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苹果茎痘病毒双重RT-PCR检测体系的建立及应用
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作者 胡国君 董雅凤 +3 位作者 张尊平 范旭东 任芳 张梦妍 《植物病理学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第3期428-432,共5页
病毒病是危害苹果(Malus domestica)的一类重要病害。已报道的苹果病毒种类很多,在我国发生普遍的主要有苹果褪绿叶斑病毒(Apple chlorotic leaf spot virus,ACLSV)、苹果茎沟病毒(Apple stem grooving virus,ASGV)、苹果茎痘病毒(Apple... 病毒病是危害苹果(Malus domestica)的一类重要病害。已报道的苹果病毒种类很多,在我国发生普遍的主要有苹果褪绿叶斑病毒(Apple chlorotic leaf spot virus,ACLSV)、苹果茎沟病毒(Apple stem grooving virus,ASGV)、苹果茎痘病毒(Apple stem pitting virus,ASPV)、苹果花叶病毒(Apple mosaic virus,ApM V)以及苹果锈果类病毒(Apple scar skid viroid,ASSVd)[1~3]。 展开更多
关键词 APPLE APPLE STEM PITTING VIRUS dual RT-PCR VIRUS detection
PEDV、TGEV二重RT-PCR检测方法的建立与应用
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作者 陈希文 杨双燕 +6 位作者 李莲 尹苗 杨勤 杨凤 罗文涛 马缨 赵洪 《黑龙江畜牧兽医》 北大核心 2018年第11期138-142,共5页
为了能快速灵敏地确诊临床腹泻仔猪的病原,试验采用分子生物学方法对基于猪流行性腹泻病毒(PEDV)M基因(KJ778616.1)和猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)N基因(GQ374566.1)的二重RTPCR检测方法进行了研究。结果表明:建立的二重RT-PCR检... 为了能快速灵敏地确诊临床腹泻仔猪的病原,试验采用分子生物学方法对基于猪流行性腹泻病毒(PEDV)M基因(KJ778616.1)和猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)N基因(GQ374566.1)的二重RTPCR检测方法进行了研究。结果表明:建立的二重RT-PCR检测方法能同时扩增鉴别PEDV和TGEV两个病原;该方法的特异性强,与猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪伪狂犬病毒(PRV)和猪轮状病毒(PoRV)等病毒间不存在交叉反应;敏感性高,PEDV的最低稀释度为1×10^-5,TGEV的最低稀释度为1×10^-4;应用建立的方法对36份临床腹泻仔猪粪便拭子、小肠组织和乳汁等样品进行检测,结果与商品化试剂盒的符合率为100%。说明试验成功建立了能同时检测并鉴别PEDV和TGEV的二重RT-PCR方法,该方法快速、准确、灵敏,在临床发病样品中应用效果良好,适合在疑似PEDV和TGEV发病猪场中推广应用。 展开更多
关键词 猪流行性腹泻病毒 猪传染性胃肠炎病毒 二重RT-PCR 鉴别诊断 建立 应用
猪瘟病毒和猪流行性腹泻病毒双重RT-PCR方法的建立 预览 被引量:2
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作者 谭飞 马士博 +6 位作者 王瑞翀 张希 姜艳平 崔文 孟柳 尹纪元 乔薪瑗 《中国兽医杂志》 CAS 北大核心 2015年第10期28-30,共3页
本研究根据GenBank中发表的猪瘟病毒(CSFV)和猪流行性腹泻病毒(PEDV)的基因组序列,设计筛选出两对用于双重RT-PCR反应的特异性引物,通过对特异性、灵敏性和稳定性等试验,建立了检测猪流行性腹泻病毒和猪瘟病毒的双重RT-PCR核酸检测... 本研究根据GenBank中发表的猪瘟病毒(CSFV)和猪流行性腹泻病毒(PEDV)的基因组序列,设计筛选出两对用于双重RT-PCR反应的特异性引物,通过对特异性、灵敏性和稳定性等试验,建立了检测猪流行性腹泻病毒和猪瘟病毒的双重RT-PCR核酸检测技术。利用建立的CSFV-PEDV双重RT-PCR核酸检测技术,对某规模化猪场病料进行检测,结果表明,扩增出大小约311 bp和501 bp大小的特异性条带,为猪瘟与猪流行性腹泻病毒混合感染。建立的CSFVPEDV双重RT-PCR核酸检测技术具有良好的特异性、灵敏性和稳定性,该方法的建立为CSFV和PEDV的快速诊断、疫情监测及流行病学研究奠定了基础。 展开更多
关键词 双重RT-PCR 猪瘟 猪流行性腹泻
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转录因子Ets-2调控小鼠成釉细胞MMP-20基因表达的研究 预览 被引量:1
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作者 孙霞 王青山 +5 位作者 韩婷婷 李东亮 孙学玲 孙岩 纪虹利 高玉光 《口腔医学研究》 CAS CSCD 2013年第1期1-4,8共5页
目的:通过研究Ets-2转录因子对调控小鼠成釉细胞金属基质蛋白酶-20(matrix metalloproteinase-20,MMP-20)基因表达的调控作用,进一步明确Ets-2在釉质发育中的作用。方法:应用免疫组化方法观察出生后5d小鼠切牙成釉细胞中Ets-2的表达... 目的:通过研究Ets-2转录因子对调控小鼠成釉细胞金属基质蛋白酶-20(matrix metalloproteinase-20,MMP-20)基因表达的调控作用,进一步明确Ets-2在釉质发育中的作用。方法:应用免疫组化方法观察出生后5d小鼠切牙成釉细胞中Ets-2的表达;在小鼠成釉细胞中分别转染200ng pcDNA3.1/myc-HisA-Ets-2和Ets-2siRNA后,利用实时定量RT-PCR法检测MMP20基因表达的不同变化;用双荧光素酶报告基因检测系统分析Ets-2对MMP-20启动子突变后转录活性的影响。结果:免疫组化显示Ets-2在成釉细胞中呈阳性表达。实时定量RT-PCR研究发现Ets-2过表达后,MMP-20表达水平显著增加;当Ets-2基因沉默后,MMP-20表达水平则显著下降。双荧光素酶报告基因检测系统检测显示,转染pcDNA3.1/myc-HisA-Ets-2的实验组与对照组相比,MMP-20启动子的转录活性升高;对启动子Ets潜在结合部位进行定点突变后,MMP-20启动子的转录活性显著下降,Ets-2丧失上调MMP-20启动子转录活性的作用。结论:小鼠成釉细胞核中Ets-2可通过MMP-20启动子上Ets潜在结合位点,上调MMP-20基因表达水平。 展开更多
关键词 转录因子Ets-2 基质金属蛋白酶-20 免疫组化 RT-PCR 双荧光素酶报告基因检测
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双重RT-PCR同时检测兰花两种主要病毒的研究 预览 被引量:2
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作者 张妙彬 潘丽晶 +1 位作者 肖杨 杨玉环 《广东农业科学》 CSCD 北大核心 2010年第5期 166-167,180,共3页
以利用Trizol试剂盒提取的蝴蝶兰组培苗叶片总RNA为模板,根据已报道的建兰花叶病毒(Cymbidium mosaic virus,CyMV)和齿兰环斑病毒(Odontoglussm ringspot virus,ORSV)外壳蛋白基因(cp)的保守序列设计特异性引物,探索RT-PCR反应条... 以利用Trizol试剂盒提取的蝴蝶兰组培苗叶片总RNA为模板,根据已报道的建兰花叶病毒(Cymbidium mosaic virus,CyMV)和齿兰环斑病毒(Odontoglussm ringspot virus,ORSV)外壳蛋白基因(cp)的保守序列设计特异性引物,探索RT-PCR反应条件,建立了可同时检测CyMV和ORSV的双重RT-PCR体系。 展开更多
关键词 兰花 双重RT-PCR 建兰花叶病毒 齿兰环斑病毒 检测
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基于DPO引物检测猪流行性腹泻病毒荧光定量RT-PCR方法的建立及初步应用 预览
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作者 王以欣 王紫薇 +8 位作者 汉武娇 王丽 姜艳平 崔文 周晗 乔薪瑗 唐丽杰 李一经 徐义刚 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第7期710-715,共6页
为建立快速、准确检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)的方法,本研究以PEDV的N基因为靶基因,基于双启动寡核苷酸引物(DPO),经过条件优化,建立了检测PEDV的荧光定量RT-PCR方法。结果显示,DPO引物的有效退火温度范围较宽(45℃~65℃);在测试的10种... 为建立快速、准确检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)的方法,本研究以PEDV的N基因为靶基因,基于双启动寡核苷酸引物(DPO),经过条件优化,建立了检测PEDV的荧光定量RT-PCR方法。结果显示,DPO引物的有效退火温度范围较宽(45℃~65℃);在测试的10种病毒中仅PEDV为阳性扩增结果,其余病毒为阴性结果,特异性较强;对PEDV质粒标准品的检测限可达1.64×10^1拷贝/μL,敏感性较高;组内、组间重复性结果的变异系数均小于1%,重复性较好。利用该方法对采集的272份临床仔猪腹泻样品(粪便、小肠组织)进行检测,结果显示,共检出PEDV阳性样品39份,阳性率为14.34%,与常规RT-PCR方法检测结果的阳性符合率为92.31%;本研究建立方法检测的阳性样品经PEDV N基因测序鉴定,确实均为PEDV阳性样品。本研究建立的基于DPO引物检测PEDV的荧光定量RT-PCR方法为PEDV的准确检测和流行病学调查提供技术支持。 展开更多
关键词 猪流行性腹泻病毒 DPO引物 荧光定量RT-PCR
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双扩增法和real-time RT-PCR法检测手足口病的比较
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作者 马静 马蓓蓓 +2 位作者 李清元 周攀 黄英 《中国卫生检验杂志》 CAS 2019年第16期1948-1949,1952,共3页
目的开展双扩增法和real-time RT-PCR法检测手足口病的比较性研究,为基层实验室建立手足口病科学快速检测方法提供依据。方法对2016年-2017年宜昌市9县市区采集的205份手足口病患者的咽拭子样本,同时采用双扩增法和real-time RT-PCR法... 目的开展双扩增法和real-time RT-PCR法检测手足口病的比较性研究,为基层实验室建立手足口病科学快速检测方法提供依据。方法对2016年-2017年宜昌市9县市区采集的205份手足口病患者的咽拭子样本,同时采用双扩增法和real-time RT-PCR法检测手足口病通用病毒、CoxA16、EV71,比较2种方法检测结果的差异,对2种方法检测结果相异的标本进行测序。结果双扩增法同real-time RT-PCR法检测结果比较,阳性标本数差异无统计学意义(x^2=0.743,P>0.05);且2种方法与测序方法结果比较,符合数差异无统计学意义(x^2=3.32,P>0.05)。结论双扩增法适合基层实验室推广使用。 展开更多
关键词 手足口病 双扩增法 real-time RT-PCR 人肠道病毒71型 柯萨奇病毒A组16型
BVDV一步法双重荧光RT—PCR检测方法的建立及应用 被引量:3
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作者 王建昌 王金凤 +2 位作者 崔元 刘立兵 袁万哲 《中国兽医学报》 CSCD 北大核心 2018年第2期245-251,共7页
为实现对牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)的快速检测和分型,本试验根据OenBank已发表的BVDV1和BVDV25’UTR基因特异性保守区域设计特异性引物和探针,以体外转录病毒RNA作为模板,建立了BVDV1和BVDV2一步法双... 为实现对牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)的快速检测和分型,本试验根据OenBank已发表的BVDV1和BVDV25’UTR基因特异性保守区域设计特异性引物和探针,以体外转录病毒RNA作为模板,建立了BVDV1和BVDV2一步法双重荧光RT-PCR方法。结果显示,双重荧光RT—PCR对BVDV1和BVDV2的检测下限均为10^2拷贝;具有较强的特异性,对口蹄疫病毒、猪瘟病毒、Hobi样病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、施马伦贝格病毒等病毒核酸的扩增均为阴性;BVDV1和BVDV2的扩增均在10^2~10^7拷贝内呈现良好的线性关系,标准曲线的相关系数(R^2)分别为0.999和0.998;方法重复性好,BVDV1和BVDV2的变异系数(CV值)分别在0.68%~1.87%和1.25%~1.900A。本试验对665份样品进行检测,共检出BVDV阳性样品45份,其中BVDV1阳性样品39份,BVDV2阳性样品5份,BVDV1和BvDv2均阳性样品1份。结果表明,本试验建立的BVDV一步法双重荧光RT-PCR方法敏感性高、特异性强、重复性好,可广泛应用于BVDV的快速检测、分型和流行病学调查。 展开更多
关键词 牛病毒性腹泻病毒 一步法 双重荧光RTPCR 检测 分型
微小RNA-101通过USP22抑制人肝癌MHCC97H细胞的上皮-间质转化功能 预览 被引量:1
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作者 鲍洁 张娟 王晶 《器官移植》 CAS CSCD 2017年第3期209-214,共6页
目的研究微小核糖核酸(miR)-101对人肝细胞癌(肝癌)MHCC97H细胞的上皮-间质转化功能的影响及其相关机制。方法 MHCC97H肝癌细胞株分别转染miR-101 mimics和negative control mimic,分别作为M101组、NCM组,并设立未转染对照(contro... 目的研究微小核糖核酸(miR)-101对人肝细胞癌(肝癌)MHCC97H细胞的上皮-间质转化功能的影响及其相关机制。方法 MHCC97H肝癌细胞株分别转染miR-101 mimics和negative control mimic,分别作为M101组、NCM组,并设立未转染对照(control)组,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测各组细胞miR-101含量。Transwell实验检测3组细胞迁移能力和侵袭能力。Western-blot法检测3组细胞vimentin、α-catenin、E-cadherin和USP22表达水平。双荧光素酶实验检测miR-101与USP22的关系。结果 M101组miR-101的表达水平明显上调,表达水平约为control组的761倍(P〈0.05)。M101组迁移细胞数量明显低于control组的[(15.7±1.6)个比(94.1±1.8)个,P〈0.05]。M101组侵袭细胞数量明显低于control组的[(9.1±0.4)个比(51.6±0.9)个,P〈0.05]。M101组细胞vimentin蛋白表达量明显降低,α-catenin及E-cadherin蛋白表达量明显升高,USP22蛋白表达量明显降低。双荧光素酶检验结果显示USP22为miR-101的下游靶基因。结论 miR-101可能通过降低下游靶基因USP22水平影响EMT相关蛋白表达,抑制MHCC97H肝癌细胞的上皮-间质转化功能。 展开更多
关键词 肝细胞癌 微小核糖核酸(miR)-101 上皮-间质转化 侵袭 转移 泛素特异性蛋白酶22(USP22) 双荧光素酶实验 逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)
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Bmo-miR-2771对家蚕丝胶蛋白基因BmSer-1表达的调控作用 被引量:1
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作者 钱平 蒋涛 +5 位作者 王欣 宋菲 陈晨 范洋洋 唐顺明 沈兴家 《蚕业科学》 CAS CSCD 北大核心 2016年第5期826-831,共6页
微小RNA(miRNA)可通过抑制mRNA转录或使RNA降解的方式在转录后水平调节靶基因的表达。研究与家蚕丝胶蛋白基因1(BmS er-1)转录后表达有关的miRNA(Bmo-miR)及其作用方式,以丰富丝胶蛋白基因表达的精细调控信息。首先从miRBase 21... 微小RNA(miRNA)可通过抑制mRNA转录或使RNA降解的方式在转录后水平调节靶基因的表达。研究与家蚕丝胶蛋白基因1(BmS er-1)转录后表达有关的miRNA(Bmo-miR)及其作用方式,以丰富丝胶蛋白基因表达的精细调控信息。首先从miRBase 21数据库中获得全部成熟体Bmo-miR,通过生物信息学分析筛选到一个对BmS er-1有潜在调控作用的BmomiR,命名为Bmo-miR-2771。设计茎环引物,采用半定量RT-PCR方法检测Bmo-miR-2771及其预测靶基因BmS er-1在家蚕5龄3 d幼虫头部、脂肪体、前部丝腺、中部丝腺、后部丝腺、中肠等组织器官以及血淋巴细胞中的表达水平,结果显示Bmo-miR-2771特异性地在中部丝腺中表达,并且靶基因BmS er-1在中部丝腺的相对表达量也明显高于其他组织。将构建的表达BmomiR-2771的重组质粒pcD NA3.0(ie1-egfp-pri-miR-2771-SV40)和表达BmS er-1 3'-UTR的重组质粒pG L3(A3-luc-Ser-1 3'UTRSV40)共转染家蚕卵巢培养细胞BmN,并以共转染pcD NA3.0(ie1-egfp-SV40)和pG L3(A3-luc-Ser-1 3'UTR-SV40)的BmN细胞为阳性对照,以海肾荧光素酶表达载体pRL-CMV为内参,检测荧光素酶活性,结果显示实验组的荧光素酶活性相对于阳性对照组显著降低(P〈0.05),从细胞水平证实了Bmo-miR-2771对BmS er-1基因表达具有负调控作用。 展开更多
关键词 家蚕 丝胶蛋白基因Ser-1 微小RNA Bmo-miR-2771 转录后调控 半定量RT-PCR 双荧光素酶报告基因系统
双重实时荧光RT-PCR法检测肠道病毒方法的建立及应用 预览 被引量:2
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作者 许联红 岳玉林 +2 位作者 王永仿 楚鹰 蒋立新 《重庆医学》 CAS 北大核心 2016年第33期4688-4690,4741共4页
目的建立检测肠道病毒(EV)和肠道病毒71型(EV71)的双重实时荧光RT-PCR法。方法设计特异性引物和探针,建立双重实时荧光RT-PCR反应体系,绘制标准曲线,对该方法的灵敏度、精密度等进行评价。收集109例临床手足口病患者粪便和咽拭子标... 目的建立检测肠道病毒(EV)和肠道病毒71型(EV71)的双重实时荧光RT-PCR法。方法设计特异性引物和探针,建立双重实时荧光RT-PCR反应体系,绘制标准曲线,对该方法的灵敏度、精密度等进行评价。收集109例临床手足口病患者粪便和咽拭子标本用该法进行检测,并与EV71商品化试剂盒检测结果进行比较。结果双重荧光PCR法建立的EV和EV71标准曲线相关系数(r)均为0.998;该法检测EV和EV71的灵敏度分别达到0.5TCID50/mL和0.05TCID50/mL;检测EV和EV71的批内精密度均小于3%,总精密度均小于或等于4%;对肠道病毒及其他人类非肠道病毒进行检测,显示了良好的特异性。109例临床样本用该法检测出84例EV病毒阳性样本,其中EV71阳性56例,EV71总阳性率为51.4%;与单重荧光PCR商品化试剂盒的检测结果完全一致(P=1.000)。结论建立的双重实时荧光RT-PCR法灵敏度高、稳定性好,对手足口病的早期高通量快速诊断具有重要意义。 展开更多
关键词 手足口病 肠道病毒 肠道病毒71型 双重实时荧光RT-PCR
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Taqman探针荧光聚合酶链式反应实时同步鉴定动物源性食品中猪肉、鸡肉源性成分 预览 被引量:3
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作者 金萍 结莉 +2 位作者 陆俊 陈英 丁洪流 《肉类研究》 北大核心 2016年第9期17-22,共6页
目的:建立一种能实时同步检测动物源性食品中猪肉源性和鸡肉源性成分的Taqman探针双重荧光聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)方法,应用于动物源性食品的成分掺假快速检验。方法:分别依据猪和鸡的种间保守基因(Cytb)... 目的:建立一种能实时同步检测动物源性食品中猪肉源性和鸡肉源性成分的Taqman探针双重荧光聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)方法,应用于动物源性食品的成分掺假快速检验。方法:分别依据猪和鸡的种间保守基因(Cytb)序列设计、合成特异性引物及不同荧光标记(FAM、HEX)的Taqman探针,建立可同步检测动物源性食品中的猪源性和鸡源性成分的Taqman探针双重荧光PCR方法。结果:所建立的Taqman探针双重荧光PCR检测方法特异性强,仅对猪、鸡成分有扩增;灵敏度高,最低检测到猪源、鸡源DNA的含量分别为0.02、0.10 ng;抗干扰性强,当DNA混样中猪源、鸡源性成分含量在2%以上水平时,所建立的混合检测体系均能对DNA混样给出正确判断。结论:所建立的混合检测体系具有高特异性、高灵敏度,能够适用于动物源性食品中猪肉、鸡肉成分的同时快速检测。 展开更多
关键词 双重荧光聚合酶链式反应 动物源性食品 猪源性成分 鸡源性成分
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双重荧光实时定量PCR法检测TNF-α mRNA表达水平 预览 被引量:1
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作者 姚霜 郑璐 +5 位作者 于洋 喻妙梅 潘丽莉 张俊 冯悦华 罗光华 《江苏大学学报:医学版》 CAS 2015年第6期524-527,共4页
目的:建立单管检测肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和内参GAPDH mRNA表达水平的双重荧光实时定量PCR方法。方法:脂多糖刺激小鼠巨噬细胞Ana-1后提取细胞RNA,经反转录合成c DNA,应用自行设计的不同荧光标记的TNF-α和GAPDH引物探针,经PCR扩... 目的:建立单管检测肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和内参GAPDH mRNA表达水平的双重荧光实时定量PCR方法。方法:脂多糖刺激小鼠巨噬细胞Ana-1后提取细胞RNA,经反转录合成c DNA,应用自行设计的不同荧光标记的TNF-α和GAPDH引物探针,经PCR扩增后,在FAM通道和CY5通道分别读取Ct值,同时应用基因测序技术对结果进行验证,并构建质粒标准品分析该方法的灵敏度和重复性。结果:双重荧光实时定量PCR法检测TNF-α的灵敏度达4×101拷贝/μL,检测线性范围可达6个数量级,批内和批间重复性好。结论:新方法消除了目的基因与内参的加样误差,节约成本,快速准确,适用于TNF-αmRNA的定量检测。 展开更多
关键词 双重荧光定量PCR 肿瘤坏死因子-Α GAPDH
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Foxo3a调控小鼠釉质发育过程中MMP-20基因的表达 预览 被引量:2
14
作者 王云虹 慈浩粟 +4 位作者 杨勇 张莉 王玉敏 李伯翰 高玉光 《牙体牙髓牙周病学杂志》 CAS 北大核心 2014年第3期136-141,共6页
目的:探讨转录因子Fox03a在釉质发育过程中调控基质金属蛋白酶-20(MMP-20)基因表达的分子机制。方法:分别利用免疫组织化学技术、免疫荧光、RT-PCR法、双荧光素酶报告基因检测系统检测转录因子Fox03a与MMP-20启动子区域的转录调控... 目的:探讨转录因子Fox03a在釉质发育过程中调控基质金属蛋白酶-20(MMP-20)基因表达的分子机制。方法:分别利用免疫组织化学技术、免疫荧光、RT-PCR法、双荧光素酶报告基因检测系统检测转录因子Fox03a与MMP-20启动子区域的转录调控水平,分析Fox03a调控MMP-20的转录活性的机制。结果:免疫组织化学染色发现Fox03a在成釉细胞核中呈阳性表达,并且随着釉质的分泌表达逐渐增强,晚期变弱;RT-PCR证实Fox03a促进MMP-20基因表达(P〈0.05);双荧光素酶检测显示,Fox03a促进MMP-20表达(P〈0.05);特定序列定点突变后的Fox03a对MMP-20基因的转录活性无显著的影响(P〉0.05)。结论:转录因子Fox03a可能通过与特定序列结合而调控MMP-20的表达,从而在釉质分泌过程中发挥重要作用。 展开更多
关键词 FOXO3A 基质金属蛋白酶-20 免疫组化 RT-PCR 双荧光素酶报告基因检测
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DPO引物多重RT-PCR技术检测甲型流感病毒的研究 预览 被引量:4
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作者 徐昌平 卢亦愚 《浙江预防医学》 2013年第1期5-7,16共4页
目的应用DPO引物技术建立一种可以同时检测新甲型流感病毒H1N1、季节性流感病毒H1N1、H3N2以及禽流感病毒H5N1的单管多重RT-PCR检测方法,为流行性感冒的监测与应急诊断提供高通量检测技术。方法应用DPO引物技术设计针对新甲型流感病毒H... 目的应用DPO引物技术建立一种可以同时检测新甲型流感病毒H1N1、季节性流感病毒H1N1、H3N2以及禽流感病毒H5N1的单管多重RT-PCR检测方法,为流行性感冒的监测与应急诊断提供高通量检测技术。方法应用DPO引物技术设计针对新甲型流感病毒H1N1、季节性流感病毒H1N1和H3N2以及禽流感病毒H5N1的高特异性DPO引物,并对多重RT-PCR反应体系优化,建立多重RT-PCR检测技术。结果建立的多重RT-PCR方法可同时扩增新甲型流感病毒H1N1221 bp、季节性流感病毒H1N1468 bp和H3N2592 bp以及禽流感病毒H5N1350 bp的基因片段。检测敏感性分别为102、102、103和102copies/ml,并与呼吸道合胞病毒、麻疹病毒、风疹病毒等呼吸道病毒无交叉反应。结论本研究建立的多重RT-PCR可以同时准确分型新甲型流感病毒H1N1、季节性流感病毒H1N1和H3N2以及禽流感病毒H5N1,为流行性感冒的监测与应急诊断提供了有效的实验室检测手段。 展开更多
关键词 甲型流感病毒 DPO引物 多重RT-PCR
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EGF/EGFR/ErbB2调控成釉细胞MMP-20基因表达的研究 预览 被引量:3
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作者 曲政 王玉敏 +3 位作者 李博涵 许针针 袁杰 高玉光 《牙体牙髓牙周病学杂志》 CAS 北大核心 2013年第7期417-423,共7页
目的:研究EGF/EGFR/ErbB2信号通路对小鼠成釉细胞中基质金属蛋白酶-20(matrixmetallopr0Ieinase-20,MMP-20)基因表达的调控作用。方法:用定时定量RT-PCR、双荧光素酶报告基因检测系统分析EGF/EGFR/ErbB2调控MMP-20基因的表达、... 目的:研究EGF/EGFR/ErbB2信号通路对小鼠成釉细胞中基质金属蛋白酶-20(matrixmetallopr0Ieinase-20,MMP-20)基因表达的调控作用。方法:用定时定量RT-PCR、双荧光素酶报告基因检测系统分析EGF/EGFR/ErbB2调控MMP-20基因的表达、EGF调控MMP-20启动子的主要区域、MAPK信号通路阻断剂对EGF调控MMP-20转录活性的影响、转录因子Jun家族介导EGF/ErbB2对MMP-20转录活性的调控;用基因定点突变和双荧光素酶基因检测报告系统分析EGF/ErbB2、C-Jun对MMP-20基因启动子转录活性的影响。结果:成釉细胞经20ng/mLEGF刺激后,MMP-20的基因表达上调(P〈0.05),MMP-20启动子在(-157~+23)之前的区域转录活性增强(P〈0.05);EGFR、ErbB2、ERK阻断剂均能抑制EGF对MMP-20基因表达的调控(P〈0.05);转录因子C-Jun介导EGFR/ErbB2上调MMP-20基因的表达(P〈0.05);突变MMP-20启动子的AP1结合位点后,MMP-20基因表达的水平下降(P〈0.05),同时EGF/ErbB2也失去上调MMP-20基因表达水平的作用。结论:在成釉细胞中EGF通过EGFR/ErbB2-ERK-C-Jun信号通路对MMP-20基因的表达起到调控作用。 展开更多
关键词 EGF EGFR ERBB2 基质金属蛋白酶-20 双荧光素酶基因检测 RT-PCR
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DUOX2在银屑病及特应性皮炎皮损表达的研究
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作者 周蓉颖 万逸枫 +2 位作者 郭昱 蒋献 吴琦 《四川大学学报:医学版》 CAS CSCD 北大核心 2013年第5期736-739,746共5页
目的探讨双功能氧化酶(dual oxidase,DUOX)2在寻常型银屑病患者皮肤、特应性皮炎(atopic dermatitis,AD)患者皮肤及正常人皮肤中的表达定位及差异,探讨其在皮肤抗感染机制中的作用。方法免疫组化法检测银屑病皮损区、银屑病非皮损区、A... 目的探讨双功能氧化酶(dual oxidase,DUOX)2在寻常型银屑病患者皮肤、特应性皮炎(atopic dermatitis,AD)患者皮肤及正常人皮肤中的表达定位及差异,探讨其在皮肤抗感染机制中的作用。方法免疫组化法检测银屑病皮损区、银屑病非皮损区、AD皮损区、AD非皮损区皮肤及正常皮肤DUOX2蛋白的表达。以逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测寻常型银屑病患者皮损区、AD皮损区及正常皮肤中DUOX2mRNA表达水平。结果免疫组化法检测结果显示,DUOX2蛋白在银屑病皮损区、银屑病非皮损区、AD皮损区、AD非皮损区皮肤及正常皮肤标本中均有表达,并主要分布在表皮基底层、棘层与真皮乳头层。银屑病皮损组较银屑病非皮损组及正常皮肤组表达增加(P<0.01);AD皮损组较AD非皮损组及正常皮肤组表达增加(P<0.01);AD皮损组较银屑病皮损组表达增加(P<0.01)。RT-PCR法检测到DUOX2mRNA在银屑病皮损及AD皮损中有表达,但差异无统计学意义(P>0.05)。结论 DUOX2在寻常型银屑病皮损、AD皮损及正常皮肤中表达,提示DUOX2可能参与皮肤抗感染机制,发挥抗菌屏障功能及氧化防御作用。 展开更多
关键词 银屑病 特应性皮炎 DUOX2 免疫组化 RT-PCR
猪繁殖与呼吸综合征和猪乙型脑炎双重一步法RT-PCR诊断试剂盒的研制 预览 被引量:3
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作者 余波 谭诗文 +3 位作者 冉懋韬 徐景峨 史开志 杨丽娟 《广东农业科学》 CSCD 北大核心 2013年第10期152-154,180共4页
根据GenBank中的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)ORFN基因、猪乙型脑炎病毒(JEV)NSl基因序列,设计了2对引物.通过反应条什的优化,成功研制了检测PRRSV和JEV的双重一步法RT—PCR诊断试剂盒,扩增产物分别为245、504bp.敏感性、特... 根据GenBank中的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)ORFN基因、猪乙型脑炎病毒(JEV)NSl基因序列,设计了2对引物.通过反应条什的优化,成功研制了检测PRRSV和JEV的双重一步法RT—PCR诊断试剂盒,扩增产物分别为245、504bp.敏感性、特异性结果显示,该RT-PCR诊断试剂盒对2种病毒的最低核酸检测量分别为PRRSV0.2ng/L、JEV0.4ng/L,而对猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒2型、猪细小病毒的扩增结果均为阴性。对52份疑似病猪样品的检测结果表明,该双重一步法RT-PCR诊断试剂盒检测结果与单*PCR检测结果完全符合。结果表明该双重一步法RT-PCR诊断试剂盒具有很好的特异性和敏感性,町用于临床猪繁殖与呼吸综合征和猪乙犁脑炎的检测。 展开更多
关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒 猪乙型脑炎病毒 双重一步法RTPCR
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应用DPO引物技术同时检测5种蚊媒病毒的多重RT-PCR方法 被引量:17
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作者 徐焕洲 平芮巾 +5 位作者 季汝武 王琳 杨鹏飞 张丽萍 岳启安 胡孔新 《中国国境卫生检疫杂志》 CAS 2012年第2期73-77,共5页
目的应用双启动寡核苷酸引物(Dual Priming Oligonucleotide,DPO)技术建立同时检测日本脑炎病毒(JapaneseEncephalitisVirus,JEV)、黄热病毒(YellowFeverVirus,YFV)、西尼罗病毒(WestNileVirus,WNV)、圣路易斯脑炎病毒(St.Loui... 目的应用双启动寡核苷酸引物(Dual Priming Oligonucleotide,DPO)技术建立同时检测日本脑炎病毒(JapaneseEncephalitisVirus,JEV)、黄热病毒(YellowFeverVirus,YFV)、西尼罗病毒(WestNileVirus,WNV)、圣路易斯脑炎病毒(St.Louis encephalitis virus,SLEV)和登革病毒(Dengue virus,DV)5种蚊媒病毒的多重RT-PCR方法。方法利用Primer Premier5.0软件设计5种病毒的特异性DPO引物,对引物浓度、Mg2+浓度和退火温度进行优化,测定多重RT-PCR反应的特异性和敏感性。结果应用DPO引物技术建立的多重RT-PCR方法可特异性扩增JEV、YFV、WNV、SLEV和DV的142 bp、293 bp、377 bp、630 bp和521 bp基因片段,灵敏度分别为5 000 PFU/ml、4 500 PFU/ml、2.3×105copies/μl、2.6×104copies/μl和1.37×104copies/μl,蚊虫模拟添加实验未发生非特异反应。结论应用DPO引物技术建立的针对5种蚊媒病毒的多重RT-PCR检测方法有良好的敏感性和特异性,可以同时对JEV、YFV、WNV、SLEV和DV进行检测。 展开更多
关键词 DPO引物 多重RT-PCR 日本脑炎病毒 黄热病毒 西尼罗病毒 圣路易斯脑炎病毒 登革病毒
AP-2α对基质金属蛋白酶-20作用的研究 预览 被引量:1
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作者 赵娜 王玉民 +4 位作者 孙学玲 曲正 孙岩 张娟娟 高玉光 《牙体牙髓牙周病学杂志》 CAS 北大核心 2012年第4期 183-188,共6页
目的:通过研究AP-2α转录因子对基质金属蛋白酶-20(matrix metalloproteinase-20,MMP-20)基因表达的调控作用,进一步明确AP-2α的功能,为研究AP-2α在釉质形成中的作用奠定基础。方法:利用RT-PCR法、双荧光素酶报告基因检测系统、... 目的:通过研究AP-2α转录因子对基质金属蛋白酶-20(matrix metalloproteinase-20,MMP-20)基因表达的调控作用,进一步明确AP-2α的功能,为研究AP-2α在釉质形成中的作用奠定基础。方法:利用RT-PCR法、双荧光素酶报告基因检测系统、染色体免疫共沉淀技术等来分析AP-2α与MMP-20启动子区域的转录调控能力。结果:小鼠成釉细胞转染AP-2αsiRNA后,成釉细胞中MMP-20 mRNA的表达水平显著上调。染色体免疫共沉淀结果显示,AP-2α可能通过与MMP-20启动子特征性序列相互作用,从而调控MMP-20的表达。双荧光素酶报告基因检测显示预测结合位点突变后,AP-2α对MMP-20启动子的表达水平无显著影响。结论:AP-2α基因沉默可显著上调MMP-20的mRNA表达水平;而AP-2α过表达可显著抑制MMP-20活性。提示AP-2α转录因子与成釉细胞内MMP-20启动子的特征性序列相互作用,从而调控MMP-20的表达水平。 展开更多
关键词 AP-2α转录因子 基质金属蛋白酶-20 RT-PCR 双荧光素酶报告基因检测 染色体免疫共沉淀
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