转染ADSCs上清液中BDNF浓度为891.38~1 196.26 ng/L[(945.33±38.54)ng/L],而绿色荧光蛋白(GFP)转染ADSCs中未检测到。Western blot证实转染ADSCs表达BDNF蛋白。结论成功构建表达大鼠BDNF基因的慢病毒载体并能在ADSCs高表达。 展开更多
关键词 脑源性神经生长因子 慢病毒载体 基因工程 脂肪干细胞
人血管紧张素Ⅱ2型受体AT2R重组细胞系的构建与鉴定 预览
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作者 陈惠莹 毛莹莹 +3 位作者 裴娜娜 颜仁和 万鹏飞 李红卫 《暨南大学学报:自然科学与医学版》 CAS CSCD 北大核心 2019年第3期187-194,共8页
目的:构建人血管紧张素Ⅱ2型受体(hAT2R)过表达稳定细胞系,探讨AT2R激动剂Compound 21等对前列腺癌细胞的作用及机制.方法:构建含hAT2R基因的慢病毒表达载体pLV-CMV-hAT2R-IRES-eGFP并包装成慢病毒.将重组慢病毒载体pLV-CMV-IRES-eGFP-h... 目的:构建人血管紧张素Ⅱ2型受体(hAT2R)过表达稳定细胞系,探讨AT2R激动剂Compound 21等对前列腺癌细胞的作用及机制.方法:构建含hAT2R基因的慢病毒表达载体pLV-CMV-hAT2R-IRES-eGFP并包装成慢病毒.将重组慢病毒载体pLV-CMV-IRES-eGFP-hAT2R感染前列腺癌细胞,并利用流式细胞术筛选出单克隆细胞株,RT-PCR及Western blot方法检测重组细胞系中hAT2R表达水平,使用AT2R激动剂CGP42112检测受体功能.结果:重组慢病毒载体感染PC-3、DU145前列腺癌细胞24 h后均能观察到eGFP表达,用流式细胞术分别筛选出单克隆细胞株,RT-PCR及Western blot检测结果显示目的基因hAT2R在两株重组细胞系中表达显著升高,CGP42112处理24 h后,重组细胞系细胞活力较正常PC-3、DU145细胞显著降低.结论:成功构建hAT2R过表达稳定细胞系. 展开更多
关键词 hAT2R Compound21 慢病毒 稳定细胞系 前列腺癌
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慢病毒Hoxa3载体的构建及其对人脐静脉内皮细胞迁移和血管新生的影响
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作者 毕雪飞 陶贵周 黄建华 《中国动脉硬化杂志》 CAS 2019年第1期18-22,共5页
目的构建慢病毒Hoxa3载体,观察其对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的转染效率,研究其对细胞迁移和血管新生的影响,并探讨Hoxa3促进血管新生的机制。方法以基因合成法从聚合酶链式反应文库获取人Hoxa3基因,酶切后插入慢病毒骨架载体,以三质粒... 目的构建慢病毒Hoxa3载体,观察其对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的转染效率,研究其对细胞迁移和血管新生的影响,并探讨Hoxa3促进血管新生的机制。方法以基因合成法从聚合酶链式反应文库获取人Hoxa3基因,酶切后插入慢病毒骨架载体,以三质粒联合转染293T细胞获得慢病毒Hoxa3载体,并进行滴度测定。转染HUVEC,获取最大转染效率。转染HUVEC后分对照组和慢病毒Hoxa3转染组,进行HUVEC迁移实验和小管形成实验,观察Hoxa3对HUVEC迁移和小管形成的影响。Western blot检测慢病毒Hoxa3载体转染HUVEC后尿激酶型纤溶酶原激活物受体(uPAR)和基质金属蛋白酶14(MMP-14)蛋白表达的变化。结果成功构建慢病毒Hoxa3载体,病毒的滴度为8×10^11TU/L;30 MOI慢病毒载体对HUVEC的转染效率达到99%以上。Western blot结果显示慢病毒Hoxa3载体转染HUVEC后Hoxa3能够有效在HUVEC中表达。与对照组比较,慢病毒Hoxa3载体转染HUVEC后显著增强HUVEC的迁移和小管形成,显著增加uPAR和MMP-14蛋白的表达(P<0.05)。结论成功构建的慢病毒Hoxa3载体可促进HUVEC的迁移和小管形成,其作用机制可能为上调HUVEC的uPAR和MMP-14蛋白表达。 展开更多
关键词 慢病毒载体 Hoxa3 人脐静脉内皮细胞 细胞迁移 血管新生
ECEL1基因PSCSI-GFP慢病毒载体的构建 预览
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作者 何剑 廖红伍 阳学风 《临床肝胆病杂志》 CAS 北大核心 2019年第6期1286-1292,共7页
目的设计并构建针对ECEL1基因的RNA干扰慢病毒载体。方法依照ECEL1基因为模板,设计RNA干扰靶点,根据选定的靶点序列,设计短发夹RNA(shRNA)干扰序列,在两端添加相应的限制性内切酶酶切位点,合成单链DNA oligo,退火缓冲液中配对形成双链DN... 目的设计并构建针对ECEL1基因的RNA干扰慢病毒载体。方法依照ECEL1基因为模板,设计RNA干扰靶点,根据选定的靶点序列,设计短发夹RNA(shRNA)干扰序列,在两端添加相应的限制性内切酶酶切位点,合成单链DNA oligo,退火缓冲液中配对形成双链DNA oligo。利用Age I和EcoR I双酶线性化GV115载体。把载体和DNA oligo相连接,其连接产物转化大肠杆菌感受态细胞,经PCR扩增并测序鉴定。再通过质粒抽提,转染,浓缩与纯化后获得重组的ECEL1基因RNAi慢病毒,用"HIV-1p24抗原ELISA法"测定样品滴度。选取检测合格的慢病毒感染人肝癌细胞(BEL-7404),并设置对照组,荧光观察感染率。并使用Real-time PCR法及Western blot检测人肝癌细胞(BEL-7404)中ECEL1基因敲减后mRNA和蛋白质的表达量。2组间比较采用两独立样本t检验。结果(1)根据ECEL1基因模板设计后,选定psc48784片段作为RNA干扰靶点,制备双链DNA oligo,PCR鉴定阳性重组子并测序,验证psc48784为正确的克隆。经过质粒抽提,转染以及浓缩纯化后,成功构建ECEL1基因RNAi慢病毒。物理检测与无菌检测合格。(2)通过HIV-1 p24抗原ELISA法测定ECEL1基因RNAi慢病毒样品病毒滴,测定样品病毒滴度为3×108TU/ml;表明已成功构建高滴度且合格的ECEL1基因RNA干扰慢病毒。(3)用ECEL1基因RNAi慢病毒感染人肝癌细胞(BEL-7404),荧光观察结果显示细胞感染效率达到80%,细胞状态稳定;使用Real-time PCR的方法及Western blot检测实验组人肝癌细胞(BEL-7404)中ECEL1基因在mRNA和蛋白质水平的表达量受到抑制(P值均<0.05),敲减效率达到70.5%。结论成功构建ECEL1基因PSCSI-GFP慢病毒载体并获得稳定高滴度的病毒样品,并获得稳定的ECEL1基因敲减的人肝癌细胞(BEL-7404)。 展开更多
关键词 ECEL1基因 慢病毒载体 肝肿瘤
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慢病毒载体介导miR-146a转染大鼠骨髓间充质干细胞的实验研究 预览
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作者 买买提沙吾提阿吉·麦麦提 马原 朱旭 《新疆医科大学学报》 CAS 2019年第6期734-738,共5页
目的探讨微小RNA-146a(miR-146a)体外转染大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)应用于基因治疗的可行性。方法体外分离、培养并鉴定BMSCs,采用具有高效转染非分裂期细胞的慢病毒载系统将miR-146a导入BMSCs中,采用绿色荧光蛋白(EGFP)荧光技术、... 目的探讨微小RNA-146a(miR-146a)体外转染大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)应用于基因治疗的可行性。方法体外分离、培养并鉴定BMSCs,采用具有高效转染非分裂期细胞的慢病毒载系统将miR-146a导入BMSCs中,采用绿色荧光蛋白(EGFP)荧光技术、实时荧光定量PCR(qPCR)、Western Blot技术分别检测转染率、miR-146a及白介素-1(IL-1)受体相关激酶1(IRAK1)和肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)蛋白水平表达情况。结果经流式细胞技术鉴定第三代BMSCs中表达CD90、CD106,不表达CD45。慢病毒感染MSCs的感染复数为50最佳感染率可达80%。EGFP荧光表达自72 h时开始逐渐增强。转染的BMSCs中miR-146a高表达。结论(1)通过贴壁筛洗法能够获取纯度较高的BMSCs。(2)通过携带miR-146a的慢病毒载体成功转染BMSCs,并下调靶蛋白IL-1 IRAK1和TRAF6。 展开更多
关键词 骨髓间充质干细胞 慢病毒载体 增强型绿色荧光蛋白(EGFP) 微小RNA-146a(miR-146a)
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TrkA regulates the regenerative capacity of bone marrow stromal stem cells in nerve grafts 预览
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作者 Mei-Ge Zheng Wen-Yuan Sui +8 位作者 Zhen-Dan He Yan Liu Yu-Lin Huang Shu-Hua Mu Xin-Zhong Xu Ji-Sen Zhang Jun-Le Qu Jian Zhang Dong Wang 《中国神经再生研究:英文版》 SCIE CAS CSCD 2019年第10期1765-1771,共7页
We previously demonstrated that overexpression of tropomyosin receptor kinase A(TrkA)promotes the survival and Schwann celllike differentiation of bone marrow stromal stem cells in nerve grafts,thereby enhancing the r... We previously demonstrated that overexpression of tropomyosin receptor kinase A(TrkA)promotes the survival and Schwann celllike differentiation of bone marrow stromal stem cells in nerve grafts,thereby enhancing the regeneration and functional recovery of the peripheral nerve.In the present study,we investigated the molecular mechanisms underlying the neuroprotective effects of TrkA in bone marrow stromal stem cells seeded into nerve grafts.Bone marrow stromal stem cells from Sprague-Dawley rats were infected with recombinant lentivirus vector expressing rat TrkA,TrkA-shRNA or the respective control.The cells were then seeded into allogeneic rat acellular nerve allografts for bridging a 1-cm right sciatic nerve defect.Then,8 weeks after surgery,hematoxylin and eosin staining showed that compared with the control groups,the cells and fibers in the TrkA overexpressing group were more densely and uniformly arranged,whereas they were relatively sparse and arranged in a disordered manner in the TrkA-shRNA group.Western blot assay showed that compared with the control groups,the TrkA overexpressing group had higher expression of the myelin marker,myelin basic protein and the axonal marker neurofilament 200.The TrkA overexpressing group also had higher levels of various signaling molecules,including TrkA,pTrkA(Tyr490),extracellular signal-regulated kinases 1/2(Erkl/2),pErk1/2(Thr202/Tyr204),and the anti-apoptotic proteins Bcl-2 and Bcl-xL.In contrast,these proteins were downregulated,while the pro-apoptotic factors Bax and Bad were upregulated,in the TrkA-shRNA group.The levels of the TrkA effectors Akt and pAkt(Ser473)were not different among the groups.These results suggest that TrkA enhances the survival and regenerative capacity of bone marrow stromal stem cells through upregulation of the Erk/Bcl-2 pathway.All procedures were approved by the Animal Ethical and Welfare Committee of Shenzhen University,China in December 2014(approval No.AEWC-2014-001219). 展开更多
关键词 NERVE REGENERATION bone marrow stromal stem cells TROPOMYOSIN RECEPTOR kinase A RECEPTOR LENTIVIRAL vector shRNA extracellular SIGNAL-REGULATED protein kinases 1/2 Bcl-2 NERVE grafts peripheral NERVE REGENERATION survival neural REGENERATION
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慢病毒介导shRNA沉默大鼠肝BRL-3A细胞PDZK1对胆管侧膜Bsep表达的影响 预览
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作者 杨方方 刘萍 +4 位作者 程静 彭偲偲 雷亮 吴涛 宋红萍 《安徽医科大学学报》 CAS 北大核心 2019年第9期1338-1342,共5页
目的构建大鼠PDZK1基因RNA干扰慢病毒载体,并观测其对大鼠BRL-3A细胞PDZK1的基因沉默效应与对胆管侧膜胆盐输出泵(Bsep)的影响。方法针对大鼠PDZK1基因序列,筛选3个干扰靶点,合成其3对小干扰RNA,将各对siRNA分别转入BRL-3A细胞,采用PCR... 目的构建大鼠PDZK1基因RNA干扰慢病毒载体,并观测其对大鼠BRL-3A细胞PDZK1的基因沉默效应与对胆管侧膜胆盐输出泵(Bsep)的影响。方法针对大鼠PDZK1基因序列,筛选3个干扰靶点,合成其3对小干扰RNA,将各对siRNA分别转入BRL-3A细胞,采用PCR和Western blot方法从中筛选出最佳siRNA;设计合成针对最佳siRNA序列的shRNA,与载体LV3 (H1/GFP&Puro)连接,共转染293T细胞,包装成介导PDZK1基因沉默的LV3/PDZK1 shRNA慢病毒载体;感染BRL-3A细胞,荧光显微镜下观察经感染的BRL-3A细胞的GFP表达情况,在mRNA和蛋白水平检测重组慢病毒LV3/PDZK1 shRNA对BRL-3A细胞的PDZK1基因的沉默效应及对Bsep的影响。结果筛选到PDZK1基因的最佳干扰靶序列。经酶切与测序结果证实,构建LV3/PDZK1 shRNA慢病毒载体成功。BRL-3A细胞经LV3/PDZK1 shRNA慢病毒感染48 h后,PCR检测PDZK1基因表达极低,Bsep表达较弱;WB检测显示PDZK1、Bsep蛋白表达均极弱。结论成功构建大鼠PDZK1基因RNA干扰慢病毒载体,该载体能有效沉默BRL3A细胞的PDZK1基因,并抑制胆管侧膜Bsep表达。 展开更多
关键词 PDZK1 胆盐输出泵 RNA干扰 慢病毒载体 BRL-3A
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NGF基因重组慢病毒载体的构建及其在人脐带血间充质干细胞的表达
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作者 吴建红 汪东亚 +3 位作者 盛璐 陈凯 孙忠全 钱伟庆 《现代生物医学进展》 CAS 2019年第11期2001-2006,共6页
目的:构建神经生长因子(NGF)的慢病毒表达载体,并观察其转染人脐带间充质干细胞后的表达情况。方法:采用实时定量PCR(RT-PCR)方法获取NGF基因编码片段,并将构建的慢病毒载体质粒与包装质粒和包膜质粒共转染293T细胞,包装生产慢病毒。应... 目的:构建神经生长因子(NGF)的慢病毒表达载体,并观察其转染人脐带间充质干细胞后的表达情况。方法:采用实时定量PCR(RT-PCR)方法获取NGF基因编码片段,并将构建的慢病毒载体质粒与包装质粒和包膜质粒共转染293T细胞,包装生产慢病毒。应用相同滴度的慢病毒转导等量间充质干细胞(MSCs),观察转染后细胞的生长形态及生长曲线,再采用RT-PCR、Western Blot方法检测NGF m RNA、蛋白质的表达水平。结果:经PCR、酶切和测序结果证明成功构建NGF基因重组慢病毒载体。同时NGF基因重组慢病毒载体能够成功转染人脐带间充质干细胞,转染率达95.35%,转染后干细胞在NGF m RNA及蛋白质的表达方面较对照组明显升高,同时经倒置显微镜观察及生长曲线实验证实转染后干细胞的生长与对照组相比无明显差异。结论:重组NGF的慢病毒表达载体能够高效的转染人脐带间充质干细胞,基因转染后干细胞的增殖分化能力与未转染细胞差异无统计学意义,可作为一种高效的干细胞转染方法。 展开更多
关键词 神经生长因子 慢病毒载体 勃起功能障碍
猪Hsp40基因过表达与干扰重组慢病毒载体的构建
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作者 吕其壮 卓严玲 +3 位作者 章烨雯 邓家华 谭小梅 林谦 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2019年第1期76-84,共9页
热休克蛋白40(Hsp40)作为Hsp70蛋白的分子伴侣,在病毒生命周期中扮演重要角色,笔者拟通过慢病毒感染技术分别建立Hsp40基因过表达和沉默的猪肺泡巨噬细胞系,为以后开展猪Hsp40蛋白调控猪圆环病毒2型(PCV2)复制的机制研究提供有效模型。... 热休克蛋白40(Hsp40)作为Hsp70蛋白的分子伴侣,在病毒生命周期中扮演重要角色,笔者拟通过慢病毒感染技术分别建立Hsp40基因过表达和沉默的猪肺泡巨噬细胞系,为以后开展猪Hsp40蛋白调控猪圆环病毒2型(PCV2)复制的机制研究提供有效模型。提取猪肺泡巨噬细胞(PAM)的总RNA,反转录成cDNA后用于Hsp40基因编码区的扩增,并将其克隆到慢病毒过表达载体pCDH-CMV-MCS-EF1-Green-Puro。测序正确后,设计针对Hsp40基因的4条shRNA干扰序列和1条阴性对照序列,并将其分别插入到慢病毒干扰载体pCDH-U6-MCS-EF1-GreenPuro。将上述6个载体分别与3个辅助载体pVSV-G、pRev和pGag/Pol共转染293T细胞进行病毒包装,测定其滴度后用于感染PAM细胞,采用RT-qPCR和Western-blot方法对Hsp40的表达效果进行鉴定。猪Hsp40基因过表达和沉默重组慢病毒的获得为进一步研究Hsp40蛋白对PCV2复制的影响和机制奠定了基础。 展开更多
关键词 Hsp40基因 过表达 RNA干扰 慢病毒载体
RBP-Jκ对结肠癌细胞增殖和移植瘤生长的影响及其在小鼠结肠癌组织的表达 预览
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作者 王文娟 刘梦洁 +1 位作者 徐瑞 王淑红 《山西医科大学学报》 CAS 2019年第3期282-289,共8页
目的探讨Notch信号通路转录抑制因子RBP-Jκ对结肠癌细胞增殖和裸鼠移植瘤生长的影响及其在小鼠模型结肠癌组织中的表达。方法用Western blot法和Real-time PCR法在8种结肠癌细胞中筛选出RBP-Jκ高表达的结肠癌细胞RKO及RBP-Jκ低表达... 目的探讨Notch信号通路转录抑制因子RBP-Jκ对结肠癌细胞增殖和裸鼠移植瘤生长的影响及其在小鼠模型结肠癌组织中的表达。方法用Western blot法和Real-time PCR法在8种结肠癌细胞中筛选出RBP-Jκ高表达的结肠癌细胞RKO及RBP-Jκ低表达的结肠癌细胞SW480。用RBP-Jκ基因重组慢病毒载体上调SW480细胞中RBP-Jκ及靶向RBP-Jκ的shRNA慢病毒载体沉默RKO细胞中RBP-Jκ的表达,构建RBP-Jκ过表达的SW480细胞(SW480-RBP)及其对照细胞SW480-NC和RBP-Jκ沉默表达的RKO细胞(RKO-shRBP)及其对照细胞RKO-NC。MTT法检测SW480细胞和RKO细胞增殖能力的变化。构建转染细胞裸鼠皮下移植瘤模型,连续观察28 d,绘制移植瘤生长曲线,监测移植瘤生长情况;氧化偶氮甲烷(Azoxymethane,AOM)诱导构建C57BL/6小鼠结肠癌模型,在结肠癌形成过程中每8周留取小鼠结肠组织,Western blot法和Real-time PCR法检测结肠组织中RBP-JκmRNA和蛋白表达的变化。结果MTT检测显示,SW480-RBP细胞的增殖速度较对照组SW480-NC细胞显著增快(P<0.05),RKO-shRBP细胞的增殖速度较对照组RKO-NC细胞显著降低(P<0.05)。裸鼠皮下移植瘤实验显示,SW480-RBP细胞所成肿瘤的体积、质量均高于对照组细胞(SW480-NC);RKO-shRBP细胞所成肿瘤的体积、质量均低于对照组细胞(RKO-NC)。在AOM诱导的C57BL/6小鼠结肠癌形成过程中,小鼠结肠组织中的RBP-JκmRNA和蛋白表达随着肿瘤形成逐渐升高。结论RBP-Jκ可以促进结肠癌细胞的增殖和裸鼠移植瘤生长,在AOM诱导的小鼠结肠癌中,RBP-Jκ蛋白表达增加与其发生发展相关。 展开更多
关键词 RBP-Jκ 移植瘤 结肠癌 慢病毒载体 基因沉默 细胞增殖
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TIPE3长型及短型过表达细胞模型的构建及鉴定
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作者 高洁芳 张洪 +2 位作者 范月莹 冯豆 孟琳 《中国药师》 CAS 2019年第9期1617-1620,1633共5页
目的:构建TIPE3长型及短型过表达慢病毒载体,转染MGC-803胃癌细胞株,筛选出稳定表达目的基因的细胞株并进行鉴定,为研究TIPE3长型及短型异构体对胃癌细胞生物学功能的影响提供重要的实验细胞模型。方法:检索NCBI基因库中人TIPE3长型及... 目的:构建TIPE3长型及短型过表达慢病毒载体,转染MGC-803胃癌细胞株,筛选出稳定表达目的基因的细胞株并进行鉴定,为研究TIPE3长型及短型异构体对胃癌细胞生物学功能的影响提供重要的实验细胞模型。方法:检索NCBI基因库中人TIPE3长型及短型基因序列并设计相应引物,PCR扩增目的基因;将GV341载体和目的基因分别进行双酶切后重组,病毒包装后感染MGC-803胃癌细胞系,嘌呤霉素筛选得到稳定表达目的基因的细胞,RT-qPCR和Western blot分别从mRNA和蛋白水平对目的基因的过表达效果进行鉴定。结果:基因测序结果表明重组过表达慢病毒载体中Long TIPE3、Short TIPE3与NCBI中检索到的基因序列一致;倒置显微镜观察各组细胞形态基本一致,表明病毒转染并未影响细胞的生长;RT-qPCR和Western blot结果表明,以空病毒转染组为对照,Long TIPE3和Short TIPE3转染组中目的基因的mRNA和蛋白水平显著提高(P<0.000 1)。结论:TIPE3长型及短型过表达细胞模型构建成功,可以用来研究TIPE3长型及短型异构体对胃癌细胞生物学功能的影响。 展开更多
关键词 LONG TIPE3 SHORT TIPE3 过表达 慢病毒载体 MGC-803
携载增强型绿色荧光蛋白基因慢病毒标记小鼠脐带间充质干细胞示踪方法 预览
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作者 朱慧 朱文侠 +1 位作者 黄广智 马小娜 《延安大学学报:医学科学版》 2019年第3期1-4,共4页
目的探讨慢病毒载体介导增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorecent protein,eGFP)转染小鼠脐带间充质干细胞(umbilical cordmesenchymal stem cells,UCMSCs)的最佳感染复数(multiplicity of infection,MOI)。方法通过组织贴壁法得... 目的探讨慢病毒载体介导增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorecent protein,eGFP)转染小鼠脐带间充质干细胞(umbilical cordmesenchymal stem cells,UCMSCs)的最佳感染复数(multiplicity of infection,MOI)。方法通过组织贴壁法得到mUCMSCs;用生长增殖曲线、成骨、成软骨及成脂分化进行鉴定;以MOI为50、100、150、200携载eGFP的慢病毒载体介导转染mUCMSC,倒置显微镜下观察荧光表达,确定荧光表达率最高的MOI组。结果eGFP慢病毒以MOI=150转染mUCMSC,效率较高,可直接用于体内示踪。结论用小鼠脐带可以分离出mUCMSCs,MOI=150时携载eGFP的慢病毒传染mUCMSCs效果最好。 展开更多
关键词 脐带间充质干细胞 慢病毒载体 增强型绿色荧光蛋白 转染
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K562白血病细胞中Musashi2干扰慢病毒载体的构建和鉴定 预览
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作者 张慧娟 胡蓉 江丽霞 《赣南医学院学报》 2019年第5期451-454,共4页
目的:构建干扰Musashi 2 (Msi2)的慢病毒载体,并探究其在K562白血病细胞株中的干扰效率。方法:将两个Msi2干扰片段分别连接入GV418慢病毒载体,与pHelper1. 0、pHelper2. 0辅助载体共转染入293T细胞进行慢病毒包装。提取细胞上清感染白血... 目的:构建干扰Musashi 2 (Msi2)的慢病毒载体,并探究其在K562白血病细胞株中的干扰效率。方法:将两个Msi2干扰片段分别连接入GV418慢病毒载体,与pHelper1. 0、pHelper2. 0辅助载体共转染入293T细胞进行慢病毒包装。提取细胞上清感染白血病K562细胞,并用嘌呤霉素药物稳筛,获取稳定感染细胞株。定量PCR和western blot分别检测K562细胞内Msi2的干扰效率。结果:与对照组比较,干扰组shMsi2-1和shMsi2-2的Msi2 mRNA水平分别降为3%和28%(P <0. 05);与对照组相比,优选出的shMsi2-1组中Msi2蛋白水平也显著下降(P <0. 05)。结论:成功构建Msi2干扰慢病毒载体并显著沉默白血病K562细胞中Msi2的表达,为后续研究Msi2在白血病中的功能和机制奠定实验基础。 展开更多
关键词 musashi2 白血病 慢病毒载体
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RNA干扰USE1基因慢病毒载体的构建及鉴定 预览
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作者 王佳悦 刘香男 +1 位作者 彭康莉 赵博 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第3期117-122,共6页
旨在构建泛素结合酶USE1基因的RNA干扰慢病毒载体,并在细胞中检测该基因的抑制表达水平,以期寻找Uba6-USE1特异性泛素化通路对应的下游底物并研究其功能。选取并合成靶向USE1基因的特异性shRNA序列,将其克隆至pLL3.7慢病毒抑制表达载体... 旨在构建泛素结合酶USE1基因的RNA干扰慢病毒载体,并在细胞中检测该基因的抑制表达水平,以期寻找Uba6-USE1特异性泛素化通路对应的下游底物并研究其功能。选取并合成靶向USE1基因的特异性shRNA序列,将其克隆至pLL3.7慢病毒抑制表达载体上,构建抑制USE1基因表达的重组慢病毒质粒并鉴定。将鉴定成功的重组质粒与psPAX2、VSVG慢病毒包装载体共转染至HEK-293细胞,收集病毒上清,测定病毒滴度并确定最佳感染稀释倍数,通过qPCR和Western Blot方法检测病毒感染HEK-293细胞后对USE1基因的抑制程度,获得能有效抑制USE1基因的慢病毒上清。结果显示,成功构建3种靶向USE1基因的RNA干扰慢病毒载体,获得滴度符合要求的3种慢病毒包装上清液,感染HEK-293细胞后发现,第2、3号shRNA序列均有明显抑制表达USE1基因效果,基因表达抑制率约50%(*P<0.05)。利用RNA干扰技术成功构建了特异性抑制泛素结合酶USE1基因表达的慢病毒载体,并经mRNA和蛋白水平检验得到2种能够显著抑制USE1表达的慢病毒上清及其shRNA序列。 展开更多
关键词 泛素结合酶USE1 RNA干扰 慢病毒载体 泛素化
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