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基于便携式和CFX96实时荧光PCR仪的冬虫夏草及其混伪品鉴定研究
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作者 贠凯祎 向丽 +3 位作者 王晓玥 刘杨 姚辉 宋经元 《药学学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第4期746-752,共7页
采用TaqMan探针实时荧光PCR方法对冬虫夏草及其混伪品进行分子鉴定研究。从100份冬虫夏草及其混伪品中提取总DNA,依据核糖体(rDNA)内部转录间隔区(internal transcribed spacer,ITS)序列,利用MEGA 7.0软件进行比较分析,找出冬虫夏草及... 采用TaqMan探针实时荧光PCR方法对冬虫夏草及其混伪品进行分子鉴定研究。从100份冬虫夏草及其混伪品中提取总DNA,依据核糖体(rDNA)内部转录间隔区(internal transcribed spacer,ITS)序列,利用MEGA 7.0软件进行比较分析,找出冬虫夏草及其混伪品的变异位点,通过Primer Premier 6.0软件设计一对特异性引物和TaqMan探针,分别在两种实时荧光PCR仪(Genesig q16和Bio-Rad CFX96)上进行灵敏度和特异性鉴定研究。灵敏度研究表明,在Bio-Rad CFX96系统中,该方法对冬虫夏草DNA模版的检测下限为0.016 ng·μL^-1;在Genesig q16系统中,该方法对冬虫夏草DNA模版的检测下限为15.527 ng·μL^-1。特异性鉴定研究表明,在Genesig q16和Bio-Rad CFX96系统上,该方法对冬虫夏草均具有良好的特异性,能与混伪品下垂虫草、古尼虫草、蛹虫草、蝉花、凉山虫草、新疆虫草明显区分。TaqMan探针实时荧光PCR方法可实现对冬虫夏草及其混伪品的准确鉴定,为药材市场的管理提供技术支撑,对名贵中药材的鉴别具有较好应用前景。 展开更多
关键词 冬虫夏草 TAQMAN探针 实时荧光PCR 分子鉴定
六种核酸提取试剂盒对粪样中小鼠肝炎病毒核酸提取效率的比较
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作者 桂飞 杨伟伟 +3 位作者 俞利平 戴方伟 杜江涛 宋晓明 《实验动物科学》 2019年第1期31-35,共5页
目的比较六种商品化试剂盒在小鼠粪便中提取小鼠肝炎病毒(MHV)RNA的效率,筛选出效率高、耗时短的核酸提取方法。方法采集感染MHV小鼠的新鲜粪便样本,分别用液氮研磨法、磁珠匀浆法以及PBS溶解离心法进行处理,通过同一核酸提取试剂盒比... 目的比较六种商品化试剂盒在小鼠粪便中提取小鼠肝炎病毒(MHV)RNA的效率,筛选出效率高、耗时短的核酸提取方法。方法采集感染MHV小鼠的新鲜粪便样本,分别用液氮研磨法、磁珠匀浆法以及PBS溶解离心法进行处理,通过同一核酸提取试剂盒比较病毒核酸提取效率,明确最佳样本前处理方法;之后,用6种试剂盒进行RNA提取,经反转录后进行TaqMan实时定量PCR检测,以Ct值评价6种试剂盒的提取效率,结合产物测序和血清抗体ELISA结果,筛选MHV的最佳核酸提取方法。结果对于粪便样本的前处理,液氮研磨法的RNA提取效率显著高于磁珠匀浆法。对于6种试剂盒的提取效果,TIANGEN DP422[总RNA浓度:(549.70±52.38) ng/μL,Ct值:(24.51±0.10)]核酸提取效率最高;TIANGEN SD101[总RNA浓度:(274.13±6.87) ng/μL,Ct值:(2.39±0.017)]和QIAGEN 52904[总RNA浓度:(288.13±15.11) ng/μL,Ct值:(2.40±0.012)]用时最短;XS VRL[总RNA浓度:(348.80±15.85) ng/μL,Ct值:(24.70±0.13)]操作最为方便。结论粪便样本前处理建议采用液氮研磨法。针对粪便中MHV RNA的提取,TIANGEN DP422提取效率最高,推荐用于小鼠肝炎病毒的分子生物学检测。 展开更多
关键词 小鼠肝炎病毒 病毒RNA提取 TAQMAN探针 实时荧光定量PCR
泛素基因TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用
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作者 邓盈盈 谢晶莹 +5 位作者 韩玉梅 张海霞 李向茸 李琼毅 魏锁成 冯若飞 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2019年第3期355-362,共8页
为建立一种泛素基因TaqMan实时荧光定量PCR检测方法,以期为泛素基因的动态检测提供有效的试验手段。根据GenBank中公布的泛素基因序列设计1对荧光定量PCR引物及1条探针,建立一种快速检测泛素基因的实时荧光定量PCR方法,并对建立的方法... 为建立一种泛素基因TaqMan实时荧光定量PCR检测方法,以期为泛素基因的动态检测提供有效的试验手段。根据GenBank中公布的泛素基因序列设计1对荧光定量PCR引物及1条探针,建立一种快速检测泛素基因的实时荧光定量PCR方法,并对建立的方法进行条件优化与评价。结果显示,建立的实时荧光定量PCR方法的线性关系好,以质粒标准品构建的标准曲线的相关系数r~2为0.999;灵敏性、特异性及重复性均较高;应用建立的方法对多种种属来源细胞进行检测,能检测出不同类型细胞中泛素的含量。结果表明,成功建立了一种快速、准确检测泛素TaqMan实时荧光定量PCR方法。 展开更多
关键词 泛素 实时荧光定量PCR TAQMAN探针
甘薯茎腐病菌Taq Man荧光定量PCR检测方法的建立与应用
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作者 沈肖玲 易建平 +4 位作者 王荣洲 钱俊婷 李艳敏 姚海峰 楼兵干 《农业生物技术学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第3期551-563,共13页
达旦提狄克氏菌(Dickeya dadantii)引起的甘薯(Ipomoea batatas)茎腐病是严重危害甘薯的一种病害。目前该病在浙江、河北、河南等省均有发生。带菌种薯和种苗的远距离调运是病害向无病区传播的主要途径,因此准确、灵敏、快速的检测方法... 达旦提狄克氏菌(Dickeya dadantii)引起的甘薯(Ipomoea batatas)茎腐病是严重危害甘薯的一种病害。目前该病在浙江、河北、河南等省均有发生。带菌种薯和种苗的远距离调运是病害向无病区传播的主要途径,因此准确、灵敏、快速的检测方法是严格执行检疫措施的有力工具。将D. dadantii编码鞭毛蛋白基因(flagellin protein gene, fliC)序列与近缘种比对发现,该基因特异性强,适合作为分子检测的靶标。本研究以fliC基因为靶标,设计了特异性引物和Taq Man探针,建立了D. dadantii荧光定量PCR (TaqMan qRT-PCR)检测方法。结果发现,该方法对D. dadantii显示了良好的特异性,能使其与同属不同种及不同属细菌有效区分。同时研究表明,该方法具有较高的灵敏度,对菌体DNA的检测灵敏度可达280 fg/μL,是常规PCR的1 000倍;对菌液的检测灵敏度可达2 CFU/μL (CFU:菌落形成单位, colony forming units),比常规PCR检测方法高100倍。利用NGM (nematode growth medium)培养基对疑似甘薯茎腐病样本进行分离,发现D. dadantii能够在培养基上形成深褐色至蓝色的菌落,可明显提高病原菌分离纯化的效率。采用构建的TaqMan qRT-PCR方法、常规PCR法和基于NGM培养基的分离培养法对70份甘薯和土壤样品进行实际样本的检测;结果表明,TaqMan q RT-PCR法、常规PCR法和分离培养法的阳性检出率分别为91.4%、77.1%和71.4%,TaqMan q RT-PCR检测准确性更高,且将检测时间从96 h缩短为1.5 h。本研究建立的基于TaqMan探针的荧光定量PCR检测体系能有效用于甘薯茎腐病疑似样本的快速检测,对该病害的检疫具有重要的意义。 展开更多
关键词 达旦提狄克氏菌 鞭毛蛋白基因(fliC) TAQMAN探针 QRT-PCR
猪圆环病毒3型TaqMan荧光PCR检测方法的建立
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作者 于新友 李天芝 《饲料与畜牧》 2019年第3期75-78,共4页
为建立快速、简便检测猪圆环病毒3型(PCV3)的方法。本研究根据GenBank中已登录的PCV3 ORF1基因序列,设计了1对特异性引物和1条TaqMan探针,通过优化反应条件,建立了检测PCV3的TaqMan荧光PCR检测方法。结果显示,该方法特异性好,不与其他... 为建立快速、简便检测猪圆环病毒3型(PCV3)的方法。本研究根据GenBank中已登录的PCV3 ORF1基因序列,设计了1对特异性引物和1条TaqMan探针,通过优化反应条件,建立了检测PCV3的TaqMan荧光PCR检测方法。结果显示,该方法特异性好,不与其他常见猪病病原体发生交叉反应,检测PCV3灵敏度可达12拷贝/μL,本试验建立的TaqMan荧光定量PCR检测方法可对PCV3进行快速诊断,适合现场检测,为PCV3相关疾病的诊断和防控奠定了基础。 展开更多
关键词 猪圆环病毒3型 荧光PCR TAQMAN探针
猪丁型冠状病毒TaqMan实时定量RT-PCR检测方法的建立和应用
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作者 秦毅斌 何苹萍 +7 位作者 卢冰霞 韦嫔媛 何颖 李斌 苏乾莲 段群棚 周英宁 赵武 《中国兽医科学》 CSCD 北大核心 2018年第6期692-699,共8页
根据GenBank中登录的猪丁型冠状病毒(PDCoV)N基因序列在保守区设计合成特异性引物和TaqMan探针,构建含有PDCoVN基因的重组质粒作为阳性标准品,通过优化各项反应条件,建立了检测PDCoV的TaqMan实时荧光定量RT-PCR方法,并对该方法进行特... 根据GenBank中登录的猪丁型冠状病毒(PDCoV)N基因序列在保守区设计合成特异性引物和TaqMan探针,构建含有PDCoVN基因的重组质粒作为阳性标准品,通过优化各项反应条件,建立了检测PDCoV的TaqMan实时荧光定量RT-PCR方法,并对该方法进行特异性、定量线性范围、敏感性和重复性等试验。结果显示,该方法仅对PDCoV出现特异性扩增反应,与猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、A群猪轮状病毒、猪嵴病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、伪狂犬病病毒、猪瘟病毒及猪细小病毒均无交叉反应。该方法的标准曲线Ct值与2.2×10 9-2.2×10 1copies/L之间的质粒浓度具有良好的线性关系,标准曲线方程为Ct=-3.539×lg X+38.95,线性相关系数(R2)为1.0,检测下限为2.2 copies/L。对3个不同浓度(2.2×10 2、2.2×10 4、2.2×10 6copies/L)的pMD18-PDCoV-N进行2次重复检测,每个浓度重复试验的Ct值的变异系数均小于1.0%,表明该方法具有良好的重复性。应用建立的方法对64份广西临床腹泻样品进行检测,结果从其中18份样品中检出PDCo V,样品阳性率为28.1%,说明广西猪群存在PDCoV感染。结果表明,建立的TaqMan实时荧光定量RT-PCR方法为PDCoV的检测和定量分析提供了一种快速、敏感和特异的技术手段。 展开更多
关键词 猪丁型冠状病毒 荧光定量RT-PCR TAQMAN探针
猪细小病毒7型Taqman实时荧光PCR检测方法的建立与应用 预览
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作者 张志 张丽丽 +3 位作者 刘爽 单虎 李晓成 王树双 《中国动物检疫》 CAS 2018年第9期90-94,共5页
猪细小病毒7型(Porcine parvovirus 7,PPV-7)是近年新发现的一种细小病毒亚型。为建立PPV-7快速准确的检测方法,以PPV-7病毒全基因组为模板,设计合成1对引物和1条Taqman探针,建立了PPV-7Taqman实时荧光定量PCR检测方法。本方法的标准... 猪细小病毒7型(Porcine parvovirus 7,PPV-7)是近年新发现的一种细小病毒亚型。为建立PPV-7快速准确的检测方法,以PPV-7病毒全基因组为模板,设计合成1对引物和1条Taqman探针,建立了PPV-7Taqman实时荧光定量PCR检测方法。本方法的标准曲线分析显示,其常数为0.999 2,敏感性可以达到46个病毒拷贝/μL,批内和批间重复性试验的变异系数均小于2%。用猪圆环病毒2型、3型,猪细小病毒1型,猪伪狂犬病病毒等病原进行特异性试验,证实本方法不能从这些病毒中检测出特异性条带,表明本研究建立的PPV-7实时荧光PCR方法具有特异性强、敏感性高、重复性好的特点。用临床样品对该方法进行了应用性评价,从96份样品中检出52份PPV-7阳性样品,证实了本方法在生产实际应用的可行性。 展开更多
关键词 猪细小病毒7型 实时荧光定量聚合酶链式反应 TAQMAN探针
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猪圆环病毒3型实时荧光定量PCR方法的建立和应用
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作者 张志 郝占武 +4 位作者 张美晶 吴发兴 刘爽 李晓成 王树双 《中国兽医科学》 CSCD 北大核心 2018年第6期686-691,共6页
猪圆环病毒3型(PCV3)是近两年报道的一种新病毒,为实现快速检测PCV3的目的,笔者以我国PCV3全基因组为模板设计合成了1对引物和1条TaqMan探针,建立了检测PCV3的实时荧光定量PCR方法。经过标准曲线分析、敏感性、特异性和重复性等一系... 猪圆环病毒3型(PCV3)是近两年报道的一种新病毒,为实现快速检测PCV3的目的,笔者以我国PCV3全基因组为模板设计合成了1对引物和1条TaqMan探针,建立了检测PCV3的实时荧光定量PCR方法。经过标准曲线分析、敏感性、特异性和重复性等一系列试验,表明该方法具有特异性强、敏感性高以及重复性好的特点。试验结果表明,阳性PCV3标准品DNA稀释10-8后(浓度为50 copies/L)仍然可以被检出,不同浓度的组间和组内重复性试验结果显示变异系数均小于3%,最后用36份临床样品进行了应用性评价,结果从中检测出9份阳性样品,表明所建立的方法是一种高效的可用于PCV3的分子诊断技术。 展开更多
关键词 猪圆环病毒3型 实时荧光定量聚合酶链式反应 TAQMAN探针
xCT基因rs13120371位点单核苷酸多态性与肺结核易感性的相关性 被引量:1
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作者 蔡侃儒 邱智辉 +3 位作者 张洁云 汪文斐 张明霞 王召钦 《中国热带医学》 CAS 2018年第2期103-106,共4页
目的通过大样本病例与对照研究明确x CT基因功能性SNP与结核病易感性的相关性,明确其调控结核病发生发展的分子机制。方法从健康对照和结核患者的全血样本中提取基因组DNA,采用TaqMan探针技术对x CT基因rs13120371位点进行基因分型并对... 目的通过大样本病例与对照研究明确x CT基因功能性SNP与结核病易感性的相关性,明确其调控结核病发生发展的分子机制。方法从健康对照和结核患者的全血样本中提取基因组DNA,采用TaqMan探针技术对x CT基因rs13120371位点进行基因分型并对基因频率进行关联性分析,结核菌特异性抗原IFN-γ斑点形成细胞的数量和放射影像学分数反应不同基因型与临床指标的相关性,Real-time PCR方法检测健康对照和结核患者外周血单个核细胞中x CT基因及其相关的CXCL1、CXCL2、IL1B基因的表达水平。结果等位基因位点基因频率分布符合Hardy-Weinberg平衡定律(χ^2=0.678,P〉0.05),选择的样本具有群体代表性。rs13120371位点的单核苷酸多态性与结核病的易感性相关,其中结核患者组等位基因A的基因频率为70.2%,等位基因G的基因频率为29.8%;健康对照组等位基因A的基因频率为66.8%,等位基因G的基因频率为33.2%,两组之间的等率基因频率差异具有统计学意义(P=0.02,OR=0.86)。AA基因型患者的结核菌特异性刺激分泌的IFN-r斑点形成细胞数量及炎症反应指标明显高于基因型GG的患者,基因型AA的细胞xCT基因的表达水平也明显上调。结论 xCT基因rs13120371位点的单核苷酸多态性与汉族人群结核感染的易感性相关,并且rs13120371位点是功能性SNP,等位基因A可能增加结核菌感染的风险。 展开更多
关键词 肺结核 TAQMAN探针 基因分型 单核苷酸多态
鸭腺病毒A型TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立 预览 被引量:1
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作者 万春和 刘荣昌 +5 位作者 程龙飞 施少华 傅光华 陈红梅 傅秋玲 黄瑜 《中国畜牧兽医》 北大核心 2018年第5期1341-1348,共8页
试验旨在建立鸭腺病毒A型(duck adenovirus A,DAdV-A)TaqMan实时荧光定量PCR检测方法。根据DAdV-A Hexon基因序列设计特异性引物和探针,建立了基于TaqMan探针检测DAdV-A的实时荧光定量PCR检测方法,对其特异性、灵敏性、重复性进行检测... 试验旨在建立鸭腺病毒A型(duck adenovirus A,DAdV-A)TaqMan实时荧光定量PCR检测方法。根据DAdV-A Hexon基因序列设计特异性引物和探针,建立了基于TaqMan探针检测DAdV-A的实时荧光定量PCR检测方法,对其特异性、灵敏性、重复性进行检测,用建立的TaqMan实时荧光定量PCR检测方法和常规PCR方法同时对福建地区临床收集的85份番鸭源病料进行DAdV-A感染的检测,比较其符合率。结果表明,试验成功建立了检测DAdV-A的实时荧光定量PCR检测方法,其扩增相关系数为0.996,扩增效率为99.9%;特异性强,对鸭常见病原(如鸭瘟病毒、鹅细小病毒、番鸭细小病毒、鸭圆环病毒、鸭源大肠杆菌、鸭疫里默氏杆菌和鸭源禽多杀性巴氏杆菌)检测均为阴性;灵敏度高,最低检测限为8.37拷贝/μL;重复性好,组内变异系数和组间变异系数分别为0.54%~1.28%和0.61%~2.39%。对临床送检的85份病料,TaqMan实时荧光定量PCR方法的阳性率为7.06%(6/85),PCR方法的阳性率为5.88%(5/85),且PCR检测的阳性样品经TaqMan实时荧光定量PCR方法检测均为阳性,符合率为100%。本研究建立了基于TaqMan探针检测DAdV-A的实时荧光定量PCR检测方法,为鸭群中开展DAdV-A的分子流行病学研究提供了有效技术手段。 展开更多
关键词 鸭腺病毒A型 Hexon基因 TAQMAN探针 实时荧光定量PCR方法
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黏菌素耐药细菌mcr-1基因TaqManPCR快速检测方法的建立
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作者 尚伟 代稳 +3 位作者 陈北方 王玫 邹大阳 仓宝成 《中华微生物学和免疫学杂志》 CSCD 北大核心 2018年第9期710-715,共6页
目的 建立一种快速灵敏准确的分子检测方法用来检测临床分离菌株中的mcr-1基因.方法 根据mcr-1基因的序列设计一对特异性引物和一条TaqMan探针,同时构建含有mcr-1基因片段的重组质粒作为阳性标准品,采用TaqMan探针荧光定量PCR方法检测... 目的 建立一种快速灵敏准确的分子检测方法用来检测临床分离菌株中的mcr-1基因.方法 根据mcr-1基因的序列设计一对特异性引物和一条TaqMan探针,同时构建含有mcr-1基因片段的重组质粒作为阳性标准品,采用TaqMan探针荧光定量PCR方法检测耐药基因mcr-1,并对方法的敏感性、重复性和特异性进行评价.结果 TaqMan探针荧光定量PCR结果显示起始模板量与Ct值之间存在良好的线性关系(R2〉0.999),检出下限为10拷贝/μl,比常规PCR敏感性高100倍;特异性检测显示只有含mcr-1基因的菌株结果为阳性,其余菌株为阴性;组内及组间重复性试验的变异系数均小于1%.利用所建立的方法对150株临床分离的耐药菌株进行检测,检测到2株菌株携带mcr-1耐药基因,2株菌株鉴定均为大肠杆菌.结论 建立的TaqMan探针荧光定量PCR检测耐药基因mcr-1的方法具有特异性强、敏感性高、重复性好的优点,可用于临床检验上特异性检测携带mcr-1基因的临床耐药菌株,为临床药物治疗提供更好的依据. 展开更多
关键词 黏菌素耐药 mcr-1基因 PCR检测 TAQMAN探针
绵羊肺炎支原体TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立 预览 被引量:1
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作者 林裕胜 江锦秀 +2 位作者 张靖鹏 游伟 胡奇林 《中国预防兽医学报》 CSCD 北大核心 2018年第4期316-320,共5页
为建立一种快速检测绵羊肺炎支原体(Mo)的检测方法,本研究根据GenBank登录的Mo Y-98株(KR021380.1)黏附素基因p113基因序列设计1对特异性引物和探针,建立了针对Mo的TaqMan荧光定量检测方法。结果显示,该方法可以特异性检测Mo,对丝... 为建立一种快速检测绵羊肺炎支原体(Mo)的检测方法,本研究根据GenBank登录的Mo Y-98株(KR021380.1)黏附素基因p113基因序列设计1对特异性引物和探针,建立了针对Mo的TaqMan荧光定量检测方法。结果显示,该方法可以特异性检测Mo,对丝状支原体山羊亚种、山羊支原体山羊肺炎亚种、莱氏无胆甾原体及羊传染性脓疱病毒(ORFV)等羊常见病原扩增结果均为阴性;该方法最低检测限为10拷贝/μL;组内和组间变异系数均小于2%;采用该方法对96份临床样品进行检测,结果Mo的阳性率为67.7%(65/96),比常规PCR法及支原体分离鉴定法更加敏感。以上结果表明本研究建立的Mo TaqMan荧光定量PCR方法可以用于Mo的准确快速检测及羊支原体性肺炎的诊断和流行病学调查。 展开更多
关键词 绵羊肺炎支原体 TAQMAN探针 RF-PCR
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鼠源VCAM-1基因TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立 被引量:1
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作者 王兴陇 包晓婧 +2 位作者 张海霞 李向茸 冯若飞 《中国兽医科学》 CSCD 北大核心 2018年第1期27-33,共7页
为建立一种鼠源VCAM-1基因TaqMan实时荧光定量PCR检测方法,以期为鼠源VCAM-1基因的动态检测提供有效的试验手段。根据GenBank中登录的鼠源VCAM-1基因序列,设计1对荧光定量PCR引物及1条探针,建立一种快速检测鼠源VCAM-1基因的实时荧光定... 为建立一种鼠源VCAM-1基因TaqMan实时荧光定量PCR检测方法,以期为鼠源VCAM-1基因的动态检测提供有效的试验手段。根据GenBank中登录的鼠源VCAM-1基因序列,设计1对荧光定量PCR引物及1条探针,建立一种快速检测鼠源VCAM-1基因的实时荧光定量PCR方法,并对建立的方法进行条件优化与评价。结果显示,建立的实时荧光定量PCR方法线性关系较好,以质粒标准品构建的标准曲线相关系数r2为0.998;灵敏性、重复性及特异性均较高。可用于鼠源细胞中VCAM-1基因的定性鉴别和含量测定。结果表明,成功建立了一种快速准确检测鼠源VCAM-1基因的TaqMan实时荧光定量PCR法。 展开更多
关键词 VCAM-1基因 TAQMAN探针 实时荧光定量PCR 检测
基于DNA条形码的翠云草快速鉴定方法研究 预览
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作者 覃桂 聂晶 +3 位作者 张飞 胡炳雄 肖凌 汪波 《世界科学技术:中医药现代化》 CSCD 北大核心 2018年第5期697-702,共6页
目的:基于卷柏属植物DNA条形码鉴定序列,运行Taq Man探针技术探讨翠云草快速鉴定新方法。方法:本文利用DNA条形码鉴定技术对采集的11种32份卷柏属样本提取总DNA扩增ITS2序列,结合Genbank数据库的34种103条序列综合分析,针对翠云草设... 目的:基于卷柏属植物DNA条形码鉴定序列,运行Taq Man探针技术探讨翠云草快速鉴定新方法。方法:本文利用DNA条形码鉴定技术对采集的11种32份卷柏属样本提取总DNA扩增ITS2序列,结合Genbank数据库的34种103条序列综合分析,针对翠云草设计特异引物及探针,运用实时荧光PCR检测技术比较序列扩增荧光信号差异实现翠云草的快速鉴定。结果:在所分析的物种中ITS2序列可将翠云草与其它卷柏属近源物种有效区分,Taq Man探针及引物特异性较好,本研究建立的方法在翠云草的鉴别中具有良好的特异性、重复性及灵敏性,甚至可从低至1 mg的样品中提取DNA得到有效检出。结论:基于DNA条形码鉴定序列变异位点信息,运用高特异Taq Man探针实时荧光PCR检测技术,可实现翠云草真伪快速鉴别,具有中药材市场监管应用前景,将为中药材快速鉴定应用研究提供参考。 展开更多
关键词 翠云草 DNA条形码 TAQMAN探针 荧光定量PCR 快速鉴定
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肉制品中牛源性成分Taqman荧光定量PCR检测法的建立 预览 被引量:1
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作者 李亮 赵新 +5 位作者 刘娜 尚宏丽 王永 兰青阔 柏韵 王宁 《食品工业科技》 CSCD 北大核心 2018年第10期251-254,261共5页
本实验根据牛线粒体差异序列设计特异性PCR引物和Taqman探针,并基于16S r DNA内参基因设计通用引物及Taqman探针,绘制并通过标准曲线确定样品中总DNA浓度以及牛源性成分DNA浓度,采用相对定量法测定肉制品中牛源性成分的质量分数。并通... 本实验根据牛线粒体差异序列设计特异性PCR引物和Taqman探针,并基于16S r DNA内参基因设计通用引物及Taqman探针,绘制并通过标准曲线确定样品中总DNA浓度以及牛源性成分DNA浓度,采用相对定量法测定肉制品中牛源性成分的质量分数。并通过特异性、灵敏度实验,及混合肉样回收率及市售肉制品检测,对本方法进行验证。结果表明,方法特异性强,可对牛肉DNA进行特异性扩增。最低检出限为10 pg/μL,具有较高的灵敏度。并根据回收实验可知,平均回收率为98.62%。可以为肉制品中牛肉含量的测定提供技术参考。 展开更多
关键词 TAQMAN探针 相对定量 牛源性 肉制品
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多杀性巴氏杆菌TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立与应用 预览
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作者 许腾林 邢桂玲 +7 位作者 刘家森 刘大飞 李志杰 姜骞 康洪涛 田进 郭东春 曲连东 《中国预防兽医学报》 CSCD 北大核心 2018年第8期706-710,共5页
为建立一种多杀性巴氏杆菌(Pm)快速敏感的检测方法,本实验根据Pm70株kmt1基因保守区设计特异性引物和TaqMan探针,建立了该菌的TaqMan荧光定量PCR检测方法,并优化了检测反应条件。本实验建立的荧光定量PCR方法可以特异性检测Pm,而对鸭... 为建立一种多杀性巴氏杆菌(Pm)快速敏感的检测方法,本实验根据Pm70株kmt1基因保守区设计特异性引物和TaqMan探针,建立了该菌的TaqMan荧光定量PCR检测方法,并优化了检测反应条件。本实验建立的荧光定量PCR方法可以特异性检测Pm,而对鸭疫里默氏杆菌、支气管败血波氏杆菌等菌株检测结果均为阴性,表明该方法具有良好的特异性。该方法对C48-1株标准品的检测灵敏度为1.75×10^1拷贝/μL,优于常规PCR检测方法(1.75×10^3拷贝/μL) 100倍;组内和组间重复性试验的变异系数均小于2%,具有良好的重复性。对20份疑似感染的临床病料样品(鸡肝脏、牛肺脏)进行增菌培养和分离鉴定,结果分离到8株多杀性巴氏杆菌;以建立的荧光定量PCR方法与常规PCR方法对增菌培养液进行检测,阳性率分别为40%(8/20)和25%(5/20),且荧光定量PCR方法与常规细菌分离鉴定的符合率为100%。对C48-1株感染致死的20份小鼠肝脏和脾脏组织研磨液进行检测,阳性率均为100%。本研究建立的方法能够快速、敏感的检测Pm,对于其临床和实验室的快速诊断具有重要意义。 展开更多
关键词 多杀性巴氏杆菌 TAQMAN探针 荧光定量PCR
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鸭瘟病毒TaqMan实时荧光定量PCR方法的建立 预览
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作者 万春和 刘荣昌 +6 位作者 陈翠腾 程龙飞 施少华 傅光华 陈红梅 傅秋玲 黄瑜 《福建农林大学学报:自然科学版》 CSCD 北大核心 2018年第6期722-728,共7页
根据鸭瘟病毒(DEV)gE基因的特征,设计特异性引物和探针,经条件优化后,建立检测DEV的TaqMan实时荧光定量PCR方法.结果表明:当gE基因含量为1.0×10^1-1.0×10^6拷贝·μL^-1时,建立的实时荧光定量PCR检测方法有良好的线性... 根据鸭瘟病毒(DEV)gE基因的特征,设计特异性引物和探针,经条件优化后,建立检测DEV的TaqMan实时荧光定量PCR方法.结果表明:当gE基因含量为1.0×10^1-1.0×10^6拷贝·μL^-1时,建立的实时荧光定量PCR检测方法有良好的线性扩增,其标准曲线方程为:y=-3.480x+37.955,扩增相关系数为0.999,敏感性强,最低检测限为10拷贝·μL^-1,特异性好,仅对DEV强毒株和弱毒活疫苗株检测到阳性扩增信号,对鸭源其他传染病病原(番鸭细小病毒、鹅细小病毒、鸭腺病毒A型、鸭甲肝病毒1型、鸭甲肝病毒3型、番鸭呼肠孤病毒、新型鸭呼肠孤病毒、H9N2亚型禽流感病毒、禽1型副粘病毒、鸭源大肠杆菌、鸭疫里默氏杆菌、鸭源禽多杀性巴氏杆菌)检测均为阴性,重复性好,组内变异系数和组间变异系数分别为0.62%-1.14%和0.69%-2.40%.对临床送检疑似DEV感染的14份样品进行检测,并与常规PCR方法、病毒分离鉴定进行比较,阳性率分别为85.71%(12/14)、71.43%(10/14)和57.14%(8/14),且与常规PCR方法、病毒分离鉴定的阳性符合率均为100%.本试验建立的TaqMan实时荧光定量PCR方法,可用于开发DEV快速诊断试剂盒,用于开展DEV流行病学调查. 展开更多
关键词 鸭瘟病毒 GE基因 TAQMAN探针 实时荧光定量PCR方法
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新疆棉花黄萎病株内生真菌荧光定量检测及时空动态分析
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作者 史应武 楚敏 +8 位作者 杨红梅 高雁 张涛 曾军 林青 李玉国 欧提库尔 娄恺 罗明 《微生物学通报》 CSCD 北大核心 2018年第2期376-385,共10页
【背景】棉花黄萎病严重制约新疆棉花持续高产和稳产,内生菌在棉花黄萎病生物防治中潜力巨大。棉花黄萎病发生与内生菌有密切关系,但棉花黄萎病株内生真菌含量的研究鲜见报道。【目的】了解棉花黄萎病株内生真菌数量的时空动态变化及其... 【背景】棉花黄萎病严重制约新疆棉花持续高产和稳产,内生菌在棉花黄萎病生物防治中潜力巨大。棉花黄萎病发生与内生菌有密切关系,但棉花黄萎病株内生真菌含量的研究鲜见报道。【目的】了解棉花黄萎病株内生真菌数量的时空动态变化及其与黄萎病病原数量的关系。【方法】用TaqMan探针实时荧光定量PCR方法对棉花黄萎病株内生真菌数量进行周年动态测定,分析棉花内生真菌数量与黄萎病原菌数量的关系。【结果】不同生育时期棉花植株根部内生真菌数量表现出不同变化趋势。库尔勒棉花吐絮期根部最大值达1.46×109 copies/g FRW,阿拉尔棉花根部内生真菌数量表现为蕾期缓慢上升,花铃期达到最大值,为8.30×107 copies/g FRW。棉花根部内生真菌数量以南疆棉区库尔勒的数量最高,吐絮期平均达1.46×109 copies/g FRW;其次为阿拉尔,花期平均达8.30×107 copies/g FRW;精河最少,苗期平均为1.85×104 copies/g FRW。棉花根部内生真菌数量的空间变化趋势是南疆、东疆、北疆依次递减:南疆库尔勒和阿拉尔内生真菌数量较高,库尔勒吐絮期达到最大值1.46×109 copies/g FRW,其次为阿拉尔8.30×107 copies/g FRW,精河最低1.85×104 copies/g FRW。精河棉花内生真菌数量与黄萎病病原菌数量显著正相关,其皮尔逊相关系数高达0.639。石河子和哈密棉花内生真菌与黄萎病病原菌呈负相关,其相关系数分别为-0.180和-0.275。其他内生真菌与黄萎病病原菌之间存在正相关,但相关性不显著。【结论】棉花黄萎病株根部内生真菌含量较高,内生真菌数量均随采样棉花生育时期和采样地点不同而呈现波动性变化,内生真菌数量最大值出现在库尔勒花铃期。 展开更多
关键词 棉花 内生真菌 TAQMAN探针 荧光定量PCR
应用TaqMan探针荧光定量PCR技术鉴定Leprdb/+小鼠子代基因型 预览
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作者 赵英政 彭强 +5 位作者 闫婷婷 张旭旭 翟晓楠 吴卫东 易宪文 徐光翠 《中国实验动物学报》 CSCD 北大核心 2018年第2期207-210,共4页
目的 建立一种高效的应用TaqMan探针荧光定量PCR技术对Leprdb/+小鼠子代基因分型的方法。方法 提取228例Leprdb/+小鼠子代鼠尾DNA,针对Lepr基因的突变位点(rs1801133)设计1对PCR引物和2条TaqMan探针。设定条件进行实时荧光PCR扩增,用SD... 目的 建立一种高效的应用TaqMan探针荧光定量PCR技术对Leprdb/+小鼠子代基因分型的方法。方法 提取228例Leprdb/+小鼠子代鼠尾DNA,针对Lepr基因的突变位点(rs1801133)设计1对PCR引物和2条TaqMan探针。设定条件进行实时荧光PCR扩增,用SDS软件对SNP位点进行分型。通过2月龄动物的肥胖表现型验证并进行Hardy-Weinberg平衡检验。结果 用建立的TaqMan探针荧光定量PCR方法对228份样本进行检测,其中GG基因型64份,基因型频率为0.1929;GT基因型123份,基因型频率为0.5395;TT基因型41份基因型频率为0.2807。TaqMan探针荧光定量PCR方法分型结果与通过肥胖表现型分型结果比较,灵敏度为97.56%,特异度为99.47%。结论 应用TaqMan探针荧光定量PCR技术可实现对Leprdb/+小鼠子代基因位点的早期分型检测,方法简便,高效。 展开更多
关键词 TAQMAN探针 Leprdb/+小鼠 基因分型
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Taqman探针荧光PCR法检测食品中的大肠埃希氏菌O145 被引量:1
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作者 游淑珠 唐食明 +5 位作者 蔡教英 姚丽锋 王小玉 冯家望 丁琦 符家忍 《现代食品科技》 北大核心 2018年第3期191-195,202共6页
针对大肠埃希氏菌O145的O抗原基因簇的wck D基因的特异性序列设计引物和Taqman探针,建立检测大肠埃希氏菌O145的荧光PCR方法,对其灵敏度、特异性进行验证,并将其用于食品样品的检测。结果表明,本研究中的方法可实现对大肠埃希氏菌O145... 针对大肠埃希氏菌O145的O抗原基因簇的wck D基因的特异性序列设计引物和Taqman探针,建立检测大肠埃希氏菌O145的荧光PCR方法,对其灵敏度、特异性进行验证,并将其用于食品样品的检测。结果表明,本研究中的方法可实现对大肠埃希氏菌O145的特异性扩增,其它27株非O145大肠埃希氏菌和20株非大肠埃希氏菌细菌的菌株均无扩增;检测的灵敏度可达165拷贝/反应;339份食品样品EC肉汤增菌后用本荧光PCR法进行检测,检出大肠埃希氏菌O145阳性31份,阳性率为9.1%。实验结果表明,本研究成功建立了可用于食品中大肠埃希氏菌O145的Taqman探针荧光PCR方法,食品样品采用EC肉汤增菌24 h、热裂解法提取核酸,增菌后检测所需时间由至少3 d~7 d缩短为仅需2 h~3 h,食品检测全过程仅需约28 h,经证实本方法特异性强、操作简便,为食品中大肠埃希氏菌O145提供了一种的快速检测手段。 展开更多
关键词 大肠埃希氏菌 O145血清型 TAQMAN探针 荧光PCR 食品 检测
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