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慢病毒介导NGF过表达转染促进骨髓间充质干细胞向神经细胞转化的研究
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作者 邓明 谢萍 +5 位作者 马永刚 明江华 周炎 陈庆 刘志勇 刘世清 《中国临床研究》 CAS 2019年第2期145-149,共5页
目的探究慢病毒介导神经生长因子(NGF)过表达转染促进骨髓间充质干细胞(BMSCs)向神经细胞转化的作用。方法体外分离,培养人BMSCs,利用基因过表达技术,构建NGF过表达慢病毒载体转染BMSCs。根据转染情况分成3组,空白对照组(未转染慢病毒... 目的探究慢病毒介导神经生长因子(NGF)过表达转染促进骨髓间充质干细胞(BMSCs)向神经细胞转化的作用。方法体外分离,培养人BMSCs,利用基因过表达技术,构建NGF过表达慢病毒载体转染BMSCs。根据转染情况分成3组,空白对照组(未转染慢病毒载体的BMSCs)、空白载体病毒组(转染不含NGF过表达慢病毒载体的BMSCs)和过表达载体病毒组(转染过表达NGF慢病毒载体的BMSCs)。利用流式细胞仪检测BMSCs的表面标记物,利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和Western blot分别检测神经细胞表面蛋白胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和神经元特异性烯醇化酶(NSE)mRNA及蛋白的表达。结果(1)BMSCs的表面蛋白标记物CD44和CD29在第2代BMSCs的表达为60.2%和58.3%,CD34和CD45在第2代BMSCs的表达为3.4%和2.6%。(2)慢病毒转染效率为90%以上。转染效率较高。(3)空白对照组、空白载体病毒组和过表达载体病毒组的GFAP和NSE mRNA的相对表达量三组比较有统计学差异(P<0.05);其中空白载体病毒组和空白对照组的组间比较无统计学差异(P>0.05);过表达载体病毒组高于空白载体病毒组,组间比较有统计学差异(P<0.05)。Western blot检测蛋白表达量也具有同样的表达特点。结论慢病毒介导NGF过表达转染促进BMSCs可以提高BMSCs向神经细胞转化的效率,可以为神经损伤和脊髓损伤提供种子细胞。 展开更多
关键词 神经生长因子 骨髓间充质干细胞 慢病毒转染 胶质纤维酸性蛋白 神经元特异性烯醇化酶
中药淫羊藿苷对TDP-43介导的骨关节炎软骨细胞病变的作用机制 预览
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作者 孙海峰 杨茂伟 +1 位作者 时永臣 王守赟 《世界中医药》 CAS 2019年第7期1672-1676,共5页
目的:研究分析中药淫羊藿苷对TDP-43介导的骨关节炎软骨细胞病变的作用机制,从而为临床有效治疗骨关节炎软骨细胞病变提供参考依据。方法:选取并构建TDP-43慢病毒转染人软骨细胞,并予以不同浓度的中药淫羊藿苷进行干预。采用荧光定量PC... 目的:研究分析中药淫羊藿苷对TDP-43介导的骨关节炎软骨细胞病变的作用机制,从而为临床有效治疗骨关节炎软骨细胞病变提供参考依据。方法:选取并构建TDP-43慢病毒转染人软骨细胞,并予以不同浓度的中药淫羊藿苷进行干预。采用荧光定量PCR检测不同组别人软骨细胞的TDP-43基因表达情况,采用流式细胞仪检测TDP-43慢病毒转染的人软骨细胞加入中药淫羊藿苷前后细胞凋亡情况,通过连续细胞计数观察细胞增殖情况。分别比较3组人软骨细胞中靶基因TDP-43与Ⅰ型胶原蛋白α1表达情况,TDP-43慢病毒转染的人软骨细胞加入中药淫羊藿苷前后细胞凋亡情况,加入不同浓度中药淫羊藿苷培养后的软骨细胞计数水平。结果:TDP-43慢病毒转染的人软骨细胞中TDP-43基因表达水平为(16.02±1.45),比正常人软骨细胞、空白慢病毒转染的人软骨细胞的(1.86±0.13)、(1.88±0.12)高,差异有统计学意义(P<0.05);而3组Ⅰ型胶原蛋白α1基因表达差异无统计学意义(P>0.05)。加入不同浓度的中药淫羊藿苷后TDP-43慢病毒转染的人软骨细胞凋亡率相比加入中药淫羊藿苷前均降低,差异有统计学意义(P<0.05)。培养3 d后、6 d后、12 d后高浓度中药淫羊藿苷培养的软骨细胞计数比中浓度高,而中浓度中药淫羊藿苷培养的软骨细胞计数水平比低浓度高,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:TDP-43可能在骨关节炎软骨细胞病变过程中发挥负调控作用,而中药淫羊藿苷可通过改善上述过程,改善TDP-43介导的骨关节炎软骨细胞病变。 展开更多
关键词 骨关节炎 软骨细胞病变 淫羊藿苷 TDP-43 作用机制 中药 慢病毒转染 细胞凋亡
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小窝蛋白-1对人甲状腺上皮细胞增殖、凋亡及胞内活性氧水平的影响 预览
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作者 刘宝翠 郑婷婷 +3 位作者 董利阳 牟笑 许铖铖 毛朝明 《江苏大学学报:医学版》 CAS 2019年第4期282-286,共5页
目的:探讨小窝蛋白-1(Caveolin-1)对人甲状腺上皮细胞系Nthy-ori 3-1增殖、凋亡和胞内活性氧产生的影响。方法:将正常人甲状腺上皮细胞(Nthy-ori 3-1)分为实验组和阴性对照组,分别转染Caveolin-1敲减病毒上清液以及阴性对照病毒上清液,... 目的:探讨小窝蛋白-1(Caveolin-1)对人甲状腺上皮细胞系Nthy-ori 3-1增殖、凋亡和胞内活性氧产生的影响。方法:将正常人甲状腺上皮细胞(Nthy-ori 3-1)分为实验组和阴性对照组,分别转染Caveolin-1敲减病毒上清液以及阴性对照病毒上清液,以未转染的Nthy-ori 3-1细胞为空白对照组,应用嘌呤霉素筛选出阳性细胞,qRTPCR和蛋白质印迹检测3组细胞Caveolin-1的mRNA和蛋白表达;MTT法检测Caveolin-1敲减后细胞增殖能力变化;流式细胞术检测Caveolin-1敲减后细胞的凋亡率;荧光探针DCFH-DA法检测Caveolin-1敲减后细胞内活性氧水平。结果:Caveolin-1抑制性慢病毒感染后,Nthy-ori 3-1细胞Caveolin-1 mRNA和蛋白水平均显著降低(P均<0. 01)。抑制Caveolin-1表达后,Nthy-ori 3-1细胞增殖能力较阴性对照组明显降低,凋亡率明显增加,细胞内活性氧水平明显升高(P均<0. 01)。结论:Caveolin-1表达降低通过增加胞内活性氧水平和细胞凋亡,抑制细胞增殖,介导甲状腺上皮细胞损伤。 展开更多
关键词 桥本甲状腺炎 甲状腺上皮细胞 小窝蛋白-1 凋亡 活性氧 慢病毒转染 基因敲减 荧光探针
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慢病毒介导shRNA LINGO-1质粒转染促进骨髓间充质干细胞向神经细胞转化的研究 预览
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作者 刘峰 李春胜 李亚南 《神经损伤与功能重建》 2019年第7期325-329,共5页
目的:探究慢病毒介导shRNA LINGO-1质粒转染促进骨髓间充质干细胞(BMSCs)向神经细胞转化的研究。方法:利用shRNA基因干扰技术,构建shRNA LINGO-1干扰载体,慢病毒转染BMSCs,根据病毒转染情况分成空白对照组(未转染慢病毒的BMSCs)、空载... 目的:探究慢病毒介导shRNA LINGO-1质粒转染促进骨髓间充质干细胞(BMSCs)向神经细胞转化的研究。方法:利用shRNA基因干扰技术,构建shRNA LINGO-1干扰载体,慢病毒转染BMSCs,根据病毒转染情况分成空白对照组(未转染慢病毒的BMSCs)、空载体病毒组(转染不含shRNA LINGO-1干扰载体慢病毒的BMSCs)、干扰载体病毒组(转染shRNA LINGO-1干扰载体慢病毒的BMSCs)。利用流式细胞仪检测BMSCs的表面蛋白,利用RT-PCR和Western-Blot检测胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、神经丝蛋白(NF)、巢蛋白的表达。结果:CD44和CD29在第2代BMSCs的表达为60.2%和58.3%;CD34和CD45在第2代BMSCs的表达为3.4%和2.6%。慢病毒转染效率为90%以上。空白对照组、空载体病毒组和干扰载体病毒组的GFAP、NSE、NF和巢蛋白m RNA的相对表达量比较差异有统计学意义(P<0.05),其中空载体病毒组和空白对照组的比较差异无统计学意义(P>0.05),干扰载体病毒组和空载体病毒组的差异有统计学意义(P<0.05)。Western-blot检测蛋白表达量也具有同样的表达特点。结论:慢病毒介导shRNA LINGO-1干扰载体转染促进BMSCs可提高BMSCs向神经细胞转化的效率。 展开更多
关键词 LINGO-1 骨髓间充质干细胞 慢病毒转染 胶质纤维酸性蛋白 神经元特异性烯醇化酶
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转基因诱导永生化鸡细胞系的建立
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作者 朱姿英 卢克焕 +1 位作者 SteveLStice 陆阳清 《基因组学与应用生物学》 CAS CSCD 北大核心 2019年第8期3498-3505,共8页
传统上从鸡胚中分离病毒用于疫苗的生产常常不能满足需求,研究从体外培养的细胞中分离病毒的途径成为当前疫苗生产领域的迫切需要。本研究利用体细胞诱导重编程技术建立永生化细胞系,为应用于疫苗制备等研究和生产奠定基础。通过慢病毒... 传统上从鸡胚中分离病毒用于疫苗的生产常常不能满足需求,研究从体外培养的细胞中分离病毒的途径成为当前疫苗生产领域的迫切需要。本研究利用体细胞诱导重编程技术建立永生化细胞系,为应用于疫苗制备等研究和生产奠定基础。通过慢病毒载体转染转录调控因子(NANOG, LIN28和C-MYC)重编程鸡成纤维细胞,并稳定培养至100代,获得永生化的细胞,而后逐步去除细胞因子、血清等添加物,优化细胞系培养体系,并对细胞驯化实现悬浮生长,以获得单位体积最大密度的细胞。研究结果表明:通过转基因将NANOG,LIN28和C-MYC 3个因子整合入细胞中表达,细胞系对碱性磷酸酶染色呈阳性反应,端粒逆转录酶(cTERT)基因在细胞系中显著上调,并稳定培养至100代,使得这些细胞具有自我更新特性和永生化的潜能。确定了培养基中的血清替代物KSR浓度为20%,并撤除了培养基中bFGF等生长因子,为细胞大规模培养应用提供了可能。永生细胞实现悬浮生长,细胞生长倍增时间为21.71 h,最大密度为1.3×106 cells/m L。因此,我们通过重编程技术建立了一株稳定的永生化细胞系,并且使它能在低浓度KSR中悬浮培养,这为疫苗制备等研究和生产提供科学依据。 展开更多
关键词 诱导型重编程 鸡永生化细胞系 无血清培养 慢病毒转染 悬浮培养
慢病毒介导siRNA沉默MMP-3对大鼠创伤性骨性关节炎模型软骨退变的影响 预览
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作者 李勤学 李传静 王锋 《昆明医科大学学报》 CAS 2019年第6期33-38,共6页
目的 探究MMP-3基因siRNA慢病毒干扰载体对大鼠骨性关节炎模型的影响。方法 制备SD大鼠OA模型,构建shRNA MMP-3 慢病毒表达载体,按照处理方法分为4组:模型对照组、假手术组、正常对照组和shRNA MMP-3载体组。每组为5只SD大鼠,模型对照... 目的 探究MMP-3基因siRNA慢病毒干扰载体对大鼠骨性关节炎模型的影响。方法 制备SD大鼠OA模型,构建shRNA MMP-3 慢病毒表达载体,按照处理方法分为4组:模型对照组、假手术组、正常对照组和shRNA MMP-3载体组。每组为5只SD大鼠,模型对照组术后1月膝关节注射的是1 mL生理盐水,shRNA MMP-3组术后1月膝关节注射的是100 uL混合1 mL的生理盐水的shRNA MMP-3慢病毒载体。大体观察SD大鼠OA模型的膝关节,并进行番红染色和免疫组织化学染色。并进行相应的评分。结果(1)SD大鼠膝关节软骨的大体评分模型对照组、假手术组、正常对照组和shRNA MMP-3载体组的4组比较,SD大鼠膝关节OA软骨的破坏具有统计学差异(P < 0.05);(2)SD大鼠膝关节OA软骨的番红染色Makin评分的四组比较中具有统计学差异(P < 0.05),shRNA MMP-3载体组评分高于模型对照组,差异有统计学差异(q = 9.438,P < 0.01);(3)SD大鼠膝关节OA软骨的aggrecan蛋白的表达中,模型对照组、假手术组、正常对照组和shRNA MMP-3载体组的四组Aggrecan表达免疫组织化学染色评分具有统计学差异(P < 0.05),shRNA MMP-3载体组评分高于模型对照组,差异有统计学意义(q = 9.438,P < 0.01)。结论 shRNA MMP-3载体可以有效的保护Aggrecan的表达,减缓OA软骨的退变。 展开更多
关键词 聚集蛋白聚糖 骨性关节炎 软骨退变 慢病毒转染
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Aggrecan基因过表达载体对大鼠骨关节炎模型的影响 预览
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作者 温俊 谢志华 +1 位作者 何志刚 郑绍毅 《南昌大学学报:医学版》 CAS 2019年第4期17-20,26,I0001,共6页
目的探究Aggrecan基因过表达载体对大鼠骨关节炎(OA)模型的影响。方法制备改良的SD大鼠OA模型,构建Aggrecan的过表达慢病毒载体,按照处理方法的不同分为4组:模型对照组、假手术组、正常对照组和Aggrecan过表达慢病毒载体组(过表达组),... 目的探究Aggrecan基因过表达载体对大鼠骨关节炎(OA)模型的影响。方法制备改良的SD大鼠OA模型,构建Aggrecan的过表达慢病毒载体,按照处理方法的不同分为4组:模型对照组、假手术组、正常对照组和Aggrecan过表达慢病毒载体组(过表达组),每组各5只。大体观察SD大鼠OA模型的膝关节,行HE染色和免疫组织化学染色,并进行相应的评分。结果构建Aggrecan慢病毒过表达载体转染HEK293细胞,感染复数为50,转染效率为80%。SD大鼠膝关节软骨的受损程度模型对照组>过表达组>假手术组>正常对照组,且差异有统计学意义(F=12.954,P<0.001)。4组SD大鼠膝关节OA软骨的HE染色Makin评分比较:过表达组低于模型对照组(q=9.438,P<0.001),高于假手术组、正常对照组(q=11.284、14.352,P<0.001)。SD大鼠膝关节OA软骨Aggrecan表达的免疫组织化学染色评分比较:过表达组低于模型对照组(q=8.174,P<0.001)。高于假手术组、正常对照组(q=7.649、7.885,P<0.001)。结论Aggrecan慢病毒过表达载体可以有效增加Aggrecan的表达,减缓OA软骨的退变。 展开更多
关键词 聚集蛋白聚糖 骨关节炎 软骨退变 慢病毒转染 动物 实验 大鼠
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三叶因子3对甲状腺乳头状癌细胞周期的影响及机制
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作者 代金 林旭 +4 位作者 郭梦姚 张静 张文静 薛刚 吴靖芳 《解剖学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第2期211-219,共9页
目的探讨三叶因子3 (TFF3)基因沉默对人甲状腺乳头状癌TPC-1和BCPAP细胞增殖及细胞周期的影响及相关分子机制。方法包装TFF3 shRNA慢病毒载体,病毒感染获得TPC-1和BCPAP稳转细胞株;生长曲线和集落形成实验检测沉默TFF3后细胞增殖状况;... 目的探讨三叶因子3 (TFF3)基因沉默对人甲状腺乳头状癌TPC-1和BCPAP细胞增殖及细胞周期的影响及相关分子机制。方法包装TFF3 shRNA慢病毒载体,病毒感染获得TPC-1和BCPAP稳转细胞株;生长曲线和集落形成实验检测沉默TFF3后细胞增殖状况;流式细胞术检测TFF3基因对TPC-1和BCPAP细胞周期的影响;实时定量聚合酶链反应(Real-time PCR)检测P27、P21和cyclin D1、周期蛋白依赖性激酶(CDK) 4 mRNA的表达情况;免疫印迹法(Western blotting)、免疫细胞化学染色检测周期相关蛋白P27、P21、cyclin D1、CDK4和蛋白激酶B(Akt)、p Akt的蛋白表达水平。结果成功包装TFF3 shRNA慢病毒载体,病毒液感染获得TPC-1和BCPAP稳转细胞株;生长曲线和集落形成实验结果显示,沉默TFF3后,细胞增殖能力减弱;流式细胞术结果显示,与对照组相比,TFF3基因沉默组G1期的细胞比例明显增高(*P<0. 05),S和G2期的细胞比例明显下降(*P<0. 05);TFF3沉默组TPC-1和BCPAP细胞中的P27、P21 mRNA和蛋白明显上调(*P<0. 05),而cyclin D1,CDK4mRNA和蛋白表达降低(*P<0. 05);4株细胞Akt蛋白含量无明显差异,但沉默TFF3组磷酸化蛋白激酶B(p Akt)表达减弱;免疫细胞化学染色显示,cyclin D1阳性蛋白位于癌细胞胞核,P27、P21蛋白表达于胞质和胞核,且沉默TFF3后在细胞核中阳性信号增强,细胞质中阳性表达降低。结论沉默TFF3可明显延长甲状腺癌细胞周期,抑制细胞的增殖,可能与抑制磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)通路相关蛋白的表达有关。 展开更多
关键词 三叶因子3 细胞周期 慢病毒转染 磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B 流式细胞术
稳定表达RFP-GFP-LC3的大鼠胰岛β细胞株的构建 预览
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作者 周佳丽 吴艳阳 +3 位作者 罗玉霜 袁玉菊 刘明俊 刘东波 《生命科学研究》 CAS CSCD 2019年第2期87-91,共5页
为了简便自噬相关机理药物在胰岛β细胞上的高通量筛选,实验通过慢病毒转染技术,将RFP-GFP-LC3质粒转入大鼠胰岛β细胞株(RIN-m5f),用G418对感染细胞进行筛选,激光共聚焦进行活细胞拍摄验证,得到100%表达RFP-GFP-LC3质粒的细胞株.无血... 为了简便自噬相关机理药物在胰岛β细胞上的高通量筛选,实验通过慢病毒转染技术,将RFP-GFP-LC3质粒转入大鼠胰岛β细胞株(RIN-m5f),用G418对感染细胞进行筛选,激光共聚焦进行活细胞拍摄验证,得到100%表达RFP-GFP-LC3质粒的细胞株.无血清饥饿处理细胞,结果显示:饥饿组GFP/RFP荧光点比值较对照组下降, P62蛋白表达量以及S6K磷酸化水平降低,加入10 μmol/L氯喹部分抑制自噬后, GFP/RFP荧光点比值回升.以上结果表明稳定表达RFP-GFP-LC3的RIN-m5f构建成功,并能够以简单的检测方式准确表达自噬全过程,为自噬在糖尿病药物机理方面的研究奠定了基础. 展开更多
关键词 糖尿病:自噬 慢病毒转染 RIN-m5f细胞株
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HLA-G慢病毒转染抑制NK细胞毒功能的实验研究
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作者 张晓莉 赵春艳 陈黎 《中国急救复苏与灾害医学杂志》 2018年第8期749-752,共4页
目的建立-株稳定表达人类白细胞抗原G(human leucocyte antigenG,HLA—G)的子宫内膜癌细胞系,探讨HLA—G对NK92细胞的杀伤活性影响。方法将HLA—G慢病毒包装并转染于HEC-1-B细胞系,稳定转染HLA—G基因的I-IEC-1-B与NK92细胞系共培... 目的建立-株稳定表达人类白细胞抗原G(human leucocyte antigenG,HLA—G)的子宫内膜癌细胞系,探讨HLA—G对NK92细胞的杀伤活性影响。方法将HLA—G慢病毒包装并转染于HEC-1-B细胞系,稳定转染HLA—G基因的I-IEC-1-B与NK92细胞系共培养,并使用乳酸脱氢酶(1actate dehydrognase,LDH)释放法检测HLA—G表达对自然杀伤(naturalkiller,NK)92细胞杀伤活性的影响。结果外源基因HLA—G成功介导转染在人子宫内膜癌HEC-1-B细胞系,通过免疫荧光可见HLA—G表达率为95%,乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测HLA—G基因表达能够有效抑制NK92细胞的杀伤活性,与对照组相比有统计学意义(P〈0.05)。结论HLA—G是-个重要的免疫抑制分子,稳定表达HLA—G的子宫内膜癌细胞可明显抑制NK92细胞的杀伤活性,可能诱导移植免疫耐受的发生。 展开更多
关键词 HLA-G 慢病毒转染 NK细胞毒
FGFR4基因沉默对肝癌细胞生物学行为影响机制分析 预览
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作者 王朝辉 辛永宁 《中西医结合肝病杂志》 CAS 2018年第3期156-158,共3页
目的:研究FGFR4基因沉默对肝癌细胞生物学行为影响。方法:采用FGFR4表达较高的肝癌细胞株smmc-7721,采用慢病毒转染降低smmc-7721中FGFR4的m RNA和蛋白表达水平。设A组为未进行转染操作的正常细胞组,B组为FGFR4基因序列被打乱后重组... 目的:研究FGFR4基因沉默对肝癌细胞生物学行为影响。方法:采用FGFR4表达较高的肝癌细胞株smmc-7721,采用慢病毒转染降低smmc-7721中FGFR4的m RNA和蛋白表达水平。设A组为未进行转染操作的正常细胞组,B组为FGFR4基因序列被打乱后重组的阴性对照组,C组为经慢病毒转染后的FGFR4基因沉默(si RNA)组。对比三组细胞的增殖能力、凋亡情况、侵袭能力以及相关效应蛋白的表达情况。结果:C组细胞增殖明显低于A组和B组,差异有统计学意义(P〈0.05);细胞穿出计数对比,A组(59.8±3.17)和B组(61.5±4.26)均显著高于C组(36.8±5.13),差异有统计学意义(P〈0.05);C组细胞凋亡显著高于A组和B组,差异有统计学意义(P〈0.05);C组FLIP、PCNA、Bcl-x L、p ERK、p STAT3、Vimentin和FGFR4的蛋白表达均显著低于A组和B组,而Caspase-3和E-cadeherin的表达则显著高于另外两组,差异有统计学意义(P〈0.05)。结论:FGFR4沉默后,肝癌细胞smmc-7721的增殖能力受到了显著的抑制,癌细胞侵袭性明显下降,肝癌细胞的凋亡率显著上升。 展开更多
关键词 FGFR4 慢病毒转染 肝癌 细胞侵袭性
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慢病毒介导的αB-晶状体蛋白基因沉默对胃癌细胞SGC-7901增殖和迁移能力的影响 被引量:3
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作者 张峰 赵达 +4 位作者 侯小明 袁得峰 张彦军 金延玲 李敏 《兰州大学学报:医学版》 CAS 2017年第2期1-6,共6页
目的 应用慢病毒转染技术研究αB-晶状体蛋白(CRYAB)基因沉默对人胃癌SGC-7901细胞增殖和迁移能力的影响。方法 构建CRYAB慢病毒载体转染人胃癌细胞株SGC-7901,获得稳定转染的细胞株,制备空载体作为阴性对照组(sh-ctrl组),实验组为C... 目的 应用慢病毒转染技术研究αB-晶状体蛋白(CRYAB)基因沉默对人胃癌SGC-7901细胞增殖和迁移能力的影响。方法 构建CRYAB慢病毒载体转染人胃癌细胞株SGC-7901,获得稳定转染的细胞株,制备空载体作为阴性对照组(sh-ctrl组),实验组为CRYAB病毒转染组(sh-CRYAB组)。提取总RNA和蛋白,应用荧光定量PCR和蛋白免疫印迹法检测CRYAB的表达,应用CCK-8、Transwell和细胞划痕实验分别检测CRYAB基因沉默后细胞增殖和迁移能力的变化。结果 慢病毒转染SGC-7901细胞后,CRYAB mRNA及蛋白水平显著降低(P〈0.01,P〈0.001),表明成功构建了稳定转染的CRYAB-shRNA胃癌细胞株。与sh-ctrl组比较,sh-CRYAB组细胞的增殖能力在第4天、第5天显著降低(P〈0.05,P〈0.01),sh-CRYAB组细胞迁移率显著降低(P〈0.01)。结论 CRYAB表达沉默可降低胃癌细胞的增殖和迁移能力,CRYAB有望成为胃癌基因治疗的新靶点。 展开更多
关键词 αB-晶状体蛋白基因 慢病毒 细胞增殖 细胞迁移 胃癌
慢病毒转染和电转染原代C57BL/6小鼠神经干细胞的比较 预览 被引量:2
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作者 加三三 胡俊 +2 位作者 李美宁 张凯丽 刘志贞 《中国现代医学杂志》 CAS 北大核心 2017年第6期6-9,共4页
目的 比较慢病毒与电转染两种技术转染小鼠原代神经干细胞的优劣,获得神经干细胞高效转染的方法 .方法 从C57BL/6小鼠脑组织中提取神经干细胞,进行原代培养;分别进行慢病毒转染和电转染,通过观察绿色荧光蛋白在细胞中的表达,比较两种转... 目的 比较慢病毒与电转染两种技术转染小鼠原代神经干细胞的优劣,获得神经干细胞高效转染的方法 .方法 从C57BL/6小鼠脑组织中提取神经干细胞,进行原代培养;分别进行慢病毒转染和电转染,通过观察绿色荧光蛋白在细胞中的表达,比较两种转染方法的转染效果,并用噻唑蓝(MTT)法计算相对存活率,比较两种方法转染后对细胞的影响.结果 慢病毒与电转染两种转染技术转染神经干细胞48 h后,慢病毒的转染率为(77.6±6.6)%,高于电转染法转染率[(29.2±4.8)%],两者比较,差异有统计学意义(P〈0.05);转染72 h后,慢病毒转染的细胞荧光表达量为(60.0±3.6)%,电转染细胞的荧光表达量仅剩(12.8±2.4)%;MTT法结果显示,电转染组细胞相对存活率为(75.8±2.3)%,慢病毒转染组细胞相对存活率为(70.1±1.4)%,两者比较,差异无统计学意义(P〉0.05).结论 对于原代神经干细胞转染,慢病毒转染法比电转染法具有更高的转染效率及长久稳定性,转染后细胞存活率与电转染法接近,因此慢病毒转染法更能满足研究者的需求. 展开更多
关键词 神经干细胞 慢病毒转染 电转染
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稳定敲低PLEKHQ1基因细胞株的建立 预览
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作者 周晨辰 陆琤 +1 位作者 张鹏飞 张硌 《中国医学装备》 2017年第11期140-142,共3页
目的:建立稳定敲低PLEKHQ1基因的RAW和THP-1细胞株。方法:在293TX细胞中进行病毒的包装,用获得的高滴度慢病毒感染RAW和THP-1细胞,通过免疫印迹和荧光显微镜,检测病毒感染后RAW和THP-1细胞PLEKHQ1蛋白表达的变化。结果:PLEKHQ1-le... 目的:建立稳定敲低PLEKHQ1基因的RAW和THP-1细胞株。方法:在293TX细胞中进行病毒的包装,用获得的高滴度慢病毒感染RAW和THP-1细胞,通过免疫印迹和荧光显微镜,检测病毒感染后RAW和THP-1细胞PLEKHQ1蛋白表达的变化。结果:PLEKHQ1-lentiviralshRNA-1质粒在转染后表现出明显的干扰作用,感染后能明显下调RAW和THP-1细胞的PLEKHQ1蛋白表达。结论:稳定敲低PLEKHQ1基因的RAW和THP-1细胞株的建立,可为进一步研究PLEKHQ1在相关疾病中的功能奠定基础。 展开更多
关键词 PLEKHQ1基因 RAW细胞株 慢病毒感染
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人源性ApoE4基因转染PC12细胞株建立及麦芽酚铝对其细胞活力影响
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作者 张婷 李立荣 +4 位作者 王姗姗 赵宇卿 张淑惠 王翡 牛侨 《中国职业医学》 北大核心 2017年第6期677-682,共6页
目的 建立人源性载脂蛋白E4(ApoE4)基因转染的大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞株PC12细胞(以下简称“PC12细胞”),探讨麦芽酚铝对该细胞株细胞活力的影响。方法 将携带有人源性ApoE4基因重组慢病毒载体转染PC12细胞株,用嘌呤霉素进行筛选... 目的 建立人源性载脂蛋白E4(ApoE4)基因转染的大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞株PC12细胞(以下简称“PC12细胞”),探讨麦芽酚铝对该细胞株细胞活力的影响。方法 将携带有人源性ApoE4基因重组慢病毒载体转染PC12细胞株,用嘌呤霉素进行筛选,获得ApoE4稳定过表达PC12细胞株(PC12-ApoE4组)和阴性空载体对照PC12细胞株(PC12-NC组)。采用实时荧光定量聚合酶链反应法分别检测PC12组、PC12-NC组、PC12-ApoE4组细胞的R-ApoE和(或)H-ApoE-FLAG的mRNA相对表达量,以鉴定构建效果。分别用浓度为0.00、100.00、200.00和400.00μmol/L的麦芽酚铝溶液对PC12-ApoE4组和PC12组细胞染毒24 h后,采用CCK-8法检测细胞存活率。结果 PC12-ApoE4组、PC12-NC组细胞荧光显微镜下均可见荧光表达,提示转染成功;PC12组细胞未见荧光表达。PC12组细胞R-ApoE基因、PC12-NC组细胞R-ApoE基因、PC12-ApoE4组细胞H-ApoE-FLAG基因的mRNA的相对表达量的中位数分别为1.00、1.01和148.74;其中,PC12组与PC12-NC组细胞R-ApoE基因的mRNA的相对表达量均低于PC12-ApoE4组细胞H-ApoE-FLAG基因(P〈0.01)。麦芽酚铝染毒后,细胞存活率在染毒剂量及细胞类型的主效应以及交互效应上均有统计学意义(P〈0.01);其中,麦芽酚铝在0.00-400.00μmol/L浓度下,随着染毒剂量的增加,2种细胞的细胞存活率均降低,均呈剂量-效应关系(P〈0.01)。结论 成功构建稳定表达人源性ApoE4基因的细胞株。麦芽酚铝和ApoE4基因对PC12细胞存活率的影响存在交互作用,ApoE4基因可增强麦芽酚铝对PC12细胞的细胞毒性。 展开更多
关键词 载脂蛋白E基因 PC12细胞 慢病毒转染 基因重组 聚合酶链反应 CCK-8 麦芽酚铝
HIF-1α基因介导的牙髓干细胞在体外的成血管作用 预览 被引量:1
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作者 邓立方 朱友明 王银龙 《安徽医科大学学报》 CAS 北大核心 2016年第8期1120-1124,共5页
目的 探索低氧诱导因子-1α(HIF-1α)基因诱导牙髓干细胞(DPSCs)在体外的成血管作用。方法 对HIF-1α进行基因突变,构建突变型、野生型以及对照组的慢病毒载体;体外培养DPSCs;分别用3种慢病毒转染DPSCs后,检测细胞转染效率、目的基... 目的 探索低氧诱导因子-1α(HIF-1α)基因诱导牙髓干细胞(DPSCs)在体外的成血管作用。方法 对HIF-1α进行基因突变,构建突变型、野生型以及对照组的慢病毒载体;体外培养DPSCs;分别用3种慢病毒转染DPSCs后,检测细胞转染效率、目的基因HIF-1α在mRNA及蛋白水平的表达,MTT法检测慢病毒载体对细胞增殖的影响;目的基因转染成功后,qPCR、Western blot法检测HIF-1α调控DPSCs成血管因子的表达。结果 MTT结果表明慢病毒载体对DP-SCs的增殖几乎无影响。qPCR和Western blot法检测目的基因HIF-1α成功表达,HIF-1α能够显著上调DPSCs的成血管因子的表达(P〈0.05)。突变组和野生组的成血管作用明显强于对照组(P〈0.05),而突变组又优于野生组(P〈0.05)。结论 HIF-1α基因可以促进DPSCs血管向分化作用。 展开更多
关键词 HIF-1Α DPSCs 慢病毒转染 成血管
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红/绿色荧光蛋白转染骨髓间充质干细胞在骨支架中的示踪及转归 被引量:1
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作者 许子星 许卫红 +1 位作者 张立群 王长昇 《中华实验外科杂志》 CAS CSCD 北大核心 2016年第1期167-170,共4页
目的比较骨髓间充质干细胞(BMSCs)分别转染红/绿色荧光蛋白(RFP/GFP),作为种子细胞在消旋聚乳酸(PDLLA)支架上贴附、增殖、代谢和分化的不同。方法以最佳感染复数(MOI)的Lentivirus-GFP/RFP转染BMSCs,成骨诱导培养后接种于... 目的比较骨髓间充质干细胞(BMSCs)分别转染红/绿色荧光蛋白(RFP/GFP),作为种子细胞在消旋聚乳酸(PDLLA)支架上贴附、增殖、代谢和分化的不同。方法以最佳感染复数(MOI)的Lentivirus-GFP/RFP转染BMSCs,成骨诱导培养后接种于PDLLA骨支架,分为GFP-BMSCs(G组)、RFP.BMSCs(R组)、未经转染的BMSCs作为对照(Control,C组)。检测并比较各组种子细胞的代谢活性、贴附、增殖、荧光示踪与成骨分化。结果G组BMSCs代谢活性持续增强,培养21d时荧光强度达20458±1364;而R组BMSCs代谢活性在培养14d时达顶峰(12216±742),培养21d急剧下降至7865±1031。荧光显微镜及扫描电镜下观察,G组与R组BMSCs均能在PDLLA支架上贴附与增殖,G组的增殖、贴附及细胞生长状态明显优于R组。实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)结果显示:随着培养时间延长,各组成骨相关基因骨钙素(OCN)、碱性磷酸酶(ALP)和骨桥蛋白(OPN)的表达均上调,G组和C组表达倍数变化近似,各时间点各基因表达均高于R组(P〈0.01)。G组和C组的OCN、ALP和OPN表达均在第21天达到高峰;R组OCN、ALP表达以第14天为高峰(分别为6.00±1.44与2.14±0.58),OPN表达第7天为高峰(5.91±1.20),各基因表达至第21天均明显下调。结论BMSCs转染GFP,在PDLLA支架上贴附、增殖、代谢和成骨分化均优于转染RFP。 展开更多
关键词 骨髓间充质干细胞 消旋聚乳酸支架 慢病毒转染
过表达微小RNA-223脊髓来源神经干细胞移植治疗大鼠脊髓损伤 被引量:1
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作者 许子星 许卫红 +2 位作者 张立群 李伟 孙炜俊 《中华实验外科杂志》 CAS CSCD 北大核心 2016年第11期2485-2489,共5页
目的 探讨微小RNA(miRNA,miR)-223是否通过靶基因RhoB调控脊髓继发炎症性损伤,观察过表达miR-223脊髓来源神经干细胞(NSCs)移植的治疗作用.方法 以最佳感染复数(MOI)为10的慢病毒载体系统转染NSCs并移植治疗大鼠脊髓损伤模型,分... 目的 探讨微小RNA(miRNA,miR)-223是否通过靶基因RhoB调控脊髓继发炎症性损伤,观察过表达miR-223脊髓来源神经干细胞(NSCs)移植的治疗作用.方法 以最佳感染复数(MOI)为10的慢病毒载体系统转染NSCs并移植治疗大鼠脊髓损伤模型,分为过表达miR-223-NSCs移植组(实验Ⅰ组)、空白载体NSCs移植组(实验Ⅱ组)和对照组(仅造模).移植后12、24h、3d及7d,分别行实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)及原位杂交检测miR-223和RhoB表达;酶联免疫吸附试验(ELISA)检测肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和IL-6表达水平.结果 慢病毒转染后,NSCs表达miR-223倍数上升至6.9±1.9.FQ-PCR结果显示:移植治疗后,实验Ⅰ组在脊髓损伤部位表达miR-223逐渐上升,3d出现表达高峰(11.64±1.82).各时间点实验Ⅱ组及对照组表达均较低,且两者间差异无统计学意义(P>0.05).RhoB在各时间点的表达趋势与miR-223相反:移植治疗后3d,表达下降至最低(0.31 ±0.08).原位杂交直观地印证了FQ-PCR结果.ELISA结果显示:移植后12h,TNF-α和IL-6表达均达到高峰.TNF-α随着时间表达下降,各时间点均以实验Ⅰ组的表达最低.IL-6的表达在对照组及实验Ⅱ组损伤后3d出现第2个高峰,而在实验Ⅰ组则持续下降.结论 miR-223通过靶基因RhoB调控炎性因子TNF-α和IL-6的表达,过表达miR-223-NSCs移植可能具备脊髓损伤的治疗作用. 展开更多
关键词 神经干细胞 微小RNA-223 脊髓损伤 细胞移植 慢病毒转染
稳定敲低MYH10基因细胞株的建立 预览 被引量:1
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作者 周晨辰 陆琤 +1 位作者 张鹏飞 张硌 《医学研究杂志》 2015年第11期51-53,共3页
目的构建稳定敲低MYHIO基因的COS-7细胞株。方法在293TX细胞中进行病毒的包装,用获得的高效价慢病毒感染COS-7细胞,通过免疫印迹和荧光显微镜,检测病毒感染后COS-7细胞MYHIO蛋白表达的变化。结果在构建的两种重组质粒中,MYH10-lenti... 目的构建稳定敲低MYHIO基因的COS-7细胞株。方法在293TX细胞中进行病毒的包装,用获得的高效价慢病毒感染COS-7细胞,通过免疫印迹和荧光显微镜,检测病毒感染后COS-7细胞MYHIO蛋白表达的变化。结果在构建的两种重组质粒中,MYH10-lentiviralshRNA-2在转染后表现出明显的干扰作用,感染后能明显下调COS-7细胞的MYH10蛋白表达。结论病毒感染的COS-7细胞可明显抑制COS-7细胞内源MYH10的表达,说明了稳定敲低MYH10基因的COS-7细胞株的建立,为进-步研究MYH10在相关疾病中的功能奠定了基础。 展开更多
关键词 MYH10基因 COS-7细胞株 慢病毒感染
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过表达胶质细胞源性神经营养因子的脂肪源性间充质干细胞对大鼠电损伤坐骨神经的作用 被引量:1
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作者 杨晨 胡大海 +3 位作者 郑朝 白晓智 王耀军 汤朝武 《中华烧伤杂志》 CAS CSCD 北大核心 2015年第3期199-204,共6页
目的观察持续过表达胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)的脂肪源性间充质干细胞(ADSC)对大鼠坐骨神经电刺激损伤后肢体运功功能恢复和神经修复的影响。方法取5只SD大鼠制备过表达GDNF的ADSC。取150只大鼠按照随机数字表法分为正常对照... 目的观察持续过表达胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)的脂肪源性间充质干细胞(ADSC)对大鼠坐骨神经电刺激损伤后肢体运功功能恢复和神经修复的影响。方法取5只SD大鼠制备过表达GDNF的ADSC。取150只大鼠按照随机数字表法分为正常对照组、GDNF-ADSC组、ADSC组、GDNF组、生理盐水组5组,每组30只。正常对照组不作处理,进行常规饲养;GDNF-ADSC组、ADSC组、GDNF组、生理盐水组大鼠在右后肢大腿造成坐骨神经电损伤,伤后即刻向损伤神经表面分别局部注射100μL过表达GDNF的ADSC悬液(细胞浓度1×10 7个/mL)、ADSC细胞悬液(细胞浓度1×10 7个/mL)、GDNF溶液(100mg/L)、生理盐水。伤后第1—8周,每组取6只大鼠进行后肢步幅测量,并观察其伤后第8周的坐骨神经形态;伤后第4周,采用蛋白质印迹法检测各组剩余大鼠坐骨神经的GDNF蛋白表达量。对数据行单因素方差分析、重复测量方差分析、SNK检验。结果GDNF-ADSC组、ADSC组、GDNF组、生理盐水组大鼠在伤后各时相点后肢步幅均明显短于正常对照组(P值均小于0.05);GDNF—ADSC组大鼠在伤后第3—8周、ADSC组大鼠在伤后第3、5、7周、GDNF组大鼠在伤后第3、5、7、8周后肢步幅均明显长于生理盐水组(P值均小于0.05);伤后第4—8周,GDNF-ADSC组大鼠后肢步幅分别为(10.83±0.97)、(13.25±1.40)、(12.86±1.42)、(14.06±1.50)、(15.09±1.17)cm,明显长于ADSC组的(8.90±0.82)、(9.03±0.57)、(9.27±0.36)、(9.86±0.36)、(9.52±0.58)em。和GDNF组的(8.87±0.69)、(8.51±1.18)、(9.34±0.87)、(9.76±0.67)、(9.50±1.22)cm(P值均小于0.05)。伤后第8周,与正常对照组比较,生理盐水组大鼠坐骨神经有髓神经纤维数明显减少,GDNF—ADSC组、ADSC组、GDNF组有髓神经纤维数明显增 展开更多
关键词 烧伤 胶质细胞源性神经营养因子 干细胞 坐骨神经 慢病毒转染
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