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双抗夹心ELISA快速检测冷鲜肉中福氏志贺氏菌2a
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作者 王怡雯 张帅 +4 位作者 张红星 齐颖颖 谢远红 刘慧 鲁舟 《中国食品学报》 EI CAS CSCD 北大核心 2019年第2期230-235,共6页
为建立冷鲜肉中福氏志贺氏菌2a双抗夹心ELISA检测体系,采用福氏志贺氏菌2a抗原免疫获得多克隆抗体,应用杂交瘤技术进行细胞融合,筛选出1株福氏志贺氏菌2a单克隆抗体杂交瘤细胞株,命名为2C10。试验结果表明,2C10杂交瘤细胞株抗体效价为1... 为建立冷鲜肉中福氏志贺氏菌2a双抗夹心ELISA检测体系,采用福氏志贺氏菌2a抗原免疫获得多克隆抗体,应用杂交瘤技术进行细胞融合,筛选出1株福氏志贺氏菌2a单克隆抗体杂交瘤细胞株,命名为2C10。试验结果表明,2C10杂交瘤细胞株抗体效价为1∶10.24×104,抗体纯度为96%,免疫球蛋白亚型为IgG2a。用此单克隆抗体作为检测抗体,多克隆抗体为捕捉抗体,建立双抗夹心ELISA体系,检测限为1 000 CFU/g。用此体系检测宋内志贺氏菌、大肠杆菌O157:H7、沙门氏菌、单增李斯特菌、枯草芽孢杆菌及阪崎肠杆菌,均无交叉反应。本研究可为冷鲜肉中福氏志贺氏菌2a的检测提供一种特异性强,准确度高的ELISA检测方法。 展开更多
关键词 福氏志贺氏菌2a 双抗夹心ELISA 单克隆抗体 多克隆抗体
人 NGAL 克隆表达及抗体的制备与鉴定
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作者 王石磊 靳鑫 +4 位作者 魏杰 张祥 阳媛 牛司强 汪德强 《重庆医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第5期555-560,共6页
目的:高效表达人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(neutrophil gelatinase-associated lipocalin,NGAL)重组蛋白并制备其多克隆及单克隆抗体。方法:人工合成经密码子优化的 NGAL 基因,构建原核表达重组质粒 pW28-NGAL,IPTG 诱导表达后... 目的:高效表达人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(neutrophil gelatinase-associated lipocalin,NGAL)重组蛋白并制备其多克隆及单克隆抗体。方法:人工合成经密码子优化的 NGAL 基因,构建原核表达重组质粒 pW28-NGAL,IPTG 诱导表达后分离纯化并分析在溶液中的聚集状态;获得的 rhNGAL 抗原免疫兔子制备多克隆抗体,免疫小鼠筛选高效价的特异性单克隆抗体并鉴定抗体亚型;Protein G 亲合柱纯化,等温滴定量热法及非竞争 ELISA 法检测抗体的亲和力,SDS-PAGE 分析纯度;最后运用 Western blot、免疫荧光和免疫组化对抗体进行鉴定。结果:高效获得高纯度 NGAL 重组蛋白,主要以单体形式存在;成功制备兔多抗,同时筛选获得 6 株高效价单克隆抗体;其中,25 号单抗为 IgG1 亚型,余者均属 IgG2a 亚型,且 19、35 号单抗的亲和常数分别为 3.06×10^9、2.14×10^9。SDS-PAGE 分析表明纯度均大于 90%。进一步的鉴定结果表明制备的抗体皆具有良好免疫反应性及特异性,且单抗的特异性明显高于多抗。结论:本研究利用密码子优化技术高效表达制备了 NGAL 重组蛋白,获得了其高效价多克隆抗体和高特异性单克隆抗体,为 NGAL 的病理生理作用等功能研究提供了良好的实验材料,为NGAL临床免疫检测诊断试剂的国产化奠定了有力的基础。 展开更多
关键词 密码子优化 中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白 多克隆抗体 单克隆抗体
草鱼干扰素3蛋白多克隆抗体制备及其应用 预览
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作者 范成坚 苏博洋 苏建国 《淡水渔业》 CSCD 北大核心 2019年第1期9-13,共5页
为探讨干扰素3(Interferon3,IFN3)在抗病毒免疫应答中的作用,以草鱼(Ctenopharyngodon idella)巨噬细胞cDNA为模板,PCR扩增IFN3成熟肽基因序列,制备草鱼IFN3蛋白的多克隆抗体,同时研究了IFN3在草鱼不同免疫组织中的蛋白表达,以及草鱼呼... 为探讨干扰素3(Interferon3,IFN3)在抗病毒免疫应答中的作用,以草鱼(Ctenopharyngodon idella)巨噬细胞cDNA为模板,PCR扩增IFN3成熟肽基因序列,制备草鱼IFN3蛋白的多克隆抗体,同时研究了IFN3在草鱼不同免疫组织中的蛋白表达,以及草鱼呼肠孤病毒(grass carp reovirus,GCRV)感染草鱼肾细胞系(Ctenopharyngodon idella kidney,CIK)后不同时间点的表达。结果显示,细菌表达的重组IFN3大小约为45kD,主要以包涵体形式存在;抗体效价约为1∶3200,制备的多克隆抗体既能识别原核表达的重组蛋白,也能识别个体水平上和细胞水平上的内源蛋白。草鱼主要免疫组织中,肝胰腺和皮肤检测到相应条带。CIK细胞感染病毒后12h开始检测到IFN3蛋白,随感染时间的延长,IFN3蛋白表达量有所增加。蛋白水平上检测IFN3的表达,为深入研究草鱼的抗病毒免疫机制奠定了基础。 展开更多
关键词 草鱼(Ctenopharyngodon idella) 干扰素3 多克隆抗体 抗体效价 蛋白表达
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重组UK114融合蛋白的表达纯化及免疫组化定位 预览
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作者 尹淑琴 范艳 +2 位作者 朱宏 梁娟 常泓 《山西农业大学学报:自然科学版》 CAS 北大核心 2019年第3期95-100,共6页
[目的]UK114(山羊肝脏肿瘤抗原)是钙蛋白酶系统的主要成分钙蛋白酶ⅠCAPN1/S1(μ-calpain)的激活蛋白,本研究旨在利用原核表达系统体外制备重组UK114蛋白,获得融合蛋白制备抗体,对其进行组织定位,为深入研究其功能提供蛋白水平的证据。... [目的]UK114(山羊肝脏肿瘤抗原)是钙蛋白酶系统的主要成分钙蛋白酶ⅠCAPN1/S1(μ-calpain)的激活蛋白,本研究旨在利用原核表达系统体外制备重组UK114蛋白,获得融合蛋白制备抗体,对其进行组织定位,为深入研究其功能提供蛋白水平的证据。[方法]将重组质粒pGEX-4T-3-UK114转化入大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达、纯化,用凝血酶对GST-UK114融合蛋白进行酶切,制备抗UK114多克隆抗体,免疫组化分析重组UK114蛋白在组织中的分布情况。[结果]GST-UK114融合蛋白的分子量为40kD,酶切得到目标蛋白,其分子量为14kD;用UK114蛋白免疫家兔,得到了理想的高效价兔抗UK114多克隆抗血清,效价大于1∶125000,抗血清经纯化得到兔抗UK114多克隆抗体,效价大于1∶25000;Western blot分析结果显示,GST-UK114融合蛋白在约40kD处有一明显条带,融合蛋白酶切后在14kD附近出现一条带;免疫组织化学分析表明,免疫组化染色主要发生在细胞质中,山羊肝脏组织中肝小叶边缘区有肝细胞出现棕色的阳性着色,部分肝窦内皮细胞也有棕色的阳性着色。肾脏皮质中的肾小管上皮细胞有棕色的阳性着色出现,肾小球中没有出现着色。[结论]试验成功获得纯化后的重组UK114蛋白,制备的抗UK114抗体可以与正常山羊肝脏和肾脏组织中的UK114蛋白结合,为其后续分子伴侣特性以及抗肿瘤特性的研究提供一定的蛋白试验依据。 展开更多
关键词 重组UK114 多克隆抗体 蛋白免疫印迹 免疫组织化学定位
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弓形虫沉默信号调节子2(TgSir2)的克隆表达与多克隆抗体制备 预览
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作者 张芳菲 曹佳欣 +5 位作者 王晨红 毛懿杰 华倩倩 刘淑贤 谭峰 胡昕 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第2期120-125,137共7页
目的制备特异识别弓形虫沉默信号调节子2(TgSir2)多克隆抗体。方法以酵母Sir2氨基酸序列为模板,寻找弓形虫基因组中同源序列,并进行信号肽预测。以弓形虫RH株cDNA为模板,构建pET28b-TgSir2重组质粒,转化入大肠埃希菌(E.coli)BL21,经异丙... 目的制备特异识别弓形虫沉默信号调节子2(TgSir2)多克隆抗体。方法以酵母Sir2氨基酸序列为模板,寻找弓形虫基因组中同源序列,并进行信号肽预测。以弓形虫RH株cDNA为模板,构建pET28b-TgSir2重组质粒,转化入大肠埃希菌(E.coli)BL21,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达后,用镍柱亲和层析法纯化诱导表达产物,并以小鼠抗His标签单克隆抗体作为一抗,蛋白质印迹(Western blotting)进行鉴定。以纯化的TgSir2蛋白作为抗原免疫新西兰大白兔,获得特异性抗TgSir2多克隆抗体。最后,以此多克隆抗体作为一抗,Western blotting检测与虫体蛋白的反应情况。结果同源比对找到弓形虫基因组中TgSir2,信号肽分析提示1-15位氨基酸为其信号肽序列。PCR、双酶切及测序结果证实原核表达质粒构建成功。SDS-PAGE结果表明,IPTG可诱导TgSir2融合蛋白的大量表达。Western blotting结果显示,制备的多克隆抗体既能特异性识别原核表达的TgSir2蛋白,也能识别弓形虫体内的内源性TgSir2蛋白。结论制备的抗重组TgSir2蛋白多克隆抗体能特异性识别弓形虫RH株的TgSir2蛋白。 展开更多
关键词 刚地弓形虫 沉默信号调节子2 蛋白翻译后修饰 组蛋白去乙酰化酶 多克隆抗体
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青霉素类抗生素广谱性酶联免疫分析方法的建立 预览
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作者 刘伟怡 刘凤银 +4 位作者 江海超 王宇 刘佳 邹红丽 穆洪涛 《生物化工》 2019年第1期52-55,59共5页
为了建立青霉素类抗生素广谱性酶联免疫分析方法,本文通过活泼酯法将青霉素G(PEN)合成人工抗原PEN-BSA和PEN-OVA,将PEN-BSA免疫新西兰大白兔获得多克隆抗体,研究了同源包被与异源包被模式及ELISA各影响因素对检测灵敏度的影响,并考察了... 为了建立青霉素类抗生素广谱性酶联免疫分析方法,本文通过活泼酯法将青霉素G(PEN)合成人工抗原PEN-BSA和PEN-OVA,将PEN-BSA免疫新西兰大白兔获得多克隆抗体,研究了同源包被与异源包被模式及ELISA各影响因素对检测灵敏度的影响,并考察了此方法对测定牛奶中青霉素类抗生素残留的适用性。结果表明:制备的PEN多克隆抗体效价高达10^-5,测定8种青霉素类抗生素几乎无交叉反应,以CAR-OVA为异源包被原具有较高的灵敏性,最低可检测浓度为2.22μg/mL,检测限为0.14μg/mL。以1、10、100μg/mL作为加标浓度,添加回收率范围为74.0%~106.3%,变异系数小于0.21%。 展开更多
关键词 青霉素类抗生素 广谱性 多克隆抗体 异源包被 ELISA
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重组铜绿假单胞菌外膜蛋白D的原核表达与多克隆抗体制备研究 预览
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作者 伍娜娜 荣娜 +5 位作者 康超 刘祥 陈琛 陈春琳 马心怡 吴三桥 《河北农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第1期99-105,共7页
为获得铜绿假单胞菌外膜蛋白OprD并研究其分子功能。本研究采用分子克隆构建OprD蛋白重组表达菌株,用正交试验设计方法获得OprD菌株的最优表达条件和培养条件,通过SDS-PAGE切胶的方法纯化OprD蛋白,小鼠免疫制备OprD多克隆抗血清,蛋白质... 为获得铜绿假单胞菌外膜蛋白OprD并研究其分子功能。本研究采用分子克隆构建OprD蛋白重组表达菌株,用正交试验设计方法获得OprD菌株的最优表达条件和培养条件,通过SDS-PAGE切胶的方法纯化OprD蛋白,小鼠免疫制备OprD多克隆抗血清,蛋白质印迹法检测抗血清的特异性。使用DNAMan和MEGA软件对OprD蛋白进行同源性和系统发生分析。结果表明,OprD重组载体双酶切、DNA测序鉴定结果、OprD蛋白表达与纯化条带大小分别与预测相符。正交试验获得OprD菌株的最优培养条件为:葡萄糖浓度为0,转速230r/min,装液量为50mL;最优表达条件为:菌液OD600=0.8时加入终浓度为0.3mmol/L的异丙基β-D-1硫代吡喃半乳糖苷(IPTG),37℃诱导12h。SDS-PAGE电泳切胶纯化获得纯度较高的OprD蛋白。蛋白质印迹法证实OprD蛋白抗血清具有较好的特异性。OprD蛋白序列系统发生分析发现,同菌属细菌存在较高的同源性,并且亲缘关系较近的细菌中OprD蛋白可能具有相似的分子功能。 展开更多
关键词 铜绿假单胞菌 外膜蛋白OprD 多克隆抗体 诱导条件
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柯萨奇病毒B组5型VP1蛋白的外源表达及多克隆抗体的制备 预览
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作者 金维维 陈伟 +2 位作者 庞冉 张同禹 井申荣 《中国免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2019年第4期463-466,共4页
目的:原核表达柯萨奇病毒B组5型的VP1蛋白,并制备其多克隆抗体及检测。方法:提取在Vero细胞中柯萨奇病毒B组5型的RNA,通过逆转录PCR(RT-PCR)扩增获取VP1基因序列,构建原核表达载体,大量诱导表达重组VP1蛋白。用HisTrap HP亲和层析柱纯... 目的:原核表达柯萨奇病毒B组5型的VP1蛋白,并制备其多克隆抗体及检测。方法:提取在Vero细胞中柯萨奇病毒B组5型的RNA,通过逆转录PCR(RT-PCR)扩增获取VP1基因序列,构建原核表达载体,大量诱导表达重组VP1蛋白。用HisTrap HP亲和层析柱纯化重组蛋白,以纯化的目的蛋白为抗原,免疫雄性SD大鼠获得VP1蛋白多克隆抗体血清,ELISA测定该抗体的效价,微量中和实验测定抗体的中和活性,Western blot检测抗体的特异性,免疫组化检测抗体对组织中抗原的识别。结果:成功构建了VP1-pET-28a重组载体,并且在BL21细胞中成功诱导表达,亲和层析柱纯化后蛋白纯度大于90%。ELISA测得抗体的效价为1∶128 000,微量中和实验显示抗体没有中和活性,Western blot分析显示抗体能与CVA16和EV71交叉反应,免疫组化实验表明抗体能够识别组织中的CVB5抗原。结论:本研究成功制备了CVB5 VP1蛋白的高效价的多克隆抗体,为CVB5病毒疫苗和病毒诊断的研发提供了有效的工具。 展开更多
关键词 柯萨奇病毒B组5型 VP1蛋白 多克隆抗体 免疫组化
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卵形鲳鲹Hepcidin-5的原核表达、纯化及多克隆抗体的制备 预览
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作者 何明旺 项雅婧 +2 位作者 孙云 曹贞洁 周永灿 《海南大学学报:自然科学版》 CAS 2019年第1期34-40,共7页
为了制备高效的卵形鲳鲹hepcidin-5蛋白多克隆抗体和对其特异性进行鉴定,本研究通过PCR扩增的方法获得了卵形鲳鲹抗菌肽hepcidin-5(Tro H5)的成熟肽cDNA序列,并构建了原核表达载体pET-32a(+)/TroH5,然后将其转入大肠杆菌表达菌株BL21(D... 为了制备高效的卵形鲳鲹hepcidin-5蛋白多克隆抗体和对其特异性进行鉴定,本研究通过PCR扩增的方法获得了卵形鲳鲹抗菌肽hepcidin-5(Tro H5)的成熟肽cDNA序列,并构建了原核表达载体pET-32a(+)/TroH5,然后将其转入大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)中进行原核表达.经IPTG诱导,成功表达了相对分子质量约为35kDa的融合重组蛋白.经不同诱导条件的优化,最终确定在IPTG终浓度为0. 1mmol/L和温度为20℃时,其表达量最大.可溶性分析表明:该融合蛋白主要存在于上清中.经镍柱亲和层析纯化获得了纯度较高的融合蛋白,然后以免疫小鼠制备多克隆抗体,经ELISA法检测,其效价达到1∶105.蛋白免疫印迹(Western blot)检测表明:所制备的多克隆抗体特异性强.本研究为进一步探究hepcidin-5的生物学功能奠定了基础. 展开更多
关键词 卵形鲳鲹 hepcidin-5 原核表达 多克隆抗体
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阴道毛滴虫巨噬细胞迁移抑制因子的原核表达及多克隆抗体制备 预览
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作者 卢叶 朱雨莲 +7 位作者 朱莉 刘卿 朱昱蓉 凌薇 唐昌霞 姜旭淦 陈盛霞 曹建平 《江苏大学学报:医学版》 CAS 2019年第1期17-20,共4页
目的:原核表达阴道毛滴虫巨噬细胞迁移抑制因子(macrophage migration inhibitory factor of Trichomonas vaginalis,TvMIF)并制备多克隆抗体.方法:采用PCR技术扩增TvMIF基因,并克隆至pTG19-T载体,酶切及测序鉴定后,再定向插入pET-30a(+... 目的:原核表达阴道毛滴虫巨噬细胞迁移抑制因子(macrophage migration inhibitory factor of Trichomonas vaginalis,TvMIF)并制备多克隆抗体.方法:采用PCR技术扩增TvMIF基因,并克隆至pTG19-T载体,酶切及测序鉴定后,再定向插入pET-30a(+)载体.将重组载体转化至大肠埃希菌BL21(DE3)中,用IPTG诱导蛋白表达.采用镍柱亲和层析法纯化TvMIF蛋白,并免疫新西兰白兔制备多克隆抗体,蛋白质印迹法检测多克隆抗体.结果:从阴道毛滴虫cDNA中扩增出TvMIF基因片段,测序结果与基因库收录序列一致.成功构建pET-30a-TvMIF重组质粒,重组TvMIF蛋白约为15.5kDa,以可溶性蛋白形式存在.获得TvMIF重组蛋白的多克隆抗体,蛋白印迹法检出TvMIF的特异性条带.结论:成功获得阴道毛滴虫MIF蛋白并制备了多克隆抗体,可用于后续研究阴道毛滴虫致病机制. 展开更多
关键词 阴道毛滴虫 巨噬细胞迁移抑制因子 原核表达 多克隆抗体
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中国绿水螅抗坏血酸过氧化物酶基因的克隆、抗体制备及表达分析 预览
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作者 张行 田晓晓 +2 位作者 董文芳 王茹梦 潘红春 《水生生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第2期305-314,共10页
为探讨中国绿水螅(Hydra sinensis)抗坏血酸过氧化物酶(Ascorbate peroxidase,APX)基因的起源及功能,研究采用RACE方法克隆了中国绿水螅APX基因的全长cDNA序列。该cDNA序列总长1357 bp,包括5′非编码区107 bp,3′非编码区146 bp及开放... 为探讨中国绿水螅(Hydra sinensis)抗坏血酸过氧化物酶(Ascorbate peroxidase,APX)基因的起源及功能,研究采用RACE方法克隆了中国绿水螅APX基因的全长cDNA序列。该cDNA序列总长1357 bp,包括5′非编码区107 bp,3′非编码区146 bp及开放阅读框(Open reading frame,ORF)1104 bp,共编码367个氨基酸,预测蛋白质分子量为40.79 kD。BLAST结果表明中国绿水螅APX蛋白同源序列绝大部分来自植物界;通过最大似然法(Maximum-likelihood)和贝叶斯分析(Bayesian inference)进行的系统发生分析显示植物界及动物界物种的APX序列各自形成单系群。把APX基因ORF全长序列克隆到原核表达质粒pET-GST中,重组质粒转化E.coliBL21(DE3)菌株,IPTG诱导后成功表达重组融合蛋白GST-APX,再使用纯化的重组蛋白免疫新西兰兔制备多克隆抗体用于APX蛋白的免疫印迹分析(Western blotting assay,WB)。在不同光照时长梯度(光强度2000 lx,每天分别光照0、4h、8h、12h、16h、20h及24h)下培养中国绿水螅30d,实时定量PCR(Quantitative real-timePCR,qPCR)及WB检测结果均表明光照时间较长时(每天光照12h以上)绿水螅APX表达呈现一定程度的上调。在长时间光辐射下水螅体内共生绿藻连续进行光合作用所累积的大量活性氧能够扩散到水螅细胞内,此时水螅体内表达上调的APX可能参与清除其细胞内的活性氧。 展开更多
关键词 中国绿水螅 抗坏血酸过氧化物酶 多克隆抗体 实时定量PCR 免疫印迹分析
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补体C9分子原核表达与多克隆抗体的制备 预览
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作者 邓亦宁 张云科 吴文学 《中国兽医杂志》 CAS 北大核心 2019年第2期49-53,共5页
通过大肠杆菌表达系统表达补体C9重组蛋白,并制备其多克隆抗体,用于检测沉积菌体表面的补体C9分子;方法:通过PCR以兔肝细胞cDNA文库为模板扩增获得补体C9部分基因,并将其克隆至原核表达载体pEASY.-Blunt E1,经测序鉴定成功获得重组质粒p... 通过大肠杆菌表达系统表达补体C9重组蛋白,并制备其多克隆抗体,用于检测沉积菌体表面的补体C9分子;方法:通过PCR以兔肝细胞cDNA文库为模板扩增获得补体C9部分基因,并将其克隆至原核表达载体pEASY.-Blunt E1,经测序鉴定成功获得重组质粒pBlunt-C9。将其转化至大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)中,经IPTG诱导,Ni-NTA亲和层析柱纯化后,获得重组蛋白。将纯化的重组蛋白免疫BALB/c雌鼠,制备抗C9的鼠源多克隆抗体。结果显示,ELISA测得鼠抗C9多克隆抗体效价为1∶12800,Western Blotting表明,制备的多克隆抗体可以特异性识别沉积在金黄色葡萄球菌和链球菌表面的C9分子,为进一步研究补体的生物学功能以及巩膜复合体(MAC)抗细菌感染机制奠定了基础。 展开更多
关键词 补体 MAC 补体C9分子 多克隆抗体
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枸杞木糖异构酶基因LbxylA的克隆、原核表达及多克隆抗体的制备 预览
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作者 赵建华 李浩霞 +5 位作者 尹跃 王亚军 李彦龙 樊云芳 安巍 曹有龙 《食品科学》 EI CAS CSCD 北大核心 2019年第10期77-83,共7页
以‘宁杞1号’枸杞果实为材料,利用逆转录-聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)技术,克隆出枸杞木糖异构酶基因(Lycium barbarum Linn. xylose isomerase,LbxylA)的全长,开放阅读框为1 446 bp,编码48... 以‘宁杞1号’枸杞果实为材料,利用逆转录-聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)技术,克隆出枸杞木糖异构酶基因(Lycium barbarum Linn. xylose isomerase,LbxylA)的全长,开放阅读框为1 446 bp,编码481个氨基酸,蛋白质分子质量为53.54 kDa,理论等电点5.37;对其进行生物信息学分析,发现LbxylA与烟草和马铃薯的木糖异构酶基因序列相似性较高,达到95%;构建重组质粒pGEX4T-1-LbxylA,转化到大肠杆菌Rosetta(DE3)中进行原核表达,通过异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-Dthiogalactoside,IPTG)诱导培养,筛选出重组蛋白的适宜表达条件为:在18℃条件下100 μmol/L IPTG诱导10 h蛋白量最大,该蛋白为融合表达的且部分可溶;进一步纯化该蛋白并将获到的LbxylA融合蛋白为抗原,以日本大耳兔免疫制备Lbxyl A多克隆抗体,采用间接酶联免疫吸附测定法,测定抗体血清的效价高于1∶81 000;随着果实的发育,果实中LbxylA的相对表达量呈现逐渐下降的趋势,且在开花后9 d果实中LbxylA表达丰度最高;利用Western blot检测到LbxylA蛋白的变化与LbxylA相对表达量基本一致,但在开花后9 d果实中蛋白表达量低于开花后15 d,随后逐渐降低,果实成熟时两者的表达量到达最低。这表明枸杞果实发育前期LbxylA蛋白由于翻译后加工可能导致蛋白质表达滞后于基因,其结果有助于进一步研究LbxylA功能及其对果实糖积累的作用。 展开更多
关键词 枸杞 木糖异构酶 原核表达 多克隆抗体 Western BLOT检测
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产肠毒素大肠杆菌K88ac-STa-LTB嵌合抗原多克隆抗体制备及植物乳杆菌表面表达研究
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作者 刘琼 刘永仕 +3 位作者 尚晓敏 李桂玲 姜延龙 王春凤 《黑龙江畜牧兽医》 CAS 北大核心 2019年第1期13-17,25,175共7页
为了研究植物乳杆菌(Lactobacillus,plantarum,L.plantarum)表面表达黏附素-肠毒素(K88ac—STa—LTB)嵌合抗原的可行性,试验利用原核表达载体pET28a表达纯化此嵌合抗原,蛋白复性后免疫Babl/c小鼠制备多克隆抗体,以制备的多克隆抗体作为... 为了研究植物乳杆菌(Lactobacillus,plantarum,L.plantarum)表面表达黏附素-肠毒素(K88ac—STa—LTB)嵌合抗原的可行性,试验利用原核表达载体pET28a表达纯化此嵌合抗原,蛋白复性后免疫Babl/c小鼠制备多克隆抗体,以制备的多克隆抗体作为一抗,采用Westem-blot、流式细胞术及间接免疫荧光试验研究此嵌合抗原在植物乳杆菌表面表达情况。结果表明:K88ac—STa—LTB嵌合抗原在大肠杆菌中以包涵体形式表达,纯化并复性的重组蛋白大小约为32.5 ku,制备的抗体效价为121b。重组菌株NC8-pLP1261-8576表达的K88ac-STa-LTB嵌合抗原经Western-blot分析,能被鼠抗LTB单克隆抗体及自制的鼠抗K88ac-STa-LTB多克隆抗体识别,流式细胞术及荧光显微镜观察证明此嵌合抗原在菌体表面表达。 展开更多
关键词 植物乳杆菌 产肠毒素大肠杆菌 黏附素-肠毒素嵌合抗原 多克隆抗体 表面表达
恶性疟原虫自噬相关蛋白8基因原核重组表达及多克隆抗体制备
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作者 李缜 邹洋 +4 位作者 黄敏君 贾永根 闫爱霞 李晶晶 谷俊朝 《中国热带医学》 CAS 2019年第5期411-415,429共6页
目的通过pET-41 Ek/LIC载体在大肠杆菌工程菌中重组表达恶性疟原虫自噬相关蛋白8(PfAtg8)基因的重组蛋白GST-PfAtg8-6×His,并用蛋白免疫法制备小鼠抗自噬相关蛋白8(PfAtg8)的多克隆抗体,并验证其效价。方法体外培养恶性疟原虫3D7株... 目的通过pET-41 Ek/LIC载体在大肠杆菌工程菌中重组表达恶性疟原虫自噬相关蛋白8(PfAtg8)基因的重组蛋白GST-PfAtg8-6×His,并用蛋白免疫法制备小鼠抗自噬相关蛋白8(PfAtg8)的多克隆抗体,并验证其效价。方法体外培养恶性疟原虫3D7株,并提取DNA,PCR扩增PfAtg8序列全长,与pET-41 Ek/LIC载体通过基因重组直接连接,在大肠杆菌Rosetta^TM(DE3)PLysS工程菌中诱导表达重组蛋白GST-PfAtg8-6×His,蛋白免疫法制备鼠抗PfAtg8的多克隆抗体并用Western blots和酶联免疫吸附测定法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)进行效价验证。结果PCR扩增PfAtg8基因并插入pET-41 Ek/LIC载体,转化入大肠杆菌。诱导表达并纯化重组蛋白,进而利用该蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体,经验证该抗体可对重组蛋白进行特异性识别,且效价可达1∶100000。结论成功表达、纯化了GST-PfAtg8-6×His重组蛋白,并免疫小鼠获得多克隆抗体血清。 展开更多
关键词 恶性疟原虫 自噬相关蛋白8 原核表达 多克隆抗体
鱼类病毒性出血性败血症病毒基质蛋白的原核表达及其亚细胞定位 预览
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作者 朱若林 沈娇娇 +4 位作者 蒋书东 杨彩桥 张晓华 鲍传和 彭开松 《中国水产科学》 CAS CSCD 北大核心 2019年第1期214-220,共7页
为了对鱼类病毒性出血性败血症病毒(viral hemorrhagic septicemia virus,VHSV)基质蛋白(matrix protein,M)进行功能研究,本实验通过PCR扩增了M基因全长序列,将其克隆至原核表达载体pET-32a(+),转化至大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞后... 为了对鱼类病毒性出血性败血症病毒(viral hemorrhagic septicemia virus,VHSV)基质蛋白(matrix protein,M)进行功能研究,本实验通过PCR扩增了M基因全长序列,将其克隆至原核表达载体pET-32a(+),转化至大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞后进行IPTG诱导表达,将纯化后的重组蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,采用间接ELISA检测抗体效价,并运用Westernblot和间接免疫荧光检测抗体特异性。结果显示,M基因全长为606bp,IPTG诱导得到的融合蛋白主要以包涵体的形式存在,大小约为36kD,比预计略小。间接ELISA检测抗体效价大于1:102400,Western blot检测显示该抗体可以特异性识别纯化的融合蛋白和VHSV感染的鲤上皮瘤(epithelioma papulosum cyprini,EPC)细胞中的M蛋白。间接免疫荧光结果显示M蛋白多抗能识别感染VHSV的EPC细胞中的M蛋白,且M蛋白主要定位于细胞质和细胞膜。本研究中M蛋白多克隆抗体的制备将有助于开展M蛋白的功能研究及疾病的免疫学诊断。 展开更多
关键词 病毒性出血性败血症病毒 基质蛋白 原核表达 多克隆抗体
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莱茵衣藻BBSome蛋白BBS2原核表达、纯化和多克隆抗体的制备及鉴定 预览
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作者 董彬 吴松 +2 位作者 程荣强 孟德梅 樊振川 《食品与生物技术学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第2期145-152,共8页
BBSome蛋白复合物是纤毛蛋白组分之一,BBSome组装或纤毛运输缺陷可导致巴-比二氏综合征。其中,BBSome组分BBS2缺失已被临床证明是导致BBS的病因之一。莱茵衣藻是研究BBSome组装和纤毛运输的一种很好的模式生物。为深入研究BBS2的致病机... BBSome蛋白复合物是纤毛蛋白组分之一,BBSome组装或纤毛运输缺陷可导致巴-比二氏综合征。其中,BBSome组分BBS2缺失已被临床证明是导致BBS的病因之一。莱茵衣藻是研究BBSome组装和纤毛运输的一种很好的模式生物。为深入研究BBS2的致病机制,需要特异性识别其BBS2蛋白的抗体。本文将莱茵衣藻BBS2基因5’端399 bp的cDNA序列克隆到原核表达载体pET28a-bbs2,转入大肠杆菌BL21(DE3)细胞进行诱导表达。在8 mol/L尿素存在的情况下对该融合蛋白进行镍柱亲和纯化,并将纯化后的融合蛋白免疫新西兰大白兔。SDS-PAGE电泳结果表明:分子量为15 kDa的重组6×His-BBS2融合蛋白为水不溶性蛋白。5次免疫后的抗莱茵衣藻BBS2抗血清效价高达1∶256 000。经Protein A琼脂糖CL-4B亲和纯化后的抗血清不仅在Western blotting分析中能特异性识别莱茵衣藻BBS2,而且在免疫荧光染色分析中能精确定位BBS2于基体和纤毛内。这一多克隆抗体的成功制备为深入开展BBS2在BBSome组装和纤毛运输中的分子作用机制提供了基础。 展开更多
关键词 莱茵衣藻 纤毛 BBS2 原核表达 蛋白纯化 多克隆抗体
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番茄果实转录因子CNR的原核表达与纯化及其抗体的制备 预览
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作者 李玲 白娟娟 +2 位作者 郭梅 王思禹 王晓玥 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第2期1-8,共8页
转录因子CNR(Colourless non-ripening)在果实的发育和成熟过程中起重要作用。目前关于番茄转录因子CNR的研究主要集中在转录水平,然而蛋白水平才是CNR发挥作用的水平。通过对CNR进行原核表达和纯化,并制备CNR的多克隆抗体,在蛋白水平... 转录因子CNR(Colourless non-ripening)在果实的发育和成熟过程中起重要作用。目前关于番茄转录因子CNR的研究主要集中在转录水平,然而蛋白水平才是CNR发挥作用的水平。通过对CNR进行原核表达和纯化,并制备CNR的多克隆抗体,在蛋白水平上确定番茄转录因子CNR的表达模式。结果表明:pET-CNR重组载体具有正确的读码框,且与已发表的番茄CNR编码序列完全一致,并且在27kD处有CNR蛋白表达,证明pET-CNR原核表达载体构建成功。诱导剂IPTG的最适宜浓度为1.0mmol/L,当用咪唑浓度为500mmol/L的洗脱缓冲液洗脱层析柱时得到单一的CNR蛋白,并以此作为抗原免疫小鼠,制得效价高且特异性好的CNR蛋白多克隆抗体。最后研究不同成熟时期番茄果实CNR蛋白的表达模式,结果发现转录因子CNR在番茄果实的破色期起重要作用。 展开更多
关键词 番茄 转录因子CNR 原核表达 蛋白纯化 多克隆抗体
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四环素多克隆抗体的制备及鉴定
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作者 赵丽花 栗慧 魏东 《黑龙江畜牧兽医》 CAS 北大核心 2019年第3期114-117,共4页
为了研究四环素(TC)多克隆抗体的制备方法,试验采用碳二亚胺法制备TC完全抗原,将制备好的免疫抗原对昆明鼠进行免疫,免疫结束后对小鼠进行眼眶取血,获得TC多克隆抗体,通过间接酶联免疫吸附试验(ELISA)法测定抗体效价,通过间接竞争ELISA... 为了研究四环素(TC)多克隆抗体的制备方法,试验采用碳二亚胺法制备TC完全抗原,将制备好的免疫抗原对昆明鼠进行免疫,免疫结束后对小鼠进行眼眶取血,获得TC多克隆抗体,通过间接酶联免疫吸附试验(ELISA)法测定抗体效价,通过间接竞争ELISA法测定多克隆抗体特异性。结果表明:该多克隆抗体效价达到1∶32000以上,抗体浓度为4.36mg/mL;与氯霉素、特布他林、沙拉沙星等常用兽药无交叉反应。说明制备的TC多克隆抗体特异性强。 展开更多
关键词 四环素 偶联 多克隆抗体 间接酶联免疫吸附试验法 标准曲线 特异性
喹乙醇代谢物完全抗原的合成与多克隆抗体的制备 预览
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作者 高子函 黄金林 《解放军预防医学杂志》 CAS 2019年第1期4-7,共4页
目的制备喹乙醇代谢物3-甲基-喹啉-2-羟酸的多克隆抗体,为食品安全快速检测喹乙醇代谢物提供支持。方法用乙酰甲喹制备喹乙醇代谢物3-甲基-喹啉-2-羧酸半抗原,再经以活化酯法制备喹乙醇代谢物-OVA(OLA-OVA)与喹乙醇代谢物-BSA(OLA-BSA)... 目的制备喹乙醇代谢物3-甲基-喹啉-2-羟酸的多克隆抗体,为食品安全快速检测喹乙醇代谢物提供支持。方法用乙酰甲喹制备喹乙醇代谢物3-甲基-喹啉-2-羧酸半抗原,再经以活化酯法制备喹乙醇代谢物-OVA(OLA-OVA)与喹乙醇代谢物-BSA(OLA-BSA),用质谱分析鉴定完全抗原;采用长程免疫法免疫小鼠,用间接ELISA法检测抗体血清效价,用竞争ELISA法检测所得抗体特异性与灵敏度。结果成功制备了喹乙醇代谢物-OVA与喹乙醇代谢物-BSA完全抗原,长效免疫小鼠并获得血清抗体效价均达到1∶10^4以上。结论经过长程免疫法可以得到高效价抗体血清,为食品安全快速检测提供技术支撑。 展开更多
关键词 喹乙醇代谢物 3-甲基-喹啉-2-羟酸 完全抗原 多克隆抗体
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