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小干扰RNA沉默HK-2细胞VDR及其对低枸橼酸尿症的意义 预览
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作者 李康健 罗钰辉 +3 位作者 莫茵 申吉泓 刘孝东 李颢 《昆明医科大学学报》 CAS 2017年第10期22-26,共5页
目的筛选有效沉默人肾近曲小管上皮细胞(HK-2cells,HK-2细胞)维生素D受体(vitaminDreceptor,VDR)基因的小干扰核糖核酸(small interfering ribonucleic acid,siRNA)及其对低枸橼酸尿症的意义.方法培养HK-2细胞,设计4条VDR-si... 目的筛选有效沉默人肾近曲小管上皮细胞(HK-2cells,HK-2细胞)维生素D受体(vitaminDreceptor,VDR)基因的小干扰核糖核酸(small interfering ribonucleic acid,siRNA)及其对低枸橼酸尿症的意义.方法培养HK-2细胞,设计4条VDR-siRNA,利用包装的慢病毒侵染所培养的HK-2细胞,利用蛋白质印迹法(westernblot,WB)和实时定量聚合酶链式反应(real-timepolymerasechainreaction,RT-PCR)检测沉默VDR基因的HK-2细胞中VDR蛋白质和VDR-mRNA的表达水平.结果siRNA1(6120)能显著抑制HK-2细胞中VDR的表达,获得了VDR-siRNA1(6120)稳定细胞株.结论VDR-siRNA1(6120)能有效沉默HK-2细胞中VDR的表达,可以进行下一步沉默VDR表达后检测Na(+)-二羧酸转运子[Na(+)-dicarboxylatecotransporter1,NaDC1]表达情况. 展开更多
关键词 HK-2细胞 维生素D受体 小干扰核糖核酸 低枸橼酸尿症
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3基因对胰腺癌裸鼠移植瘤化疗敏感性的影响 预览
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作者 肖华平 谢辉 +2 位作者 罗春阳 李庆 方玉江 《中国现代医学杂志》 北大核心 2017年第30期1-7,共7页
目的探讨RNA干扰沉默诱骗受体-3(DcR3)对人胰腺癌细胞裸鼠移植瘤化疗敏感性的影响及其可能机制.方法取对数生长期的AsPC-1细胞1×10^6个/ml,接种于5周龄裸鼠右后肢腹股沟,当皮下肿瘤直径为8mm左右,随机分为4组(P=10):对照组、... 目的探讨RNA干扰沉默诱骗受体-3(DcR3)对人胰腺癌细胞裸鼠移植瘤化疗敏感性的影响及其可能机制.方法取对数生长期的AsPC-1细胞1×10^6个/ml,接种于5周龄裸鼠右后肢腹股沟,当皮下肿瘤直径为8mm左右,随机分为4组(P=10):对照组、化疗组、阴性质粒+化疗组、DcR3siRNA+化疗组.观察DcR3siRNA联合化疗药物对人胰腺癌AsPC-1细胞裸鼠移植瘤的治疗效果.应用ELISA和Westernblot检测DcR3蛋白的变化;TUNEL分析肿瘤细胞凋亡;Westernblot和RT-PCR检测FasL、Caspase-8和Cas-pase-3等凋亡因子的表达.结果化疗组、阴性质粒+化疗及DcR3siRNA+化疗组均可抑制移植瘤的生长,与对照组比较,3组抑瘤率平均值分别为(35.87±4.58)%、(40.68±4.16)%和(90.25±2.53)%,4组间差异有统计学意义(P=47.736,=0.000),DcR3siRNA+化疗组抑瘤率较化疗组增加;对照组、化疗组、阴性质粒+化疗以及DcR3siRNA+化疗组移植瘤重量平均值分别为(0.95±0.03)、(0.63±0.04)、(0.67±0.02)和(0.17±0.06)g,4组间差异有统计学意义(P=85.531,P=0.000),DcR3siRNA+化疗组瘤重较化疗组减轻;对照组、化疗组、阴性质粒+化疗组、DcR3siRNA+化疗组凋亡率平均值分别为(6.3±2.21)%、(14.8±2.65)%、(14.5±3.06)%和(54.6±3.23)%,4组间差异有统计学意义(P=104.225,=0.000),DcR3siRNA+化疗组凋亡率较化疗组增加;DcR3siRNA+化疗组的FasL、Caspase-8和Caspase-3蛋白表达较其他各组上升(P=0.000).结论沉默DcR3可激活FasL/Caspase凋亡途径,促进细胞凋亡,增加胰腺癌细胞移植瘤对化疗的敏感性. 展开更多
关键词 胰腺癌 诱骗受体-3 RNA干扰 凋亡 化疗敏感性
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干预Wip1基因对人肝癌细胞系Huh-7的影响
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作者 李哲 刘军 +4 位作者 李晓明 赵丽娟 路健 吴灵潼 李秉寿 《中国临床研究》 CAS 2016年第10期1297-1302,共6页
目的干预人肝癌细胞系Huh-7的野生型p53诱导的磷酸酶1(Wip1)基因的表达,并观察其细胞生物学特性的变化。方法采用转染法,将促进Wip1基因表达的质粒和抑制Wip1基因表达的小干扰RNA(siRNA)分别转染Huh-7细胞。质粒转染的Huh-7细胞为... 目的干预人肝癌细胞系Huh-7的野生型p53诱导的磷酸酶1(Wip1)基因的表达,并观察其细胞生物学特性的变化。方法采用转染法,将促进Wip1基因表达的质粒和抑制Wip1基因表达的小干扰RNA(siRNA)分别转染Huh-7细胞。质粒转染的Huh-7细胞为质粒转染组,未经质粒转染的为未转染组,siRNA转染的为siRNA干扰组,用Negative Control siRNA转染的为NC组。转染后,行Western blot、CCK-8、细胞划痕、Transwell实验,检测各组细胞生物学特性的变化。结果质粒转染后,Huh-7细胞Wip1蛋白的表达上调,细胞增殖促进,增殖率在107.42%-176.36%之间。未转染组在0-24 h、-48 h、-72 h时的迁移距离分别小于质粒转染组:[(34.78±4.77)μm vs(61.60±2.02)μm,(33.98±3.48)μm vs(64.75±4.67)μm,(35.49±0.90)μm vs(67.89±4.23)μm,P均〈0.01]。未转染组3次Transwell实验的细胞迁移数均少于质粒转染组:[(90.00±3.00)vs(178.67±5.77),(74.33±26.95)vs(209.00±32.91),(79.33±20.74)vs(208.67±73.24),P均〈0.01]。siRNA转染后,Huh-7细胞Wip1蛋白的表达下调;细胞抑制率在12.37%-40.81%之间;NC组在0-24 h、-48 h、-72 h时的迁移距离分别大于siRNA干扰组:[(31.24±4.42)μm vs(16.04±6.21)μm,(31.33±2.13)μm vs(18.20±5.67)μm,(32.45±3.08)μm vs(18.99±5.32)μm,P均〈0.01];NC组3次Transwell实验的细胞迁移数均多于siRNA干扰组:[(74.00±12.17)vs(33.00±10.44),(77.00±5.00)vs(32.67±2.08),(81.33±17.16)vs(29.30±2.51),P均〈0.01]。结论促进Huh-7细胞Wip1基因表达后,其Wip1蛋白的表达上调,细胞增殖、迁移、侵袭能力增强。抑制Huh-7细胞Wip1基因表达后,其Wip1蛋白的表达下调,细胞增殖、迁移、侵袭能力被抑制。 展开更多
关键词 肝癌 磷酸酶1基因 质粒转染 小干扰核糖核酸 细胞生物学特性
我国小核酸药物研发与注册的相关问题研究 被引量:1
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作者 董浩 梁毅 《中国药房》 CAS 北大核心 2016年第7期876-878,共3页
目的:为我国小核酸药物(Si RNA)研发与注册提供参考。方法:介绍国内外Si RNA的研发现状,归纳我国Si RNA在药品审评、审批中遇到的问题并提出建议。结果与结论:我国Si RNA研发与国外发达国家相比至少有5~10年的差距。Si RNA注册类... 目的:为我国小核酸药物(Si RNA)研发与注册提供参考。方法:介绍国内外Si RNA的研发现状,归纳我国Si RNA在药品审评、审批中遇到的问题并提出建议。结果与结论:我国Si RNA研发与国外发达国家相比至少有5~10年的差距。Si RNA注册类别不明确,申请者缺乏指导性文件,缺乏符合条件的生产车间,药品注册部门审批、审批时效性较差。建议药品注册部门开展Si RNA注册改革试点工作,出台Si RNA注册指南,逐步放宽临床申请条件,鼓励申请者参与国际多中心临床试验,以提高Si RNA审评、审批效率。 展开更多
关键词 小核酸药物 研发 新药 药品注册
RNA干扰VEGFR-2表达对Calu-1细胞增殖、迁移、侵袭力及放射效应影响 被引量:2
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作者 刘毅 刘亮 +6 位作者 胡晨曦 周莉华 乔云 王磊 刘彬 陈晖 蒋晓东 《中华放射肿瘤学杂志》 CSCD 北大核心 2015年第6期714-718,共5页
目的:研究VEGFR?2对肺癌细胞系Calu?1细胞增殖、迁移、侵袭及联合放射后凋亡率影响,并探讨其可能机制。方法 siRNA敲低Calu?1细胞中的VEGFR?2基因,借助实时荧光定量PCR和蛋白印迹法检测VEGFR?2表达水平的变化;将细胞分为对照组... 目的:研究VEGFR?2对肺癌细胞系Calu?1细胞增殖、迁移、侵袭及联合放射后凋亡率影响,并探讨其可能机制。方法 siRNA敲低Calu?1细胞中的VEGFR?2基因,借助实时荧光定量PCR和蛋白印迹法检测VEGFR?2表达水平的变化;将细胞分为对照组、VEGF组、VEGFR?2基因敲低组和基因敲低加VEGF组。利用CCK8法、细胞划痕实验及Transwell实验分别检测细胞增殖、迁移和侵袭能力变化,利用蛋白印迹法检测VEGFR?2及下游相关信号通路蛋白表达水平变化;各组细胞联合放射后,检测细胞凋亡。结果 RNA干扰VEGFR?2后Calu?1细胞中VEGFR?2的mRNA水平和蛋白水平均降低( P=0.001、0.000);RNA干扰VEGFR?2后Calu?1细胞的增殖、迁移、侵袭能力均降低( P=0.000、0.000、0.031);RNA干扰VEGFR?2后Calu?1细胞中Akt、ERK 1/2、p38的蛋白磷酸化水平均降低( P=0.336、0.986、0.553);RNA干扰VEGFR?2后联合放射后Calu?1细胞的凋亡率增加( P=0.012),RNA干扰VEGFR?2后HIF?1α蛋白表达被抑制( P=0.016)。结论 VEGFR?2基因表达敲低后显著抑制了Calu?1细胞的多项生理功能,并提高了放射后细胞凋亡率。 展开更多
关键词 小分子干扰核糖核酸 血管内皮生长因子受体2 Calu-1细胞系 放射效应
磁性纳米复合物对人肝癌细胞增殖能力的影响 预览 被引量:5
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作者 王子真 胡刚 吴新淮 《器官移植》 CAS CSCD 2015年第6期425-428,437共5页
目的:探讨磁性纳米复合物对人肝细胞癌(肝癌)细胞(HepG2细胞株)增殖能力的影响。方法以聚乙烯亚胺包被的磁性纳米复合物(PEI-SPIO)作为基因载体复合富含亮氨酸重复单位的 G 蛋白耦联受体(LGR)5-小干扰 RNA (siRNA),待细胞... 目的:探讨磁性纳米复合物对人肝细胞癌(肝癌)细胞(HepG2细胞株)增殖能力的影响。方法以聚乙烯亚胺包被的磁性纳米复合物(PEI-SPIO)作为基因载体复合富含亮氨酸重复单位的 G 蛋白耦联受体(LGR)5-小干扰 RNA (siRNA),待细胞融合达60%时转染 HepG2细胞建立PEI 组,等量的单纯 LGR5-siRNA 转染 HepG2建立 SI 组,另设未转染对照(Ctrl)组。采用 MRI T2扫描检测纳米复合物进入细胞的效率,细胞计数试剂盒(CCK)-8实验检测细胞增殖抑制率,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测细胞 LGR5的信使核糖核酸(mRNA)表达水平,蛋白印迹法检测LGR5、cyclin D1蛋白表达。结果PEI 组 HepG2细胞的 MRI T2信号明显减低。与 Ctrl 组相比,PEI组 HepG2细胞的细胞增殖抑制率明显升高,LGR5 mRNA 的相对表达量和 LGR5、cyclin D1蛋白相对表达量均明显降低(均为 P <0.05),而 SI 组细胞的相应指标差异无统计学意义(均为 P >0.05)。结论磁性纳米复合物 PEI-SPIO 复合 LGR5-siRNA 可有效转染 HepG2细胞,其机制可能是通过下调cyclin D1表达水平抑制人肝癌 HepG2细胞的增殖能力。 展开更多
关键词 纳米复合物 小干扰核糖核酸 肝癌细胞 细胞增殖 磁共振成像
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src抑制的蛋白激酶C底物调控内皮细胞分泌TNF-α 被引量:3
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作者 尤青海 孙耕耘 +2 位作者 高磊 岳扬 张丹 《中华急诊医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2012年第12期1349-1353,共5页
目的探讨8re抑制的蛋白激酶c底物(SSeCKS)对脂多糖(LPS)诱导大鼠肺微血管内皮细胞(PMVEC)分泌肿瘤坏死因子(TNF)-α的影响。方法体外培养Wistar大鼠PMVEC,按随机数字表法分组(n=4),10mg/LLPS刺激1h、3h、6h、12h、24h或0.... 目的探讨8re抑制的蛋白激酶c底物(SSeCKS)对脂多糖(LPS)诱导大鼠肺微血管内皮细胞(PMVEC)分泌肿瘤坏死因子(TNF)-α的影响。方法体外培养Wistar大鼠PMVEC,按随机数字表法分组(n=4),10mg/LLPS刺激1h、3h、6h、12h、24h或0.1mg/L、1mg/L、10mg/LLPS刺激24h;蛋白激酶C抑制剂(BIM)预处理0.5h或50nmol/LSSeCKS-siRNA转染PMVEC48h后再加入10mg/LLPS孵育24h,酶联免疫吸附法检测细胞培养液上清TNF-α 量(ng/L)。采用SPSSl0.0软件进行分析,组间比较采用单因素方差分析,以P〈0.05为差异具有统计学意义。结果0.1、1、10mg/LLPS刺激PMVEC24h后的,TNF-α分泌量分别为(253.70±23.55)、(327.88±37.25)、(403.204-36.22)ng/L,均高于未刺激组(82.28±22.56)ng/L(均P=0.000);10mg/LLPS刺激PMVEC后,TNF-α分泌量于1h升高(170.11±49.22)ng/L,6h达峰值(404.82±13.78)ng/L,刺激24h后仍维持高水平(395.67±36.23)ng/L,分别与未刺激组(84.60±23.61)ng/L比较:P=0.001,0.000,0.000;BIM预处理PMVEC后再给予LPS刺激,TNF-α分泌量(200.44±27.39)ng/L较LPS单独刺激(402.28±31.07)ng/L显著较少(P=0.000);与LPS单独刺激比较(407.28±32.64)ng/L,SSeCKS-siRNA抑制SSeCKS表达后,LPS对PMVEC分泌TNF-α的诱导效应(195.20±13.28)ng/L也显著下降(P=0.000)。结论下调SSeCKS表达和蛋白激酶C活性可抑制LPS对PMVEC分泌TNF-α的诱导效应,从而减轻PMVEC的炎症反应。 展开更多
关键词 脂多糖 肺微血管内皮细胞 肿瘤坏死因子 src抑制的蛋白激酶C底物 蛋白激 酶C抑制剂 小分子干扰RNA 炎症 信号通路
小干扰RNA抑制HepG2.2.15细胞中乙型肝炎病毒复制与表达 预览 被引量:5
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作者 任广立 方颖 +7 位作者 张卫云 马恒颢 许蔓春 欧巧群 罗爱武 王鲜艳 彭智勇 白雪帆 《实用儿科临床杂志》 CAS CSCD 北大核心 2008年第22期 1750-1753,共4页
目的了解基于载体的siRNA对HepG2.2.15细胞中HBV的抑制作用,观察特异性siRNA载体对细胞的毒副作用及可能的非靶向效应,探讨新的抗病毒治疗手段。方法根据GenBank收录HepG2.2.15细胞系中HBV基因全序列,设计构建针对HBV的C基因区的3条siRN... 目的了解基于载体的siRNA对HepG2.2.15细胞中HBV的抑制作用,观察特异性siRNA载体对细胞的毒副作用及可能的非靶向效应,探讨新的抗病毒治疗手段。方法根据GenBank收录HepG2.2.15细胞系中HBV基因全序列,设计构建针对HBV的C基因区的3条siRNA的双链复合体,经退火连接入p-Silencer-Cmv4.1载体,连接产物转化JM109细胞,载体经聚丙烯酰胺凝胶电泳及测序鉴定后中量超纯提取质粒,定量后与转染试剂siPort XP-1转染HepG2.2.15细胞。免疫荧光及Western blot检测病毒蛋白HBsAg、HBeAg的表达;RT-PCR检测HBV RNA的表达变化;Real-time PCR定量检测HBV DNA拷贝变化。同时采用MTT法检测细胞的生长曲线与生长率。ELISA法检测IFN-α的表达变化。结果Western Blot结果显示在转染第3天p-C2对HBsAg、HBeAg的抑制率分别为(81.15±0.69)%、(88.12±0.92)%,免疫荧光显示同样结果。RT-PCR检测结果显示C基因特异的表达性siRNA可以显著抑制HBV的mRNA表达,对C区HBV mRNA的抑制达96.9%。定量PCR检测显示特异性siRNA使HBV DNA拷贝数降低102个数量级。而MTT检测表明该特异性siRNA表达载体不影响细胞的生长曲线与生长率,治疗组与对照组比较无差异。ELISA法检测表明特异性siRNA并不影响细胞干扰素的表达,p-C1、p-C2、p-C3组与未转染组、p-NC组比较表达均无差异。结论基于载体的特异性siRNA在体外可抑制HepG2.2.15细胞中HBV的复制和表达。该抑制作用是特异性的,同时对细胞无明显毒副作用。该作用为基因水平的裂解作用,不会出现耐药现象。 展开更多
关键词 乙型肝炎病毒 小干扰RNA 基因治疗 HEPG2.2.15细胞
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HIF-2α基因下调后的诱导多能干细胞移植对大鼠脑缺血损伤治疗作用的影响 预览
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作者 余学问 徐华 +7 位作者 黄忠华 李振国 闵琴琴 梁莹莹 徐洲稳 石红琴 邵牧民 王家传 《器官移植》 CAS CSCD 北大核心 2018年第6期417-423,共7页
目的 探讨低氧诱导因子(HIF)-2α基因下调后的诱导多能干细胞(iPSCs)移植对大鼠脑缺血损伤治疗作用的影响。方法 24只雄性SD大鼠随机分为3组(每组8只):iPSCs治疗组、iPSCs+siHIF-2α组,磷酸盐缓冲液(PBS)对照组。所有大鼠均采用大脑中... 目的 探讨低氧诱导因子(HIF)-2α基因下调后的诱导多能干细胞(iPSCs)移植对大鼠脑缺血损伤治疗作用的影响。方法 24只雄性SD大鼠随机分为3组(每组8只):iPSCs治疗组、iPSCs+siHIF-2α组,磷酸盐缓冲液(PBS)对照组。所有大鼠均采用大脑中动脉栓塞法制作脑缺血模型,栓塞90 min后进行再灌注。再灌注后3 d进行iPSCs移植、iPSCs+siHIF-2α移植或PBS注射。在移植之前及之后的第2、4周,行神经行为学评价并采用小动物正电子发射体层仪(micro-PET)扫描测定18F-氟代脱氧葡萄糖(18F-FDG)的摄取值。移植后第4周,处死大鼠行免疫荧光检测神经细胞标志物。结果 在干细胞移植后第2、4周,iPSCs治疗组的神经功能评分均明显低于PBS对照组(均为P<0.05),而iPSCs+siHIF-2α组的神经功能评分在这两个时间点均高于iPSCs治疗组(均为P<0.05)。在干细胞移植后的第2、4周,与PBS对照组比较,iPSCs治疗组和iPSC+siHIF-2α组脑缺血大鼠脑部的糖代谢水平(损伤侧/正常侧)明显增加(均为P<0.001)。干细胞移植后第2周,iPSCs治疗组大鼠脑缺血区糖代谢水平明显高于iPSCs+siHIF-2α组(P<0.001)。此后iPSCs+siHIF-2α组大鼠脑缺血区糖代谢水平持续上升,至干细胞移植后第4周,与iPSCs治疗组较为接近,但仍低于iPSCs治疗组(P=0.025)。免疫荧光结果提示移植的干细胞存活并迁移至梗死区周边,并且大部分的移植干细胞均表达了神经细胞标志物。结论 iPSCs移植对大鼠脑缺血损伤有明显的治疗作用,HIF-2α基因下调对iPSCs的治疗作用有一定的影响。 展开更多
关键词 脑缺血 诱导多功能干细胞 干细胞移植 低氧诱导因子-2α 小动物正电子发射体层仪(micro-PET) 18F-氟代脱氧葡萄糖(18F-FDG) 糖代谢 小干扰核糖核酸(siRNA)
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siRNA对肝癌细胞异常表达FAT10基因的抑制效应研究 预览 被引量:4
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作者 刘天德 余新 +1 位作者 洪波 邵江华 《新医学》 2009年第6期 358-360,417,共4页
目的:探讨小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)对原发性肝癌(肝癌)细胞中异常表达的类泛素蛋白FAT10的抑制作用,研究其对肝癌细胞生长的影响。方法:针对FAT10基因设计4条siRNA序列,并转染至人肝癌细胞株Hep3B细胞,通过实... 目的:探讨小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)对原发性肝癌(肝癌)细胞中异常表达的类泛素蛋白FAT10的抑制作用,研究其对肝癌细胞生长的影响。方法:针对FAT10基因设计4条siRNA序列,并转染至人肝癌细胞株Hep3B细胞,通过实时荧光定量PCR检测siRNA对FAT10基因表达的影响,使用四甲基偶氮唑蓝法检测siRNA对Hep3B细胞生长情况的影响,采用流式细胞术分析siRNA对Hep3B细胞周期变化的影响。结果:Hep3B细胞转染siRNA后,FAT10mRNA表达降低,Hep3B细胞的生长受到了明显的抑制,其生长主要停滞在G0/G1期,而S期和G2/M期细胞所占比例下降。结论:siRNA可抑制Hep3B细胞FAT10基因的表达,并抑制Hep3B细胞的生长。FAT10基因可能是调控肝癌基因表达的新的靶基因。 展开更多
关键词 肝细胞癌 原发性 肝细胞 类泛素蛋白 小干扰核糖核酸基因 肿瘤抑制
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