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蓬乱蛋白2干扰和过表达慢病毒载体的构建及其在hUVECs中的表达 预览
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作者 生欣 王俊华 +3 位作者 刘月华 郜双林 谢夏丹 范芳 《中国现代医学杂志》 CAS 2019年第1期15-22,共8页
目的获得蓬乱蛋白2(DVL2)基因干扰和过表达慢病毒表达系统,并在人脐静脉内皮细胞中(hUVECs)稳定表达。方法①聚合酶链反应扩增目的基因,设计合成shRNA,以慢病毒表达质粒为基础构建DVL2干扰和过表达载体,酶切电泳、实时荧光定量聚合酶链... 目的获得蓬乱蛋白2(DVL2)基因干扰和过表达慢病毒表达系统,并在人脐静脉内皮细胞中(hUVECs)稳定表达。方法①聚合酶链反应扩增目的基因,设计合成shRNA,以慢病毒表达质粒为基础构建DVL2干扰和过表达载体,酶切电泳、实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)和测序技术鉴定载体构建是否成功;②以3质粒系统在HEK293T细胞中包装病毒,通过荧光显微镜观察计数并计算病毒滴度;以嘌呤霉素筛选稳定转染的hUVECs,通过荧光显微镜观察计数获得转染效率。将感染好的细胞分为BC组(hUVECs空白对照)、NC组(HBLV-GFP-PURO阴性对照)、干扰组(pHB-shRNA-HDVL2)及过表达组(pHBLV-HDVL2)。③通过qRT-PCR与Western blotting检测分别从mRNA和蛋白表达水平验证目的基因的干扰和过表达水平。结果①插入慢病毒表达载体的基因片段与目的基因的碱基序列完全一致。干扰序列峰形图为单峰,无突变。②病毒包装后,NC组、干扰组、过表达组滴度分别为2×10^8、2×10^8和1×10^8TU/ml,感染人脐静脉内皮细胞的感染效率达98%。③干扰组DVL2的表达较BC组降低,差异有统计学意义(P<0.05),过表达组较BC组升高,差异有统计学意义(P<0.05),其中干扰效率为61%,蛋白质过表达水平为BC组的2.7倍。结论DVL2基因干扰和过表达慢病毒载体构建成功,并能够在原代hUVECs中稳定表达。 展开更多
关键词 蓬乱蛋白2/Wnt蛋白质类 慢病毒载体 内皮细胞 RNA干扰 过表达
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