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非洲猪瘟病毒沈阳分离株p30基因的克隆及其亲水区的原核表达
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作者 王永志 安鼎杰 +5 位作者 李小宇 李忠鹏 张静远 张守峰 扈荣良 赵玉民 《东北农业科学》 北大核心 2019年第1期40-43,共4页
2018年中国首次发生了非洲猪瘟疫情。本研究从来源于沈阳地区的1个非洲猪瘟病毒(African swine fever vi?rus, ASFV)分离株中克隆了p30基因(GenBank No. MK482370)。序列分析发现,该基因与安徽分离株相同(GenBank No.MK128995),而与已... 2018年中国首次发生了非洲猪瘟疫情。本研究从来源于沈阳地区的1个非洲猪瘟病毒(African swine fever vi?rus, ASFV)分离株中克隆了p30基因(GenBank No. MK482370)。序列分析发现,该基因与安徽分离株相同(GenBank No.MK128995),而与已报道的沈阳分离株SY-18株(GenBank No. MH766894)不同,新克隆的p30基因全长585 bp,编码194个氨基酸,而SY-18株p30基因全长606 bp,编码201个氨基酸。该结果提示,我国的ASFV存在基因变异或者传播来源复杂,流行病学分析应关注该基因,不同毒株的致病力有待深入研究。本研究利用pGEX-6p-1表达系统成功表达了p30基因的亲水区;通过Ni-NTA-琼脂糖亲和层析技术对重组蛋白进行纯化,获得了纯度较高的重组蛋白,为ASFV的血清学监测提供了抗原。 展开更多
关键词 非洲猪瘟 P30基因 原核表达
非洲猪瘟病毒p30基因的原核表达及间接ELISA抗体检测方法的建立 预览
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作者 吴竞 王西西 +2 位作者 吴映彤 任肖 郭晓宇 《中国畜牧兽医》 北大核心 2018年第12期3555-3562,共8页
为建立检测血清中非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)抗体的间接ELISA方法,本试验将ASFVp30基因进行原核表达,采用SDS-PAGE和Western blotting方法对重组蛋白进行表达鉴定和免疫原性分析,随后以纯化的重组蛋白为包被抗原,经... 为建立检测血清中非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)抗体的间接ELISA方法,本试验将ASFVp30基因进行原核表达,采用SDS-PAGE和Western blotting方法对重组蛋白进行表达鉴定和免疫原性分析,随后以纯化的重组蛋白为包被抗原,经条件优化、特异性试验、敏感性试验和重复性试验,建立一种血清中ASFV抗体的检测方法。结果显示,ASFVp30基因成功克隆到原核表达载体pET-32a(+)中,获得pET-32a-p30重组质粒;转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞进行诱导表达,得到P30重组蛋白,重组蛋白大小约为42ku,主要以包涵体形式存在;Western blotting结果显示,纯化后的蛋白具有良好的免疫原性;以纯化的P30重组蛋白为包被抗原,建立了检测ASFV抗体的间接ELISA方法,通过方阵试验对间接ELISA方法进行优化,最终确定了抗原最佳包被浓度为1.2μg/mL,待检血清最佳稀释倍数为1∶100,最佳封闭液为1%BSA,酶标抗体最佳稀释度为1∶4 000,以此建立的ASFV间接ELISA方法临界值为0.322。本方法仅与ASFV阳性血清发生特异性反应,与猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、口蹄疫病毒、伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型及猪流行性腹泻病毒阳性血清均无交叉反应,具有较强的特异性。该方法检测ASFV阳性血清灵敏度可达到1∶1 600;批内重复性和批间重复性变异系数均<10%。本试验建立的间接ELISA方法具有良好的特异性、灵敏度和重复性,可初步应用于ASFV抗体的检测。 展开更多
关键词 非洲猪瘟(ASFV) P30基因 原核表达 重组蛋白 间接ELISA
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绵羊肺炎支原体Y98标准株P30外膜蛋白与IFN-γ的融合表达及其免疫原性 被引量:2
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作者 张亚宁 刘文青 +2 位作者 赵红艳 张乐祎 赵宝华 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第6期843-848,共6页
以绵羊肺炎支原体(Mycoplasma oumvipneonia,MO)标准株Y98的P30外膜蛋白为抗原,同时以细胞因子IFN-γ为佐剂,将两者串联融合表达。小鼠免疫保护试验结果显示,P30重组蛋白的免疫保护率为60%,IFN-γ重组蛋白的免疫保护率为20%,P30-IFN-... 以绵羊肺炎支原体(Mycoplasma oumvipneonia,MO)标准株Y98的P30外膜蛋白为抗原,同时以细胞因子IFN-γ为佐剂,将两者串联融合表达。小鼠免疫保护试验结果显示,P30重组蛋白的免疫保护率为60%,IFN-γ重组蛋白的免疫保护率为20%,P30-IFN-γ重组蛋白的免疫保护率达到80%。间接ELISA试验证实,经100μL与200μL P30-IFN-γ重组蛋白免疫小鼠的血清中,P30抗体效价分别为1∶32 000与1∶64 000。以上结果证实,所制备的重组蛋白对小鼠实验个体基本安全,且P30-IFN-γ重组蛋白中的细胞因子IFN-γ组分可以调节机体免疫机能,增强P30蛋白的免疫保护效果。 展开更多
关键词 绵羊肺炎支原体 P30基因 IFN-Γ 融合蛋白
绵羊肺炎支原体Y98 P30基因的克隆、表达及免疫试验 被引量:5
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作者 赵红艳 刘文青 +3 位作者 车腾飞 卢金华 宋静岚 赵宝华 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第3期 397-400,405,共5页
根据猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp)跨膜蛋白P30基因序列设计引物,通过PCR克隆出绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae,MO)膜蛋白P30基因片段。通过对该序列的同源性分析表明MOP30基因与Mhp P30基因核苷酸序列同... 根据猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp)跨膜蛋白P30基因序列设计引物,通过PCR克隆出绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae,MO)膜蛋白P30基因片段。通过对该序列的同源性分析表明MOP30基因与Mhp P30基因核苷酸序列同源性为79%。抗原表位及跨膜结构预测的结果表明,MO P30基因与Mhp P30基因的抗原表位及跨膜结构均具有高度的一致性。该片段中含1个TGA编码Trp,而不是终止密码子。将P30基因与原核表达载体pET-28a连接构建pET-28a-P30表达质粒,转化受体菌Rossta得到重组菌株Rossta(pET-28a-P30)。经诱导后SDS-PAGE表明有30 000左右的目的条带出现;Western blot表明Rossta(pET-28a-P30)表达的30 000蛋白主要以包涵体的形式存在;小鼠免疫试验表明Rossta(pET-28a-P30)原核表达的蛋白对小鼠具有一定的保护作用。 展开更多
关键词 绵羊肺炎支原体Y98 P30基因 基因表达 免疫动物
隐孢子虫Gal/GalNAc特异性凝集素p30原核表达系统的构建及鉴定 预览
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作者 黄慧聪 赵巧莲 +1 位作者 谭峰 潘长旺 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第2期 134-139,共6页
目的获取隐孢子虫Gal/GalNAc特异性凝集素p30基因,并构建原核表达系统,获得相应的重组蛋白。方法采用聚合酶链反应(PCR)技术,从微小隐孢子虫基因组中扩增出p30基因,然后将其克隆入pMD18-T载体,转化后挑取阳性克隆进行酶切和测... 目的获取隐孢子虫Gal/GalNAc特异性凝集素p30基因,并构建原核表达系统,获得相应的重组蛋白。方法采用聚合酶链反应(PCR)技术,从微小隐孢子虫基因组中扩增出p30基因,然后将其克隆入pMD18-T载体,转化后挑取阳性克隆进行酶切和测序鉴定,并进行生物信息学分析及预测。再将亚克隆与表达载体PET-28a(+)分别酶切并连接,经IPTG诱导表达,表达产物用Ni—NTA亲和层析法纯化,SDS—PAGE和Western blotting检测表达效果。结果PCR扩增得到特异的微小隐孢子虫Gal/GalNAc特异性凝集素p30基因,测得的核苷酸序列及其推导的氨基酸序列与GenBank上提交的序列同源性分别为98%~100%和99%~100%,理论等电点和分子量分别为6.4854和31842Da,并存在9个潜在的抗原表位。经酶切、测序结果表明质粒已导入Rosetta。SDS—PAGE和Western blotting证实重组菌成功表达融合蛋白。结论成功构建微小隐孢子虫Gal/GalNAc特异性凝集素p30原核表达系统。 展开更多
关键词 隐孢子虫 P30基因 克隆 原核表达
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弓形虫半巢式PCR检测方法的建立 预览 被引量:15
6
作者 孔得翔 王素华 +2 位作者 曲道峰 蔡渭明 杜爱芳 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第1期 52-54,62,共4页
根据GenBank上公布的弓形虫RH株的P30基因(X14080)设计了3条特异性引物P1、P2和P3,建立了半巢式PCR检测体系,并将P1和P3的扩增产物克隆到pUCm-T载体上进行测序。结果表明,该体系能够扩增出约250bp的片段,P1和P3能扩增出约500bp的... 根据GenBank上公布的弓形虫RH株的P30基因(X14080)设计了3条特异性引物P1、P2和P3,建立了半巢式PCR检测体系,并将P1和P3的扩增产物克隆到pUCm-T载体上进行测序。结果表明,该体系能够扩增出约250bp的片段,P1和P3能扩增出约500bp的片段,克隆到pUCm—T载体上的504bp片段与P30基因(X14080)的序列同源性为99.8%。该PCR检测体系特异性强,在健康猪血液、猪链球菌、多杀性巴氏杆菌、胸膜肺炎放线杆菌和猪圆环病毒DNA上未扩增出条带;敏感性高,最低检测为18培。该检测体系的成功构建为猪弓形虫的检测和流行病学调查提供了有力的技术支持。 展开更多
关键词 猪弓形虫病 P30基因 半巢式PCR 克隆
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隐孢子虫Ga1/Ga1NAc特异性凝集素P30基因的克隆及生物信息学分析 被引量:1
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作者 赵巧莲 黄慧聪 +2 位作者 潘长旺 梁韶晖 南存标 《中国病原生物学杂志》 CSCD 2009年第6期439-443,共5页
目的克隆隐孢子虫Ga1/Ga1NAc特异性凝集素P30基因并测序,对其进行生物信息学分析。方法采用聚合酶链(PCR)技术,从微小隐孢子虫基因组中扩增P30基因,然后将其克隆入pMD18-T载体,转化后挑取阳性克隆进行酶切和测序鉴定,并对获得的... 目的克隆隐孢子虫Ga1/Ga1NAc特异性凝集素P30基因并测序,对其进行生物信息学分析。方法采用聚合酶链(PCR)技术,从微小隐孢子虫基因组中扩增P30基因,然后将其克隆入pMD18-T载体,转化后挑取阳性克隆进行酶切和测序鉴定,并对获得的P30基因进行生物信息学分析。结果PCR扩增得到特异的微小隐孢子虫P30基因,测得的核苷酸序列及其推导的氨基酸序列与GenBank上提交的序列同源性分别为98%-100%和99%-100%。结论成功克隆出序列正确的微小隐孢子虫P30基因,预测的P30蛋白具有9个潜在的抗原表位,为其相关研究奠定了基础。 展开更多
关键词 隐孢子虫 P30基因 克隆 生物信息学分析
刚地弓形虫NT株P30基因的克隆与表达 预览 被引量:2
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作者 张理航 刘茂军 +4 位作者 吕芳 李贺侠 吴叙苏 冯志新 邵国青 《江苏农业学报》 CSCD 北大核心 2009年第1期 147-150,共4页
参考Genbank登录的刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)P30全基因序列,设计合成1对引物,通过PCR在刚地弓形虫的基因组DNA中扩增出P30基因片段,然后构建重组表达质粒pET-32a(+)/P30,用IPTG诱导,在表达菌BL21(DE3)表达出分子量为4... 参考Genbank登录的刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)P30全基因序列,设计合成1对引物,通过PCR在刚地弓形虫的基因组DNA中扩增出P30基因片段,然后构建重组表达质粒pET-32a(+)/P30,用IPTG诱导,在表达菌BL21(DE3)表达出分子量为4.83×10。的融合蛋白,经Western-blotting鉴定目的蛋白具有良好的免疫学活性,为刚地弓形虫疫苗的制备及猪弓形虫抗体ELISA检测方法的建立奠定了基础。 展开更多
关键词 刚地弓形虫 P30基因 克隆 表达
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弓形虫P30基因的克隆及其在E.coli中的融合表达 预览 被引量:1
9
作者 王素华 曲道峰 +1 位作者 蔡渭明 杜爱芳 《检验检疫科学》 2008年第4期8-10,共3页
【目的】研究弓形虫P30基因的克隆及其在E.coli中的融合表达。【方法】参照弓形虫P30序列设计引物,应用PCR技术扩增出弓形虫RH株P30的部分基因,将扩增产物克隆到pUCm—T载体,测序正确后再亚克隆到质粒pET-30a中,得到重组质粒pET-30... 【目的】研究弓形虫P30基因的克隆及其在E.coli中的融合表达。【方法】参照弓形虫P30序列设计引物,应用PCR技术扩增出弓形虫RH株P30的部分基因,将扩增产物克隆到pUCm—T载体,测序正确后再亚克隆到质粒pET-30a中,得到重组质粒pET-30a—P30并将其转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE和Westen-blot分析。【结果】P30基因在E.coli中得到了高效表达,表达的融合蛋白的分子量在30kDa附近,可以被鼠抗Toxoplasma gondii阳性血清特异性识别。【结论】该研究为Toxoplasma gondii的检测和疫苗研制及综合防制奠定了基础。 展开更多
关键词 弓形虫 P30基因 基因克隆 原核表达
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弓形虫半巢式PCR检测方法的建立 预览 被引量:2
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作者 王素华 《检验检疫科学》 2008年第1期6-8,共3页
根据GenBank上公布的弓形虫RH株的P30基因(X14080)设计了3条特异性引物P1、P2和P3,建立了半巢式PCR检测体系,并将P1和P3的扩增产物克隆到pUCm-T载体上进行测序。结果表明,该体系能够扩增出约250bp的片段,P1和P3能扩增出约500bp的片段... 根据GenBank上公布的弓形虫RH株的P30基因(X14080)设计了3条特异性引物P1、P2和P3,建立了半巢式PCR检测体系,并将P1和P3的扩增产物克隆到pUCm-T载体上进行测序。结果表明,该体系能够扩增出约250bp的片段,P1和P3能扩增出约500bp的片段,克隆到pUCm-T载体上的504bp片段与P30基因(X14080)的序列同源性为99.8%。该PCR检测体系的特异性强,不能在健康猪血液、猪链球菌、多杀性巴氏杆菌、胸膜肺炎放线杆菌和猪圆环病毒DNA上扩增出条带;敏感性高,最低检测的DNA含量为18fg。 展开更多
关键词 猪弓形虫病 P30基因 半巢式PCR 克隆
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编码刚地弓形虫棒状体蛋白2与主要表面抗原1基因的克隆和表达 预览
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作者 张佃波 高红刚 +6 位作者 崔勇 魏庆宽 宰德富 李瑾 柏雪莲 赵立江 刘克义 《中国病原生物学杂志》 CSCD 2006年第3期 202-206,共5页
目的 构建编码弓形虫RH株棒状体蛋白2(ROP2)和主要表面抗原1的重组表达质粒,纯化和复性的融合蛋白为弓形虫病快速诊断试剂盒及蛋白质疫苗的研制作准备。方法 用PCR技术从弓形虫基因组DNA中扩增出ROP2和P30基因片段,分别克隆人pMDl8-... 目的 构建编码弓形虫RH株棒状体蛋白2(ROP2)和主要表面抗原1的重组表达质粒,纯化和复性的融合蛋白为弓形虫病快速诊断试剂盒及蛋白质疫苗的研制作准备。方法 用PCR技术从弓形虫基因组DNA中扩增出ROP2和P30基因片段,分别克隆人pMDl8-T载体,并对重组人外源基因的质粒通过PCR、双酶切和测序鉴定,将pMD-ROP2中RoP2基因片段经EcoRI和HindⅢ酶切、连接等反应,亚克隆入pET-30a(+)原核表达载体,构建pET-ROP2载体,然后再将pMD-P30中的P30基因片段与经同样NcoI和EcoRI酶切的pET-30a(+)载体连接,经含卡那霉素的LB平板筛选,酶切和PCR鉴定。阳性重组质粒转化到大肠埃希菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导,表达产物用SDS-PAGE进行鉴定。大量的表达融合蛋白经纯化和复性后,用Westernblot分析。结果 从弓形虫RH株DNA中扩增出特异的RoP2和P30基因片段,成功克隆出pET-ROP2和pET-P30载体。结论 成功构建了pET-ROP2和pET-P30重组体,获得纯化和复性的弓形虫ROP2和P30的高效表达产物,为弓形虫病的诊断和疫苗研究奠定了基础。 展开更多
关键词 刚地弓形虫 P30基因 ROP2基因 融合蛋白纯化 WESTERN BLOT
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编码弓形虫表面抗原P30、P22复合基因真核表达载体的构建 预览
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作者 郭岚 古钦民 +4 位作者 李瑛 周怀瑜 赵群力 丛华 何深一 《中国寄生虫病防治杂志》 CSCD 2005年第1期 8-11,共4页
目的构建编码弓形虫RH株表面抗原P30、P22复合基因的真核表达重组质粒, 为进一步表达融合蛋白及研制核酸疫苗做准备. 方法用弓形虫RH株腹腔接种小鼠,收集腹水,酚/氯仿法抽提弓形虫基因组DNA;用PCR技术从基因组DNA中扩增编码表面抗原P30... 目的构建编码弓形虫RH株表面抗原P30、P22复合基因的真核表达重组质粒, 为进一步表达融合蛋白及研制核酸疫苗做准备. 方法用弓形虫RH株腹腔接种小鼠,收集腹水,酚/氯仿法抽提弓形虫基因组DNA;用PCR技术从基因组DNA中扩增编码表面抗原P30、P22的基因片段,分别重组入pMD18-T载体中.将pMD18-T载体中的P30、P22基因片段分别酶切,定向克隆入pUC18克隆载体中, pUC18-P30-P22中的P30-P22片段经酶切、纯化后,亚克隆入pcDNA3.1(-)真核表达载体,用酶切、PCR及测序的方法对重组子进行鉴定. 结果从弓形虫RH株基因组DNA中扩增出特异的P30及P22片段;大小均与预测值相符;克隆pUC18-P30-P22重组质粒的酶切片段分别与P30、P22基因大小一致;经亚克隆、筛选鉴定获得了pcDNA3.1-P30-P22重组质粒,所测P30、P22基因序列与文献报道一致.结论成功构建弓形虫pUC18-P30-P22重组质粒和pcDNA3.1-P30-P22重组质粒,为研制弓形虫DNA疫苗奠定了基础. 展开更多
关键词 弓形虫属 P30基因 P22基因 克隆
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刚地弓形虫P30(SAG1)重组抗原的高效表达和体外纯化 预览
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作者 张佃波 宰德富 +5 位作者 公茂庆 李瑾 魏庆宽 崔勇 黄炳成 刘克义 《中国人兽共患病杂志》 CSCD 北大核心 2005年第12期 1089-1093,共5页
目的表达和纯化弓形虫P30(SAG1)蛋白,为弓形虫病快速诊断试剂盒及蛋白质疫苗的研制奠定基础.方法 PCR法从弓形虫基因组DNA 中扩增 P30基因片段,P30产物克隆到表达质粒pET-30a(+) 构建重组载体,将其转化到DH5α中.经PCR扩增和质粒酶切及... 目的表达和纯化弓形虫P30(SAG1)蛋白,为弓形虫病快速诊断试剂盒及蛋白质疫苗的研制奠定基础.方法 PCR法从弓形虫基因组DNA 中扩增 P30基因片段,P30产物克隆到表达质粒pET-30a(+) 构建重组载体,将其转化到DH5α中.经PCR扩增和质粒酶切及基因测序鉴定后,阳性重组质粒转化到大肠埃氏菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导,表达产物用SDS-PAGE和Western blot进行鉴定.大量的诱导表达产物用SNBC 3S NTA Resin方法纯化并进行复性.结果扩增的P30基因片段为750bp, 重组表达融合蛋白量单位为30ku,与理论值相符.结论成功构建重组体,获得纯化和复性的弓形虫主要表面抗原P30的高效表达产物,为弓形虫病的诊断和疫苗研究奠定了基础. 展开更多
关键词 刚地弓形虫 P30基因 融合蛋白纯化
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刚地弓形虫P30(SAGl)基因的克隆与表达 预览 被引量:7
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作者 张佃波 公茂庆 +3 位作者 魏庆宽 李谨 黄炳成 刘克义 《中国寄生虫病防治杂志》 CSCD 2005年第2期 92-95,共4页
目的 构建弓形虫P30基因表达载体并获得重组表达蛋白。方法 将弓形虫P30基因的开读框用PCR扩增,NcoⅠ和Hind Ⅲ酶切后,与同样酶切的表达质粒pET-30a(+)经T4连接酶连接,然后转化到DH5a中。菌液经PCR扩增和质粒酶切及基因测序鉴定后,... 目的 构建弓形虫P30基因表达载体并获得重组表达蛋白。方法 将弓形虫P30基因的开读框用PCR扩增,NcoⅠ和Hind Ⅲ酶切后,与同样酶切的表达质粒pET-30a(+)经T4连接酶连接,然后转化到DH5a中。菌液经PCR扩增和质粒酶切及基因测序鉴定后,将阳性重组质粒转化到大肠埃希菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导,表达产物用SDSPAGE和Western blot进行鉴定。结果 扩增的P30基因片段为750bp,重组质粒诱导表达产物分子质量单位为30ku,与理论值相符。Western blot确认重组质粒表达蛋白与小鼠抗弓形虫单克隆抗体(P30McAb)发生特异性反应。结论 成功构建重组体并获得弓形虫主要表面抗原P30的高效表达产物,为弓形虫病的诊断和疫苗研究奠定了基础。 展开更多
关键词 刚地弓形虫 P30基因 蛋白表达
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编码弓形虫表面抗原P30基因的克隆及在E.coli中的表达 预览
15
作者 占国清 吴少庭 +3 位作者 李国光 高世同 林敏 郑春福 《中国人兽共患病杂志》 CAS CSCD 北大核心 2003年第3期 31-33,共3页
目的构建编码弓形虫RH株表面抗原P30基因重组表达质粒,初步观察P30基因在E.coli表达.方法将P30基因定向克隆到分支杆菌-大肠杆菌穿梭表达质粒热休克蛋白70(hsp70)起动基因的下游的多克隆位点,构建重组表达质粒pBCG-P30;采用亚克隆技术,... 目的构建编码弓形虫RH株表面抗原P30基因重组表达质粒,初步观察P30基因在E.coli表达.方法将P30基因定向克隆到分支杆菌-大肠杆菌穿梭表达质粒热休克蛋白70(hsp70)起动基因的下游的多克隆位点,构建重组表达质粒pBCG-P30;采用亚克隆技术,将含P30和hsp70起动基因的复合片段,插入表达载体pBK-CMV质粒,转化大肠杆菌DH5a,在卡那霉素阳性LB培养基平板筛选阳性重组子,并经双酶切及PCR扩增鉴定.重组质粒pBK-P30转化大肠杆菌,IPTG诱导表达后进行SDS-PAGE和Western boltting分析.结果1)阳性重组质粒pBCG-P30、pBK-P30经酶切和PCR鉴定,与预期的结果相符合.2)序列测定证实克隆的基因为编码P30抗原的基因.3)P30基因在大肠杆菌诱导表达后获得45kDa融合蛋白,此抗原未被弓形虫高免兔血清识别.结论成功构建编码弓形虫表面抗原P30重组表达质粒,并在大肠杆菌中获得表达,为弓形虫DNA疫苗的研制奠定基础. 展开更多
关键词 编码弓形虫 表面抗原 P30基因 克隆 E.COLI 表达 基因重组 弓形虫
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含有弓形虫表面抗原P22、P30复合基因的载体构建 预览 被引量:1
16
作者 王伟 古钦民 《中国人兽共患病杂志》 CSCD 北大核心 2002年第6期 43-45,共3页
目的 选择弓形虫表面抗原P22,P30的有效基因片段,共同构建在同一克隆载体pUC19和表达载体pGE-MEX^TM-1上,并保证其连接方向及开放6读码框的正确。方法 根据已发表P30基因序列,用PCR技术调取所需基因片段,P22基因片段来自重组质粒pG... 目的 选择弓形虫表面抗原P22,P30的有效基因片段,共同构建在同一克隆载体pUC19和表达载体pGE-MEX^TM-1上,并保证其连接方向及开放6读码框的正确。方法 根据已发表P30基因序列,用PCR技术调取所需基因片段,P22基因片段来自重组质粒pGEX-2T-v22,将两片段定向克隆于克隆载体pUC19及表达质粒pGEMEX^TM-1上,用酶切及测序的方法对重组子进行鉴定。结果 酶切产物经电泳显示条带清晰,P22,P30基因片段的泳动位置分别在446bp和860bp的位置,与预计结果一致;测序结果表明插入的复合基因片段方向及序列均正确。结论 成功构建的含有P22,P30基因片段的质粒重组体,保证了两基因连接方向,序列及开放读码框的正确,为今后两基因的进一步复合表达研究奠定了基础。 展开更多
关键词 弓形虫 P30基因 P22基因 克隆 疫苗
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弓形虫P30基因非融合蛋白表达的研究 预览 被引量:3
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作者 丛华 古钦民 +3 位作者 周怀瑜 赵群利 何深一 李瑛 《山东医科大学学报》 2001年第6期 497-499,共3页
目的:构建弓形虫主要表面抗原P30基因的原核表达载体并在E.coli中进行表达.方法:采用定向克隆的方法,将PCR扩增得到的P30片段,插入原核表达质粒pBV220上,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,于氨苄LB培养平板上筛选阳性克隆,经过酶切及PCR扩... 目的:构建弓形虫主要表面抗原P30基因的原核表达载体并在E.coli中进行表达.方法:采用定向克隆的方法,将PCR扩增得到的P30片段,插入原核表达质粒pBV220上,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,于氨苄LB培养平板上筛选阳性克隆,经过酶切及PCR扩增鉴定重组子.将含阳性重组子pBV220-P30的工程菌经温度诱导表达,SDS-PAGE电泳及免疫印迹分析.结果:成功构建了pBV2200-P300重组质粒;SDS-PAGE电泳及Western-blot显示表达P30非融合蛋白的分子量为29kD,且能被弓形虫高免鼠血清识别.结论:从弓形虫基因组DNA中获取P30基因,并成功构建了pBV220-P30重组质粒,诱导表达了P30非融合蛋白.对弓形虫病基因疫苗研制奠定了基础. 展开更多
关键词 弓形虫属 P30基因 基因表达
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截短的弓形虫P30基因在E.coli中的高效表达及纯化条件的探索 预览 被引量:13
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作者 龚娅 陈晓光 杨培梁 《中国人兽共患病杂志》 CSCD 北大核心 2001年第2期 14-18,共5页
目的构建能在E.coli中高效表达的弓形虫主要表面抗原(P30)基因的重组表达质粒,并对纯化条件进行优化。方法 对已知的弓形虫P30基因序列进行部分取舍,用PCR技术从弓形虫ZS1株的基因组DNA中扩增出截短的P30基因片段,插入载体pET-30(a... 目的构建能在E.coli中高效表达的弓形虫主要表面抗原(P30)基因的重组表达质粒,并对纯化条件进行优化。方法 对已知的弓形虫P30基因序列进行部分取舍,用PCR技术从弓形虫ZS1株的基因组DNA中扩增出截短的P30基因片段,插入载体pET-30(a)中,转化大肠杆菌DH5 α,IPTG诱导表达,包涵体经洗涤、变性、复性及不同程度的浓缩后,进行SDSPAGE及免疫印迹分析。结果从弓形虫ZS1株基因组DNA中扩增出截短的P30基因片段,成功构建重组表达质粒pETP30;SDS-PAGE显示蛋白表达带的分子量约为31kD,表达量占菌体总蛋白的31.58%,经1M及2M尿素洗涤后,其纯度分别达63.42%及75.74%;免疫印迹显示,该纯化蛋白能被弓形虫病人阳性血清所识别,而且当浓缩至初始体积的1/3~1/6时,纯化蛋白与DNA免疫鼠血清的反应最强。结论成功构建重组质粒pET-P30,并以融合蛋白的形式进行了高效表达,经变性、复性后,该蛋白具有特异的免疫反应性,为弓形虫诊断试剂盒的研制打下基础。 展开更多
关键词 弓形虫 P30基因 蛋白表达 E.COLI 纯化
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弓形虫P30基因MBP融合蛋白的表达 预览 被引量:5
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作者 丛华 古钦民 《中国人兽共患病杂志》 CSCD 北大核心 2000年第1期 29-31,共3页
目的 构建弓形虫主要表面抗原P30基因的原核表达载体并在E.coli中表达。方法根据已发表的弓形虫P30基因序列,自行设计合成一对引物并在此物5‘端分别引入限制性内切酶EcoRI、SaⅡ酶切位点,用PCR技术从弓形虫... 目的 构建弓形虫主要表面抗原P30基因的原核表达载体并在E.coli中表达。方法根据已发表的弓形虫P30基因序列,自行设计合成一对引物并在此物5‘端分别引入限制性内切酶EcoRI、SaⅡ酶切位点,用PCR技术从弓形虫RH株基因组DNA中扩增P30基因片段,插管PMALP2质粒转化大肠杆菌DH5aα感受态细胞,干氨苄LB2平板上筛选阳性克隆,经过酶切及PCR扩增鉴定重组子。将阳性重组经IPTG诱导表 展开更多
关键词 弓形虫 P30基因 融合蛋白 基因表达 MBP
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弓形虫P30基因原核表达载体的构建 预览
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作者 丛华 赵跃然 《中国寄生虫病防治杂志》 CSCD 2000年第3期 172-174,共3页
为获取具有生物学活性的弓形虫P30蛋白,采用定向克隆的方法,自行设计引物通过PCR扩增得到P30基因片段,用EcoRI和SalI双酶切后,连接到同样酸切的原核表达载体(pBV220和pMALP2)上,转化大肠杆菌DH... 为获取具有生物学活性的弓形虫P30蛋白,采用定向克隆的方法,自行设计引物通过PCR扩增得到P30基因片段,用EcoRI和SalI双酶切后,连接到同样酸切的原核表达载体(pBV220和pMALP2)上,转化大肠杆菌DH5α,分别得到含重组闰pBV220-P30和pMALP2-P30的工程菌,扩菌提取质粒经过酶切分析和PCR扩增鉴定后,证实P30基因的两个原核表达载体构建成功,为其在原核系统中的表达作 展开更多
关键词 弓形体 P30基因 克隆
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