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一个毛竹LTR反转录转座子结构鉴定及表达模式分析
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作者 潘飞翔 汤定钦 周明兵 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第3期445-457,共13页
为了在毛竹中开发更多的活性LTR反转录转座子,文中分析和鉴定了一个毛竹LTR反转录转座子(Ph-LTR2),系统分析了该转座子在逆境下的表达模式。Ph-LTR2转座子全长6 030 bp,属于Ty3-Gypsy家族中的Reina亚家族。LTR序列同源性为96.41%,插入... 为了在毛竹中开发更多的活性LTR反转录转座子,文中分析和鉴定了一个毛竹LTR反转录转座子(Ph-LTR2),系统分析了该转座子在逆境下的表达模式。Ph-LTR2转座子全长6 030 bp,属于Ty3-Gypsy家族中的Reina亚家族。LTR序列同源性为96.41%,插入时间约为61.92万年,在基因组中有5个拷贝。Ph-LTR2转座子结构域包括GAG (种属特异抗原,gag protein)蛋白域、PR (蛋白酶,Proteases)蛋白域、RT (反转录酶,Reverse transcriptases)蛋白域、RH (RNA酶H,Ribonuclease H)蛋白域、INT (整合酶,Integrase)蛋白域和CHR (染色质组织修饰域,Chromatin organization modifier)蛋白域。通过实时定量PCR检测了INT、RT和RH的表达模式,确定INT、RT和RH在毛竹叶、笋、根存在组织表达特异性。在高温、低温、甲基化抑制剂、辐照与高盐等胁迫下,Ph-LTR2转座子INT、RT和RH的转录水平均不同程度地提高了,具体来讲,INT、RT和RH在高温、低温、甲基化抑制剂处理后转录水平上调;在低剂量辐照处理和低浓度盐溶液处理后转录水平也上调,但随剂量和浓度的增加表达水平又下降,这些结果表明Ph-LTR2转座子的表达模式响应外界环境的变化,但具体机制尚不清楚。本研究结果为开发基于Ph-LTR2转座子标签奠定了一定的理论基础。 展开更多
关键词 LTR反转录转座子 环境胁迫 毛竹实生苗 实时荧光定量PCR
六种核酸提取试剂盒对粪样中小鼠肝炎病毒核酸提取效率的比较
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作者 桂飞 杨伟伟 +3 位作者 俞利平 戴方伟 杜江涛 宋晓明 《实验动物科学》 2019年第1期31-35,共5页
目的比较六种商品化试剂盒在小鼠粪便中提取小鼠肝炎病毒(MHV)RNA的效率,筛选出效率高、耗时短的核酸提取方法。方法采集感染MHV小鼠的新鲜粪便样本,分别用液氮研磨法、磁珠匀浆法以及PBS溶解离心法进行处理,通过同一核酸提取试剂盒比... 目的比较六种商品化试剂盒在小鼠粪便中提取小鼠肝炎病毒(MHV)RNA的效率,筛选出效率高、耗时短的核酸提取方法。方法采集感染MHV小鼠的新鲜粪便样本,分别用液氮研磨法、磁珠匀浆法以及PBS溶解离心法进行处理,通过同一核酸提取试剂盒比较病毒核酸提取效率,明确最佳样本前处理方法;之后,用6种试剂盒进行RNA提取,经反转录后进行TaqMan实时定量PCR检测,以Ct值评价6种试剂盒的提取效率,结合产物测序和血清抗体ELISA结果,筛选MHV的最佳核酸提取方法。结果对于粪便样本的前处理,液氮研磨法的RNA提取效率显著高于磁珠匀浆法。对于6种试剂盒的提取效果,TIANGEN DP422[总RNA浓度:(549.70±52.38) ng/μL,Ct值:(24.51±0.10)]核酸提取效率最高;TIANGEN SD101[总RNA浓度:(274.13±6.87) ng/μL,Ct值:(2.39±0.017)]和QIAGEN 52904[总RNA浓度:(288.13±15.11) ng/μL,Ct值:(2.40±0.012)]用时最短;XS VRL[总RNA浓度:(348.80±15.85) ng/μL,Ct值:(24.70±0.13)]操作最为方便。结论粪便样本前处理建议采用液氮研磨法。针对粪便中MHV RNA的提取,TIANGEN DP422提取效率最高,推荐用于小鼠肝炎病毒的分子生物学检测。 展开更多
关键词 小鼠肝炎病毒 病毒RNA提取 TAQMAN探针 实时荧光定量PCR
维氏气单胞菌灭活疫苗对草鱼免疫相关基因表达的影响及其保护效果
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作者 任燕 时云朵 +5 位作者 曾伟伟 王英英 李莹莹 常藕琴 尹纪元 石存斌 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2019年第7期726-731,共6页
目的探讨维氏气单胞菌(Aeromonas veronii,Av)灭活疫苗对草鱼免疫相关基因表达的影响及保护效果。方法采用GZ09007菌株制备Av灭活疫苗,分别通过浸泡和注射两种途径免疫草鱼,同时设对照组(未免疫),于免疫后2、4、7、11、14和21d,经实时... 目的探讨维氏气单胞菌(Aeromonas veronii,Av)灭活疫苗对草鱼免疫相关基因表达的影响及保护效果。方法采用GZ09007菌株制备Av灭活疫苗,分别通过浸泡和注射两种途径免疫草鱼,同时设对照组(未免疫),于免疫后2、4、7、11、14和21d,经实时荧光定量PCR法检测草鱼脾脏、头肾、鳃组织中IgM、IL-1β、C3、C-凝集素及溶菌酶的m RNA表达量;于免疫30 d后用同源菌株进行攻毒,连续观察14d,计算各免疫组的相对保护率(relative percent survival,RPS)。结果 2个免疫组的5个免疫相关基因mRNA表达量均显著高于对照组(P <0. 001),且注射组表达量普遍高于浸泡组,注射组IgM基因较浸泡组更早表达,C3、C-凝集素及溶菌酶基因表达量更高或表达持续时间更长。脾脏中IL-1β和溶菌酶基因表达量达最高值为免疫后14~21d,头肾和鳃组织中5个基因表达量达最高值均为免疫后2~4d,各基因表达量最高值为对照组的1.81~37. 52倍。腹腔注射攻毒14 d后,注射组及浸泡组的RPS分别为66.7%和36.7%。结论Av灭活疫苗免疫草鱼后,可增强脾脏、头肾和鳃组织中IgM、IL-1β、C3、C-凝集素及溶菌酶基因mRNA表达,提高草鱼抗Av感染的能力。 展开更多
关键词 维氏气单胞菌 灭活疫苗 实时荧光定量PCR 免疫相关基因 免疫保护
甘肃省白菜死棵病病原菌鉴定及其融合群检测技术 预览
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作者 王朵 谢学文 +2 位作者 柴阿丽 石延霞 李宝聚 《中国农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2019年第16期2787-2799,共13页
【目的】明确引起甘肃省白菜死棵病的病原菌种类,并建立该病原菌的分子生物学检测方法,为白菜死棵病的预防及有效防治提供参考依据。【方法】对采自甘肃省的白菜死棵病菌分离、纯化培养,观察菌落形态,初步明确其病原菌为立枯丝核菌(Rhiz... 【目的】明确引起甘肃省白菜死棵病的病原菌种类,并建立该病原菌的分子生物学检测方法,为白菜死棵病的预防及有效防治提供参考依据。【方法】对采自甘肃省的白菜死棵病菌分离、纯化培养,观察菌落形态,初步明确其病原菌为立枯丝核菌(Rhizoctonia solani),为准确鉴定,从分离菌株中选取部分菌株利用通用引物rDNA-ITS和TEF-1α(translation elongation factor,1-alpha)进行PCR扩增、测序,采用MEGA 7.0中最大似然法(maximum likelihood,ML)构建系统发育树,同时用特异性引物对F-RS/R-RS进行融合群鉴定;采用叶面喷雾和茎基部灌根法对20个白菜品种进行致病力测定。根据立枯丝核菌rDNA-ITS基因保守区域序列,运用Primer 5.0设计1对特异性检测引物,建立实时荧光定量PCR(real-time fluorescent quantitative PCR,real-time PCR)检测该病原菌的方法。利用立枯丝核菌融合群(anastomosis groups,AGs)AG3-AG11、双核丝核菌AG-A(binulceate Rhizoctonia AG-A)、水稻纹枯病菌(R. solani AG-1-IA)、镰孢菌(Fusarium spp.)、腐霉菌(Pythium spp.)等常见病原菌的菌丝DNA进行常规PCR和real-time PCR检测,对特异性、灵敏度和可重复性进行评价。利用该体系对人工接种不同天数和田间采集的白菜病株及其根际土壤进行检测。【结果】共分离得到86株立枯丝核菌,经常规PCR特异性检测,结果表明大多数菌株属于立枯丝核菌融合群AG-2-1(68/86),少数为AG-1-IB(18/86);选取50个代表菌株进行ITS和TEF-1α基因测序和系统发育分析,AG-2-1和AG-1-IB分别与相应融合群参考序列聚在一支,且亲缘关系置信度为100%;致病力测定结果表明,两个融合群代表菌株对20个白菜品种的茎基部均可致病,AG-2-1对金娃娃、小皇宝叶部无致病力,且AG-1-IB的致病力稍强于AG-2-1。设计的引物特异性强,常规PCR检测结果表明仅白菜死棵病菌有扩增条带。Real-time PCR检测结果表明引物F-RS/R-RS特异性强,对白菜 展开更多
关键词 白菜 立枯丝核菌融合群 实时荧光定量PCR 检测
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microRNA-194及microRNA-497在结直肠癌患者血清中的表达和临床意义 预览
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作者 徐菲菲 陈昭华 王亚南 《检验医学与临床》 CAS 2019年第14期1997-2000,共4页
目的探讨microRNA-194(miR-194)、microRNA-497(miR-497)在结直肠癌(CRC)患者血清中的表达及临床意义。方法收集52例CRC患者(CRC组)和22例健康体检者(对照组)血清标本,采用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)检测miR-194、miR-497的表达... 目的探讨microRNA-194(miR-194)、microRNA-497(miR-497)在结直肠癌(CRC)患者血清中的表达及临床意义。方法收集52例CRC患者(CRC组)和22例健康体检者(对照组)血清标本,采用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)检测miR-194、miR-497的表达量。结果 CRC组血清中miR-194表达为1.90(0.86~3.35),明显高于对照组[0.76(0.69~0.93)],CRC组血清中miR-497表达为1.57(0.62~2.38),高于对照组[0.79(0.36~1.15)],差异均有统计学意义(P<0.05)。不同年龄、肿块大小、肿瘤分化程度、淋巴结转移情况及TNM分期的CRC患者miR-194、miR-497水平比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。结论 miR-194和miR-497在CRC患者血清中表达上升,其异常表达可能与CRC的发生有关。 展开更多
关键词 结直肠癌 microRNA-194 microRNA-497 实时荧光定量聚合酶链反应
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鸭甲肝病毒2型TaqMan实时荧光定量PCR方法的建立
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作者 万春和 陈翠腾 +6 位作者 施少华 程龙飞 傅光华 刘荣昌 陈红梅 傅秋玲 黄瑜 《中国家禽》 北大核心 2019年第15期23-27,共5页
研究利用全基因合成技术合成DHAV-2全基因组序列,并以此为标准品建立检测DHAV-2的TaqMan实时荧光定量PCR方法。结果表明:建立的方法敏感性高,最低检测限仅为33.7拷贝/μL;特异性强,对鸭甲肝病毒1型(DHAV-1)、鸭甲肝病毒3型(DHAV-3)、禽... 研究利用全基因合成技术合成DHAV-2全基因组序列,并以此为标准品建立检测DHAV-2的TaqMan实时荧光定量PCR方法。结果表明:建立的方法敏感性高,最低检测限仅为33.7拷贝/μL;特异性强,对鸭甲肝病毒1型(DHAV-1)、鸭甲肝病毒3型(DHAV-3)、禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)、番鸭呼肠孤病毒(Muscovy duck reovirus,MDRV)、新型鸭呼肠孤病毒(Novel duck reovirus,N-DRV)、鸭源禽Ⅰ型副黏病毒(Duck-origin avian paramyxovirus type 1,APMV-1)和禽坦布苏病毒(Avian Tembusu virus,ATmV)均无交叉扩增;重复性佳,组内和组间变异系数最高分别为1.68%和2.19%。对2018年福建地区临床收集的128份鸭源病料进行检测,结果未检测DHAV-2感染阳性。研究结果为DHAV-2的快速检测试剂盒研究及储备DHAV-2检测技术奠定了基础。 展开更多
关键词 鸭甲肝病毒2型 TAQMAN 实时荧光定量PCR
2017年5月至12月河北省儿童病毒性脑炎病原学研究
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作者 樊涛 韩彦洁 +11 位作者 张瑞卿 于盼辉 赵莉 齐菊菊 李鑫娜 王瑞欢 孙一硕 赵剑 胡川泽 王佶 孙素真 马学军 《中华实验和临床病毒学杂志》 CAS CSCD 2019年第3期275-279,共5页
目的了解河北省儿童病毒性炎病原学特点。方法随机收集2017年5月2017年12月河北省儿童医院神经内科住院诊断为病毒性脑炎患儿的脑脊液样本399例,采用结合自动化工作站的实时荧光定量PCR方法和Sanger测序方法检测脑脊液中的病毒核酸。运... 目的了解河北省儿童病毒性炎病原学特点。方法随机收集2017年5月2017年12月河北省儿童医院神经内科住院诊断为病毒性脑炎患儿的脑脊液样本399例,采用结合自动化工作站的实时荧光定量PCR方法和Sanger测序方法检测脑脊液中的病毒核酸。运用SPSS21. 0统计分析软件结合临床资料进行分析。不同月份EV引起的脑炎的感染率比较,采用行x列表卡方检验法进行分析。不同病毒引起的脑炎患者的MRI和脑电图阳性率比较采用Fisher确切概率检验法进行分析。不同病毒合并感染阳性率的比较采用Fisher确切概率进行分析。结果399例样本中80例阳性,检出阳性率20.05%,包括肠道病毒(Entervirus, EV ) 22例,甲型流感病毒(Influenza A virus, FluA )4 例,腮腺炎病毒(Mumps virus, MuV )3 例,单纯疱疹 1 型(Herpes simplex virus 1,HSV1)2 例,单纯疱疹 2 型(Herpes simplex virus 2, HSV2) 1 例,EB 病毒(Epstein - Barr virus, EBV ) 4 例,巨细胞病毒(Cytomegalovirus, CMV) 7 例,带状疱疹病毒(Varicella-zoster Virus, VZV) 7 例,腺病毒(Adenovirus,AdV)8例,人疱疹病毒6型(Human herpesvirus 6,HHV6)14例。阳性样本中8例为合并感染,分别为EV 合并 HHV6 3 例,EV 合并乙性脑炎病毒(Japanese encephalitis virus, JEV, HHV2 合并 AdV 1 例,FluA合并HHV6 1例,MuV合并HHV6 1例,HSV1合并VZV 1例。河北省儿童EV病毒性脑炎高发于5月、6月(P = 0.016)。 HHV6病毒脑炎较非HHV6病毒脑炎易合并感染(P = 0.016);不同病毒引起的脑炎患者的MRI和脑电图阳性率均无统计学差异(P>0.05)。结论 EV是河北省儿童病毒性脑炎最常见的病原。FluA引起的脑炎在临床不容被忽视。 展开更多
关键词 病毒性脑炎 病原谱 自动化工作站 实时荧光定量PCR
实时荧光定量PCR检测高温即时浸酸对蚕卵中家蚕微孢子虫的灭活效果
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作者 王璐 杨琼 +4 位作者 邢东旭 马振刚 李庆荣 肖阳 廖森泰 《蚕业科学》 CAS CSCD 北大核心 2019年第2期304-308,共5页
家蚕微孢子虫(Nosema bombycis,Nb)引起的家蚕微粒子病是对蚕种生产危害最为严重的家蚕病害,蚕种浸酸处理是蚕业生产中常用的一种防病处理手段。为探明浸酸处理对家蚕微粒子病的防治效果,将家蚕二化性四元杂交组合两广二号的带毒蚕卵分... 家蚕微孢子虫(Nosema bombycis,Nb)引起的家蚕微粒子病是对蚕种生产危害最为严重的家蚕病害,蚕种浸酸处理是蚕业生产中常用的一种防病处理手段。为探明浸酸处理对家蚕微粒子病的防治效果,将家蚕二化性四元杂交组合两广二号的带毒蚕卵分别进行常规即时浸酸处理和高温即时浸酸处理,采用实时荧光定量PCR对卵龄24~240 h蚕卵中的家蚕微孢子虫进行定量检测。结果发现,常规和高温浸酸处理后每日取样蚕卵中家蚕微孢子虫的检测值较阳性对照组均显著降低,高温浸酸组又明显低于常规浸酸组,表明2种浸酸处理对蚕卵中的家蚕微孢子虫均有灭活作用,且高温处理的灭活效果更为显著。对蚕卵孵化后饲养至3龄眠和5龄起的幼虫逐条进行显微镜镜检,结果显示高温即时浸酸处理对家蚕微粒子病的相对防治效果分别为92.30%±2.95%和81.80%±0.06%。综上表明,高温即时浸酸处理带毒蚕卵对家蚕微粒子病有显著的防治作用。 展开更多
关键词 高温即时浸酸 蚕卵 家蚕微孢子虫 实时荧光定量PCR
两台荧光定量PCR仪检测HBV DNA结果的一致性分析 预览
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作者 孙嘉峰 王军军 +1 位作者 邱丽萍 王建伟 《临床医药实践》 2019年第2期122-124,共3页
目的:评价ABI ViiA 7 Dx和ABI7300实时荧光定量PCR仪检测HBV DNA结果的一致性并分析仪器间结果的偏倚。方法:按照美国临床实验室标准化委员会EP9-A2标准的要求,以通过卫生部室间质量评价的ABI7300实时荧光定量PCR仪作为参比仪器,ABI Vii... 目的:评价ABI ViiA 7 Dx和ABI7300实时荧光定量PCR仪检测HBV DNA结果的一致性并分析仪器间结果的偏倚。方法:按照美国临床实验室标准化委员会EP9-A2标准的要求,以通过卫生部室间质量评价的ABI7300实时荧光定量PCR仪作为参比仪器,ABI ViiA 7 Dx实时荧光定量PCR仪作为实验仪器。分别在两台PCR仪上检测40份血浆标本的HBVDNA,对两台PCR仪的检测结果进行比对并计算判断偏倚。结果:ABI ViiA 7 Dx和ABI7300实时荧光定量PCR仪检测HBV DNA结果间的相关性较好(r=0.9835),两台PCR仪检测结果的偏倚可以接受。结论:ABI ViiA 7 Dx和ABI7300实时荧光定量PCR仪检测HBVDNA结果一致性较好,可以同时用于临床HBVDNA的检测。 展开更多
关键词 实时荧光定量PCR 乙型肝炎病毒 一致性
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2015-2016年福建省市售牡蛎贻贝中诺如病毒污染情况 预览
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作者 刘雪杰 傅祎欣 +3 位作者 叶玲清 李闽真 马群飞 陈伟伟 《江苏预防医学》 CAS 2019年第4期386-388,共3页
目的了解福建省市售牡蛎贻贝中诺如病毒污染情况,为食品中诺如病毒风险评估提供数据支持。方法分离牡蛎贻贝消化腺,研磨至匀质,加磷酸盐缓冲液及蛋白酶K进行前处理。提取病毒核酸并采用实时荧光定量PCR进行检测,对阳性样本进一步定量分... 目的了解福建省市售牡蛎贻贝中诺如病毒污染情况,为食品中诺如病毒风险评估提供数据支持。方法分离牡蛎贻贝消化腺,研磨至匀质,加磷酸盐缓冲液及蛋白酶K进行前处理。提取病毒核酸并采用实时荧光定量PCR进行检测,对阳性样本进一步定量分析。结果2015—2016年采集市售牡蛎及贻贝240份,检出诺如病毒阳性26份,阳性率为10.83%,病毒含量在3.20×10^3~7.90×10^5 copies/g(消化腺)。GI型阳性16份,GII型阳性22份;GI和GII型皆为阳性8份。结论福建省市售牡蛎贻贝中存在诺如病毒污染现象,需加强监测,开展相关风险评估,以降低诺如病毒引起的食源性疾病负担。 展开更多
关键词 诺如病毒 牡蛎贻贝 实时荧光定量PCR 食源性疾病
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稀释剂种类和冻融次数对质粒标准品实时荧光定量PCR检测的影响 预览
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作者 雷杰 牛群 +4 位作者 王楠 杨瑜 谢贝 刘志辉 孟繁荣 《国际医药卫生导报》 2019年第10期1521-1525,共5页
目的探讨稀释剂种类和冻融次数这两种因素对实时荧光定量PCR检测中质粒标准品的影响。方法 分别采用ddH2O和TE缓冲液两种稀释剂将质粒标准品稀释为1×10^8、1×10^7、1×10^6、1×10^5、1×10^4拷贝/μl的5个浓度... 目的探讨稀释剂种类和冻融次数这两种因素对实时荧光定量PCR检测中质粒标准品的影响。方法 分别采用ddH2O和TE缓冲液两种稀释剂将质粒标准品稀释为1×10^8、1×10^7、1×10^6、1×10^5、1×10^4拷贝/μl的5个浓度检测液各5份,在冻融1次、5次、10次、15次、20次和25次之后进行实时荧光定量PCR检测,比较其Ct值。结果 ①浓度1×10^8、1×10^7、1×10^6、1×10^5、1×10^4拷贝/μl时,冻融1次、5次、10次、15次、20次和25次之后,质粒标准品在ddH2O和TE缓冲液两种稀释剂中,实时荧光定量PCR检测Ct值中位数分别为17.46和17.32(P>0.05),23.52和23.61(P>0.05),26.77和26.37(P>0.05),32.73和30.88(P<0.05),33.08和31.51(P<0.05)。②冻融1次、5次、10次、15次、20次和25次,在ddH2O和TE缓冲液中,各浓度标准品Ct值中位数分别如下:1×108拷贝/μl:17.43、17.56、17.45、17.45、17.26、17.94(P>0.05)和17.38、17.36、17.47、17.31、17.30、17.62(P>0.05);1×10^7拷贝/μl:22.17、23.16、24.12、23.51、23.94、23.89(P<0.05)和22.40、24.09、24.07、23.54、23.68、24.05(P<0.05);1×10^6拷贝/μl:24.66、25.27、26.66、27.29、27.78、27.40(P<0.05)和24.92、26.22、26.31、26.59、26.93、26.53(P<0.05);1×10^5拷贝/μl:29.25、30.66、32.72、32.84、33.27、33.39(P<0.05)和29.21、30.10、30.97、30.87、31.72、32.44(P<0.05);1×10^4拷贝/μl:31.05、30.50、32.99、33.21、33.59、33.41(P<0.05)和31.22、31.28、31.49、31.52、32.37、32.31(P<0.05)。结论 相对于ddH2O,质粒标准品选择用TE缓冲液作为稀释剂更稳定。质粒标准品随着冻融次数增多,其稳定性越差,因此要避免反复冻融质粒标准品。 展开更多
关键词 冻融 稀释剂 质粒标准品 实时荧光定量PCR
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美国白蛾中肠碱性磷酸酶HcALP1与苏云金杆菌3种Bt蛋白的体外结合特性分析
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作者 常梦颖 赵丹 +3 位作者 张雅昆 徐畅 陆秀君 崇郭巍 《蚕业科学》 CAS CSCD 北大核心 2019年第3期331-337,共7页
美国白蛾(Hyphantria cunea)是危害桑树的主要害虫之一。为明确苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)杀虫晶体蛋白Cry对其作用机制,克隆美国白蛾中肠碱性磷酸酶基因,并对其编码蛋白的时空表达特异性及与Bt Cry1Ab35、Cry1Ac和Cry9Ea1... 美国白蛾(Hyphantria cunea)是危害桑树的主要害虫之一。为明确苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)杀虫晶体蛋白Cry对其作用机制,克隆美国白蛾中肠碱性磷酸酶基因,并对其编码蛋白的时空表达特异性及与Bt Cry1Ab35、Cry1Ac和Cry9Ea10的结合特性进行分析。根据美国白蛾中肠转录组数据获得碱性磷酸酶基因序列,设计特异引物,PCR扩增得到美国白蛾中肠碱性磷酸酶基因全长,命名为hcalp1(GenBank登录号为MH796758)。该基因开放阅读框为1 629 bp,编码542个氨基酸,预测蛋白质分子质量和等电点分别为60413 kD和583。实时荧光定量PCR和Western blot结果表明,hcalp1在美国白蛾4龄幼虫表达量最高,HcALP1蛋白在4龄幼虫中肠中的表达量也最高。构建原核重组表达载体pET30a-hcalp1,IPTG诱导表达获得分子质量约为70 kD的重组HcALP1蛋白;将Bt Cry1Ab35、Cry1Ac和Cry9Ea10原毒素分别经胰蛋白酶消化后与HcALP1重组蛋白进行体外配体印迹试验,发现HcALP1重组蛋白可与Bt Cry1Ab35、Cry1Ac和Cry9Ea10发生特异结合,推测HcALP1可能为3种Bt蛋白的中肠受体蛋白。 展开更多
关键词 美国白蛾 碱性磷酸酶 Bt Cry蛋白 配体印迹 实时荧光定量PCR
不同肥料配比对黄芪有效成分合成关键酶基因表达的影响 预览
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作者 陈家炜 梁华 +5 位作者 李文倩 张莹 胡瑜辉 柴智 赵建平 梁建萍 《山西农业科学》 2019年第10期1751-1755,共5页
为了探究不同肥料配比对黄芪有效成分合成途径的关键基因表达量的影响,以1年生黄芪为试材,选取3种诱导子(水杨酸、萘乙酸、硝普钠)以及固氮菌T16、T21和黄芪绿肥配制成肥料,按照正交试验设计4因素3水平的9个组合,利用实时荧光定量PCR对... 为了探究不同肥料配比对黄芪有效成分合成途径的关键基因表达量的影响,以1年生黄芪为试材,选取3种诱导子(水杨酸、萘乙酸、硝普钠)以及固氮菌T16、T21和黄芪绿肥配制成肥料,按照正交试验设计4因素3水平的9个组合,利用实时荧光定量PCR对PAL、CHS和SS基因在不同配比施肥条件下黄芪根、茎部位的表达量进行测定分析。结果表明,不同肥料配比差异性地影响PAL、CHS、SS基因的表达量。因而,推断其可能会影响黄芪药效成分在根茎部位的合成与积累。 展开更多
关键词 实时荧光定量PCR 有效成分 基因表达差异
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全自动核酸提取平台高敏HBV DNA 定量检测的性能评价
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作者 朱振坤 俞晓春 +2 位作者 薛静俊 冯冬玉 罗守军 《中国病毒病杂志》 CAS 2019年第3期214-219,共6页
目的验证Natch S全自动核酸提取平台高敏HBV DNA定量检测的性能。方法参考美国临床实验室标准化协会批准指南(CLSI-EP),采用Natch S全自动核酸提取平台及实时荧光定量聚合酶链反应分析系统检测高敏HBV DNA,评价该方法的精密度、正确度... 目的验证Natch S全自动核酸提取平台高敏HBV DNA定量检测的性能。方法参考美国临床实验室标准化协会批准指南(CLSI-EP),采用Natch S全自动核酸提取平台及实时荧光定量聚合酶链反应分析系统检测高敏HBV DNA,评价该方法的精密度、正确度、线性范围、检测能力和抗污染能力等性能指标,采用化学发光微粒子免疫检测法检测HBV标志物和IFCC速率法检测丙氨酸氨基转移酶(ALT),并分析两者之间的相互关系。结果精密度方面,高(10~7 IU/ml)、中(10~3 IU/ml)和低(10~2 IU/ml)浓度样本的批内与批间精密度CV值均≤5.0%;正确度方面,参加2017-2018年全国临床检验中心室间质评正确率100%,且实测值与靶值偏倚均<±0.20 lg IU/ml;线性范围方面,在(1.0×10~2~5.0×10~9)IU/ml范围内有良好的线性关系(Y=0.4+0.97X,R~2=0.999≥0.98,P<0.05);检测能力方面,检出限30 IU/ml和定量限100 IU/ml的检出率100%,且定量限100 IU/ml的CV值为3.21%;抗污染能力方面,与高浓度(>10~6 IU/ml)阳性样本间隔放置的阴性样本均未检出阳性结果;临床应用评价,566例慢性乙型肝炎(乙肝)患者血清样本高敏HBV DNA载量分布情况以<30 IU/ml组为主,占45.94%,与其他组ALT异常构成比差异有统计学意义(P均≤0.043),同一HBV DNA载量水平HBeAg>1.0 S/Co组与HBeAg≤1.0 S/Co组ALT异常构成比差异无统计学意义(P均≥0.61)。结论基于Natch S全自动核酸提取平台的高敏HBV DNA定量检测各项分析性能指标均表现良好,符合PCR检测要求,且对低病毒载量慢性乙肝患者抗病毒治疗监测具有重要意义。 展开更多
关键词 乙型肝炎病毒 HBV DNA 高敏 磁珠法 实时荧光定量PCR 性能验证
猪δ冠状病毒TaqMan-MGB荧光定量RT-PCR方法的建立和应用
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作者 李晓菲 陈婷 +8 位作者 韩薇 孙爱荣 葛晓杰 梁文花 黄艳 王力 王彩宏 魏笑笑 秦立廷 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2019年第4期425-431,共7页
为了快速准确地检测猪δ冠状病毒(porcine deltacoronavirus,PDCoV),本研究根据PDCoV基因序列保守区设计特异性引物和TaqMan-MGB探针,建立了一种特异性检测PDCoV的TaqMan-MGB荧光定量方法。结果显示,该方法特异性良好,对猪瘟病毒、猪繁... 为了快速准确地检测猪δ冠状病毒(porcine deltacoronavirus,PDCoV),本研究根据PDCoV基因序列保守区设计特异性引物和TaqMan-MGB探针,建立了一种特异性检测PDCoV的TaqMan-MGB荧光定量方法。结果显示,该方法特异性良好,对猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒、猪伪狂犬病病毒、猪细小病毒和猪圆环病毒2型等的检测结果均为阴性,无交叉反应;模板浓度在3.15×108~3.15×101copies/?L范围内具有良好的线性关系;敏感性高,最低检测限为10 copies/?L的模板;重复性好,批内和批间重复性试验变异系数分别为0.25%~1.06%和0.58%~1.27%;对临床样品的检测结果显示,本研究建立的荧光定量检测方法对PDCoV的阳性检出率(40%)高于常规PCR方法对PDCoV的阳性检出率(31.7%)。该方法的建立为PDCoV的实验室鉴别诊断及流行病学调查提供了快速、准确的检测手段。 展开更多
关键词 猪δ冠状病毒 TAQMAN-MGB探针 荧光定量方法
QPCR法与DNA探针杂交法检测重组人生长激素原液中残余DNA的比较
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作者 刘莹 张春琪 +7 位作者 刘玉林 俞露 韩慧利 刘涵 王莹 龚士卿 刘琳琳 刘照惠 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2019年第2期199-202,共4页
目的对重组人生长激素(recombinant human growth hormone,rhGH)原液中残余DNA检测的实时荧光定量PCR(以下简称QPCR)法和DNA探针杂交法进行对比。方法提取3批rhGH原液中残余DNA,经SYBR GREENⅠ荧光染料法对残余DNA进行QPCR检测,对建立... 目的对重组人生长激素(recombinant human growth hormone,rhGH)原液中残余DNA检测的实时荧光定量PCR(以下简称QPCR)法和DNA探针杂交法进行对比。方法提取3批rhGH原液中残余DNA,经SYBR GREENⅠ荧光染料法对残余DNA进行QPCR检测,对建立的方法进行准确度、精密度及引物特异性验证,并与《中国药典》三部(2015版)中规定的DNA探针杂交法检测的残余DNA含量进行比较。结果 QPCR法对3批rhGH原液残余DNA含量均可定量,灵敏度可达7. 5 fg。标准品DNA浓度在7. 5 fg/μL~750 pg/μL范围内线性关系良好,R2为0. 998,加标回收率为78. 40%~106. 45%。两种方法检测的3批rhGH原液残余DNA含量均小于《中国药典》三部(2015版)中规定的10 ng/剂量的要求。结论 QPCR法高效快捷,通过DNA与染料结合可实时监控PCR过程中的每一步反应,减小污染,对样品中残余DNA可进行准确定量,比DNA探针杂交法更适用于样品中残余DNA含量的检测。 展开更多
关键词 实时荧光定量PCR 探针杂交法 重组人生长激素 残余DNA 质量控制
牛细小病毒SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立
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作者 李振雪 赵飞鹏 +7 位作者 于晓丽 姜艳平 崔文 李一经 唐丽杰 徐义刚 王丽 乔薪瑗 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2019年第9期1136-1142,共7页
为建立检测牛细小病毒的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法,本研究通过提取牛细小病毒(ATCC VR-767)核酸,扩增NS1基因片段(大小约为171 bp),将NS1基因片段克隆到pMD19-T载体中,并将重组质粒p MD19-T-NS1/DH5α作为标准样品,用于建立SYBR Gree... 为建立检测牛细小病毒的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法,本研究通过提取牛细小病毒(ATCC VR-767)核酸,扩增NS1基因片段(大小约为171 bp),将NS1基因片段克隆到pMD19-T载体中,并将重组质粒p MD19-T-NS1/DH5α作为标准样品,用于建立SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法。研究结果显示,扩增基因片段长约171 bp,符合目的基因大小,经鉴定所构建的重组质粒正确。用该质粒测得SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR的最低检测量为53.3 copies/uL。用该方法检测牛细小病毒、牛轮状病毒、牛病毒性腹泻病毒、牛呼吸道合胞体病毒和猪细小病毒,结果显示,只有牛细小病毒可以被检测到,而其他病毒均未被检出,表明该方法具有良好的特异性。重复性试验结果表明,批内和批间重复变异系数均小于1%,表明该方法具有良好的重复性。结果表明,本研究建立的基于NS1基因的牛细小病毒SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法具有良好的特异性、灵敏性、重复性,可用于牛细小病毒感染的检测。 展开更多
关键词 牛细小病毒 NS1基因 实时荧光定量PCR
瞬时沉默乙醛脱氢酶对辣椒疫霉效应因子RxLR129113功能的影响 预览
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作者 王俪颖 梁涛 +4 位作者 朱彤彤 马艳飞 江伟霖 冀瑞卿 张修国 《山东农业大学学报:自然科学版》 北大核心 2019年第1期31-34,共4页
辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici)产生的效应因子RxLR129113在本氏烟上的功能之一是抑制BAX引起的细胞坏死,而且已经证实乙醛脱氢酶(ALDH)是RxLR129113的互作蛋白。为了探究乙醛脱氢酶(ALDH)是否影响Rx LR129113抑制BAX引起的细胞坏死... 辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici)产生的效应因子RxLR129113在本氏烟上的功能之一是抑制BAX引起的细胞坏死,而且已经证实乙醛脱氢酶(ALDH)是RxLR129113的互作蛋白。为了探究乙醛脱氢酶(ALDH)是否影响Rx LR129113抑制BAX引起的细胞坏死,本研究利用病毒诱导的基因沉默(VIGS)技术,克隆了乙醛脱氢酶(ALDH)基因片段,插入到烟草脆裂病毒载体(TRV)中,构建了pTRV-ALDH的VIGS载体,转入农杆菌侵染本氏烟后qrt-PCR验证成功沉默了ALDH基因。在沉默ALDH基因的本氏烟上瞬时表达RxLR129113,24 h接种BAX。结果表明,在NbALDH沉默植株上,RxLR129113仍然抑制BAX引起的细胞坏死。本研究结果表明RxLR129113与ALDH互作不影响其抑制BAX引起的细胞坏死,为进一步深入开展辣椒疫霉效应因子RxLR129113功能机制研究奠定了基础。 展开更多
关键词 辣椒疫霉 实时荧光定量PCR 基因沉默(VIGS)技术 表达量
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LAMP技术在感染乙脑病毒致倦库蚊混合样本检测中的应用 预览
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作者 郭晓霞 高剑 +3 位作者 李春晓 邢丹 董言德 赵彤言 《寄生虫与医学昆虫学报》 CAS 2019年第1期36-40,共5页
为建立媒介蚊虫自然感染种群样本携带病原体快速灵敏的检测技术,本研究将实验室经口感染乙脑病毒的致倦库蚊阳性样品和未感染乙脑病毒的阴性样品按一定比例混合成混合样本,分别采用环介导等温扩增技术(Loop Mediated Isothermal Amplifi... 为建立媒介蚊虫自然感染种群样本携带病原体快速灵敏的检测技术,本研究将实验室经口感染乙脑病毒的致倦库蚊阳性样品和未感染乙脑病毒的阴性样品按一定比例混合成混合样本,分别采用环介导等温扩增技术(Loop Mediated Isothermal Amplification,LAMP)和实时荧光定量聚合酶链反应(Real-time Fluorescent Quantitative PCR,qPCR)检测方法,对感染乙脑病毒的致倦库蚊混合样本进行检测。结果显示:当阳性样本在混合样本中所占比例为0.01%时,LAMP仍然可检测到病原体;定量PCR的最低检出比例是阳性样本在混合样本中所占0.14%以上。通过进一步优化反应体系各组分的浓度、反应时间和温度,建立了灵敏性高的LAMP扩增方法。 展开更多
关键词 LAMP 乙脑病毒 混合样本
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血清胆红素水平对HBV DNA检测的影响及其去除胆红素影响的方法 预览
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作者 余清 滕凤猛 杨学文 《检验医学与临床》 CAS 2019年第7期909-911,共3页
目的探讨血清胆红素水平对乙肝病毒脱氧核糖核酸(HBV DNA)定量检测的影响及其去除胆红素影响的方法。方法采用实时荧光定量聚合酶链反应检测含不同水平胆红素标本中HBV DNA病毒载量,再采用倍比稀释法比较用生理盐水和正常血清作为稀释... 目的探讨血清胆红素水平对乙肝病毒脱氧核糖核酸(HBV DNA)定量检测的影响及其去除胆红素影响的方法。方法采用实时荧光定量聚合酶链反应检测含不同水平胆红素标本中HBV DNA病毒载量,再采用倍比稀释法比较用生理盐水和正常血清作为稀释介质对HBV DNA定量检测的影响。结果血清胆红素水平对HBV DNA定量检测结果有明显影响,但其影响与血清胆红素水平及HBV DNA载量有关。当HBV DNA载量≥1×106 U/mL时,血清胆红素对HBV DNA定量检测结果无影响;当HBV DNA载量<1×106U/mL时,其检测结果与胆红素水平相关。当胆红素水平≥250μmol/L时,对HBV DNA定量检测结果有影响;当胆红素水平<250μmol/L时,对HBV DNA检测结果无影响。采用倍比稀释法可去除胆红素对HBV DNA定量检测结果的影响,且生理盐水介质明显优于正常血清介质。结论血清胆红素对HBV DNA定量检测结果的影响与胆红素水平和HBV DNA载量相关,采用倍比稀释法可去除胆红素对HBV DNA定量检测结果的影响。 展开更多
关键词 胆红素 乙肝病毒脱氧核糖核酸 荧光定量聚合酶链反应 影响因素
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