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蓝舌病I型病毒VP5蛋白的表达纯化及免疫原性分析 预览
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作者 陈玉梅 党伟华 +5 位作者 刘燕凯 周景明 刘红亮 郭亚楠 张改平 王爱萍 《中国动物检疫》 CAS 2019年第3期69-74,83共7页
为分析蓝舌病I型病毒(BTV-1)VP5蛋白的免疫原性,本研究构建了载体PET-28a-VP5并转化BL21(DE3),然后进行IPTG诱导表达,以及SDS-PAGE和Western-blot分析。结果显示,重组VP5蛋白相对分子质量约为62kDa,与预期结果一致。进一步优化条件,发现... 为分析蓝舌病I型病毒(BTV-1)VP5蛋白的免疫原性,本研究构建了载体PET-28a-VP5并转化BL21(DE3),然后进行IPTG诱导表达,以及SDS-PAGE和Western-blot分析。结果显示,重组VP5蛋白相对分子质量约为62kDa,与预期结果一致。进一步优化条件,发现IPTG为0.2mmol/L、温度为25℃、诱导6h时,重组蛋白在上清中表达量最高,通过Ni柱纯化获得的重组蛋白纯度约为75%。将纯化后的重组蛋白VP5分别以40μg/只和20μg/只免疫Balb/c小鼠,同时设置PBS为阴性对照,对三免后血清进行间接ELISA检测,发现高、低剂量免疫小鼠均能产生针对VP5蛋白的特异性抗体。用灭活BTV-1进行DOT-ELISA检测,发现其能与VP5蛋白免疫的小鼠血清发生特异性反应,说明利用大肠杆菌表达的重组蛋白VP5具有良好的免疫特性,这为进一步开展BTV相关研究奠定了基础。 展开更多
关键词 蓝舌病1型病毒 VP5蛋白 蛋白表达 蛋白纯化 条件优化 免疫分析
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Biophysical characterization and ligand-binding properties of the elongation factor Tu from Mycobacterium tuberculosis
2
作者 Juanjuan Yang Jing Hong +4 位作者 Ling Luo Ke Liu Chun Meng Zhi-liang Ji Donghai Lin 《生物化学与生物物理学报:英文版》 SCIE CAS CSCD 2019年第2期139-149,共11页
Mycobacterium tuberculosis(Mtb)is the key devastating bacterial pathogen responsible for tuberculosis.Increasing emergence of multi-drug-resistant,extensively drug-resistant,and rifampicin/isoniazid-resistant strains ... Mycobacterium tuberculosis(Mtb)is the key devastating bacterial pathogen responsible for tuberculosis.Increasing emergence of multi-drug-resistant,extensively drug-resistant,and rifampicin/isoniazid-resistant strains of Mtb makes the discovery of validated drug targets an urgent priority.As a vital translational component of the protein biosynthesis system,elongation factor Tu(EF-Tu)is an important molecular switch responsible for selection and binding of the cognate aminoacyl-tRNA to the acceptor site on the ribosome.In addition,EF-Tu from Mtb(MtbEF-Tu)is involved in the initial step of trans-translation which is an effective system for rescuing the stalled ribosomes from non-stop translation complexes under stress conditions.Given its crucial role in protein biosynthesis,EF-Tu is identified as an excellent molecular target for drug design.Here,we reported the recombinant expression,purification,biophysical characterization,and structural modeling of the MtbEF-Tu protein.Our results demonstrated that prokaryotic expression plasmids of pET28a-MtbEF-Tu could be expressed efficiently in Escherichia coli.We successfully purified the 6× His-tagged proteins with a yield of 16.8 mg from 1 l of Luria Bertani medium.Dynamic light scattering experiments showed that MtbEF-Tu existed in a monomeric form,and circular dichroism experiments indicated that MtbEF-Tu was well structured.Moreover,isothermal titration calorimetry experiments displayed that the purified MtbEF-Tu protein possessed intermediate binding affinities for guanosine-5′-triphosphate(GTP)and GDP.The GTP/GDP-binding sites were predicted by flexible molecular docking approach which reveals that GTP/GDP binds to MtbEF-Tu mainly through hydrogen bonds.Our work lays the essential basis for further structural and functional studies of MtbEF-Tu as well as MtbEF-Tu-related novel drug developments. 展开更多
关键词 tuberculosis MtbEF-Tu PROTEIN BIOSYNTHESIS PROTEIN expression and purification protein-guanine NUCLEOTIDE interaction
人源CBX7功能结构域的重组表达与纯化
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作者 胡温温 ALTAF Simair +3 位作者 吕缜一 陈婷 张云龙 陆昌瑞 《生命科学研究》 CAS CSCD 2019年第2期92-99,共8页
CBX7 (chromobox 7)在细胞寿命延长和癌症发生中起着重要的调控作用。然而,获取足量的全长CBX7蛋白并用于结构研究极为艰难。实验阐述了CBX7功能结构域CBX7 (aa 145~227)重组表达载体构建的详细过程。同时,通过Ni-NTA亲和层析对融合目... CBX7 (chromobox 7)在细胞寿命延长和癌症发生中起着重要的调控作用。然而,获取足量的全长CBX7蛋白并用于结构研究极为艰难。实验阐述了CBX7功能结构域CBX7 (aa 145~227)重组表达载体构建的详细过程。同时,通过Ni-NTA亲和层析对融合目的蛋白进行了纯化,并利用SDS-PAGE及Western-blot进行了鉴定分析。纯化后的融合蛋白样品通过离子交换和分子筛层析进一步分离剩余杂质。本实验得到的高浓度CBX7蛋白可用于结晶,为后续CBX7的结构和功能研究奠定了基础。 展开更多
关键词 人源CBX7 功能结构域 蛋白质表达 蛋白质纯化 肿瘤抑制
H3N2犬流感病毒M1蛋白的原核表达及鉴定 预览
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作者 余晓颖 田园 +4 位作者 张国利 吴广谋 刘雨玲 李泽鸿 岳玉环 《中国兽药杂志》 2019年第1期1-8,共8页
为制备犬流感病毒(H3N2) M1蛋白纯品,针对M1基因序列设计引物,用聚合酶链式反应(PCR)扩增目的基因片段,扩增产物克隆至表达载体pET-SUMO中并转化至宿主菌BL21(DE3),诱导表达目的蛋白,探索纯化工艺,制备目的蛋白,并用Western blot检测纯... 为制备犬流感病毒(H3N2) M1蛋白纯品,针对M1基因序列设计引物,用聚合酶链式反应(PCR)扩增目的基因片段,扩增产物克隆至表达载体pET-SUMO中并转化至宿主菌BL21(DE3),诱导表达目的蛋白,探索纯化工艺,制备目的蛋白,并用Western blot检测纯化的M1目的蛋白。通过PCR成功扩增出大小为771 bp的M1基因,成功构建p ET-SUMO-M1表达载体,表达的融合蛋白相对分子量为41 kD,主要以可溶形式表达,纯化后获得蛋白纯品,Western blot检测显示用M1蛋白(28 k D)免疫小鼠制备的多抗能与制备的蛋白纯品发生特异性反应,从而证明蛋白纯品为M1目的蛋白。试验制备出的M1蛋白纯品可为进一步制备通用型抗犬流感病毒抗体提供纯品抗原。 展开更多
关键词 H3N2犬流感病毒 M1蛋白 原核表达 蛋白纯化
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Cry1Ia蛋白的表达与纯化 预览
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作者 郭小琴 钱红梅 +4 位作者 郭星 高佳丽 张义茹 高建华 王兴春 《山西农业科学》 2019年第5期748-750,769共4页
苏云金芽孢杆菌表达的Cry1Ia蛋白对鳞翅目和鞘翅目昆虫具有较好的杀虫活性。为便于后期评价不同的Cry1Ia蛋白,建立了Cry1Ia蛋白的表达与纯化体系。将一个cry1Ia基因的编码基因接入pET28aDel表达载体,并将其转化大肠杆菌BL21(DE3)star菌... 苏云金芽孢杆菌表达的Cry1Ia蛋白对鳞翅目和鞘翅目昆虫具有较好的杀虫活性。为便于后期评价不同的Cry1Ia蛋白,建立了Cry1Ia蛋白的表达与纯化体系。将一个cry1Ia基因的编码基因接入pET28aDel表达载体,并将其转化大肠杆菌BL21(DE3)star菌株。在大肠杆菌中诱导Cry1Ia蛋白的表达,并与Bt中的表达产物进行比较。最后,利用Cry1Ia蛋白C端包含的组氨酸标签,对大肠杆菌表达的Cry1Ia蛋白进行纯化。结果显示,大肠杆菌中Cry1Ia蛋白随着表达时间的延长,产物积累显著,并且其表达量高于Bt菌株,因此,其更适宜生产完整的Cry1Ia蛋白。对大肠杆菌表达的Cry1Ia进行纯化,获得了理想的结果。研究构建了Cry1Ia蛋白的大肠杆菌表达体系,并成功对其进行纯化,可为进一步研究此类蛋白的杀虫活性和机制奠定基础。 展开更多
关键词 苏云金芽孢杆菌 大肠杆菌 cry1Ia 蛋白表达 蛋白纯化
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小鼠cofilin2蛋白的原核表达及纯化
6
作者 袁白银 刘钟颖 《生物技术》 CAS 2019年第1期23-28,共6页
[目的]构建小鼠cofilin2原核表达载体并纯化表达产物。[方法]以胚胎期小鼠心脏组织的c DNA为模板PCR扩增cofilin2基因,经酶切连接表达载体PGEX-4T-1后转化入大肠杆菌E.coli BL21感受态细胞中,利用异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)进... [目的]构建小鼠cofilin2原核表达载体并纯化表达产物。[方法]以胚胎期小鼠心脏组织的c DNA为模板PCR扩增cofilin2基因,经酶切连接表达载体PGEX-4T-1后转化入大肠杆菌E.coli BL21感受态细胞中,利用异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达及优化,利用SDS-PAGE凝胶电泳,考马斯亮蓝R-250进行染色,检测GST-cofilin2的表达情况。通过谷胱甘肽树脂(Glutathione Resin)亲和层析进行纯化,最后通过Western Blot进行验证。[结果]PCR成功扩增cofilin2基因,双酶切及测序结果表明pGEX-4T-1-cofilin2原核表达载体构建成功,SDS-PAGE鉴定表明,在22℃、200μmol/L的IPTG能诱导出大量可溶性的GST-cofilin2蛋白,分子量为43kDa。Western Blot验证得到纯化的GST-cofilin2。[结论]成功构建小鼠cofilin2原核表达载体,纯化得到的重组小鼠cofilin2蛋白可用于后续的生物学研究。 展开更多
关键词 cofilin2 原核表达 蛋白纯化 融合蛋白
人钾离子通道调节蛋白的原核表达及纯化 预览
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作者 郭林红 周炜 《中国免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2019年第11期1348-1353,共6页
目的:探讨人钾离子通道调节蛋白(KCNRG)的原核表达体系和纯化条件,为该蛋白的功能机制研究提供工具。方法:以pcDNA3.1-KCNRG-2ex重组质粒为模板,采用特异引物扩增KCNRG基因编码区。PCR 产物双酶切后克隆入pET28a-MBP-His和pGEX-4T-1 载... 目的:探讨人钾离子通道调节蛋白(KCNRG)的原核表达体系和纯化条件,为该蛋白的功能机制研究提供工具。方法:以pcDNA3.1-KCNRG-2ex重组质粒为模板,采用特异引物扩增KCNRG基因编码区。PCR 产物双酶切后克隆入pET28a-MBP-His和pGEX-4T-1 载体中。重组的pET28a-KCNRG-MBP-His和pGEX-4T-1-KCNRG质粒转化Top10感受态细胞。鉴定阳性克隆,并选取测序正确的质粒转化Rosetta(DE3)蛋白表达菌株,IPTG 诱导表达,用SDS-PAGE 及Western blot检测重组融合蛋白的表达。结果: PCR扩增产物长度为819 bp。经双酶切和测序,鉴定重组质粒pET28a-KCNRG-MBP-His和pGEX-4T-1-KCNRG构建成功。SDS-PAGE检测,KCNRG-MBP融合蛋白在菌液的上清中表达,KCNRG-GST融合蛋白主要以包涵体形式表达。Western blot 检测,重组KCNRG-MBP蛋白和重组KCNRG-GST蛋白分别能被抗6×His 抗体和抗GST抗体识别。经镍柱亲和层析纯化,获得纯化的KCNRG-MBP融合蛋白(凝胶成像系统软件分析纯化蛋白的纯度>90%)。结论:成功构建重组质粒pET28a-KCNRG-MBP-His,并实现KCNRG-MBP融合蛋白的可溶性原核表达。 展开更多
关键词 钾离子通道调节蛋白 原核表达 蛋白纯化
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化学生物学综合创新实验——基于pMAL蛋白融合表达系统的蛋白纯化 预览
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作者 赵仲麟 曹占奇 +3 位作者 袁超 吕东灿 孟彦羽 李瑞歌 《南方农机》 2019年第7期6-7,共2页
化学生物学是当代出现的一门新兴交叉学科,其专业实验课程的建设成为很多高等院校教学改革中的重要课题。本文介绍了一个基于麦芽糖结合蛋白的蛋白质纯化的系统,使用E.coli克隆载体pMAL-p5X,适用于表达及纯化重组蛋白质。可得到无亲和... 化学生物学是当代出现的一门新兴交叉学科,其专业实验课程的建设成为很多高等院校教学改革中的重要课题。本文介绍了一个基于麦芽糖结合蛋白的蛋白质纯化的系统,使用E.coli克隆载体pMAL-p5X,适用于表达及纯化重组蛋白质。可得到无亲和标签的目的蛋白,减低其对蛋白质的影响,优于以往的蛋白质亲和层析方法。此实验可作为化学生物学专业本科或研究生综合性创新实验内容。 展开更多
关键词 化学生物学 麦芽糖结合蛋白 蛋白纯化 创新实验
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口蹄疫病毒3C蛋白多克隆抗体的制备与鉴定
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作者 陈飞 吴香菊 +2 位作者 齐静 成子强 杜以军 《畜牧与兽医》 北大核心 2019年第1期71-75,共5页
扩增口蹄疫病毒(FMDV) 3C蛋白编码基因,将其克隆到原核表达载体,并转化至大肠杆菌BL21中进行诱导表达;3C重组蛋白纯化后免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体,通过ELISA和Western blot检测多克隆抗体的效价和特异性,并将该抗体通过间接免疫... 扩增口蹄疫病毒(FMDV) 3C蛋白编码基因,将其克隆到原核表达载体,并转化至大肠杆菌BL21中进行诱导表达;3C重组蛋白纯化后免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体,通过ELISA和Western blot检测多克隆抗体的效价和特异性,并将该抗体通过间接免疫荧光(IFA)和Western blot应用于3C的检测。ELISA结果显示,制备的3C蛋白多克隆抗体效价达1∶256 000;IFA结果显示,该抗体能够检测到3C蛋白在细胞中的定位;Western blot结果显示,该多克隆抗体能够检测到在细胞中过表达的3C蛋白。本研究制备的FMDV 3C蛋白多克隆抗体为FMDV及其3C蛋白的相关研究提供了重要的物质基础。 展开更多
关键词 FMDV 3C蛋白 原核表达 蛋白纯化 多克隆抗体
橡胶树炭疽菌CsHog1基因的克隆和原核表达分析 预览
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作者 廖小淼 何其光 +6 位作者 刘耀 徐良向 周晓韵 刘文波 张宇 林春花 缪卫国 《热带作物学报》 CSCD 北大核心 2019年第5期932-938,共7页
HOG MAPK途径在植物病原真菌生长发育、致病过程和对杀菌剂敏感性等方面发挥重要功能,但在不同的病原真菌中具有一定差异。为研究Hog1蛋白在橡胶树炭疽菌(Colletotrichum siamense)中的功能和调控机制,本研究利用同源克隆法克隆获得橡... HOG MAPK途径在植物病原真菌生长发育、致病过程和对杀菌剂敏感性等方面发挥重要功能,但在不同的病原真菌中具有一定差异。为研究Hog1蛋白在橡胶树炭疽菌(Colletotrichum siamense)中的功能和调控机制,本研究利用同源克隆法克隆获得橡胶树炭疽菌(C. siamense)的CsHog1基因,构建GST-CsHog1融合表达载体,利用SDS-PAGE和WesternBlot检测蛋白表达情况。结果表明:橡胶树炭疽菌(C.siamense)的CsHog1基因大小1383 nt,编码459个氨基酸,包含5个内含子,具有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶催化结构域;聚类分析显示橡胶树炭疽菌的CsHog1基因编码的氨基酸序列与黄瓜炭疽菌的ClOsc1(Hog1同源基因)同源性最高。所构建的蛋白融合表达载体在供试条件下(IPTG0.3、0.5、0.8、1.0 mmol/L;温度16、25、28℃)均可较好诱导表达,GST-CsHog1融合蛋白大小约为70 ku。用GST亲和层析柱纯化获得蛋白,经Western Blot检测显示该蛋白可与GST单克隆抗体特异性结合。 展开更多
关键词 橡胶树 橡胶树炭疽菌 Hog1基因 蛋白纯化 原核表达
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重组MBP-SUV39H1在大肠杆菌中表达与纯化
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作者 李剑 李丕龙 《生物技术》 CAS 2019年第1期11-15,22共6页
[目的]在大肠杆菌中获得具有甲基转移酶活性的重组MBP-SUV39H1蛋白。[方法]通过在大肠杆菌中同时表达异染色质蛋白1(HP1)与重组MBP-SUV39H1蛋白的方法,实现了MBP-SUV39H1的表达,采用his亲和纯化与分子筛Superdex200(SD200)两步分离纯化... [目的]在大肠杆菌中获得具有甲基转移酶活性的重组MBP-SUV39H1蛋白。[方法]通过在大肠杆菌中同时表达异染色质蛋白1(HP1)与重组MBP-SUV39H1蛋白的方法,实现了MBP-SUV39H1的表达,采用his亲和纯化与分子筛Superdex200(SD200)两步分离纯化方案,并利用质谱和ELISA检测MBP-SUV39H1的甲基转移酶活性。[结果]利用大肠杆菌成功表达了MBP-SUV39H1融合蛋白,经纯化后目的条带单一,并具有良好的甲基转移酶活性。[结论]纯化的具有甲基转移酶活性的MBP-SUV39H1可用于抑制剂筛选等后续研究。 展开更多
关键词 SUV39H1 HP1 原核共同表达 蛋白质纯化 活性测定
京水菜种子SU1抗菌蛋白的纯化、稳定性和抑菌机制
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作者 袁素素 秦武洒 叶秀娟 《植物保护学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第2期369-376,共8页
为拓展抗菌蛋白在新型生物农药上的潜在应用价值,通过SP-Sepharose阳离子交换层析、Mone S阳离子交换层析和Superdex 75凝胶过滤层析从京水菜Brassica juncea var. multisecta种子中纯化得到一种分子量约为30kD的SU1抗菌蛋白,采用纸片... 为拓展抗菌蛋白在新型生物农药上的潜在应用价值,通过SP-Sepharose阳离子交换层析、Mone S阳离子交换层析和Superdex 75凝胶过滤层析从京水菜Brassica juncea var. multisecta种子中纯化得到一种分子量约为30kD的SU1抗菌蛋白,采用纸片扩散法测定该抗菌蛋白的稳定性和抑菌活性,并采用荧光染色法分析其抗菌机制。结果表明,在pH为1~3和11~13条件下,SU1抗菌蛋白抑菌活性不受影响;40~80℃热处理和100 mmol/L Mn^2+、Al^3+、Zn^2+、Cu^2+、Fe^3+、Pb^2+、Mg^2+、K^+和Cr^3+离子处理后,该抗菌蛋白仍具有抑菌活性,而100mmol/LCa^2+离子处理后该抑菌蛋白的抑菌活性消失。此外,乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA)溶液处理后SU1抗菌蛋白的抑菌活性消失,再次加入Cr^3+离子时,其抑菌活性恢复。SU1抗菌蛋白能抑制7种植物病原真菌的生长,可破坏尖孢镰刀菌Fusarium oxysporum菌丝细胞膜透性和细胞核的完整性,并引起线粒体膜电势增加和菌丝细胞脱氧核糖核酸的分解。 展开更多
关键词 京水菜种子 抗菌蛋白 纯化 稳定性 抑菌机制
诸葛菜种子抗真菌蛋白的提取及其抑菌活性 预览
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作者 张玮玮 袁素素 +1 位作者 王财成 叶秀娟 《福建农林大学学报:自然科学版》 CSCD 北大核心 2019年第3期296-302,共7页
通过柱层析技术从诸葛菜种子中分离抗真菌蛋白,并采用纸片扩散法、琼脂平板稀释法和凹玻片法对抗真菌蛋白的抑菌活性和稳定性进行研究.结果表明:从诸葛菜种子中分离出一种分子质量约为10 ku的抗真菌蛋白,命名为Zp;经QE质谱鉴定,Zp蛋白... 通过柱层析技术从诸葛菜种子中分离抗真菌蛋白,并采用纸片扩散法、琼脂平板稀释法和凹玻片法对抗真菌蛋白的抑菌活性和稳定性进行研究.结果表明:从诸葛菜种子中分离出一种分子质量约为10 ku的抗真菌蛋白,命名为Zp;经QE质谱鉴定,Zp蛋白可能是诸葛菜种子中的一种防御素蛋白.Zp蛋白对11种植物病原真菌均具有较强抑制作用,其中对尖孢镰刀菌生长的半抑制浓度(IC50)为54.36μg·mL^-1,对其孢子萌发的IC50为15.97μg·mL^-1.Zp蛋白的抑菌活性在温度0~100℃和pH 1~14的范围内稳定,其对有机溶剂(15%甲醇、乙醇、异丙醇、乙醚和丙酮)和金属阳离子(50~250 mmol·L^-1 Mg^2+、K^+、Mn^2+和Ca^2+)也具有较强的耐受力. 展开更多
关键词 诸葛菜 抗真菌蛋白 纯化 抑菌活性 稳定性
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人源PDCD4全长及其MA3功能域的原核表达和蛋白纯化
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作者 汤志明 覃韦宁 +2 位作者 李佳莉 杨萍 李珊 《湖北医药学院学报》 CAS 2019年第2期101-104,共4页
目的:构建细胞程序性死亡因子4(PDCD4)及其MA3功能域的原核表达载体,并在体外表达及纯化蛋白。方法:提取胃癌细胞株7901总RNA,通过反转录获得c DNA,并通过聚合酶链式反应(PCR)扩增PDCD4全长及MA3功能域基因片段,定向连接到p GEX-6P-1原... 目的:构建细胞程序性死亡因子4(PDCD4)及其MA3功能域的原核表达载体,并在体外表达及纯化蛋白。方法:提取胃癌细胞株7901总RNA,通过反转录获得c DNA,并通过聚合酶链式反应(PCR)扩增PDCD4全长及MA3功能域基因片段,定向连接到p GEX-6P-1原核表达载体。将构建好的原核表达载体转化感受态大肠杆菌BL21,异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导目的蛋白表达,采用GST亲和层析的方法获得纯化蛋白,并通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳检测和免疫印迹鉴定。结果:PCR获得PDCD4全长及MA3基因片段,成功构建了p GEX-6P-1-PDCD4和p GEX-6P-1-PDCD4-MA3原核表达载体,并在体外表达纯化了GST-PDCD4全长和GST-PDCD4-MA3融合蛋白。结论:构建了PDCD4及其功能域的原核表达载体并在体外表达纯化了目的蛋白,为更好地研究PDCD4的功能奠定了基础。 展开更多
关键词 PDCD4 原核表达 蛋白纯化
重组人免疫球蛋白D-Fc片段蛋白的构建 预览
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作者 张静 陈文生 +3 位作者 胡晓曦 黄琼 吴育晶 魏伟 《安徽医科大学学报》 CAS 北大核心 2019年第4期514-519,共6页
目的构建重组人免疫球蛋白D-Fc(IgD-Fc)片段蛋白,检测IgD受体(IgDR)在健康人CD4^+T细胞和T淋巴瘤细胞株Jurkat、MOLT-4上的表达情况,检测IgD-Fc与IgD竞争结合CD4^+T细胞表面IgDR的能力。方法采用PCR法得到人IgD-Fc目的基因,经原核蛋白... 目的构建重组人免疫球蛋白D-Fc(IgD-Fc)片段蛋白,检测IgD受体(IgDR)在健康人CD4^+T细胞和T淋巴瘤细胞株Jurkat、MOLT-4上的表达情况,检测IgD-Fc与IgD竞争结合CD4^+T细胞表面IgDR的能力。方法采用PCR法得到人IgD-Fc目的基因,经原核蛋白表达和层析纯化,制备出重组人IgD-Fc片段蛋白。流式细胞术检测IgDR在健康人CD4^+T细胞和T淋巴瘤细胞株Jurkat、MOLT-4上的表达情况,以及IgD、重组人IgD-Fc片段蛋白与CD4^+T细胞表面IgDR的竞争结合情况。结果成功构建含IgD-Fc基因片段的原核表达载体p ET28a(+)/IgD-Fc,得到重组人IgD-Fc片段蛋白。CD4^+T细胞及T淋巴瘤细胞株表面IgDR与IgD亲和力相近,重组人IgD-Fc片段蛋白可与IgD竞争性结合IgDR。结论重组人IgD-Fc片段蛋白工艺成熟稳定,可与IgD竞争性结合IgDR,可能成为针对IgD水平升高的自身免疫性疾病的新型治疗药物。 展开更多
关键词 免疫球蛋白D IgDR 自身免疫性疾病 蛋白纯化
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拟南芥PRL1多克隆抗体的制备及应用 预览
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作者 樊瑛 梁爽 +2 位作者 刘思宇 郑璐 齐亚飞 《西北农林科技大学学报:自然科学版》 CSCD 北大核心 2019年第4期129-137,共9页
【目的】制备拟南芥PRL1蛋白的多克隆抗体,并检测PRL1在拟南芥真叶中的积累情况。【方法】扩增拟南芥PRL1基因的CDS序列,将其克隆至原核表达载体pET-28a中,转化到BL21(DE3)表达菌,经IPTG诱导后,对诱导产生的PRL1重组蛋白进行镍柱亲和纯... 【目的】制备拟南芥PRL1蛋白的多克隆抗体,并检测PRL1在拟南芥真叶中的积累情况。【方法】扩增拟南芥PRL1基因的CDS序列,将其克隆至原核表达载体pET-28a中,转化到BL21(DE3)表达菌,经IPTG诱导后,对诱导产生的PRL1重组蛋白进行镍柱亲和纯化。将制备的PRL1重组蛋白通过皮下注射免疫家兔,从抗血清中分离、纯化PRL1抗体。扩增拟南芥PRL1基因的启动子序列及其基因组DNA序列,将其克隆至植物表达载体pBI111L中,再转化到农杆菌GV3101中,利用农杆菌侵染法构建prl1回复株系。利用纯化的抗体检测PRL1在野生型、prl1点突变体、PRL1T-DNA插入突变体和prl1转基因回复系中蛋白积累量的差异。【结果】克隆了PRL1基因的CDS序列,成功构建了pET-28a-PRL1原核表达载体,实现了PRL1重组蛋白在大肠杆菌中的表达(包涵体)。克隆了PRL1基因的启动子序列及其基因组DNA序列,成功构建了pBI111L-PPRL1-Strep-gPRL1植物表达载体及prl1回复株系。制备获得了PRL1重组蛋白的多克隆抗体,用该抗体能够有效地在拟南芥样品中检测出一条分子质量约为54ku的蛋白,该蛋白在prl1点突变体中表达量下降,在PRL1T-DNA插入突变体中缺失,而在prl1回复株系中表达量升高,并且在分裂旺盛的幼嫩组织中PRL1积累量较高。【结论】成功制备了PRL1蛋白的多克隆抗体,可用于拟南芥中PRL1蛋白含量的检测。 展开更多
关键词 拟南芥 PRL1蛋白 原核表达 蛋白纯化 多克隆抗体制备
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重组人源galectin-1通过调节自噬水平保护神经元 预览
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作者 李毅 伍超 +4 位作者 任静 高歌 段春礼 杨慧 鲁玲玲 《基础医学与临床》 CSCD 2019年第4期495-500,共6页
目的制备重组人源半乳糖凝集素1(rhgalectin-1),并研究其对受损神经元自噬水平的促进作用。方法利用PCR技术构建pEGX-4T-1-galectin-1原核生物蛋白表达质粒,构建工程菌。收集rhgalectin-1蛋白,并进行纯化及纯度鉴定。用细胞毒性物质鱼藤... 目的制备重组人源半乳糖凝集素1(rhgalectin-1),并研究其对受损神经元自噬水平的促进作用。方法利用PCR技术构建pEGX-4T-1-galectin-1原核生物蛋白表达质粒,构建工程菌。收集rhgalectin-1蛋白,并进行纯化及纯度鉴定。用细胞毒性物质鱼藤酮(rotenone)处理神经母细胞瘤SK-N-SH细胞系,检测在有无rhgalectin-1预处理的情况下自噬标志物LC3Ⅱ以及p62的水平,分析不同组别细胞的自噬水平。结果成功制备了具有生物学活性的rhgalectin-1,发现rhgalectin-1可降低鱼藤酮对SK-N-SH细胞的毒性作用。鱼藤酮处理SK-N-SH细胞后,其自噬水平有所降低。表现为LC3Ⅱ水平明显降低以及p62水平明显增加(P<0.05)。而rhgalectin-1预处理组细胞自噬水平明显增加,LC3Ⅱ水平明显升高,p62水平明显降低(P<0.05)。当用自噬阻断剂bafilomycin阻断自噬体降解后,可观察到rhgalectin-1预处理并给予鱼藤酮刺激组较单独鱼藤酮刺激组LC3Ⅱ水平明显增加(P<0.05),此现象说明了rhgalectin-1处理的确增强了自噬水平而不是抑制自噬体的降解。结论 rhgalectin-1可以增强神经元的自噬水平,这一特性可能在神经元的毒性抵抗以及损伤后修复过程中发挥重要作用。 展开更多
关键词 半乳糖凝集素1 蛋白纯化 神经元 鱼藤酮 自噬
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鸡HNF4α蛋白片段的原核表达与纯化
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作者 陈珏 郁建锋 +1 位作者 王中亮 顾志良 《中国家禽》 北大核心 2019年第3期33-38,共6页
肝细胞核因子4α(Hepatocyte nuclear factor 4α,HNF4α)作为细胞核受体超家族的成员之一,是肝脏内重要的转录因子,对肝细胞分化和成熟起调控作用。研究以大肠杆菌表达系统表达获得鸡的HNF4α重组蛋白为目的,通过PCR技术分别截取鸡HNF... 肝细胞核因子4α(Hepatocyte nuclear factor 4α,HNF4α)作为细胞核受体超家族的成员之一,是肝脏内重要的转录因子,对肝细胞分化和成熟起调控作用。研究以大肠杆菌表达系统表达获得鸡的HNF4α重组蛋白为目的,通过PCR技术分别截取鸡HNF4α蛋白gHNF4α-315和gHNF4α-222两个多肽的基因片段,将其克隆入pColdⅢ质粒,并转化入大肠杆菌BL21(DE3),构建重组表达菌,对重组蛋白多肽的表达条件进行优化,同时通过蛋白的变性和复性与Ni-NTA亲和层析纯化重组HNF4α蛋白多肽。结果显示:BL21-pColdⅢ-gHNF4α-222重组菌在IPTG和15℃的低温条件下成功表达分子量为25 ku的重组蛋白gHNF4α-222,而gHNF4α-315未能表达。在15℃下,以终浓度0.1 mmol/L的IPTG诱导18 h是重组蛋白多肽的表达最佳条件,gHNF4α-222主要以包涵体形式表达;从包涵体纯化得到了纯度在95%以上的可溶性gHNF4α-222重组蛋白,为制备鸡HNF4α抗体,进一步研究鸡HNF4α的功能奠定了基础。 展开更多
关键词 鸡HNF4α 蛋白 大肠杆菌表达 包涵体 纯化
荒漠肉苁蓉多糖提取及纯化工艺优化
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作者 肖星辉 高海霞 +4 位作者 李鸿辉 姬晓慧 崔肖南 李桂芳 李予霞 《中国中药杂志》 CAS CSCD 北大核心 2019年第3期475-481,共7页
该研究以新疆荒漠肉苁蓉为实验材料,通过单因素、正交实验探究水浸提法提取荒漠肉苁蓉多糖的最优工艺;通过Sevag法和酶法及两者联用探究其对蛋白去除和对多糖保留的效果,确定荒漠肉苁蓉多糖最适去蛋白法;通过AB-8大孔树脂法和活性炭法... 该研究以新疆荒漠肉苁蓉为实验材料,通过单因素、正交实验探究水浸提法提取荒漠肉苁蓉多糖的最优工艺;通过Sevag法和酶法及两者联用探究其对蛋白去除和对多糖保留的效果,确定荒漠肉苁蓉多糖最适去蛋白法;通过AB-8大孔树脂法和活性炭法探究脱色和纯化方法,确定肉苁蓉多糖纯化的最佳工艺。结果表明,水浸提法对荒漠肉苁蓉多糖提取的最佳工艺为提取温度75℃,提取时间165 min,料液比1∶55,在此工艺下,荒漠肉苁蓉多糖提取率为18.40%;最适去蛋白工艺为温度50℃,时间为2 h,木瓜蛋白酶用量为0.2%,在此脱蛋白体系下,脱蛋白率可达31.40%,多糖的保留率可达96.00%;在荒漠肉苁蓉多糖脱色方面,活性炭脱色率为80.37%,多糖的回收率为77.05%,AB-8大孔树脂脱色率为86.43%,多糖的回收率为91.93%,表明宜用大孔树脂进行脱色;AB-8大孔树脂纯化工艺为:上样浓度取4 g·L-1,洗脱液的浓度为60%乙醇,流速1 mL·min-1,多糖粗提取液的纯度从67.70%升高至84.80%,纯化效果明显。 展开更多
关键词 荒漠肉苁蓉 多糖 脱蛋白 纯化 AB-8大孔树脂
Zn^2+对PPR蛋白锌指结构域原核表达的影响 预览
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作者 吴炳男 陈丽 +2 位作者 张云龙 陈婷 陆昌瑞 《食品与药品》 CAS 2019年第2期105-110,共6页
目的研究Zn^2+对PPR蛋白锌指结构域的原核表达、纯化过程的影响,并对Zn^2+的作用机制进行了初步探索。方法采用分子克隆的方法构建PPR蛋白锌指结构域及其突变体的His-SUMO融合蛋白表达质粒,研究Zn^2+对其原核表达及Ni-柱亲和纯化过程的... 目的研究Zn^2+对PPR蛋白锌指结构域的原核表达、纯化过程的影响,并对Zn^2+的作用机制进行了初步探索。方法采用分子克隆的方法构建PPR蛋白锌指结构域及其突变体的His-SUMO融合蛋白表达质粒,研究Zn^2+对其原核表达及Ni-柱亲和纯化过程的影响,并利用快速诱导法对Zn^2+的作用机制进行了初步探索。结果培养基中添加1mmol/LZn^2+可明显提高融合蛋白的稳定性;亲和纯化时在上清中添加10mmol/LEDTA可明显提高亲和纯化效率;Zn^2+作用机制的初探实验表明只有Zn^2+可作用于锌指结构位点,并帮助稳定锌指结构域。结论Zn^2+可作用于PPR蛋白的锌指结构位点,并使锌指结构变得稳定;在蛋白原核表达时添加一定浓度的Zn^2+可明显提高蛋白稳定性。 展开更多
关键词 ZN^2+ PPR蛋白 锌指结构域 亲和纯化
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