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乙型肝炎病毒HBx蛋白与醛缩酶B相互作用的验证
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作者 赵福河 焦佰海 焦伯延 《中国卫生检验杂志》 CAS 2019年第4期393-395,399共4页
目的验证乙型肝炎病毒HBx蛋白与醛缩酶B(ALDOB)存在蛋白相互作用。方法在CytoTrap细胞质酵母双杂交验证HBx蛋白与ALDOB蛋白发生相互作用的前提下,将HBx编码基因和ALDOB编码基因分别克隆入pFLAG-CMV-2载体和pcDNA3.1/myc-His(-)A载体。转... 目的验证乙型肝炎病毒HBx蛋白与醛缩酶B(ALDOB)存在蛋白相互作用。方法在CytoTrap细胞质酵母双杂交验证HBx蛋白与ALDOB蛋白发生相互作用的前提下,将HBx编码基因和ALDOB编码基因分别克隆入pFLAG-CMV-2载体和pcDNA3.1/myc-His(-)A载体。转染Huh7肝细胞,经蛋白质印迹法检测融合蛋白表达后,利用免疫共沉淀(CO-IP)进一步验证HBx蛋白与ALDOB蛋白在肝细胞内发生相互作用。结果 CytoTrap细胞质酵母双杂交验证HBx蛋白与ALDOB蛋白可以发生相互作用,并成功构建pFLAG-CMV-2-HBx和pcDNA3.1/myc-His(-)A-ALDOB载体,融合蛋白FLAG-HBx和ALDOB-myc可以在Huh7细胞内表达并能相互沉淀。结论 HBx蛋白和ALDOB蛋白存在直接相互作用。 展开更多
关键词 HBX蛋白 醛缩酶B 免疫共沉淀
大鼠H9c2心肌细胞中SK2通道和JP2蛋白的表达及定位 预览
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作者 罗天霞 樊红琨 +2 位作者 李立人 闫宁宁 章茜 《郑州大学学报:医学版》 CAS 北大核心 2019年第1期15-18,共4页
目的:研究大鼠H9c2心肌细胞中SK2通道和JP2蛋白的表达及定位,探讨二者的相互作用。方法:采用Western blot检测SK2通道及JP2蛋白在H9c2细胞中的表达,免疫共沉淀鉴定JP2与SK2通道之间的相互作用,免疫荧光标记观察SK2通道和JP2蛋白在H9c2... 目的:研究大鼠H9c2心肌细胞中SK2通道和JP2蛋白的表达及定位,探讨二者的相互作用。方法:采用Western blot检测SK2通道及JP2蛋白在H9c2细胞中的表达,免疫共沉淀鉴定JP2与SK2通道之间的相互作用,免疫荧光标记观察SK2通道和JP2蛋白在H9c2细胞的定位。结果:心肌细胞H9c2表达SK2通道及JP2蛋白,SK2通道和JP2蛋白可形成免疫复合物,SK2通道和JP2蛋白存在部分共定位。结论:心肌细胞H9c2中SK2通道与JP2蛋白存在相互作用。 展开更多
关键词 SK2通道 JP2蛋白 H9C2心肌细胞 免疫共沉淀 大鼠
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单纯疱疹病毒1型US11蛋白结合DNA甲基转移酶3A的作用研究 预览
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作者 钟霞 潘建华 童坚 《实用医学杂志》 CAS 北大核心 2019年第1期56-60,共5页
目的通过免疫共沉淀联合质谱分析筛查与单纯疱疹病毒1型(HSV-1)中US11蛋白存在潜在相互作用的宿主蛋白。方法使用荧光标记的HSV-1病毒感染人成纤维细胞(HFF),通过免疫共沉淀(IP)方法对US11及其相互作用蛋白进行提取和纯化,并与质谱(MS)... 目的通过免疫共沉淀联合质谱分析筛查与单纯疱疹病毒1型(HSV-1)中US11蛋白存在潜在相互作用的宿主蛋白。方法使用荧光标记的HSV-1病毒感染人成纤维细胞(HFF),通过免疫共沉淀(IP)方法对US11及其相互作用蛋白进行提取和纯化,并与质谱(MS)联用来鉴定相关蛋白。结果利用IP-MS分析技术成功筛选出7个与US11存在潜在相互作用宿主蛋白,其中DNA甲基转移酶3A(DNMT3A)被定性为一种新的US11结合蛋白。结论HSV-1病毒US11蛋白与哺乳动物DNA甲基转移酶机制的功能关联,DNMT3A是HSV-1感染所需的有效宿主因子。 展开更多
关键词 免疫共沉淀 质谱 单纯疱疹病毒1型 US11蛋白 DNA甲基转移酶3A
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筛选和鉴定与东方田鼠抗性基因ILKAP表达蛋白相互结合的日本血吸虫童虫蛋白
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作者 李荣 熊德慧 胡维新 《中国寄生虫学与寄生虫病杂志》 CAS CSCD 北大核心 2019年第2期121-126,共6页
目的筛选和鉴定与东方田鼠抗性基因整合素连接激酶相关丝氨酸/苏氨酸磷酸酶(ILKAP)表达蛋白相互结合的日本血吸虫童虫蛋白。方法提取东方田鼠骨髓细胞蛋白和日本血吸虫童虫蛋白,进行免疫共沉淀,实验组为东方田鼠骨髓蛋白+日本血吸虫童... 目的筛选和鉴定与东方田鼠抗性基因整合素连接激酶相关丝氨酸/苏氨酸磷酸酶(ILKAP)表达蛋白相互结合的日本血吸虫童虫蛋白。方法提取东方田鼠骨髓细胞蛋白和日本血吸虫童虫蛋白,进行免疫共沉淀,实验组为东方田鼠骨髓蛋白+日本血吸虫童虫蛋白+ILKAP抗体+磁性珠子,阴性对照组以兔IgG抗体代替ILKAP抗体,阳性对照组为东方田鼠骨髓蛋白或日本血吸虫童虫蛋白。十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)对免疫沉淀复合物进行分离,切取差异性蛋白条带通过基质辅助激光解吸飞行时间质谱仪(MALDI-TOF-MS)鉴定,获得的混合物肽片段利用Mascot软件进行分析检索。分别以东方田鼠骨髓cDNA和日本血吸虫童虫cDNA为模板,RT-PCR扩增东方田鼠ILKAP(MfILKAP)基因和日本血吸虫表膜抗原(SjTA)基因。将MfILKAP和SjTA基因分别克隆至真核表达载体Flag-pCMV-2b和Myc-pcDNA3.1/(-)b中,构建的重组质粒Flag-ILKAP-pCMV-2b和Myc-TA-pcDNA3.1/(-)b共转染至HEK293T细胞中作为实验组,设阴性对照组Myc-TA-pcDNA3.1/(-)b或Flag-ILKAP-pCMV-2b和空白对照组Myc-pcDNA3.1/(-)b或Flag-pCMV-2b。用抗体Myc、Flag以及ILKAP分别与转染后的HEK293T细胞总蛋白进行免疫共沉淀和蛋白质印迹(Western blotting)分析。结果东方田鼠骨髓细胞蛋白和日本血吸虫童虫蛋白经过免疫共沉淀实验,结果显示,实验组与阴性对照组、阳性对照组相比,有差异条带。经MAIDI-TOF-MS鉴定,利用Mascot软件中的串级质谱数据搜索功能进行搜索鉴定,鉴定出与东方田鼠ILKAP抗体相互作用的日本血吸虫童虫蛋白8种。RT-PCR结果显示,ILKAP和TA在东方田鼠骨髓和日本血吸虫童虫中均有表达,东方田鼠骨髓ILKAP的扩增产物为1100~1200bp,理论值为1147bp,日本血吸虫童虫TA基因的扩增产物大小为500~600bp,理论值为561bp。质粒pCMV-Tag2b、pcDNA3.1/myc-His(-)b经酶切后,均有单一条带,分别约为4300、5500bp;重组� 展开更多
关键词 东方田鼠 日本血吸虫 整合素连接激酶相关丝氨酸/苏氨酸磷酸酶 免疫共沉淀
白斑综合症病毒极早期蛋白WSV403相互作用蛋白的筛选 预览
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作者 马艳丽 李钫 杨丰 《应用海洋学学报》 CSCD 北大核心 2019年第3期373-380,共8页
WSV403是白斑综合症病毒(WSSV)的一个极早期基因,它编码一种E3泛素连接酶。在293T细胞中,利用串联亲和纯化和蛋白质谱技术筛选WSV403的相互作用蛋白,获得了15个可能与WSV403结合的蛋白。在此基础上对5个候选基因进行了克隆,并分别将它们... WSV403是白斑综合症病毒(WSSV)的一个极早期基因,它编码一种E3泛素连接酶。在293T细胞中,利用串联亲和纯化和蛋白质谱技术筛选WSV403的相互作用蛋白,获得了15个可能与WSV403结合的蛋白。在此基础上对5个候选基因进行了克隆,并分别将它们与WSV403基因共表达。通过免疫共沉淀和免疫荧光分析证实了WSSV极早期蛋白WSV403能够与核转运蛋白(KPNA6)、丝/苏氨酸蛋白磷酸酶2A65kDa调节亚基A(PPP2RIA)和striatin(STRN)发生相互作用。该研究结果为进一步揭示WSV403的作用机制奠定了基础。 展开更多
关键词 海洋生物学 白斑综合症病毒 WSV403 免疫共沉淀 相互作用
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家蚕AGO1蛋白结合RNA的分离与鉴定
6
作者 杨帆 高珍 +4 位作者 马亚飞 蒋彩英 吕正兵 盛清 聂作明 《蚕业科学》 CAS CSCD 北大核心 2019年第3期346-352,共7页
RNA诱导的基因沉默复合体(RNA-induced silencing complex,RISC)核心蛋白为Argonaute(AGO)家族蛋白,作为miRNA及RNAi功能途径中的关键蛋白,能够结合miRNA和siRNA,降解靶标基因mRNA或抑制其翻译。因此,利用AGO蛋白抗体通过免疫沉淀分离... RNA诱导的基因沉默复合体(RNA-induced silencing complex,RISC)核心蛋白为Argonaute(AGO)家族蛋白,作为miRNA及RNAi功能途径中的关键蛋白,能够结合miRNA和siRNA,降解靶标基因mRNA或抑制其翻译。因此,利用AGO蛋白抗体通过免疫沉淀分离其结合RNA是目前规模化分离鉴定miRNA及相关小RNA靶基因的重要方法。首先对家蚕AGO1基因进行克隆表达和抗体制备,用自制的兔多克隆抗体免疫沉淀家蚕组织内源BmAGO1蛋白,成功分离BmAGO1蛋白结合的RNA;同时在BmN细胞中采用6×His标签融合表达BmAGO1蛋白,用His单抗免疫沉淀His-BmAGO1蛋白,同样成功分离获得其结合RNA。qRT-PCR检测发现,BmAGO1蛋白结合的RNA中含有家蚕miRNA靶基因BmEm4的mRNA。研究结果为批量鉴定家蚕miRNA靶基因奠定了基础,同时也为深入研究BmAGO1蛋白在家蚕中的功能提供了依据。 展开更多
关键词 家蚕 BmAGO1蛋白 免疫共沉淀 AGO结合RNA miRNA靶基因
家蚕热休克蛋白HSP60相互作用蛋白筛选与鉴定 预览
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作者 董战旗 蒋亚明 潘敏慧 《中国农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2019年第2期376-384,共9页
【目的】HSP60是热休克蛋白中重要的一员,在昆虫先天性免疫过程中起重要作用,同时也是昆虫生长发育的必要因子。前期研究证明家蚕BmHSP60参与家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,BmNPV)入侵细胞过程,本研究通过鉴定Bm... 【目的】HSP60是热休克蛋白中重要的一员,在昆虫先天性免疫过程中起重要作用,同时也是昆虫生长发育的必要因子。前期研究证明家蚕BmHSP60参与家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,BmNPV)入侵细胞过程,本研究通过鉴定BmHSP60相互作用蛋白,为其在家蚕先天性免疫中作用机制研究打下基础。【方法】利用免疫共沉淀和银联-质谱分析技术(LC-MS/MS),首先构建BmHSP60过表达载体并融合Flag标签,转染到家蚕细胞中48 h后,收集蛋白,进行免疫共沉淀,用Flag抗体孵育磁珠调取相互作用蛋白,银染处理后,能够检测到明显的差异条带,把差异条带切胶保存在-80℃,然后质谱分析差异条带的多肽;根据质谱结果和差异条带的大小与NCBI数据库进行比对,筛选到候选相互作用蛋白。最后,构建候选相互作用蛋白的克隆载体并融合HA标签,分别和BmHSP60表达载体共转到家蚕细胞,免疫共沉淀和荧光共定位验证BmHSP60和候选蛋白之间的相互作用。并通过Mito-Tracker-Green分析BmHSP60候选相互作用蛋白与线粒体的共定位。【结果】免疫共沉淀银染结果显示BmHSP60相互作用蛋白在110、90、75、60和35 kD附近有5条明显的差异条带,将这5条条带混成蛋白池进行质谱分析,通过银联-质谱分析结果和家蚕基因组数据库以及NCBI数据库进行比对分析共鉴定到32个差异蛋白,根据多肽数量和蛋白分子量的大小共筛选到5个相互作用候选蛋白与银染结果差异条带一致,分别为ADP/ATP translocase(ANT)、Actin、Alpha-tubulin、Elongation factor 1-alpha(EF1α)和HSP90。构建BmHSP60候选相互作用蛋白克隆表达载体并融合HA标签,与BmHSP60共同转染到家蚕细胞,免疫共沉淀immunoprecipitated(IP)用α-Flag抗体孵育,immunoblotting(IB)再用α-Flag抗体孵育,均能够检测到BmHSP60表达。而IB用α-HA抗体孵育显示只有BmANT和BmHSP90能够检测到相应的条带,而Alpha-tubulin和EF1 展开更多
关键词 家蚕 BmHSP60 相互作用蛋白 免疫共沉淀 BmANT1 BmHSP90
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免疫共沉淀与质谱联用检测拟南芥SIK1/Hippo互作蛋白
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作者 张平平 龚清秋 《南开大学学报:自然科学版》 CAS CSCD 北大核心 2019年第4期93-98,112共7页
Hippo通路是迄今为止发现的最重要的负调控动物器官大小的信号通路之一,其核心由两对级联的激酶-脚手架蛋白复合物构成.本实验室在前期工作中首次发现了拟南芥Hippo(Hpo)的同功能基因SIK1,并建立了与Hpo-Mats对应的SIK1-MOB1模块,发现... Hippo通路是迄今为止发现的最重要的负调控动物器官大小的信号通路之一,其核心由两对级联的激酶-脚手架蛋白复合物构成.本实验室在前期工作中首次发现了拟南芥Hippo(Hpo)的同功能基因SIK1,并建立了与Hpo-Mats对应的SIK1-MOB1模块,发现其通过促进退出细胞分裂与细胞延展,参与植物侧生器官大小的调控.为进一步探究SIK1调控器官大小的分子机制,构建了SIK1-GFP转基因株系,用GFP-Trap免疫共沉淀方法捕获与SIK1内源互作的蛋白,并进行质谱分析,获得了SIK1的候选互作蛋白.研究结果将为后续建立完整的植物Hippo信号通路打下基础. 展开更多
关键词 Hippo通路 免疫共沉淀 GFP-Trap 质谱 SIK1
鸭胚成纤维细胞上坦布苏病毒受体蛋白的鉴定 预览
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作者 赵冬敏 韩凯凯 +7 位作者 刘青涛 黄欣梅 杨婧 刘宇卓 章丽娇 田宇杰 王梦瑶 李银 《南方农业学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第1期173-178,共6页
【目的】拓展对坦布苏病毒受体的认知,为研究其在鸭体内的感染机制打下基础。【方法】取9日龄SPF鸭胚制备鸭胚成纤维细胞(DEF),待细胞长成单层后提取DEF膜蛋白,利用免疫共沉淀试验筛选出DEF膜蛋白中可与坦布苏病毒结合的蛋白,经病毒辅... 【目的】拓展对坦布苏病毒受体的认知,为研究其在鸭体内的感染机制打下基础。【方法】取9日龄SPF鸭胚制备鸭胚成纤维细胞(DEF),待细胞长成单层后提取DEF膜蛋白,利用免疫共沉淀试验筛选出DEF膜蛋白中可与坦布苏病毒结合的蛋白,经病毒辅覆蛋白结合分析(VOPBA)验证后通过LC-MSMS质谱分析进行鉴定;同时人工合成鸭热休克蛋白70基因(HSP70)序列的开放阅读框(1905 bp),构建重组质粒pET32a-HSP70并转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达,以重组蛋白免疫小鼠制备抗鸭HSP70血清,与DEF细胞共孵育后接种坦布苏病毒,并采用实时荧光定量PCR检测抗血清对病毒感染的抑制作用。【结果】DEF膜蛋白中分子量约70 kD的蛋白可与坦布苏病毒结合,经LC-MSMS质谱分析和序列比对可确定该蛋白即为鸭热休克蛋白70(HSP70)。含重组质粒pET32aHSP70的BL21(DE3)感受态细胞经IPTG诱导4 h后,SDS-PAGE检测发现在分子量约85 kD处出现目的蛋白条带,获得的重组鸭HSP70蛋白主要以包涵体形式进行表达,且能与His标签抗体发生特异性反应。以重组鸭HSP70蛋白免疫小鼠获得的抗鸭HSP70血清可封闭DEF细胞上的HSP70,而竞争性抑制坦布苏病毒感染。【结论】HSP70是坦布苏病毒感染DEF细胞的受体,可作为新的靶点用于抗坦布苏病毒药物设计。 展开更多
关键词 坦布苏病毒 鸭胚成纤维细胞 热休克蛋白70 受体 免疫共沉淀 病毒辅覆蛋白结合分析(VOPBA)
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免疫共沉淀法测定14-3-3ε蛋白与Cdc25B的相互作用 预览
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作者 李瑞林 孟峻 刘儒 《山西医科大学学报》 CAS 2019年第7期889-893,共5页
目的研究14-3-3ε蛋白与Cdc25B的相互作用及其作用位点,为小鼠卵母细胞减数分裂G2期阻滞的机制研究提供实验依据。方法本实验依次构建pcDNA3.1-ZEO-HA-14-3-3ε、pEGFP-Cdc25B-WT、pEGFP-Cdc25B-Ser321A、pEGFP-Cdc25B-Ser321D表达载体... 目的研究14-3-3ε蛋白与Cdc25B的相互作用及其作用位点,为小鼠卵母细胞减数分裂G2期阻滞的机制研究提供实验依据。方法本实验依次构建pcDNA3.1-ZEO-HA-14-3-3ε、pEGFP-Cdc25B-WT、pEGFP-Cdc25B-Ser321A、pEGFP-Cdc25B-Ser321D表达载体,分别转染HEK293细胞,分为四组,分别为Cdc25B-vector+14-3-3ε组(空载体组),Cdc25B-WT+14-3-3ε组,Cdc25B-Ser321A+14-3-3ε组,Cdc25B-Ser321D+14-3-3ε组。通过免疫共沉淀法获得各组细胞裂解液及免疫沉淀物,用Western blotting检测Cdc25B-vector、Cdc25B-WT、Cdc25B-Ser321A、Cdc25B-Ser321D与14-3-3ε蛋白是否有共沉淀,如有共沉淀,说明两蛋白存在相互作用。结果本实验构建的4种表达载体经验证均构建成功。免疫共沉淀实验得出14-3-3ε能与野生型Cdc25B结合,当Cdc25B的S321突变成S321A时,这种结合不发生;而具有模拟磷酸化作用的Cdc25B-S321D也能与14-3-3ε结合。结论Cdc25B S321是14-3-3ε蛋白与Cdc25B相互作用的特异性结合位点,此结合位点可能成为14-3-3ε蛋白与Cdc25B共同调控小鼠卵母细胞减数分裂进程及G2期阻滞的重要靶点,为后期哺乳动物生殖细胞的相关研究奠定实验基础。 展开更多
关键词 14-3-3ε蛋白 CDC25B 作用位点 免疫共沉淀
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基于免疫共沉淀技术探讨涤痰通瘀方对急性脑出血大鼠应激性肝损害的调控作用
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作者 马迪 王威 +3 位作者 许晓英 张秀静 王帅 赵海滨 《北京中医药大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第2期138-142,共5页
目的研究急性脑出血大鼠应激性肝损害细胞因子信号转导抑制因子1(SOCS1)与白细胞介素-1受体相关激酶(IRAKs)的交叉对话及涤痰通瘀方对其的调控作用。方法将SD大鼠随机分成脑出血组、涤痰通瘀组、正常组。建立大鼠急性脑出血模型,采用免... 目的研究急性脑出血大鼠应激性肝损害细胞因子信号转导抑制因子1(SOCS1)与白细胞介素-1受体相关激酶(IRAKs)的交叉对话及涤痰通瘀方对其的调控作用。方法将SD大鼠随机分成脑出血组、涤痰通瘀组、正常组。建立大鼠急性脑出血模型,采用免疫共沉淀法检测SOCS1与IRAK-1、2、4、M之间的相互作用,并观察造模后不同时相点各组大鼠肝组织病理染色结果。结果 SOCS1与IRAK-1、2、4、M可以相互作用,对急性脑出血大鼠肝损害起到一定的保护作用,同时涤痰通瘀方对SOCS1/IRAKs交叉对话有一定的调控作用。结论SOCS1/IRAK-1、2、4、M相互作用,对LPS细胞内信号转导炎性级联反应起到抑制效应,在肝损害保护效应中发挥关键作用。经涤痰通瘀方干预后,可以有效改善肝组织病理学结构,是防治脑出血应激性肝损害的重要途径。 展开更多
关键词 免疫共沉淀 细胞因子信号转导抑制因子1 白介素-1受体相关激酶 涤痰通瘀方 大鼠
家蚕AGO2蛋白的单克隆抗体制备 被引量:2
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作者 朱兵 曹赟洁 +2 位作者 周雍 盛清 聂作明 《蚕业科学》 CSCD 北大核心 2018年第3期376-381,共6页
Argonaute(AGO)蛋白家族在小RNA诱导的基因沉默中发挥重要作用。基于家蚕基因组测序发现的AGO蛋白编码序列,选择Bm AGO2为目标蛋白质,制备该蛋白质的单克隆抗体,为进一步研究其介导的miRNA靶基因以及基因调控网络奠定试验基础。通过分... Argonaute(AGO)蛋白家族在小RNA诱导的基因沉默中发挥重要作用。基于家蚕基因组测序发现的AGO蛋白编码序列,选择Bm AGO2为目标蛋白质,制备该蛋白质的单克隆抗体,为进一步研究其介导的miRNA靶基因以及基因调控网络奠定试验基础。通过分析Bm AGO2蛋白的抗原性分布,筛选出Bm AGO2抗原表位区aAGO2,设计引物扩增目的片段,构建重组表达载体p ColdⅡ-aAGO2原核表达aAGO2蛋白,以纯化后的aAGO2蛋白免疫BALB/c小鼠。剖取免疫小鼠脾脏,将脾细胞与骨髓瘤细胞Sp2/0融合。以HAT选择培养基及间接ELISA法筛选阳性克隆,经Western blotting和免疫沉淀检测,获得2株生长状态好、能分泌高效价抗体的单克隆杂交瘤细胞株I5-A9和E1-3。经抗体亚型检测后,选择细胞株I5-A9进行大量培养,菌液注射小鼠腹腔制备的腹水经辛酸-硫酸铵沉淀及Protein A/G亲和层析纯化,获得了纯度较高的Bm AGO2单克隆抗体。利用获得的抗体免疫共沉淀家蚕卵巢培养细胞Bm N以及家蚕5龄幼虫的内源Bm AGO2蛋白,从分离的结合RNA检测到小RNA被显著富集,表明成功制备了可用于免疫共沉淀的Bm AGO2单克隆抗体并分离BmAGO2结合的RNA。 展开更多
关键词 家蚕 BmAGO2蛋白 单克隆抗体 免疫共沉淀
PRRSV 2b蛋白与LGALS1相互作用的验证研究 预览
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作者 杨达汉 邓守全 +5 位作者 崔一龙 刘锴 王学理 霍晓伟 马德慧 薛江东 《中国农学通报》 2018年第29期112-117,共6页
旨在研究猪繁殖与呼吸综合症病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)2b蛋白与宿主细胞蛋白之间的相互作用。本研究利用酵母回返试验、GST-pull down试验、免疫共沉淀试验3种方法对LGALS1与PRRSV 2b蛋白间... 旨在研究猪繁殖与呼吸综合症病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)2b蛋白与宿主细胞蛋白之间的相互作用。本研究利用酵母回返试验、GST-pull down试验、免疫共沉淀试验3种方法对LGALS1与PRRSV 2b蛋白间是否相互作用进行验证。结果表明:在酵母回返试验中,含有LGALS1与2b基因的杂交酵母菌株在SD/-Trp-Leu-His-Ade/AbA/X-α-gal的平板上生长出蓝色菌落;在GST-pull down试验中,LGALS1与2b蛋白反应的样品经Western blot可检测到融合蛋白带;在免疫共沉淀试验中,LGALS1与2b蛋白反应的样品经HA单抗沉淀后,经Western blot可检测到相应蛋白带。该研究证明了LGALS1与PRRSV 2b蛋白间发生相互作用,为研究PRRSV感染途径和增殖过程提供了理论基础。 展开更多
关键词 2b蛋白 LGALS1(凝集素-1) 酵母双杂交 蛋白质体外结合实验 免疫共沉淀
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MEF2C基因调节猪骨骼肌肌纤维的发育表达
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作者 朱弘焱 沈芷伊 +3 位作者 张宇婷 许晶 田玉民 苏玉虹 《解剖科学进展》 2018年第4期350-353,共4页
目的研究肌细胞增强因子2C(MEF2C)基因对骨骼肌肌纤维发育表达的调节情况,并探明二者的相关关系。方法实验采集猪骨骼肌,提取组织总RNA,采用实时荧光定量PCR技术检测基因在猪生后七个不同时间点的表达情况;提取猪骨骼肌总蛋白,利用免... 目的研究肌细胞增强因子2C(MEF2C)基因对骨骼肌肌纤维发育表达的调节情况,并探明二者的相关关系。方法实验采集猪骨骼肌,提取组织总RNA,采用实时荧光定量PCR技术检测基因在猪生后七个不同时间点的表达情况;提取猪骨骼肌总蛋白,利用免疫共沉淀,用特异抗体沉淀MEF2C及其相互作用蛋白复合物,经SDS-PAGE分离,洗脱蛋白复合物并酶解,电喷雾质谱技术分析及数据库比对,并通过Western blotting验证蛋白的相互作用。结果猪MEF2C基因在刚出生及生后90d时的表达量高于其他时间点,其发育表达规律与肌纤维相关基因(MyHCslow、MyHC2a、MyHC2x、MyHC2b)的表达趋势类似,成功筛选并鉴定出与转录因子MEF2C相互作用的蛋白为MDHM。结论 MEF2C基因可能参与骨骼肌肌纤维形成与表达,且促进慢肌纤维的表达。 展开更多
关键词 MEF2C 肌纤维 免疫共沉淀 质谱
宫颈癌HeLa细胞内SKP2结合蛋白的筛选和功能预测 被引量:4
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作者 贾静 方健飞 +2 位作者 任娟 贾振宇 王孝举 《中国肿瘤生物治疗杂志》 CSCD 北大核心 2018年第3期258-262,共5页
目的:通过免疫共沉淀与质谱分析技术从宫颈癌HeLa细胞中获取与S期激酶相关蛋白2(S-phase kinase-associated protein 2,SKP2)结合的蛋白质群体并预测其生物功能。方法:以免疫共沉淀与Western blotting技术建立SKP2免疫共沉淀体系,以... 目的:通过免疫共沉淀与质谱分析技术从宫颈癌HeLa细胞中获取与S期激酶相关蛋白2(S-phase kinase-associated protein 2,SKP2)结合的蛋白质群体并预测其生物功能。方法:以免疫共沉淀与Western blotting技术建立SKP2免疫共沉淀体系,以SDS-PAGE和银染技术获得SKP2结合蛋白的特异条带,通过质谱分析技术获得可能与SKP2结合的蛋白群体,应用生物信息学技术对筛选得到的蛋白进行GO分析与KEGG分析。结果:HeLa细胞内存在一定水平的SKP2蛋白表达,可进行免疫共沉淀反应;成功建立了SKP2免疫共沉淀体系,并获得SKP2结合蛋白样品;针对差异的凝胶条带进行质谱分析,共鉴定出SKP2结合蛋白563个;设定筛选条件后,获得可信度较高的SKP2蛋白270个,进行GO分析与KEGG分析后初步预测了结合蛋白参与的细胞功能和信号通路。结论:从宫颈癌HeLa细胞中成功筛选获取SKP2结合蛋白,为后续筛选靶标结合蛋白和寻找细胞靶向药物奠定了基础。 展开更多
关键词 细胞S期激酶相关蛋白2 免疫共沉淀 宫颈癌 结合蛋白
柔嫩艾美耳球虫顶膜抗原-1与微线蛋白-2相互作用的鉴定
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作者 王旭 宫鹏涛 +2 位作者 李建华 杨举 张西臣 《中国病原生物学杂志》 CSCD 北大核心 2018年第3期267-273,共7页
目的研究柔嫩艾美耳球虫顶膜抗原-1(EtAMA1)与微线蛋白-2(EtMIC2)之间的相互作用。方法以柔嫩艾美耳球虫子孢子cDNA为模板,PCR扩增EtAMA1和EtMIC2基因,构建酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-EtAMA1及捕获载体pGADT7-EtMIC2并转化Y2HGold酵... 目的研究柔嫩艾美耳球虫顶膜抗原-1(EtAMA1)与微线蛋白-2(EtMIC2)之间的相互作用。方法以柔嫩艾美耳球虫子孢子cDNA为模板,PCR扩增EtAMA1和EtMIC2基因,构建酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-EtAMA1及捕获载体pGADT7-EtMIC2并转化Y2HGold酵母菌中,观察酵母在营养缺陷选择培养基上的生长情况。原核表达GST-EtAMA1和His-EtMIC2融合蛋白,纯化后进行GST-Pulldown试验。同时构建真核表达载体pcDNA3.1-HisEtAMA1和pcDNA3.1-HA-EtMIC2并转染HEK-293T细胞,收集细胞裂解液,进行免疫共沉淀试验。在此基础上构建双分子荧光互补载体pEtAMA1-Myc-LC151和pEtMIC2-HA-KN151并转染HEK-293T细胞,激光共聚焦观察转染细胞荧光发生情况。结果诱饵基因和捕获基因均对酵母双杂交系统无自激活和毒性作用,pGBKT7-EtAMA1/pGADT7-EtMIC2共转化菌能激活酵母双杂交报告系统;原核表达并纯化GST-EtAMA1和His-EtMIC2融合蛋白进行GST-Pulldown试验,二者可在体外相互作用;EtAMA1和EtMIC2可在HEK-293T细胞中共表达,免疫共沉淀试验进一步证实二者间的相互作用;双分子荧光互补技术验证EtAMA1和EtMIC2在细胞内存在相互作用。结论通过酵母双杂交、GST-Pulldown、免疫共沉淀及双分子荧光互补技术验证柔嫩艾美耳球虫顶膜抗-1(EtAMA1)与微线蛋白-2(EtMIC2)之间存在相互作用,这为揭示微线蛋白在鸡球虫入侵宿主细胞过程中的分子机制提供了理论基础。 展开更多
关键词 顶膜抗原-1 微线蛋白-2 柔嫩艾美耳球虫 蛋白相互作用 免疫共沉淀
去泛素化酶USP13与抑癌蛋白Merlin的相互作用 预览
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作者 徐静 王星 陈大虎 《中国酿造》 北大核心 2018年第11期132-136,共5页
神经纤维瘤病Ⅱ型为遗传性疾病,NF2基因是重要的抑癌基因,其编码的Merlin蛋白表达水平的变化与肿瘤的发生密切相关。Merlin蛋白可以被泛素化修饰,但对其去泛素化过程的研究却鲜有报道。该研究采用免疫共沉淀(Co-IP)及免疫印迹(WB)方法... 神经纤维瘤病Ⅱ型为遗传性疾病,NF2基因是重要的抑癌基因,其编码的Merlin蛋白表达水平的变化与肿瘤的发生密切相关。Merlin蛋白可以被泛素化修饰,但对其去泛素化过程的研究却鲜有报道。该研究采用免疫共沉淀(Co-IP)及免疫印迹(WB)方法研究去泛素化酶USP13与抑癌蛋白Merlin之间的相互作用。结果表明,抑癌蛋白Merlin与去泛素化酶USP13之间具有相互作用,为进一步研究抑癌蛋白Merlin与去泛素化酶USP13之间的关系提供依据。 展开更多
关键词 抑癌蛋白Merlin 去泛素化酶USP13 免疫共沉淀 蛋白质相互作用
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番茄Pti基因瞬时表达与互作检测 预览
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作者 刘莹 冯国栋 +3 位作者 张政 周宇 王洋 牛向丽 《合肥工业大学学报:自然科学版》 北大核心 2018年第12期1700-1704,1723共6页
丁香假单胞菌所导致的细菌性斑点病是影响番茄产量和品质的重要病害,而番茄色氨酸苏氨酸激酶(Pto)是植物识别、防御这一病原菌的重要抗性蛋白。文章通过克隆番茄 Pti (Pto interaction protein)基因 Pti 4、 Pti 5和 Pti 6,分别构建植... 丁香假单胞菌所导致的细菌性斑点病是影响番茄产量和品质的重要病害,而番茄色氨酸苏氨酸激酶(Pto)是植物识别、防御这一病原菌的重要抗性蛋白。文章通过克隆番茄 Pti (Pto interaction protein)基因 Pti 4、 Pti 5和 Pti 6,分别构建植物表达载体,利用农杆菌介导方法在烟草叶片中进行瞬时表达和western blotting检测,并进一步利用免疫共沉淀技术,在植物体系中检测了它们与番茄Pto蛋白的相互作用。实验结果表明,利用所构建 Pti 4、 Pti 5和 Pti 6基因植物表达载体,在烟草中获得了预期大小Pti4、Pti5和Pti 6蛋白,并在植物体系中验证了它们与Pto蛋白的相互作用。该工作为深入研究 Pti 基因在番茄分子免疫途径的功能奠定了基础。 展开更多
关键词 植物抗病 植物表达载体 WESTERN印迹 免疫共沉淀 蛋白质相互作用
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干扰素诱导蛋白Nmi与人巨细胞病毒皮层蛋白UL23相互作用区域的研究 预览
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作者 叶倩宸 陈业伟 +5 位作者 傅政民 李晓钿 冯琳远 杨晓苹 冉艳红 李弘剑 《中国病理生理杂志》 CSCD 北大核心 2018年第7期1270-1276,共7页
目的:探究干扰素诱导蛋白N-Myc相互作用因子(Nmi)与人巨细胞病毒(HCMV)皮层蛋白UL23相互作用的关键区域。方法:根据前期实验结果,分别将10个不同截短突变型的Nmi构建到原核表达载体p GEX-4T-1上,转化到大肠杆菌Rosetta(DE3)感... 目的:探究干扰素诱导蛋白N-Myc相互作用因子(Nmi)与人巨细胞病毒(HCMV)皮层蛋白UL23相互作用的关键区域。方法:根据前期实验结果,分别将10个不同截短突变型的Nmi构建到原核表达载体p GEX-4T-1上,转化到大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞中,表达并纯化出带有GST标签的融合蛋白,利用GST-pulldown的方法探究Nmi与UL23相互作用的区域。根据GST-Pulldown实验结果,用同源重组的方法在真核表达载体pc DNA4-Myc上分别构建3个缺失突变型Nmi。将实验组和对照组的Nmi分别与含有Flag标签的UL23质粒共转染至He La细胞中,通过免疫共沉淀法进一步研究Nmi与UL23的相互作用区域。结果:(1)10个截短突变型Nmi与GST基因融合的原核表达载体构建成功;(2)3个缺失突变型Nmi与Myc基因融合的真核表达载体构建成功;(3)GST-pulldown实验证明Nmi与UL23相互作用位点位于Nmi上的第192~202位氨基酸区域;(4)免疫共沉淀法确认Nmi的第192~202位氨基酸区域是与UL23相互作用的区域,与GST-pulldown实验结果一致。结论:Nmi与UL23相互作用的区域位于Nmi上第192~202位氨基酸区域。这为阐明UL23帮助HCMV在宿主体内潜伏的分子机理提供了基础。 展开更多
关键词 人巨细胞病毒 N-Myc相互作用因子 GST-pulldown实验 免疫共沉淀
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氯离子通道蛋白1的缺失突变体CLIC1(Δ49-51)与Sedlin蛋白相互作用的研究 预览
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作者 洪翠丽 金振辉 +3 位作者 朱亮亮 潘林鑫 耿慧武 刘晓颖 《安徽医科大学学报》 北大核心 2018年第11期1690-1695,共6页
目的 探究胞内氯离子通道蛋白1(CLIC1)的缺失突变体CLIC1(Δ49-51)在哺乳动物细胞中的表达、定位改变,及与Sedlin蛋白在体内、体外相互作用的影响。方法 构建CLIC1的缺失突变体的真核表达质粒pcDNA3.1-CLIC1(Δ49-51)-FLAG;免疫荧... 目的 探究胞内氯离子通道蛋白1(CLIC1)的缺失突变体CLIC1(Δ49-51)在哺乳动物细胞中的表达、定位改变,及与Sedlin蛋白在体内、体外相互作用的影响。方法 构建CLIC1的缺失突变体的真核表达质粒pcDNA3.1-CLIC1(Δ49-51)-FLAG;免疫荧光观察CLIC1(Δ49-51)与Sedlin在COS7细胞中的共定位;在HEK 293T细胞中进行免疫共沉淀和GST pulldown实验,研究CLIC1(Δ49-51)与Sedlin的相互作用。结果 CLIC1(Δ49-51)在COS7细胞中主要定位于细胞质,小部分定位于细胞核。相对于野生型CLIC1的细胞核定位,缺失突变体的细胞内定位发生明显改变并且与Sedlin蛋白没有共定位。Western blot结果显示CLIC1(Δ49-51)能在HEK 293T细胞中有效表达;免疫共沉淀实验结果表明其与Sedlin在体内没有相互作用;GST pulldown结果表明其与Sedlin在体外没有相互作用。结论 CLIC1蛋白的第49~51位氨基酸序列KRR对CLIC1蛋白在细胞内的正确定位发挥重要作用;其缺失突变后影响了CLIC1在细胞内的定位、表达及CLIC1与Sedlin的相互作用。 展开更多
关键词 CLIC1缺失突变体 免疫荧光 免疫共沉淀 GST pulldown
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